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RELATRIO SEGUNDA AULA PRTICA PRECIPITAO DE PROTENAS

Bioqumica Estrutural

Emilia Arthur Notalgiacomo Fernanda Martins Gonzaga de Oliveira Giuliana Garcia Juliana Paneczko Jurgilas

Profa. Dra. Eleonora Cano Carmona

RIO CLARO 2013

SUMRIO

Introduo 1. Objetivos 2. Materiais e Mtodos 2.1. 2.2. Materiais Mtodos

3. Resultados 3.1. Anlise Qualitativa

4. Concluso 5. Referncias bibliogrficas

INTRODUO As protenas, formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas, possuem funes de extrema importncia nos organismos, e suas propriedades e caractersticas refletem sua composio. A sequncia de aminocidos presentes na protena pode determinar o tipo de interao possvel entre as cadeias laterais que apresentam caractersticas de carga. A carga eltrica total de uma protena ser ento o somatrio das cargas apresentadas pelos radicais dos aminocidos que a compe. A carga destes radicais depende por sua vez do pKa e do pH da soluo. Para cada protena existe um valor de pH onde h equivalncia no numero de grupos cidos desprotonados e grupos bsicos protonados, neste ponto, chamado ponto isoeltrico a solubilidade da protena menor devido a estabilizao das molculas com cargas opostas. H tambm o efeito na solubilidade quando se considera a concentrao de sais, existem certas protenas que aumentam sua solubilidade quando se adiciona um nvel regulado de sal, fenmeno salting in (leva em considerao o fato dos ons adicionais interagirem com grupos carregados das protenas atenuando a interao entre elas). Quando a concentrao de sais excessivamente alta, h baixa na solubilidade, efeito de salting out. Para se estudar os efeitos, como o da solubilidade, o isolamento da protena trs um melhor detalhamento, para determinar suas propriedades, composio e sequencia de aminocidos e para isso existem tcnicas disponveis. Uma das delas a precipitao, onde se utilizam variao de temperatura e variados reagentes, por exemplo, a fim de modificar ou no a estrutura das protenas mostrando assim, caractersticas que podem definir sua

especificidade; portanto o isolamento das protenas pode trazer meios para identific-las.

1. OBJETIVOS Estudar as diferentes formas de precipitao de protenas, relacionando suas diferentes formas presentes em diferentes pHs, alm da interao com outros compostos, influenciando na sua solubilidade.

2. MATERIAIS E MTODOS 2.1. Materiais Soluo de protenas preparada pela diluio de clara de ovo 10% cido tricloroactico 10% Acetato de chumbo 0,1 M Sulfato de cobre 0,1 M lcool etlico absoluto Hidrxido de sdio 2,5 M Acetona Soluo alcalina de casena 1% (pH prximo de 8) Azul de bromofenol cido clordrico 0,1 M Clara de ovo in natura Cloreto de sdio 2,0 M Soluo saturada de sulfato de amnio

2.2. Mtodos Os mesmos sugeridos no roteiro.

3. RESULTADOS 3.1. Anlise Qualitativa Quando adicionamos sais neutros a uma soluo proteica, ocorre um aumento da fora inica (NaCl e (NH4)2SO4). Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma soluo contendo protenas as cargas provenientes da dissociao do sal passam a interagir entre elas. Consequentemente observa-se o aumento da solubilidade da protena em meio aquoso. Ctions de metais pesados como Hg++, Pb++, Cu++, Fe++, Cd++ e Zn++ formam precipitados insolveis de protenas. Quando adicionados soluo proteica, percebe-se a formao de precipitado. (Acetato de chumbo (CH3COO)2Pb.3H2O, cido tricloroactico (CCl3COOH), sulfato de cobre (CuSO4).

Protenas possuem estruturas tridimensionais que so relativamente sensveis ao do calor, o que causa a desorganizao das cadeias peptdicas com consequente alterao conformacional, desnaturando a protena, diminuindo sua solubilidade, e levando a sua precipitao. Como solventes orgnicos possuem constantes dieltricas baixas, as interaes protena-protena superam as interaes protena-solvente,

precipitando a protena (CH3-CH2OH etanol) e (CH3COCH3 acetona). Quando adicionado um cido forte ou uma base forte a uma soluo, h mudana brusca do pH, o que causa a desnaturao da protena formando precipitado (NaOH e HCl).

3.1.a. Inicialmente a soluo era transparente. Aps o aquecimento, a soluo tornou-se esbranquiada (opaca) com material floculado, ou seja, apresenta menor densidade.

Figura 1. Soluo de 2 ml de soluo de protena aps aquecimento.

3.1.b. Ao adicionar uma gota de sulfato de cobre 0,1 M ao primeiro tubo de ensaio contendo 2 ml da soluo de protenas, verificamos que a colorao passou de transparente para um azul opaco. Com a adio de excesso de reagente (seis gotas a mais), a soluo ficou transparente e apresentou um azul mais intenso.

Ao adicionar uma gota de acetato de chumbo 0,1 M ao segundo tubo de ensaio contendo 2 ml da soluo de protenas, verificamos que a soluo tornou-se esbranquiada (opaca). Aps a adio de excesso de reagente, nada ocorre, permanecendo com a mesma colorao.

