Cintica de la mejora de la 1,4-alfa-D-glucano biosntesis glucohidrolasa de un nuevo aislado de Aspergillus oryzae IIB-6 y el parmetro anlisis de la importancia del diseo

2-factorial
Bilqees Ftima 1 y Sikander Ali 1

(1) Instituto de Biotecnologa Industrial (IIB), GC Universidad Lahore, H.30, ST.7, Tezab Ahata, Lahore-39, Pakistn Bilqees Ftima Email: fatima_gcu@yahoo.com Sikander Ali (autor correspondiente) Email: alisbiotech@yahoo.com Recibido: 14 de junio 2012Aceptado: 02 de octubre 2012Publicado en lnea: 06 de octubre 2012

Abstracto
Diecisis cultivos de moho diferentes viz. Aspergillus, Alternaria, Arthroderma, Trichoderma, Fusarium, Penicillium, Rhizopus y Chochliobolus fueron aisladas de las muestras de suelo de Qatar por el mtodo de dilucin en serie. La proyeccin inicial de los aislamientos se realiz mediante la seleccin de colonias iniciales que muestran zonas relativamente grandes de la hidrlisis del almidn en placas de agar nutriente.Los aislados se sometieron entonces a seleccin secundaria por fermentacin sumergida (SMF). El 1,4--D-glucano glucohidrolasa (GGH) actividad oscilaba desde 1,906 hasta 12,675 U / ml / min. El rendimiento del producto fue analizado en funcin de la morfologa del micelio, el nivel de la biomasa y el contenido de protenas. El aislado de Aspergillus oryzae IIB-6, que dio la mxima produccin de enzima se incub en medio M3 que contiene 20 g / l de almidn, 10 g / l de lactosa, 8,5 g / l de extracto de levadura, 6 g / l de licor de maz (CSL), 1,2 g / l MgSO4 0,7 H 2 O, 1,3 g / l NH 4 Cl, 0,6 g / l de CaCl2 0,2 H2O, pH 5 a 30 2 C y 200 rpm. Sobre la base de las variables cinticas, notablemente Q p (0,058 0,01 U / g / h), Y p / s (0,308 0,03 ab U / g) y q p (0,210 0,032 abc U / g de hongos biomasa / h ), A. oryzae II B-6 se encontr que era un productor de hiper GGH (LSD 0,0345) en comparacin con A. kawachii II B-2. Se observ una mejora notable en la actividad enzimtica de ms del 30% (13.917 1,01 U / ml / min) cuando los parmetros del proceso a saber. condiciones culturales (pH 5, perodo de incubacin 72 h) y los requisitos nutricionales (6 g / l de CSL, 9,5 g / l de extracto de levadura, 10 g / l de almidn, 20 g / l de lactosa) se optimizaron adicionalmente usando una 2-factorial Plackett- diseo Burman. Los trminos modelo resultaron ser altamente significativa (SA, p 0.05), lo que indica la utilidad potencial de la cultura (dof ~ 3). Palabras clave Aspergillus oryzae Batch-cultura del diseo 2-factorial cultura Glucoamilasa Cintica Mould Abreviaturas GGH 1,4--D-glucano glucohidrolasa IIB Instituto de Biotecnologa Industrial CSL Licor de maz SA Altamente significativa, dof, grado de libertad SmF

Fermentacin sumergida PDA Agar de dextrosa de patata DCM Masa celular seca DNS cido dinitrosaliclico ANOVA Anlisis de la varianza.

