RESUMEN BIOINGENIERIA Presentacin 1: tecnologa de la fermentacin

LUIS CHICO, 10078

Bioingeniera: uso en ingeniera o en la industria de organismos o procesos biolgicos Biotecnologa: explotacin de procesos biolgicos para la industria y otros propsitos, especialmente la manipulacin gentica de microorganismos para la produccin de antibiticos, hormonas, enzimas, etc. Se busca diseo y optimizacin de procesos de produccin biotecnolgica: Uso de microorganismos o enzimas para alcanzar produccin ms limpia y eficaz Convierten materias primas en un componente til, luego se separa el componente de la mezcla de reaccin El proceso de produccin contiene un componente biolgico sensible que requiere tratamiento especial (difiere a la biotecnologa de las dems ingenieras) Los productos producidos son fuentes alternas de energa, reciclaje de residuos, productos innovadores como antibiticos, hormonas, etc. y enzimas Las reas de aplicacin son: Tecnologa de fermentacin Ingeniera de enzimas Tecnologa de residuos (conservacin y reciclaje de recursos) Sistemas biolgicos utilizados: Virus (vacunas) Procariotas (bacterias, algas)

Tecnologa medioambiental Tecnologa de recursos renovables

Eucariotas (levaduras, mohos, clulas animales o vegetales) Enzimas

Los procesos biotecnolgicos deben cumplir con mandatos de seguridad, pureza, potencia, eficacia y consistencia. Entre los criterios de diseo estn: concentracin, productividad, rendimiento, calidad y pureza. Las ventajas de usar microorganismos es que pueden crecer en amplia gama de sustratos y pueden producir muchos productos, adems de que se pueden manipular genticamente para aumentar rendimientos o producir ciertos productos importantes. Fermentacin: Fisiolgica proceso de produccin de energa a partir de ruptura de compuestos ricos en energa en condiciones anaerbicas Biotecnolgico proceso en el que microorganismos se cultivan a gran escala para convertir un sustrato en un producto ms til Etapas: 1. Actividades upstream: preparacin de fermentacin (seleccin del bicho, formulacin medio, esterilizacin aire, medio de fermentacin y fermentador, preparacin de inculo e inoculacin del medio. 2. Fermentacin: el proceso en s. Biorreactor o fermentador separa las dos actividades 3. Actividades downstream: recuperacin de producto, purificacin, empaque, evaluacin de propiedades. Criterios de seleccin de organismo: 1. Caractersticas nutricionales 4. Estabilidad del organismos 2. Temperatura 5. Productividad del organismo 3. Reaccin con el equipo 6. Facilidad de recuperacin de producto a. Bacterias facilidad gentica (ADN 1 molcula), alta productividad, alta velocidad de crecimiento, resistencia a fuerza de corte. NEG: pobres secretores, poca glicosilacin b. Levaduras alta productividad, velocidad de crecimiento y concentracin de clulas, buenas secretoras, modificaciones postrasduccionales, cepas glico modificadas disponible, complejidad de manipulacin gen c. Mohos metabolitos primarios (cidos org), aerbicos estrictos, fed-batch. NEG: lento crecimiento, crecimiento de masa es por extensin de punta (atla viscosidad, mala mezcla y transferencia de calor y masa) d. Clulas de mamferos protenas similares a humanos, secretan al medio, correctamente construidas y activas. NEG. Velocidad crecimiento lenta, baja densidad celular, baja productividad, sensible a fuerza de corte.