Figura 2. A. Solues aps a adio de duas gotas de sulfato de cobre 0,1 M no primeiro tubo de ensaio e de duas gotas de acetato de chumbo 0,1 M no segundo tubo de ensaio. B. Solues aps a adio de mais seis gotas dos mesmos reagentes.

3.1.c. Ao adicionar duas gotas de cido tricloroactico 10% soluo de 2 ml de protenas, verificamos que no houve a formao de precipitado e a colorao no foi alterada. Aps a adio de mais trs gotas, houve a formao de um floculado branco de protenas desnaturadas. Com a adio de excesso de reagente (mais trs gotas), a soluo ficou opaca e esbranquiada, com material em suspenso e tambm com mais material floculado se comparado com a situao anterior. Em seguida, ao adicionar-se lentamente o hidrxido de sdio 2,5 M (trs gotas), a soluo torna-se transparente de novo e com material floculado.

Figura 3. A. Soluo aps a adio de duas gotas de cido tricloroactico 10%. B. Soluo aps a adio de mais trs gotas de cido tricloroactico 10%. C. Soluo aps a adio de trs gotas de hidrxido de sdio.

3.1.d. Ao adicionar lcool etlico (4,5 ml) ao primeiro tubo de ensaio contendo 2 ml de soluo de protenas, ocorreu a separao do lquido em duas fases. No segundo tubo de ensaio foi adicionada acetona, o que tornou a soluo levemente opaca com substncia floculada.

3.1.e. Foi pipetada uma soluo (2 ml) alcalina de casena (transparente) e a ela foram adicionadas duas gotas de azul de bromofenol, o qual tornou a soluo violeta. Em seguida, gota a gota, o cido clordrico foi adicionado a esta soluo at que ocorresse a formao de precipitado. Aps a adio de seis gotas de cido clordrico a colorao tornou-se azul escura, apresentando pouco material em suspenso. Aps a adio de nove gotas, havia mais precipitado presente e o azul ficou mais claro. Com 12 gotas, a colorao passa para um azul esverdeado. Com 15 gotas, verde limo. Com 18 gotas permanece a mesma colorao. Com 21 gotas, apresentou uma colorao mais amarelada. Com 27 gotas, mais amarelo e apresentou material precipitado.

Figura 4. A. Soluo aps adio de seis gotas de cido clordrico. B. Soluo aps a adio de nove gotas de cido clordrico. C. Soluo aps a adio de 27 gotas de cido clordrico.

3.1.f. Ao adicionar 200 ml de gua destilada a 250 ml de clara de ovo e agitar a soluo, verificou-se a precipitao das globulinas e a permanncia da albumina em soluo.

3.1.g. Uma soluo de 2 ml do tpico anterior foi pipetada (3.1.f) e a ela adicionado, gota a gota (65 gotas), cloreto de sdio 2,0 M at a verificao da redissoluo (90% de redissoluo) do precipitado de protenas, devido a restaurao da fora inica original.

Figura 5. Soluo de clara de ovo e gua destilada com globulinas precipitadas.

3.1.h. Foi pipetada 2ml da soluo do tpico anterior (3.1.g), e a ela adicionada 2ml de uma soluo saturada de sulfato de amnio. Verificamos a formao de precipitado de protenas (globulinas). Em seguida, ao ser adicionado 6 ml de gua destilada, verificamos a redissoluo das protenas.

Figura 6. Soluo de clara de ovo e gua.

4. CONCLUSO Vrios fatores influenciam na solubilidade e/ou na desnaturao de protenas, como por exemplo, mudanas de pH, elevao de temperatura, adio de solutos (exemplo: sais de metais pesados, cidos, bases e solventes orgnicos). Um ponto importante que essencial destacar que nem todas as protenas precipitadas devido baixa solubilidade (ocorrncia de precipitao) foram desnaturadas, porm, geralmente as protenas que foram desnaturadas apresentam baixa solubilidade e acabam precipitando. Essas situaes podem ser alteradas para que sejam obtidos os resultados desejados, como por exemplo, a separao da protena em fase insolvel. Isso pode ser um mtodo eficiente para se analisar um componente no proteico que est contido em material proteico. Outra forma que pode ser utilizada para realizar a remoo

da protena no caso da ocorrncia de desnaturao das protenas, a qual pode acontecer devido a adio dos mesmos compostos. No ponto isoeltrico a carga lquida de todas as molculas ser zero, isso far com que elas fiquem menos solveis. Isso se deve ao fato de que nesse ponto elas no vo se repelir, ou seja, no ocorre repulso eletrosttica entre as molculas proteicas vizinhas, o que provoca a sua precipitao. Portanto, no pI as protenas apresentam menor solubilidade.

5. BIBLIOGRAFIA NELSON, D. L. Principles of Biochemistry. Editora WH Freeman and Company. 5 edio. Estados Unidos da Amrica, 2008. RIBEIRO, M. G. Titulao cido forte base forte. Porto Alegre, 2004. VOET, D.; VOET, J.G.; PRATT,C.W. Fundamentos de Bioqumica. Artmed Editora, Porto Alegre RS, 2002. MARZZOCO,A.;TORRES, B.B. Bioqumica Bsica. 3 Editora Guanabara Koogan S.A. Rio de Janeiro RJ, 2007.