1 Antecedentes
La enzima 1,4--D-glucano glucohidrolasa (GGH, EC 3.2.1.3) es una exo-amilasa que escinde tanto -1, 4 y -1, 6 enlaces glicosdicos, produciendo -D-glucosa de la extremo no reductor de la cadena de polmero de almidn. GGH degrada el almidn en glucosa en tericamente 100% rendimientos. La velocidad de reaccin disminuye con la disminucin de la longitud de cadena del sustrato dextrina. La enzima tambin es capaz de catalizar una inversa de la reaccin normal de la hidrlisis para producir principalmente maltosa y la isomaltosa ( Rangabhashiyam et al. 2011 ). Tiene amplia gama de aplicaciones en las industrias para la produccin de dextrosa, jarabe de maz alto en fructosa (HFC) y etanol ( Rubinder et al. 2002 ). Con el advenimiento de las nuevas fronteras de la biotecnologa, el espectro de aplicaciones de enzimas se ha ampliado en muchos otros campos, como la qumica clnica, medicinales y de anlisis, y en la industria textil, alimentos, detergentes, papel, el respaldo, el vino, la cerveza, la destilacin y de qumica fina industrias. Anteriormente, se consideraba que los materiales vegetales y animales fueron las mejores fuentes de enzimas. Hoy en da, sin embargo, las enzimas microbianas son cada vez ms importantes por sus ventajas tcnicas y econmicas ( Kelly y Fogarty 1976 ; Kumar y Satyanarayana 2009 ). Un grupo diverso de microorganismos ha sido reportado para producir la enzima. Sin embargo, enzima comercial tradicionalmente ha sido producido mediante el empleo de hongos filamentosos, ya que secretan grandes cantidades de enzima extracelular. La produccin de una enzima activo depende de la seleccin de un molde adecuado para el propsito. Hongos GGH contiene de unin tanto de almidn y dominios de unin catalticos, siendo el primero responsable de la actividad en almidn crudo ( Karaoglu y Ulker 2006 ). El suelo es conocido por ser un repositorio de productores amilasa fngica; Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium y Rhizopus spp. se han aislado y caracterizado. Sin embargo, ni siquiera un solo informe global ha aparecido en la literatura disponible se trata de la cintica de crecimiento, la morfologa del micelio y anlisis de la importancia paramtrica a travs del diseo factorial estadstico. Adems, tambin es imprescindible para detectar hongos til para la fabricacin del producto deseado ( Oshoma et al. 2010 ). Los mtodos de cultivo influyen en gran medida la produccin y las propiedades de la enzima. Los mtodos ms comunes de la produccin implican ya sea en estado slido (SSF) o fermentacin sumergida (SMF).Tradicionalmente, GGH ha sido producido por los procesos posteriores como la produccin de enzimas fue aproximadamente 5 veces mayor que con el anterior ( Pandey et al. 2000 ). Las condiciones de fermentacin como el perodo de crecimiento, la temperatura, el pH, la agitacin y la aireacin y la composicin del medio afectan en gran medida la produccin de enzimas bajo SMF. En SmF, la morfologa de los microorganismos filamentosos vara entre dos formas extremas, pellets y filamentos libres, dependiendo de las condiciones de cultivo y el genotipo de la cepa. De acuerdo con informes anteriores, la morfologa del micelio es crucial para el proceso de fermentacin, no slo en relacin a la forma de las hifas s mismos y la agregacin en terrones microscpicos (micro-morfologa), sino tambin en la forma peletizada de crecimiento (macro-morfologa ).Sin embargo, informes sobre la morfologa preferida son a menudo contradictorios, ya que cada una de las dos formas extremas - Bolitas vs filamentos - tiene sus propias caractersticas en relacin con la fisiologa celular, cintica de crecimiento, el consumo de nutrientes y la reologa de caldo, que puede ser considerado ya sea como ventajas o como inconvenientes ( Clementi y Rossi 1986 ; Papagianni 2004 ). El presente estudio se ocupa de la deteccin de cultivos de moho, aislados del suelo, para la produccin y la optimizacin de las condiciones culturales de GGH est llevando a cabo de forma asptica a partir de las especies seleccionadas y sus cambios morfolgicos. El diseo experimental Plackett-Burman 2-factorial se utiliz para identificar an ms las condiciones de cultivo de lotes importantes que influyen en la productividad de la enzima.

2 Resultados y discusin

En los presentes estudios, se aislaron y se seleccionaron para la produccin de GGH bajo SMF (Tabla diecisis cultivos de moho suelo habitado diferentes 1 ). La actividad de la enzima y DCM oscilaron desde 1,906 hasta 12,675 U / ml / min y 7,236 a 15,803 g / l, respectivamente. La actividad enzimtica mxima (12.675 1 U / ml / min) se obtuvo con IIB-6 y se identific como Aspergillus oryzae. Este valor de la enzima vari significativamente (p 0.05) que las otras especies, excepto A. kawachii (IIB-2). El DCM fue 13,045 1,413 g / l, mientras que el contenido de protena se registr a ser 73.343 1.522 g / ml. Por lo tanto, el A.aislamientos oryzae II B-6 y A. kawachii IIB-2, se seleccionaron ser productores de hiper GGH para la comparacin cintica. Una morfologa del micelio diversificada se not con sin embargo, otras culturas A.oryzae II B-6 exhibi tipo mixto de micelios. El rendimiento del producto se analiz independiente de la morfologa del micelio o tamao de los grnulos, la concentracin de biomasa y el contenido de protena segn lo informado por Kelly y Fogarty (1976) . Razzaque y Ueda (1978) trabajaron en Aspergillus spp. y tambin se seleccionaron una cepa de A. oryzae RIB-40 como el mejor productor GGH. Del mismo modo, diez cepas de A. flavus, dos cepas de A. Tamarii y uno de cada A. niger y A.awamori resultaron ser prometedor productor entre todos los aislamientos de suelo de bosque Kusmi ( Morya y Yadav 2009 ).Catorce Aspergillus aisladas de suelo fueron elegidos como los productores hiper por Abdalwahab et al.(2012) . Tabla 1 Proyeccin de diferentes cultivos de moho para la produccin GGH en fermentacin sumergida *

Culturas Mould

El conteni do de proten a (g / ml)

La activida d enzimt ica (U / ml / min)

DC M (g / l)

Morfolog a micelial **

Bibliogr afa Citada

Las cepas aisladas

Codifica cin

Aspergillussp p.

II B-1

30 0,997

8,831 0,974

13.1 31 0.61 2 12.2 43 0.92 6 7,23 2 0,23 1 12.5 23 0.82

Masa rechonc ha

Papagia nni (2004)

Aspergillus kawachii

II B-2

30.34 1 0.574

12 0,987

Grande grnulos

Shoji et al.(2007 ) Norouzi an et al. (200 6) Kelly y Fogarty (1976)

SppChochlio bolus.

II B-3

64.67 2 0.521 73.67 5 0.525

2,341 0,936 4,343 0,986

Gelatino so

Aspergillus niger

IIB-4

Viscoso

Culturas Mould

El conteni do de proten a (g / ml)

La activida d enzimt ica (U / ml / min)

DC M (g / l)

Morfolog a micelial **

Bibliogr afa Citada

Las cepas aisladas

Codifica cin

4 12.1 61 0.63 2 13.0 44 0.41 3 10.5 23 0.15 1 15.8 12 0.14 5 14.3 43 0.15 4 12.8 31 0.11 5 16,3 4

Aspergillus flavus.

IIB-5

16.67 1 0.572

11.523 0.525

Mezclad o

( Gomes y col. 2005)

Aspergillus oryzae

II B-6

73.34 3 0.524

12.673 0.998

Mezclad o Grnulo s interme dios

Kassim (1983) Norouzi an et al. (200 6) Karaogl uy Ulker (2006) Karaogl uy Ulker (2006)

Arthrodermas pp.

II B-7

61.66 1 0.521

1,902 0,523

Fusarium oxysporum

II B-8

29 0,997

2,724 1,082

Bellas bolitas

Trichoderma viride

II B-9

12 0,996

1,948 1,309

Masa rechonc ha

Aspergillus fumigatus

II B-10 II B-11

16.34 2 0.522 16.67 3

3,839 0,521 5,343

Bellas bolitas Masa rechonc

Goto et al.(1998 ) Norouzi an et

Alternaria

Culturas Mould

El conteni do de proten a (g / ml)

La activida d enzimt ica (U / ml / min)

DC M (g / l)

Morfolog a micelial **

Bibliogr afa Citada

Las cepas aisladas

Codifica cin

alternata

0.521

0,997

0,12 3 13.3 65 0.15 1 13.8 45 0.12 3

ha

al. (200 6) Morita et al.(1998 ) Nandi y Mukherj ee (1989) Naraya nan y Ambedk ar (1993) Bertolin et al.(2003 ) Michele na y Castillo (1984)

Rhizopus spp.

II B-12

73 0,641

10.185 0.523

Viscoso

Penicillium italicum

IIB-13

143 0.998

2,563 0,524

Viscoso

Candidus Aspergillus

II B-14

12.67 2 1.052

7,943 0,932

10.2 32 0.22 1 8,63 4 0,15 2 9,82 3 0,16 1

Bellas bolitas Grnulo s pequeo s Grnulo s pequeo s

Aspergillus awamori

IIB-15

10 0,997

4,684 0,975

Foetidus Aspergillus

II B-16

10 0,993

5,362 0,521

* La incubacin se llev a cabo durante 72 h con una intensidad de agitacin de 200 rpm a temperatura y pH 30 2 C y 5, respectivamente. ** Fundacin de hongos macro-morfologa se han establecido en el apartado de mtodos. Bares Y-de error indican la desviacin estndar ( SD) entre las tres repeticiones paralelas. Los valores de cada conjunto difieren significativamente a p 0.05. Los parmetros cinticos a saber. tasa de crecimiento especfico (), parmetros de formacin de producto (Q p, Y p / s, Y p / x, q p) y variables de consumo de sustrato (Y x / s, Q s, q s, Q x) se compararon para dos Produccin de

hiper cepas, es decir, A. kawchii IIB-2 y A. oryzae II B-6 (Tabla 2 ). La comparacin de Q s (g de biomasa / L / h) para la productividad de la enzima demostrado que aislar IIB-6 tiene un valor ms alto para la velocidad volumtrica de consumo de sustrato (Q s = 0,268 0,03 g de una / l / h) que el IIB-2 (0,212 0,021 aC g / l / h). A varias veces (~ 10) la mejora en trminos de productividad volumtrica enzima se observ con el anterior en todos los tipos examinados. Aunque IIB-2 consigue un valor ms alto (Y x / s = 1,124 0,221 g ab DCM / g) que IIB-6 (1,065 0,113 g bc DCM / g), sin embargo la tarde demostr una mejora significativa (p 0.05) en la tasa volumtrica de formacin de producto. Adems, cuando ambos de los aislamientos de molde se monitorizaron para la constante de velocidad especfica, II B-6 dio valores ms altos para q p (mejora superior al 45%). Por lo tanto, A. oryzae IIB-6 mostr un total de 5 a 8 veces en la mejora de los valores de Q p, Y p / x, Y p / s y q p sobre el A. kawchii IIB-2 (LSD ~ 0.034) que es altamente significativa (HS) y esto fue apoyado por los hallazgos reportados por ( PIRT 1975 ). Goto et al. (1998)encontraron que los parmetros nutricionales influyen en la tasa de consumo de sustrato, tasa de crecimiento especfico y la posterior productividad GGH. Los valores cinticos de la enzima demuestran que GGH es una exo-en lugar de un modo endo, ya que tiene mayor afinidad por el almidn en lugar de otros polmeros oligo-o polisacridos. Tabla 2 Comparacin de diversos parmetros cinticos para la productividad GGH por A. kawachii (IIB-2) yA. oryzae (IIB-6) a las 72 h de fermentacin *

Los parmetros cinticos

La produccin de Hyper aislados fngicos II B-2 II B-6

Tasa de crecimiento especfico (h

-1)

0,212 0,121

ab

0,196 0,023

Variables de produccin de enzimas Q (U / ml / h)

p

0.032 0.022

cde

0,058 0,012 0,308 0,031 2,455 0,552 0.210 0.032

Y Y
p

p/s

(U / ml / g) (U / ml / g)

0.124 0.0122 1.625 0.051 0.008 0.002

def

ab

p/x

defg

q (U / g de biomasa fngica / h) Variables de consumo de sustrato Y

X/s

de

abc

(g biomasa fngica / g)

1.124 0.23

ab

1.065 0.112
aC

aC

Q (g / l / h)
s

0.212 0.022 0.125 0.012 0.142 0.021

0,268 0,032 0,195 0,051 0,216 0,021

q (g / g de biomasa fngica / h)
s

bcd

ab

Q (g biomasa fngica / l / h)
x

aC

Los parmetros cinticos

La produccin de Hyper aislados fngicos II B-2 II B-6

Diferencia mnima significativa (DMS) <p> Nivel de significacin

0.087 S

0.034 SA

* Los parmetros cinticos: (h -1) = tasa de crecimiento especfico, Q p = U / ml / h, / s = U / ml / g de sustrato consumido, Y p / x = U / ml / g de biomasa fngica form Y p , Q p = U / g de biomasa de hongos / h, Y x / s = g biomasa fngica / g sustrato utilizado, Q s = g sustrato consumido / l / h, q s = g sustrato consumido / g de biomasa fngica / h, Q x = g biomasa fngica form / L / h. SA denota "muy significativo", mientras que S representa valores "significativos". LSD representa 'la mnima diferencia significativa'. <p> es de probabilidad. Indica desviacin estndar entre los tres repeticiones paralelas. Los valores designados por letras distintas en cada fila difieren significativamente a p 0.05. Entre los diversos medios de fermentacin, la produccin GGH mxima (12.609 0.899 U / ml / min, el LSD ~ 2.651) se obtuvo cuando se utiliz M3 (Tabla 3 ). Fue debido al hecho de que la produccin de enzima est fuertemente influenciada por las fuentes de carbono y nitrgeno orgnicos segn lo informado porBertolin et al. (2003) . Adems, M3 tiene una cantidad adecuada de fuentes de C / N en comparacin con M1, M2, M4, y M5. El contenido de protena y DCM eran 73,287 1,521 g / ml (LSD ~ 0.267) y 12.967 0.912 g / l (LSD ~ 1,723), respectivamente. Se observaron sedimentos miceliales mezclados en el caldo. Tabla 3 Evaluacin de medio de fermentacin para la produccin de GGH por A. oryzae IIB-6 en fermentacin sumergida *

Med ios (g / l) **

PH inic ial

Disolven te (1-L)

El conte nido de prote na (g / ml)

La activid ad enzim tica (U / ml / min)

DC M (g / l)

Morfolo ga micelial

Bibliografa Citada

M1

4.6

HCl 0,01 N

27.67 1 0.521

3,553 0,353

5,54 1 0,53 2 11.6 12 0.87 2 12.9 64 0.98 5

Bellas bolitas

Shoji et al.(2007)

M2

5.5

Desioni zada H O
2

63.54 4 0.998

9,661 0,713

Grande grnulo s Grnul os mezcla dos

Papagianni (2004) Michelena y Castillo (1984) ;Mali k et al.(2011)

M3

Destila da H O
2

73.28 4 1.523

12.62 3 0.854

Med ios (g / l) **

PH inic ial

Disolven te (1-L)

El conte nido de prote na (g / ml)

La activid ad enzim tica (U / ml / min)

DC M (g / l)

Morfolo ga micelial

Bibliografa Citada

M4

7.2

Tamp n fosfato Tamp n de acetato de sodio

17.67 1 0.986

1,852 0,734

3,45 6 0,63 4

Grnul os interme dios

Singh y Soni (2001)

M5 LS D

6.4

53.33 4 0.721

7,171 0,532

8,61 3 0,99 8 1.72 3

Bellas bolitas

Morita et al.(1998) ;No rouzian et al. (2006)

0.267

2.651

* La incubacin se llev a cabo durante 72 h con una intensidad de agitacin de 200 rpm a temperatura y pH 30 2 C y 5, respectivamente. ** Composicin medios se da en la seccin de mtodos. Los constiuents de medio optimizado (M3) se disearon ms en nuestros laboratorios en el IIB y han sido previamente bien explotado. indican la desviacin estndar (SD) entre las tres repeticiones paralelas. Los valores de cada conjunto difieren significativamente a p 0.05. Durante el tiempo de estudio (Figura 1 ), la produccin de la enzima permaneci muy baja a las 12 h de incubacin (0.709 0.989 U / ml / min) y se demostr que la concentracin de la enzima se correlaciona con el crecimiento del hongo ( Hyland y Clayton 1992 ). Se aument al aumentar el perodo de incubacin, pero hasta cierto punto. La produccin de enzimas mxima (13.227 1.521 U / ml / min, el LSD ~ 2.268) se consigui 72 h despus de la inoculacin. Era aproximadamente 18.66 veces mayor que la actividad de la enzima obtenido a las 12 h. El contenido de protena y DCM fueron 76 1,042 g / ml (LSD ~ 2.184) y 15.623 1.154 g / l (LSD ~ 0,093), respectivamente. La morfologa micelial se encontr como pequeas bolitas. Del mismo modo, Morita et al. (1998) obtiene la mxima produccin de enzima en 72 h de fermentacin. La actividad de la enzima se redujo gradualmente cuando perodo de incubacin se prolong ms all del ptimo, que era debido al agotamiento de los nutrientes y la acumulacin de otra por productos tales como proteasas que actuaban en los dominios de unin de almidn que causa que la enzima pierde su actividad en el caldo fermentado. Abdalwahab et al. (2012) reportaron que A. awamori, A. niger y A. Tamarii han mostrado una mxima produccin de la enzima despus de 48 h, mientras que A. terreus mostr un rendimiento mximo de produccin de enzimas a las 72 h. En otro estudio, perodo de incubacin de 96-120 h fue optimizado por Kumar y Satyanarayana (2007) .

Figura 1 Evolucin temporal de produccin GGH por A. oryzae II B-6. Las incubaciones se llevaron a cabo a 200 rpm (pH 5) y la temperatura de 30 2 C. Bares Y-de error indican la desviacin estndar ( SD) entre las tres repeticiones paralelas. - - La actividad enzimtica (U / ml / min), - - DCM (g / l),--total contenido de protena (g / ml). Actividad GGH no fue alentador a pH 4 (5.911 1.031 U / ml / min) ser debido al hecho de que un pH cido era txico para los micelios de A. oryzae que resulta en la inhibicin de la produccin GGH. The maximum enzyme production (13.1521.021 U/ml/min) was achieved when initial pH was adjusted to 5 (LSD~1.715) and varied significantly than other values (p0.05) as depicted in Figure 2 . Mixed mycelia were found in the flask. The protein content and DCM were 781.723 g/ml (LSD~2.889) and 14.9221.061 g/l (LSD~0.507), respectively. Similarly, previous workers also optimized pH 5 for enzyme production ( Mishra and Das 2002 ).Abdalwahab et al. (2012) was found optimum pH for maximum enzyme production to be 6.0 for all isolates (A. awamori , A. niger and A. tamarii ) except for A. terreus which gave maximum production at pH 4.0. A sharp decline in enzyme activity (7.1831.201U/ml/min) was observed at pH 6.5. It was due to the fact that the mould required slightly acidic pH for its growth and subsequent enzyme production as reported earlier byBertolin et al. (2003) .

Figura 2 Effect of initial pH on GGH production by A. oryzae IIB-6. Incubations were carried out for 72 h at 302C and 200 rpm. Y-error bars indicate standard deviation (sd) among the three parallel replicates. -Enzyme activity (U/ml/min), -- DCM (g/l), -- Total protein content (g/ml). The effect of different concentrations of CSL and yeast extract on GGH production are shown in Figure 3 . Maximum production was observed to be 13.2631.501 U/ml/min when 6 g/l CSL was used in the fermentation medium (LSD~7.006), which was nearly 3.02 fold higher than control. Small pellets were observed in the fermented broth. The protein content and DCM were 74.3421.521 g/ml (LSD~5.656) and 12.9741.051 g/l (LSD~0.126), respectively. Kassim (1983) used 30 g/l CSL in the fermentation medium. Therefore, our finding is economically more significant. In contrast to our study, Michelena and Castillo (1984)optimized only 0.8 g/l CSL for better enzyme production. Cherry et al. (2004) who reported that A. fumigatusproduces high amylase activity with yeast extract. However, Abdalwahab et al. (2012) found that yeast extract affect negatively enzyme production by A. tamarii and A. awamori while with A. niger and A. terreus it stimulate the production. In present study, the maximum production (13.4891.601 U/ml/min, LSD~4.091) was obtained when 9.5 g/l was added into the fermentation medium by A. oryzae . The mycelial morphology was observed as large pellets. Protein content and DCM were found to be 81.9411.501 g/ml (LSD~1.778) and 15.6431.115 g/l (LSD~0.175), respectively. Similarly, Kumar et al. (2007) observed maximum enzyme production when 10 g/l yeast extract was used in fermentation medium. Sporangiospores secreted 41% higher GGH titres in shake flasks when 20 g/l yeast extract was used ( Oshoma et al. 2010 ). However,Nandi and Mukherjee (1989) reported that yeast extract (5 g/l) stimulates the production of enzyme.

Figura 3

Effect of different concentrations of CSL and yeast extract as nitrogen sources on GGH production by A. oryzae IIB-6. Incubation were carried out for 72 h (200 rpm) at 302C and pH 5. Y-error bars indicate standard deviation (sd) among the three parallel replicates. -- Enzyme activity (U/ml/min), -- DCM (g/l), - Total protein content (g/ml). Different concentrations of starch and lactose were added into the fermentation medium to induce better GGH production (Figure 4 ). The maximum enzyme activity (13.1840.991 U/ml/min) was noted when 10 g/l starch was used (LSD~1.735) which was about 1.86 fold higher compared to the control. The protein content and DCM were 75.1621.081 g/ml (LSD~2.266) and 14.4711.213 g/l (LSD~0.287), respectively. Mycelial morphology was in the form of small pellets. Similarly, Kunamneni et al. (2005) and Arnthong et al. (2010)reported that enzyme production reached maximal when 10 g/l starch was added in the fermentation medium. As the amount of starch was increased enzyme production was decreased which was due to carbon catabolite repression ( Morita et al. 1998 ). However, other workes reported that 20 g/l rice flour (as a source of starch) concentration seems to be the concentration that gave maximum production of GGH. Above 20 g/l, there was little increase in enzyme production. These results were mostly obvious in the case of A. niger and A. awamori ( Abdalwahab et al. 2012 ). Previously, Cherry et al. (2004) optimized 40 g/l starch concentration for enzyme production from fungal isolate A. fumigatus.

Figura 4 Effect of different concentrations of starch and lactose as carbon sources on GGH production by A. oryzae IIB-6. Incubation were carried out for 72 h (200 rpm) at 302C and pH 5. Y-error bars indicate standard deviation (sd) among the three parallel replicates. -- Enzyme activity (U/ml/min), -- DCM (g/l), - Total protein content (g/ml). The lactose concentrations (20 g/l) gave maximum enzyme production (13.9171.012 U/ml/min, LSD~0.636). The mycelial morphology was observed as round pellets of intermediate sized. The protein content and DCM were 84.004.05 g/ml (LSD~2.712) and 14.561.24 g/l (LSD~0.507), respectively. Other lactose concentrations (10 and 15 g/l) also induced relatively better enzyme production ie, 13.4611.511 U/ml/min and 13.5730.502 U/ml/min, respectively. However in contrast to our study, Singh and Soni (2001) used 10 g/l lactose to stimulate enzyme production. Similar observations have also been made by Negi and Banerjee (2010) for amylase production by A. awamori. Some other workers ( Vidya et al., 2012) used lactose at 30 g/l concentration and found to be the best source for maximum amylase production. The 2-factorial experimental system ie, Plackett-Burman design was applied to determine the significant process parameters involved in GGH production by the newly isolated mould culture of A. oryzae IIB-6 (Table4 ). The validation of the model was investigated under the conditions predicted against the responses obtained for enzyme production. A differential correlation was noted between the observed and predicted values as reported by Burkert et al. (2006) . The optimal levels of the parameters for improved enzyme production under submerged fermentation (SmF) were incubation period (72 h), initial pH (5), CSL 6, yeast extract 9.5, starch 10 and lactose 20 (g/l). The statistical analyses of the responses for enzyme production were also performed (Table 5 ). The correlation (1.618 E +0025) of A, B, C, D and E for F values depicted that the model was highly significant (HS, p0.05). Correspondingly, the lower probability values indicated that the model terms are statistically valid. The analysis of linear, quadratic and interaction coefficients were performed on the batch culture results which highlighted that enzyme production was a function of the independent parameters ( Ahuja et al. 2004 ) Lactose used as a sole carbon source (degree of freedom 3) has an important physiological role in the improvement of enzyme activity ( Burkert et al. 2006 ). According to these results, the fungal strain of A. oryzae IIB-6 could be considered as an organism of choice for GGH productivity. Tabla 4 Application of Plackett-Burman design at various process parameters (designated by different captions) for GGH production by A. oryzae IIB-6*

Los parmetros del proceso identificadas a travs del diseo 2factorial Las fuentes de nitrgeno CSL conc . (g/l)
C

Enzyme activity (U / ml / min)

Cultural conditions

Carbon sources

Incubatio n period (h)A

Initia l pH B

Yeast extrac t (g/l) D

Starc h conc. (g/l) E

Lactos e conc. (g/l) F

Observad o

Predicte d

24 36 48

4 4.5 4.5

sna 2 4

6.5 7.5 8.5

Sna Sna 10

5 10 15

6.252 8.654 10.435

8.245 9.558 12.126

Los parmetros del proceso identificadas a travs del diseo 2factorial Las fuentes de nitrgeno CSL conc . (g/l)
C

Enzyme activity (U / ml / min)

Cultural conditions

Carbon sources

Incubatio n period (h)A

Initia l pH B

Yeast extrac t (g/l) D

Starc h conc. (g/l) E

Lactos e conc. (g/l) F

Observad o

Predicte d

72 72 84

5 5.5 6

6 6 8

9.5 10 10

10 20 30

20 20 25

13.917 12.544 11.006

13.756 13.642 10.865

*The different letters represent significant process parameters for GGH fermentation. Statistical analysis of the model was based on 2-factorial experimental design. The abbreviation ' sna ' means that specific nutritional source (C/N) was not added into the fermentation medium (M3). Tabla 5 Statistical analysis of 2-factorial experimental design at various significant process parameters for GGH production by A. oryzae IIB-6*

Significant process parameters

Sume los valores medios

Fvalor

Grado de libertad

<p> Probabilidad

La B C D E F Correlacin

4.133 7.415 8.768 10.225 12.688 12.112 1.618 E +0025

7.628 10.784 12.105 14.482 15.295 14.044

1 1 1 2 3 2

0.078 0.065 0.057 0.052 0.034 0.025

*CM 19.24; R 2 0.238. The cap-letters represent significant process parameters (incubation period, initial pH, CSL conc., yeast extract conc., starch conc., lactose conc.) for enzyme production.

3 Conclusions
A soil-inhabited mould isolate A. oryzae IIB-6 was identified as a hyper producer of 1,4--D-glucan glucohydrolase (GGH) in submerged fermentation (SmF). M3 as a basal medium gave better GGH yield at 302C (200 rpm). The cultural conditions such as pH 5 and incubation period (72 h) were also optimized. Among the carbon and nitrogen sources, lactose (20 g/l) and yeast extract (9.5 g/l) raised the enzyme activity to a maximal of 13.91 U/ml/min. The values of kinetic variables, notably Q p (0.0580.011 a U/ml/h), Yp/s (2.4550.551 a U/ml/g) and q p (0.2100.032 abc U/g fungal biomass/h) demonstrated that the isolated mould culture has a faster growth rate and subsequently a higher enzyme production capability ( LSD~0.034). An overall improvement of more than 30% in terms of enzyme activity was accomplished when the significant process parameters were determined after Plackett-Burman design. The value of correlation (1.618E +0025 with dof~3) depicted that the model terms are highly significant (HS, p0.05). However, enzyme characterization is in progress prior to scale up studies.

4 Methods
Los productos qumicos y los reactivos utilizados en este estudio fueron de grado analtico y adquiridos directamente de Sigma (EE.UU.), BDH (Reino Unido) y Fluka (Suiza).

4.1 Isolation and preliminary screening of mould cultures

The soil samples were collected from various localities of Doha (Qatar) in sterilized polythene bags. Each sample was diluted by serial dilution method. One millilitre of appropriately diluted soil suspension (10 5 , 10 6 ) was plated on starch agar medium (10 g/l raw corn starch, 1.496 g/l KH 2 PO 4 , 1 g/l MgSO 4 .7H 2 O, 1 g/l NaNO 3 , 20 g/l agar, pH 4.8 and sterilized at 121C, 15 lbs/in 2 pressure for 15 min) using pour plate method. The plates were incubated at 302C for 72 h and subsequently flooded with iodine solution (2 g/l iodine, 4 g/l potassium iodide prepared in deionized water). The zone of clearance around the microbial growth indicated GGH activity. The initial colonies of mould cultures showing bigger zones (~2 mm 2 ) of starch hydrolysis in the plates were picked up and transferred to potato dextrose agar (PDA) slopes (pH 5.6) aseptically and then incubated at 302C for 4 6 days until optimal growth. The slant cultures were stored at 4C in a mini cold lab (430D, Gallenkamp, London, UK) and renewed at least twice a month.

4.2 Identification of mould isolates

Los aislados fngicos fueron identificados morfolgicamente usando una cinta adhesiva de aproximadamente 1 cm de longitud. El extremo pegajoso se coloca sobre el cultivo de hongos para recoger el micelio y otras estructuras reproductivas de los hongos segn lo informado por Harris (2000) . Fue colocado hacia arriba sobre un portaobjetos de microscopio. Se aadi una gota de 0,5 g / l de azul de tripano (preparada en lactofenol). Un cubreobjetos se coloca sobre la cultura de diapositivas y despus visualiza a 40X con un microscopio compuesto. Los cultivos de moho identificadas fueron confirmadas despus ( Cebolla et al. 1986).

4.3 Preparacin del inculo

Un volumen de 10 ml de esterilizado 0,5 g / l de di-acetil ster de sulfo sdica del cido succnico (monoxal OT) se transfirieron aspticamente a un cultivo inclinado que tiene un crecimiento ptimo de conidios. Los grupos de esporas se rompieron con la ayuda de un bucle de alambre de inoculacin estril. Una suspensin homognea se hizo por suavemente agitando el tubo. El recuento de esporas fue hecha por un hemocitmetro (130M, Neubyeur, Munich, Alemania) y se encontr que 1,2 10 7 UFC / ml.

4.4 Procedimiento de fermentacin y las fases crticas

Agite tcnica fermentacin en matraz fue empleado para el 1,4--D-glucano glucohidrolasa (GGH) la produccin en fermentacin sumergida tcnica (SMF). Un mililitro de suspensin de esporas se transfiri a los matraces individuales Erlenmeyer de 250 ml que contienen 50 ml esterilizados (a 121 C, 2 15-lbs/in presin durante 15 min) medio lquido M3 (encontrado ptima). El pH inicial se ajust a 5. Todas las fermentaciones microbianas se llevaron a cabo en un incubador con agitacin rotatoria a 30 2 C, 200 rpm durante 72 h. Los experimentos se llevaron a cabo en paralelo en un conjunto de tres repeticiones.

4,5 medios de fermentacin

Se evaluaron los medios siguientes para la produccin de GGH durante el curso del estudio, M1. 30 g / l de salvado de trigo 30, 1-L de HCl 0,01 N, pH 4,6. M2. 10 g / l de almidn, 5 g / l de lactosa, 10 g / l de caldo nutriente, 2 g / l de (NH4) 2 SO4, 2 g / l de CaCl2 0,2 H 2 O, 1-L de agua desionizada, pH 5,5 .

M3. 20 g / l de almidn, 10 g / l de lactosa, 8,5 g / l de extracto de levadura, 6 g / l de licor de maz macerado, 1,2 g / l de MgSO4 0,7 H 2 O, 1,3 g / l de NH4Cl, 0,6 g / l CaCl2 0,2 H 2 O, 1-L de agua destilada, pH 5. M4. 3 g / l de extracto de levadura, 20 g / l de peptona, 0,05 g / l de MgSO4 0,7 H 2 O, 0,2 g / l de CaCl2 0,2 H 2O, 0,1 g / l FeSO 4, tampn de fosfato de 1-L, pH 7,2 . M5. 10 g / l de almidn, caldo de 10 g / l de nutriente, 2,4 g / l de (NH4) 2 SO4, 5 g / l de CaCl2 0,2 H 2 O, 1-L de tampn de acetato de sodio, pH 6,4.

4.6 GGH aislamiento de la cultura mosto fermentado

El caldo fermentado se filtr a travs de un horno de secado (a 102 C durante 15 min) previamente pesado de papel de filtro Whatman N 1. Se observ la morfologa micelial. El filtrado transparente se utiliza para la enzima y el ensayo de protenas, mientras que se utiliz masa celular para calcular el peso seco.

4.7 Determinacin de la morfologa micelial

La morfologa del micelio se observ a nivel macro ( Cebolla et al. 1986 ). Los micelios se clasificaron en funcin de su forma y su tamao como siguen: Bolitas de Bellas (aglutinamiento redondas con dimetros comprendidos entre 1-1,5 mm); pequeas bolitas (aglutinamiento redondas con dimetros comprendidos entre 3-3,5 mm); bolitas intermedios (redondos con dimetros de entre 4 -4,5 mm); grandes grnulos (terrones redondas con dimetros entre 6-6,5 mm); mixto (una mezcla de todas las cuatro formas anteriores); viscoso (una mezcla espesa de pequeas y finas pellets con algunos filamentos libres); gelatinoso (gel mezcla de finos grnulos y filamentos) y masa rechoncha (sola masa irregular con tamaos variables de micelio).

4.8 Tcnicas analticas

La masa celular que queda en el papel de filtro previamente pesado se lav dos veces con agua destilada y se sec en horno a 102 C durante 2 h. La masa celular seca (DCM) se calcul restando el peso del papel de filtro desde el peso final y se convierte en g / l. GGH se ensay de acuerdo con el mtodo de Caldwell et al. (1968) . Un mililitro de enzima (diluida a 10 -3 veces) y 1 ml de sustrato (solucin de almidn soluble 50 g / l de Litner en tampn de acetato de sodio 0,05 M, pH 5) se incub a 60 C durante 60 min con una velocidad de agitacin constante de 100 rpm. La cantidad de azcar reductor liberada se determin usando 3, cido 5-dinitrosaliclico (DNS) de reactivo mediante la medicin de un 546 nm en un espectrofotmetro contra la glucosa como el estndar. "Una unidad de actividad GGH era la cantidad de enzima que libera 1 mg de azcar reductor (como glucosa) bajo las condiciones de ensayo especificadas". El azcar liberado luego se convierte en U / ml / min. La concentracin de protena se estim en el filtrado mediante el mtodo de Bradford (1976) con cristalina de albmina de suero bovino como el estndar. El contenido de protena se control midiendo Un 595nm.

4.9 de cribado secundaria de cultivos de moho aislados por la tcnica SmF

Diecisis culturas diferentes de molde (codificados como IIB-1 a II B-16) de los gneros Aspergillus, Alternaria, Arthroderma, Fusarium, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus y Chochlobolus spp. fueron seleccionados para la produccin de GGH (Tabla 1 ). Todos los cultivos se ensayaron por triplicado mediante la incubacin del medio de fermentacin (M3 ptima) a pH 5, 30 2 C, 200 rpm durante 72 h.

4.10 Anlisis paramtrico por estudio cintico

Se estudiaron las variables cinticas de acuerdo con el procedimiento de ( PIRT 1975 ). Los valores para la tasa de crecimiento especfico es decir, (h-1) se calculan a partir de las parcelas de ln (x) en funcin del tiempo de fermentacin. El coeficiente de rendimiento de crecimiento (Y x / s) se calcul como la pila seca masa dividida por la cantidad de sacrido utilizado durante el curso de la fermentacin. Los coeficientes de rendimiento del producto a saber Y p / s e Y p / x se determina mediante el uso de las relaciones Y p / s = dP / dS y Y p / x = dP / dx, respectivamente. Las tarifas volumtricas para la utilizacin de sustratos (Q s) y la formacin de producto (Q p) se determinaron a partir de las pendientes mximas en parcelas de sustrato utilizado y GGH producidos frente al tiempo de fermentacin (dt). La tasa volumtrica para la formacin de biomasa (Q x) se calcula a partir de la pendiente mxima en una parcela de la formacin de masa celular frente a perodo de tiempo de incubacin. Las constantes de velocidad especficas para la formacin de producto (q p) y la utilizacin de sustratos (q s) fueron determinados por las ecuaciones q p = Y p / x y qs = Y s / x, respectivamente. Adems, la tasa especfica para la formacin de masa celular (q x) fue, calcula multiplicando la tasa de crecimiento especfico () con el coeficiente de rendimiento de crecimiento (Y x / s).

4.11 Determinacin de las condiciones importantes de cultivo de lotes

Diferentes medios de fermentacin (M1, M2, M3, M4, M5) se evaluaron para la produccin de GGH por A.oryzae II B-6 (Tabla 3 ). Todos los medios se incubaron a 30 2 C, 200 rpm durante 72 h. El perfil de curso de tiempo para la produccin de GGH en matraces de agitacin se estudi mediante la incubacin de medio M3. La incubacin se llev a cabo durante 12-108 horas a 30 2 C (200 rpm). El pH inicial ptima para la produccin de la enzima se midi mediante la incubacin del medio de fermentacin durante 72 h bajo un estrecho rango de pH (4-6,5). Tambin se investigaron las concentraciones ptimas de fuentes de nitrgeno y carbono. Fueron medidos y comparados con el control (paralelo ejecutar) Los efectos de diferentes concentraciones de CSL (2-10 g / l) y extracto de levadura (6,5-10 g / l) como fuentes de nitrgeno sobre la produccin GGH. Diferentes concentraciones de almidn (10-40 g / l) y lactosa (5-25 g / l) fueron empleados como fuentes de carbono para estudiar sus efectos en la produccin de la enzima. Los experimentos de fuentes de C / N se realizaron por separado por triplicado a pH 5 durante 72 h.

4.12 El anlisis estadstico y la aplicacin de diseo experimental Plackett-Burman

Pruebas de rango mltiple de Duncan (SPSS-16, versin 9.5) se aplicaron bajo anlisis unidireccional de la varianza (ANOVA I-) y los efectos del tratamiento se compararon despus ( Snedecor y Cochran 1980 ). La significacin se presenta en forma de probabilidad (<p>) valores. Las condiciones de cultivo por lotes significativos que afectan a la mejora de la productividad GGH fueron identificados con un sistema de 2factorial es decir, el diseo experimental Plackett-Burman ( Ahuja et al. 2004 ) Las variables se denotan en dos intervalos muy espaciados y el efecto de los parmetros individuales en la produccin de la enzima fue calculado por las siguientes ecuaciones, (1)

(2) En la ecuacin. I, E es el efecto de primer parmetro en estudio mientras M + y M-son las respuestas de la enzima por el aislado fngico seleccionado. N es el nmero total de optimizaciones. En la ecuacin. II, E es el parmetro importante, 1 es el coeficiente lineal, 2 el coeficiente cuadrtico mientras que 3 es el coeficiente de la interaccin entre los parmetros de proceso importantes. Agradecimientos
Estamos muy agradecidos con el Director IIB y vicerrector de sus contribuciones para promover la cultura de la investigacin en la Universidad. Financiamiento Esta investigacin recibi ninguna subvencin especfica de cualquier organismo de financiacin de los sectores pblico, sin fines de lucro o comercial.

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Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto en relacin con este artculo.

Autores de las contribuciones

BF efecta trabajo de banco; SA concibi la obra. Ambos autores igualmente participado en la preparacin del manuscrito, ledo y aprobado el manuscrito final.