Medio de cultivo Fuente de energa, fuente de C, fuente de N, micronutrientes para crecimiento, agua, O 2. Ser barato y disponible, maximizar crecimiento, productividad y velocidad de formacin de producto. Se suelen utilizar: melaza de caa de azcar, residuos lignocelulosos, suero de queso, licor de maz, etc. Esterilizacin Aire es por filtracin de membrana, medio por calor. Preparacin de inculo crecimiento a niveles suficientes para hacer scale up. Fermentacin propagacin de microorganismo, produccin de producto deseado. Condiciones aerbicas o anaerbicas. Sistemas: 1. Batch: medio y cultivo se alimentan en el fermentador y luego se cierra. Solo se aade para ajustar pH 2. Continuo: aade continuamente medio fresco y productos/cultivos se retiran a velocidad constante (concentracin de nutrientes y clulas son constantes durante todo el proceso) 3. Fed-batch: aade nutrientes adicionales al fermentador. Otro tipo de clasificacin: Fermentacin de estado slido (SSF) Fermentacin sumergida (SMF) dependiendo de la cantidad de agua libre en el medio. Productos obtenidos: 1. Biomasa (levadura de pan, SCP, cultivos, alimentacin humana y animal) 2. Metabolitos primarios (aminocidos, cidos orgnicos, vitaminas, polisacridos, etanol, metano. Y metabolitos secundarios como antibiticos 3. Bioconversin: biotrasnformacin de esteroides, L-sorbitol, etc. 4. Enzimas: (amilasa, lipasa, celulasa, etc.) Downstream Operaciones unitarias dependen de naturaleza del producto, nivel de purificacin necesario, volumen y si es producto intra o extracelular. Incluye recuperacin de productos y tratamiento de efluentes. Pasos: 1. Pretratamiento: ruptura celular, estabilizacin, esterilizacin, pasteurizacin, floculacin 2. Separacin slido-lquido: eliminar restos celulares (filtros, centrifugacin, sedimentacin) 3. Concentracin: aislamiento primario del producto (adsorcin, extraccin liq-liq, precipitacin, evaporacin) 4. Purificacin: tcnicas altamente selectivas (cromatografa, ultrafiltracin, precipitacin fraccionada, dilisis) 5. Formulacin: tcnicas altamente selectivas aislamiento final del producto (cristalizacin, centrifugacin o filtracin y secado). Significan hasta 80% de costo. Es el cuello de botella.

Presentacin 2: Microorrganismos Microorganismos pueden vivir como clulas individuales o colonias multicelulares. Se busca la masa celular productos del metabolismo celular. Procariotas no tienen membranas que limitan rganos. Bacterias y aqueas. Generalmente son organismos unicelulares. Todos sus componentes intracelulares solubles en agua se encuentran juntos en el citoplasma. Eucariotas rganos delimitados por membranas. Protozoos. Todos los multicelulares son eucariotas. Divisin celular es diferente. Virus entidades simples, acelulares, una o ms molculas de ADN o ARN (slo uno) encerradas en capa de protena. Se reproducen dentro de clulas vivas y son parsitos intracelulares obligados. Se clasifican por su cido nucleico, simetra de capsid (capa protenica que rodea el ARN), presencia o ausencia de envoltura, anfitrin, etc. Difieren de clulas vivas por: organizacin simple, ausencia de ADN y ARN en el mismo virin, incapacidad de reproducirse independientemente. Existen en dos fases: Virin fase extracelular, pocas o ninguna enzima, no reproduccin Fase intracelular cidos nucleicos replicndose, inducen el metabolismo del anfitrin a sintetizar componentes del virin. Bacterias ubicua en naturaleza. No estn delimitadas por membranas, unicelulares o coloniales, todas son idnticas, hetertrafas o auttrofas. Nucleoide, plsmido, ribosomas, membrana plasmtica, pared celular, flagelos, pelos. Pueden moverse por flagelos, filamento axial, limo (cpsula externa a travs de la que se mueven). Fisin binaria, asexual. Conjugacin bacteriana (conexin por puente de conjugacin = pelo, plsmido F o plsmido sexual). Actinobacterias = Gram +, Streptomyces. Descomponen residuos animales y vegetales. Edafognesis (formacin y evloucin de suelo), capacidad quelante; formacin de humus. Metabolitos secundarios. La mayora es aerbica

Arqueas dominio de microorganismos unicelulares. Procariotas. Similar con eucariotas por genes y rutas metablicas (transcripcin y traduccin). Utiliza variedad de fuentes d energa (azcares, amonaco, iones metlicos, hidrgeno). Fisin binaria, fragmentacin o gemacin. Extremfilos porque viven en ambientes hostiles. Metanognos = ayudan digestin y forman biogs. Tipos: 1. Termoacidfilos (amantes al calor) 2. Halfilos (amantes a la sal) 3. Metangenos (productores de metano) Hongos (levaduras, mohos, setas). Pared celular contiene quitina. Tamao pequeo de estructuras. Fermento para pan, vino, cerveza, soya, cidos orgnicos, alcoholes, enzimas, antibiticos, etc. Hetertrofos: secretan enzimas hidrolticas y cidos para descomponer. Saprfitos, parsitos o mutualismo. Ncleos delimitados por membrana. Gemacin o fisin binaria. Pared celular: glucanos y quitina. Crecen por hifas con mltiples ncleos y se extienden por su punta. Mohos crecen por extensin de micelio (punta) y son aerbicos estrictos. Viscosidad se ve afectada por mohos. Levaduras unicelulares que forman cadenas, reproduccin asexual y sexual (asexual por gemacin = ms comn), aerobios, pH neutro o ligeramente cido. Reproduccin asexual Modo de reproduccin en la que descendencia surge de un solo padre y hereda genes de ese padre. Copias genticamente exactas. Esporas clulas a partir de las cuales crece un nuevo organismo (protistas, plantas, bacterias y hongos) Gemacin descendencia crece en cuerpo de padre (levaduras) Fisin binaria clula se divide en 2 clulas separadas. Copia de DNA, clula se divide a la mitad. (bacterias) Regeneracin organismo pierde parte de s, donde crece un reemplazo. Reproduccin sexual Mitosis ocurre en clulas eucariotas precede a la divisin celular, reparto equitativo del material hereditario caracterstico (ADN) Meiosis forma de reproduccin celular, en glndulas sexuales para produccin de gametos. Clula diploide experimenta dos divisiones sucesivas para formar cuatro clulas haploides.

Presentacin 3: Factores que afectan el crecimiento microbiano Los factores son: Temperatura o Mnima, ptima, mxima. Mesfilos (20-45C), psicrfilos (0-20C), termfilos (50-80C), hipertermfilos (>60C) o Mx y min son funcin de metabolismo celular. Cada especie tiene sus propios valores. o Afecta afinidad directamente. pH o 6-8 pH externo, aunque interno se mantenga neutro. Afecta las protenas o Productos del metabolismo pueden cambiar el pH. Usar buffers. disponibilidad de agua o actividad de agua: intensidad con la que se asocia el agua con diferentes constituyentes no acuosos y slidos o medida del estado de energa del agua o aw presin de vapor del agua en una sustancia dividida por la del agua pura a la misma temperatura. o Aumenta directamente con la temperatura. Sustancias con alta a w soportan ms microorganismos o Factor ms importante para el crecimiento o Influye en: obscurecimiento no enzimtico, oxidacin lpidos, degradacin vitaminas, reacciones enzimticas, desnaturalizacin de protena, gelatinizacin de almidn y retrogradacin de almidn. presin osmtica o dos soluciones estn separadas por barrera semipermeable (disolvente s, soluto no) no es intrnseca o Es la presin que se debe aplicar a una solucin para evitar el flujo del agua hacia el interior, a travs de una membrana semipermeable. o Citoplasma posee osmolaridad ligeramente superior al entorno, para que entre agua Medios hipotnicos (aw medio > aw citoplasma), se infla = lisis Medios hipertnicos (aw medio < aw citoplasma), se desinfla = plasmlisis o Transporte de solutos (permiten aumentar la concentracin de soluto soluble, dentro de la clula) Bombeo inico Biosntesis molculas orgnicas osmticamente activas Bombeo sustancias osmoprotectoras o Transporte activo: antiporte = se mueve encontra del gradiente

Tipos de organismos: osmfilos (alta concentracin de soluto), osmotolerante (toleran altas concentraciones de solutos), halfilos (prosperan en alta concentracin de sal), halotolerante (toleran altas concentraciones de sal), barfilos (prosperan en alta presin), barotolerante (toleran alta presin). gases disueltos o O2: Aerobios = obligatorios, facultativos, microaerfilos Anaerobios = aerotolerantes, obligatorios Condiciones culturales que alcanzan masa celular mxima pueden NO ser las que maximicen produccin de metabolismo Respiracin anaerbica = proceso de oxidorreduccin de monosacridos donde el O 2 no es el aceptor terminal de electrones, sino se usa sulfato o nitrato. Se genera menos energa. Fermentacin = proceso catablico de oxidacin incompleta que no requiere oxgeno y el producto final es un compuesto orgnica.

Presentacin 4: Requerimientos nutricionales de los microbios Las bacterias se componen de: 70% agua, 15% protenas. Macroelementos: C, O, N, H, P, S, K, Mg, Ca, Fe. Microelementos: Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu, Si Nutriente esencial: cualquier sustancia que se debe proporcionar a un organismo ya que no puede biosintetizarlo. Compuestos orgnicos fuentes de C, H y O, energa, electrones para redox. Tipos de organismos Carbn Energa

Electrones litotrofos (sustancias auttrofos (CO2) fottrofos (luz) inorgnicas reducidas) heterotrofos quimiotrofos organotrofos (materia (materia orgnica) (materia orgnica) orgnica) autotrofia fotolitotrofica heterotrofia fotoorganotrofica autotrofia quimiolitotrofica heterotrofia quimioorganotrofica

Mixotrofos = pueden alterar patrones metablicos en respuesta al medio ambiente. Factores de crecimiento compuestos orgnicos componentes celulares esenciales que no pueden ser producidos. Aminocidos Purinas y pirimidinas Vitaminas compuestos orgnicos que constituyen la totalidad o parte de los cofactores enzimticos. Absorcin de nutrientes Especficos, capaces de transportar sustancias en contra de gradiente, capaces de pasar nutrientes por membrana semipermeable Difusin pasiva mayor a menor concentracin, velocidad depende de concentracin Difusin facilitada protenas transportadoras (permeasas), gradiente de concentracin impulsa, no consume energa Transporte activo en contra de gradiente de concentracin, requiere de consumo de energa metablica Medio de cultivo para fermentacin requiere de: agua, oxgeno, fuente de energa, fuente de carbono, fuente de nitrgeno y micronutrientes para crecimiento. Oligoelementos, antiespumantes, buffers, factores de crecimiento, precursores, inhibidores, inductores, quelantes

Presentacin 5: Metabolismo microbiano La ingeniera metablica estudia el anlisis y modificacin de rutas metablicas (reacciones de transformacin de molculas de un tipo en otro, importndose la concentracin de molculas y velocidades de cambio). Busca comprender mejor y modelar el metabolismo celular de manera cuantitativa. El metabolismo es la suma de todas las transformaciones qumicas que ocurren en una clula u organismo a travs de reacciones catalizadas por enzimas. CATABOLISMO = descomposicin de nutrientes, ANABOLISMO = sntesis de materiales celulares. Las enzimas pueden ser secretadas al medio (exoenzimas) o trabajar dentro del organismo (endoenzimas). Enzimas: son catalizadores biolgicos y actan sobre una sustancia especfica (sustrato) y cataliza una sola reaccin. Tiene 3D y un sitio activo (sitio que interacta con el sustrato). Formacin de complejo enzima-sustrato permite reducir energa de activacin. La funcin de las enzimas es acelerar reacciones bioqumicas a una temperatura compatible con el comportamiento de la clula. Todos los metabolitos microbianos se pueden clasificar por tres principios: 1. Cmo el organismo obtiene en carbono para la sntesis de masa celular (auttrofos, hetertrofos, mixtrofos). 2. Cmo el organismo obtiene los electrones que son utilizados en la conservacin de la energa o en reacciones biosintticas (littrofo = inorgnicos, organtrofo = orgnicos) 3. Cmo obtiene energa para vivir y crecer (quimitrofos, fottrofos). Descomposicin de polmeros como celulosa, quitina o lignina necesitan de varios organismos para descomponerlos (mineralizacin) Metabolismo microbiano hetertrofo (procariotas): gluclisis para azcares, TCA para degradar acetato (produce ATP, NADH y FAHD2). Metabolismo se comprende de: 1. Reacciones de mantenimiento (suministran energa, electrones y precursores metablicos) 2. Reacciones de anabolismo (biosntesis, usan la energa) En eucariotas y bacterias, energa se obtiene de la sntesis de ATP, y para generarlo pueden hacerlo por: 1. Fosforilacin a nivel sustrato (fermentaciones) 2. Fosforilacin oxidativa (respiraciones) 3. Fotofosforilacin (fotosntesis) Respiracin celular: Etapa Gliclisis Descarboxilacin Ciclo Krebs Cadena transportadora de eEntra 1 glucosa 2 piruvatos + 2 CoA 2 AcetilCoA 10 NADH, 2 FADH2 Respiracin celular Sale ATP 2 piruvatos 2 2 Acetil 0-2 CoA CO2 2 10 NAD+, 2 FADH+ 34 NADH 2 2 6 0 FADH2 0 0 2 0 Lugar Citoplasma Mitocondria Mitocondria Mitocondria Mem.int.

Una reaccin redox exergnica puede formar un compuesto rico en energa o formar un gradiente de concentracin y/o carga elctrica a ambos lados de una membrana. Fosforilaciones: 1. Fosforilacin a nivel sustrato son escalares (no influye la situacin espacial dentro de la clula), reacciones que transfieren grupo qumico (fosfato) y son catalizadas por enzimas solubles en citoplasma, hay intermediarios metablicos en el que el fosfato est unido covalentemente. Se acopla a proceso metablico por fermentacin. a. Sustrato orgnico reducido es catabolizado para producir ATP y genera equivalentes de reduccin NADH e intermediarios oxidados de ruta catablica. EL aceptor final de electrones es compuesto orgnico endgeno producido en la ruta de fermentacin. RENDIMIENTO: bajo, debido a poca diferencia de energa entre donador y aceptor. b. En fermentaciones, parte del C se excreta como producto de fermentacin y parte se usa para reacciones biosintticas.

2.

Fosforilacin oxidativa es vectorial (orientado en el espacio), ligados a una membrana, tiene secuencia ordenada de transportadores de electrones que se oxidan/reducen reversiblemente (cadena transportadora de electrones). No hay intermediarios y se realiza por gradiente electroqumico de protones. a. Respiracin = obtiene energa por oxidacin de sustratos reducidos. Las coenzimas reducidas (NADH, FADH) transfieren electrones a aceptor final oxidado a travs de cadena transportadora de electrones. b. Clases de molculas transportadores: flavoprotenas, citocromos, coenzima Q o ubiquinona c. La transferencia se da ordenadamente en la direccin de mayor potencial redox positivo, que se traduce a potencial electroqumico de protones que origina ATP. d. Mecanismo de fosforilacin basado en teora quimiosmtica de Mitchell. e. Ocurre en membrana citoplastmtica (procariotas) y en crestas mitocondriales (eucariotas) f. Membrana es impermeable a protones, forma gradiente

La captacin de energa por microorganismos quimitrofos ocurre por captacin de energa de un sustrato orgnico por oxidacin, luego una reduccin de un aceptor de electrones y todo acoplado a un sistema de fosforilacin de ADP. Fosforilacin a nivel sustrato en fermentaciones Gliceraldehdo-3-P a 1,3-difosfogliceraldehido a 3-fosfogliceraldedico. GLUCLISIS 1. Fase preparatoria 1 Glucosa a 2 Gliceraldehdo-3-fosfato (consume 2 ATP) 2. Fase de conservacin de la energa 2 GP a 2 Ac. Pirvico (genera 4 ATP) y se reducen 2 NAD+ a NADH. CICLO DE KREBS Serie de reacciones en la que se libera la energa qumica potencial de la AcetilCoA a travs de oxidaciones y reducciones hacia coenzimas portadoras. Primero, cido pirvico a AcetilCoA (descarboxilacin) y genera NADH. AcetilCoA se junta con compuesto de cido oxalactico (4 C) y forma cido ctrico. Ocurren reacciones de descarboxilacin y de redox. Productos ms importantes: NADH y FADH2 Lpidos: catabolizan a travs de oxidacin beta. Produce unidades de 2C vinculados con CoA. Siguen gluclisis y TCA. Protenas: transaminacin, descarboxilacin y deshidrogenacin convierten aminocidos para poder ser catabolizados a sustancias que ingresan a gluclisis o TCA. MITOCONDRIA Organelo cubierto por membrana. Es la planta de energa celular porque transforma ATP en energa. Sus partes son: membrana externa, espacio intermembrana, membrana interna, crestas y matriz. Funciones: redox en fosforilacin oxidativa, genera ATP sintetasa, protenas transportadoras regulan pasos metablicos, maquinaria de importacin de protenas, fusin y fisin de protenas mitocondriales.

Presentacin 6: Etapas de crecimiento celular Crecimiento microbiano puede ser aumento en tamao de poblacin o aumento en masa de poblacin. Tienden a aumentar ambas al mismo tiempo. Para bacterias, nmero de clulas y masa de poblacin aumentan con el tiempo, el crecimiento individual de las clulas va a travs de un ciclo en el que masa celular aumenta y disminuye. Aumento en el nmero de clulas consecuencia inmediata de divisin celular (fisin binaria) Aumento de masa celular duplican su tamao entre divisiones. Producto de anabolismo o Aumento de masa es consecuencia de anabolismo, y para que ocurra debe estar en entorno propicio. El tamao promedio de clulas tiende a permanecer constante. Crecimiento bacteriano se reproducen por fisin binaria (produce 2 clulas idnticas). Clula aumenta tamao, duplica componentes, divisin celular invaginacin. Bacterias NO tienen distribucin de edad grande. La edad se mide por divisiones. Crecimiento de levaduras eucariotas, se reproducen por gemacin. Volumen aumenta, se produce brote, crecen ambos, yema se separa en clula ms pequea, hija crece ms rpido hasta alcanzar tamao de madre. Madre e hija poseen diferentes velocidades de crecimiento y su superficie celular es diferente. Crecimiento micelial mohos crecen por elongacin de cadena hifa. Hifas entrelazadas = micelio. Pueden formar pellets que inhiben transferencia de masa O2 ms importante. Clulas ms jvenes (mejor metabolismo) se encuentran en puntas.

Fisin binaria: divisin celular procariota Tiempo de generacin o tiempo de duplicacin es el tiempo que tarda una bacteria para hacer una fisin binaria, a partir de su ltima divisin. CRECIMIENTO Puede ser estudiado desde: Nivel celular o del organismo interesa procesos celulares (metablicos y de regulacin) se busca aumento en longitud y volumen, la divisin y replicacin. A nivel poblacin aumento del nmero de individuos o tamao de poblacin. Se modela con ecuaciones matemticas. o Es el estudio de la propagacin. Modelaje Una sola clula se divide en 2 cada 3 horas (tiempo de duplicacin o de generacin, t d). El tiempo es variable INDEPENDIENTE y nmero de clulas DEPENDIENTE. No = nmero de clulas iniciales. v = 1/td = Para especie determinada de bacteria, el tiempo de duplicacin es caracterstica inmutable. = velocidad de crecimiento especfica (ln2/td). FASE DE CRECIMIENTO CELULAR 1. Fase de latencia o adaptacin (lag) adaptacin y aclimatacin (aumenta MASA tamao sin dividirse) 2. Fase de aceleracin crecen a su nivel ptimo 3. Fase exponencial (log) crecimiento acelerado (mximo crecimiento), poblacin se duplica en nmero cada tiempo de generacin, no hay cambio en masa celular promedio. Tamao es pequeo 4. Fase de desaceleracin nutrientes se agotan o productos txicos se secretan 5. Fase estacionaria crecimiento celular neto es conteo total aumenta, recuento es constante. 6. Fase de muerte (disminucin exponencial) mueren por lisis. Presentacin 7: Cintica del crecimiento microbiano Presentacin 8: Tecnologa de enzimas (protenas)