Tecnologia do DNA Recombinante-TDR

(clonagem de DNA)

CONSTRUINDO A MOLCULA DE DNA , RECOMBINANTE

BIOTECNOLOGIA:Engenharia gentica.
A utilizao de microorganismos, plantas e animais para a produo de substncias teis ao ser humano chamada de biotecnologia. A engenharia gentica uma nova biotecnologia baseada nas tcnicas modernas de manipulao do DNA, que permite transplantar genes de uma espcie para outra e criar uma nova molcula de DNA que no exista na natureza.

Histrico
Stanley Cohen e Herbert Boyer fizeram o primeiro experimento de engenharia gentica em 1973. Eles demonstraram que o gene para o RNA ribossomal de um sapo (eucarionte) podia ser transferido para uma bactria (procarionte) que o expressava.

Xenopus laevis.

rDNA (DNA recombinante)

DNA Recombinante
So molculas de DNA que contm fragmentos de DNA ligados covalentemente, derivados de duas ou mais fontes, geralmente espcies diferentes.

A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular.

A origem do termo clonagem vem da gentica bacteriana que considera uma colnia de bactria como um clone porque todos os indivduos so geneticamente idnticos bactria inicial.

Aplicao da Tecnologia do DNA recombinante

A Tecnologia do DNA recombinante tem uma ampla aplicao. Pode ser usada para: -produzir substncias teis: insulina humana, hormnio de crescimento,vacinas, enzimas industriais em grandes quantidades, estudar mecanismos de replicao e expresso gnica, etc; -investigao de paternidade; -diagnstico de doenas genticas e infecciosas; -terapia gnica; -transgnicos;

Sintetizar compostos teis

ETAPAS PARA FORMAO DE UM DNA RECOMBINANTE

GERAO DE FRAGMENTOS DE DNA

Enzima de restrio

Ligase

JUNO COM UM VETOR OU UMA MOLCULA CARREADORA

Eletroporao ou CaCl2 Resistncia a antibiticos ou algum outro marcador

Transformao:

INTRODUO EM UMA CLULA HOSPEDEIRA

SELEO

OBTENO DO DNA RECOMBINANTE

Enzimas de restrio

Extremidade cega:

Enzimas de restrio
Extremidades: PROTUBERANTES

Iso-esquismero

Melhor opo para a clonagem?

DNA Ligase em Ao!

I hope

T4 DNA Ligase

Escolhendo o Vetor

Tamanho do DNA a ser clonado? Produo de Protena? Em clula procaritica ou eucaritica?

Tipos de Vetores e tamanho dos insertos

Para diferentes tamanhos de DNA:
plasmideos: at 5 kb Vetor de fago lambda () : at 50 kb BAC (bacterial artificial chromosome): 300 kb YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb

Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido

shuttle vectors: podem crescer em duas espcies diferentes

Caractersticas de um Vetor de expresso

Caractersticas de um Plasmdeo

MCS

Bula pUC19

Tipos de Vetores
-Vetor de fago lambda ()
BAC (bacterial artificial chromosome): 300 kb YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb

Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido

Vetor de fago lambda () : at 50 kb

Uns dos vetores mais usados nos processos de clonagem molecular o denominado bacterifago , comporta-se como um vrus de E.coli . O fago ao infectar a bactria E.coli pode seguir 2 vias: - ciclo ltico; - ciclo lisognico;

O fago como vetor de clonagem

Durante o ciclo ltico, os genes envolvidos na lisogenia podem ser substitudos por outro framento de DNA (inserto de interesse), sem que haja qualquer alterao na via ltica. Este processo altamente eficiente quando comparado com a transformao bacteria usando plasmdeo.

O fago como vetor de clonagem

Tipos de Vetores
BAC (bacterial artificial chromosome): 300 kb YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb

Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido

Bacterial Artificial Chromosomes

Based on the F plasmid that confers the ability to conjugate. Low copy number plasmids (usually 1 per cell), which prevents crossing over between repeated sequences in the insert DNA But, low copy number also means low DNA yield. Transformed into E. coli using electroporation, subjecting the bacteria to a high voltage electrical field. BACs are currently the most common vector for large inserts such as eukaryotic genome projects.

Tipos de Vetores
YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb

Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido

Yeast Artificial Chromosomes

A linear chromosome, has centromere, telomeres, ARS (autonomously replicating sequence), selectable marker for yeast (uracil or tryptophan biosynthesis genes usually). Also has E. coli ori and selectable marker: you can grow the vector itself in E. coli Then purify it, ligate in foreign DNA, transform into yeast.

Tranformao ou transfeco?
Tranformao Bactrias CaCl2 (bactria competente) e Eletroporao Transfeco Eucariontes Lipofectamina

Tranformao Bactrias

Isolamento e amplificao dos plasmdeos recombinantes

Seleo: Antibiticos, colonias brancas ou azuis (LacZ, IPTG, X-gal),

Seleo

Marcadores de Seleo:

Marcadores de Seleo:

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Para checar a clonagem:

POR RESTRIO:

PCR: SEQUENCIAMENTO: