UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO ESCOLA DE QUMICA Departamento de Engenharia Bioqumica

DESENVOLVIMENTO PRELIMINAR DE UM BIOSSENSOR ENZIMTICO PARA DETERMINAO DE TANINOS HIDROLISVEIS

ARIANA FARIAS MELO

2008

ii

DESENVOLVIMENTO PRELIMINAR DE UM BIOSSENSOR ENZIMTICO PARA DETERMINAO DE TANINOS HIDROLISVEIS

ARIANA FARIAS MELO

Dissertao apresentada ao corpo docente do Curso de Ps Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro para obteno do Titulo de Mestre em Cincias.

Orientadores: Andra Medeiros Salgado Gustavo Adolfo Saavedra Pinto.

Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro 2008

iii

DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR ENZIMTICO PARA DETERMINAO DE TANINOS HIDROLISVEIS

ARIANA FARIAS MELO

Dissertao apresentada ao corpo docente do Curso de Ps Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ como parte dos requisitos necessrios obteno do Titulo de Mestre em Cincias. Aprovada por:

Orientador (es) _______________________________________ Andra Medeiros Salgado, D. Sc

_______________________________________ Gustavo Adolfo Saavedra Pinto, D. Sc

Banca Examinadora _____________________________________ Mnica Caramez Triches Damaso, D.Sc _____________________________________ Selma Gomes Ferreira Leite, D.Sc _____________________________________ Snia Couri, D.Sc

Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro 2008

iv

MELO, Ariana Farias Desenvolvimento preliminar de um biossensor enzimtico para determinao de taninos hidrolisaveis/ Ariana Farias Melo. Rio de Janeiro: UFRJ / EQ, 2008. xix, 104f., 29,7 cm. Dissertao (Mestrado em Cincias) Universidade Federal do Rio de Janeiro/ UFRJ, Escola de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, 2008. Orientadores: Andra Medeiros Salgado e Gustavo Adolfo Saavedra Pinto 1. Biossensor 2. Taninos. 3. Tanase 4. Tecnologia Enzimtica I: Salgado, Andra Medeiros. Pinto, Gustavo Adolfo Saavedra. II: Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Qumica, Programa de PsGraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos. III. Ttulo.

Aos meus pais Adriano e Glaucia e aos meus irmos Argos, Arine e Adriana, Dedico.

vi

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeo aos meus pais Adriano e Glaucia, pelo seu apoio e ajuda em todas as horas, pois sem eles, no disso seria possvel. As minhas irms Arine e Adriana, por me fazer lembrar que sempre bom voltar pra casa. Ao meu irmo Argos, que apesar de usar poucas palavras sempre me ajuda na hora de tomar alguma deciso A professora Andra pela sua acolhida e orientao. Ao Gustavo, pela sua orientao nos ltimos anos e principalmente pela sua amizade, conselhos e ajuda em todos os momentos. Aos meus padrinhos cariocas, Oldar e Maria Lcia que adotei de corao. A Maria Marta, a irm mais velha que passei a ter. Aos amigos Jorge e Adriana pelos deliciosos bolinhos de milhos sempre bem-vindos. A Cssia pelos belos passeios. A professora Maria Alice por ter me recebido em seu Laboratrio. Aos meus companheiros e amigos de Laboratrio, pela convivncia e boas horas de risadas: Rafael, Diego, Ana Iraidy, Etel, Andr, Priscilla (e Sophia), Lvia, Ana Claudia, Bernardo, Nattascha, Mariana, Kelly, Ana Paula; A companheira Roberta pelas nossas longas caminhas e pelos cafezinhos. A Gizele por sua amizade e companheirismo deste o inicio. A Tatiana pela acolhida em sua famlia e principalmente por me fazer lembrar que sempre podemos conquistar novas amizades eternas e sem cobranas. A Luiza por sempre me ajudar a lavam os inmeros tubos de ensaio.

vii

A todos os meus grandes amigos cearenses que apesar da distncia sempre estiveram presentes: Germana, Emanuela,Rebeca, Esau, Ivan, Valter, Fernanda, Knya, Milena e Rodrigo. A CAPES pelo suporte financeiro.

Enfim agradeo a todos que a seu modo me ajudaram a conquistar mais uma etapa na minha vida.

viii

RESUMO

DESENVOLVIMENTO PRELIMINAR DE UM BIOSSENSOR ENZIMTICO PARA DETERMINAO DE TANINOS HIDROLISAVEIS

Resumo da Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Psgraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, Escola de Qumica, da Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

Ariana Farias Melo

Orientadores: Andra Medeiros Salgado, D. Sc Gustavo Adolfo Saavedra Pinto, D. Sc

O uso de enzimas para fins analticos vem aumentando a cada dia, principalmente no ramo da biotecnologia ligada ao desenvolvimento de novos instrumentos de anlises cada vez mais especficos. Desta forma, o

desenvolvimento de biossensores vem crescendo, j que estes permitem que a medida do analito de interesse seja realizada pela transduo seletiva de um parmetro da reao biocomponente-analito em um sinal eltrico passvel de ser monitorado. Por este motivo, o elemento biolgico que compe o instrumento, tornase um componente essencial para a sua construo. Com isso o objetivo deste trabalho foi o estudo de um processo de imobilizao da enzima tanase em suporte vtreo, a determinao das suas condies timas de atuao e a sua eficincia quando aplicada a um sistema adequado de transduo para a construo de um biossensor para taninos hidrolisveis. Aps o processo de imobilizao o pH timo

ix

da tanase imobilizada, apresentou um pequeno desvio para o lado alcalino, j temperatura tima se manteve igual ao da tanase na forma solvel. A tanase imobilizada demonstrou um comportamento linear da sua atividade na faixa de concentrao de 100 a 500mg/L de acido tnico, iniciando a partir da uma diminuio na taxa de reao at uma concentrao de 1000mg/L de acido tnico, para ambas as temperaturas avaliadas (30oC e 50oC), sendo que os valores de Vmx e Km foram maiores na temperatura de 50oC. Verificou-se tambm que a tanase imobilizada apresenta um timo perfil de estabilidade sob as condies de reao de pH 5,0 e 30oC.Um outro ponto analisado foi o tempo de vida til, demonstrando que a tanase imobilizada aps um perodo de 90 dias de estocagem reteve a sua atividade . No aspecto de reutilizao do suporte foi possvel verificar que possvel realizar a reutilizao do suporte o que torna a fabricao dos biossensor economicamente mais vivel Com relao aos testes para o possvel transdutor a ser utilizado a enzima tanase imobilizada demonstrou ser apta a ser utilizada no desenvolvimento do biossensor enzimtico, quando foi utilizado o sistema de transduo tanase imobilizada e colormetro (490 nm), uma vez que o sistema apresentou uma boa repetibilidade e linearidades em suas respostas.

ABSTRACT

DEVELOPEMENT AN ENZIMATIC BIOSENSOR FOR TANNIN DETERMINATION Abstract da Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, Escola de Qumica, da Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

Ariana Farias Melo

Orientadores: Andra Medeiros Salgado, D. Sc Gustavo Adolfo Saavedra Pinto, D. Sc

The use of enzymes for analytical purposes is increasing every day, mainly in the field of biotechnology related to the development of new tools for analysis increasingly specific. Thus, the development of biosensors is growing, it allows the measurement of the analyte of interest is achieved by transduction of a selective parameter of the reaction biocomponente-analyte in an electric signal that can be monitored. For this reason, the biological factor that makes up the instrument, it is an essential component for its construction. With that the aim of this work was the study of a process of immobilization of the enzyme tannase in support vitreous, the determination of their conditions of work and their optimal efficiency when applied to a proper system of transduction for the construction of a biosensor for hydrolysable tannins. After the process of immobilization the optimum pH of tannase immobilized, presented a small diversion to the alkaline side, as optimum temperature remained the same as in the tannase as soluble The tannase immobilized showed a linear behavior of its activity in

xi

the concentration range of 100 to 500mg / L of tannic acid, starting from there a decrease in the rate of reaction until a concentration of 1000 mg/L of tannic acid for both temperatures evaluated (30oC and 50oC), and the values of Km Vmx and were higher in temperature of 50oC. There was also that the tannase immobilized presents a great profile of stability under the conditions of reaction at pH 5.0 and 30oC. An another point considered was the time of life, demonstrating that the tannase immobilized after a period of 90 days, stocking retained their activity. In the aspect of re-use of the media were unable to verify that it is possible to reuse the support which makes the manufacture of biosensor most economically viable With regard to testing for the transducer can be used to tannase immobilized enzyme shown to be able to be used in development the enzyme biosensor, when the system was used for transduction tannase immobilized and colorimeter (490 nm), as the system showed good repeatability and linearidades in their answers.

xii

SUMRIO

CAPTULO 1 INTRODUO CAPTULO 2 OBJETIVO CAPTULO 3 REVISO BIBLIOGRAFICA 3.1 - Taninos 3.1.1. Taninos Hidrolisveis 3.1.2 Taninos Condensados - Proantocianidinas 3.1.3 Taninos na Indstria 3.1.4 Mtodos de Quantificao de Taninos 3.2 Biossensores 3.2.1 Funcionamento de um biossensor 3.2.2 Componente biolgico 3.2.3 Transdutor 3.2.4 Aplicao dos biossensores 3.3 Enzimas 3.3.1. Atividade enzimtica 3.3.2 Tanase 3.3.2.1 Ao da enzima tanase 3.3.2.2 Fonte de obteno da enzima tanase 3.3.2.3 Propriedades da enzima tanase

01 06 08 08 10 13 15 16 17 19 21 24 31 32 34 35 36 38 39

xiii

3.4 Imobilizao do componente biolgico 3.4.1 Imobilizao por adsoro 3.4.2 Imobilizao por Ocluso 3.4.3 - Imobilizao por Encapsulao 3.4.4 Imobilizao por Ligao Covalente Cruzada 3.4.5 Imobilizao por Ligao Covalente 3.4.6 - Influncia do Glutaraldeido CAPTULO 4 MATERIAIS E MTODOS 4.1 Materiais e Reagentes 4.1.1 - Enzima 4.1.2 Suporte 4.1.3 - Reagentes 4.2 - Metodologias 4.2.1 Determinao da atividade da tanase livre 4.2.1 Tcnica de imobilizao 4.2.2 Determinao de atividade da tanase imobilizada 4.2.3 Determinao do efeito da imobilizao sobre o perfil de atividade da enzima. 4.2.3.1 - pH 4.2.3.2 Temperatura 4.2.4 Determinao do efeito de fatores externos e operacionais sobre a estabilidade da enzima imobilizada. 4.2.4.1 - pH

41 43 44 45 45 46 47 50 50 50 50 51 51 51 53 54 57

57 58 58

58

xiv

4.2.4.2 Temperatura 4.2.4.3 Operacional 4.2.5 Avaliao da influncia da imobilizao sobre os parmetros cinticos da enzima. 4.2.5.1 Determinao da taxa de reao (vo) 4.2.5.2 Determinao de Vmax e Km 4.2.6 Avaliao do tempo de vida til da enzima imobilizada 4.2.7 Avaliao da reutilizao do suporte 4.2.8 Determinao da variao de pH pela ao da enzima tanase livre e imobilizada. 4.2.9 Determinao da variao colorimetrica pela ao da enzima tanase imobilizada. CAPTULO 5 RESULTADOS E DISCUSSES 5.1 Imobilizao do componente biolgico (enzima tanase) e avaliao da tcnica utilizada sob diferentes aspectos 5.1.1- Avaliao do Procedimento de Imobilizao 5.1.2 Avaliao do Tempo no Processo de Imobilizao 5.1.3-Efeito do pH na Atividade da Enzima Tanase Livre e Imobilizada 5.1.3.1-Influncia do pH no perfil de atividade da enzima tanase 5.1.3.2- Estabilidade da enzima tanase sob diferentes valores de pH 5.1.4- Efeito da Temperatura na Atividade da Enzima Tanase Livre e Imobilizada

59 59 60

60 60 61 61 62

62

64 64

66 67 69

69

71

72

xv

5.1.4.1- Influncia da temperatura no perfil da atividade da tanase 5.1.4.2- Estabilidade trmica da enzima tanase 5.1.5- Determinao dos Parmetros Cinticos da Tanase Imobilizada 5.1.6- Determinao do Tempo de Vida til da Tanase imobilizada 5.1.7- Determinao da Estabilidade Operacional da Tanase Imobilizada 5.1.8- Estudos de Reutilizao do Suporte para o Processo de Imobilizao 5.2- Testes com transdutores CAPTULO 6 CONCLUSES E SUGESTES 6.1 - Concluses 6.2 - Sugestes CAPTULO 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

73

75 76

79

81

83

85

95 97 98

xvi

Lista de Tabelas
Tabela 3.1 5.1 5.2 Descrio Tipos de transdutores empregados em biossensores Atividade da tanase imobilizada no suporte avaliado Efeito do tempo do processo de imobilizao na atividade da enzima tanase imobilizada 5.3 5.4 Parmetros cinticos da tanase livre e imobilizada Rendimento da imobilizao e determinao das atividades com a reutilizao do suporte 5.5 Equao da reta das curvas obtidas pelo sistema colormetro + tanase imobilizada 94 78 84 Pg. 25 67 68

xvii

Lista de Figuras

Figura 3.1

Descrio Reao de oxidao do anel aromtico de unidades de cido glico

Pg. 11

3.2 3.3 3.4 3.5 3.6

Reao oxidativa de formao de um tanino hidrolisvel. Diviso dos taninos hidrolisveis Taninos condensados Esquema geral de funcionamento de um biossensor Classificao dos biossensores de acordo com o Elemento Biolgico Sensvel

12 13 14 20 22

3.7 3.8 3.9 3.10 3.11

Atividade estersica e depsidase da Tanase. Etapas da degradao do cido tnico pela Tanase. Classificao dos mtodos de imobilizao de enzimas. Grupamento funcionais presentes nas enzimas. Formas propostas para o glutalradeido aquosa, (I) linermono (II) e dihidratos (III), um hemiacetal cclico (IV) e oligmeros (V).

37 38 43 46 48

3.12

Estrutura do glutaralteido em soluo acida e neutra.

48

xviii

4.1 4.2 4.3 5.1

Fotogrfica do suporte utilizado Prola de vidro Formao do complexo: cido Glico com a Rodanina. Descrio qumica da reao no processo de imobiliza. Atividade residual de tanase no sobrenadante ao longo do processo de imobilizao

51 52 53 66

5.2

Perfil da atividade residual da tanase livre () e imobilizada em prolas de vidro () a diferentes valores de pH

69

5.3

Estabilidade da tanase livre e imobilizada em prola de vidro sob diferentes valores de pH .

72

5.4

Perfil da atividade residual da tanase livre () e imobilizada () a diferentes valores de temperatura

73

5.5

Estabilidade trmica da tanase livre e imobilizada e imobilizada.

75

5.6

Atividade da tanase imobilizada em funo da concentrao de cido tnico nas temperaturas de reao de 30C () e 50C ()

77

5.7

Avaliao dp tempo de vida til da tanase livre e imobilizada em prolas de vidro

80

5.8

Estabilidade operacional da tanase imobilizada em prolas de vidro a 30C (a) e 50oC (b).

82

xix

5.9

Curva de resposta para o transdutor (eletrodo de pH) a partir de reaes da enzima tanase livre

86

5.10

Avaliao da estabilidade de resposta do eletrodo com o tempo de reao () 5 min () 10 min () 15 min.

87

5.11

Curva de resposta ou calibrao para o sistema transdutor (eletrodo de pH) e a enzima imobilizada usando solues de diferentes concentraes de cido tnico com e sem lavagem entre as medidas

89

5.12

Avaliao do tempo de reao na resposta do sistema eletrodo de pH + enzima tanase imobilizada em prolas de vidro (a) 5 minutos, (b) 10 minutos (c) 15 minutos.

91

5.13

Curva de resposta ou calibrao para o sistema transdutor (colormetro) + enzima tanase imobilizada usando solues de diferentes concentraes de cido tnico com e sem lavagem entre as medidas.

93

Introduo

CAPTULO 1

INTRODUO

A necessidade de sistemas de deteco mais versteis para o monitoramento de bioprocessos tem estimulado a produo de uma grande variedade de mtodos analticos. Os biossensores revelam grandes perspectivas quanto a sua utilizao no monitoramento on-line de biorreatores, possibilitando uma rpida adaptao nos processos biotecnolgicos (Alfaya, 2002). A incorporao de molculas com atividade biolgicas, principalmente enzimas, em metodologias analticas tem aumentado sensivelmente nos ltimos anos, obtendo sucesso nos mais variados procedimentos ,inclusive nos que visam rea de controle dos bioprocessos (Alfaya, 2002, Salgado, 2001). Os biossensores so ferramentas analticas que combinam biomolculas imobilizadas com transdutores qumicos ou fsicos para criar uma superfcie que permita a medio direta, possivelmente contnua, de um analito especfico. Assim, um biossensor combina a especificidade de um componente biolgico ativo, para o analito de interesse, com a sensibilidade de um transdutor, que converte o sinal biolgico em um sinal eltrico proporcional concentrao do analito (Salgado, 2001). Os biossensores representam uma ferramenta promissora para suplementar as tcnicas existentes, devido as suas caractersticas nicas, tais como seletividade, baixo custo relativo de construo e estocagem, potencial para miniaturizao,
1

Introduo

facilidade de automao e construo de equipamentos simples e portteis para rpidas anlises de monitoramento no campo. Entretanto, necessrio enfatizar que estas ferramentas no podem e no devem ser vistas como uma substituio das tcnicas analticas clssicas, mas sim como um complemento a estas (Cabral et al, 2003; Romani et al., 2000) A possibilidade de minimizar ou at mesmo eliminar alguns fatores limitantes apresentados pelas enzimas livres, como solubilidade em gua, baixa ou nenhuma resistncia a temperaturas elevadas, no poderem ser utilizadas em solventes orgnicos e estarem presente em baixas concentraes (Chibata e Tosa, 1978), faz com que as enzimas imobilizadas tornem-se bastante atrativas para serem utilizadas no desenvolvimento de novos mtodos analticos. Atravs da imobilizao possvel obter uma maior estabilidade da enzima, uma menor interferncia de compostos indesejveis e tambm a possibilidade de reutilizar a mesma diminuindo assim o custo por anlise (Zhao et al., 1998, Campanella et al., 2008 Cabral et al, 2003). O processo de imobilizao do componente biolgico tambm uma etapa crucial na construo de um biossensor, pois a escolha da tcnica de imobilizao, bem como, do suporte a ser utilizado de extrema importncia para o bom desempenho deste instrumento (Arya, et al., 2008) Em contrapartida, o suporte a ser utilizado pode ter um efeito crtico sobre a eficincia do processo de imobilizao e da estabilidade da enzima (Tischer e Kasche, 1999). Entres os suportes mais utilizados podemos citar os suportes orgnicos e os inorgnicos. Os suportes orgnicos podem ser sintticos como o nylon entre outros ou naturais (quitina, celulose, etc.), j os inorgnicos poder ser

Introduo

divididos em de origem mineral (argilas e areia) ou de origem sinttica (vidro e slica). Os suportes inorgnicos apresentam uma srie de vantagens, tais como: elevada fora mecnica, estabilidade trmica e resistncia ao ataque de microrganismos e de solventes orgnicos (Hernndez-Jstiz et al., 1998). Alm disso, os materiais inorgnicos no apresentam modificao na sua estrutura quando expostos a uma ampla faixa de valores de presso, temperatura e pH. Os taninos so compostos fenlicos com alto peso molecular que apresentam a propriedade de se combinar com protenas, formando complexos (Leka e Lonsane. 1997). Podem estar presentes em folhas, frutas, cascas, podendo se acumular em grandes quantidades em tecidos vegetais especficos (Pinto et al. 2005). Os complexos formados com as protenas so de especial interesse para as indstrias de curtimento e de bebidas. Nesta ltima, causam grandes problemas nos processos industriais, como por exemplo na produo de chs gelados formando uma espcie de creme (Makkar, 1998; Santos et al. 1997). Os taninos representam o segundo maior grupo entre os compostos fenlicos e o quarto constituinte mais abundante nos vegetais (Haslam 2007 e Pinto et al. 2005). So divididos em dois grupos com base na sua estrutura molecular: os

taninos hidrolisveis e as proantocianidinas (Aguilar e Guitirrez-Snchez 2001). Os taninos hidrolisveis so constitudos por polisteres de cido glico e diferentes carboidratos. A molcula com um poliol, em geral a glicose, compe o ncleo central, cujos radicais hidroxil podem estar parcialmente ou totalmente esterificados com radicais galoil. Esses taninos so hidrolisveis por cidos, bases e enzimas em suas unidades formadoras, sendo divididos em galotaninos e elagitaninos. As
3

Introduo

proantocianidinas tambm chamadas de taninos condensados por causa da sua estrutura qumica compacta. So constitudas por oligmeros ou polmeros de unidades flavonides unidas por ligaes carbono-carbono no suscetveis clivagem por hidrlise. Existem atualmente na literatura, vrios mtodos para determinao de taninos hidrolisveis, entretanto cada um apresenta restries de aplicao, principalmente no que se diz respeito a sua aplicao em amostras reais. Inoue e Hagerman (1988) desenvolveu um procedimento para determinao de taninos hidrolisveis, que envolve a formao de complexo com a rodanina, porm esse mtodo s eficiente para os galotaninos. Wilson e Hagerman (1990) relataram um aperfeioamento da metodologia que utiliza NaNO2 como reagente, mas esse mtodo eficiente apenas para a quantificao de acido elgico, cido formado pela hidrlise dos elagitaninos. J Bate Smith (1977) descreve um mtodo para determinao tanto de galotaninos como de elagitaninos, contudo esse mtodo apresenta dois pontos crticos, temperatura e tempo de reao, j que em temperaturas elevadas aceleram a reao e o complexo formado s estvel em um curto espao de tempo. Zhao et al., (1998) desenvolveram um sensor microbiano para determinao de cido tnico (tipos mais comum utilizado como padro para quantificao de tanino), baseando-se na variao de oxignio gerada pela degradao do composto orgnico (cido tnico) pelo microrganismo. Comparando a proposta do sensor para cido tnico com outros biossensores este representa uma nova abordagem conveniente e de baixo custo para a quantificao dos taninos vegetais, porm so necessrias algumas melhorias para torn-lo amplamente aceito na indstria de curtumes de produtos alimentcios e farmacutica.

Introduo

Neste trabalho foi estudado o processo de imobilizao da enzima tanase em suporte vtreo (prola de vidro), bem como as caractersticas bioqumicas (pH e temperatura tima, estabilidade trmica, alcalina e operacional) e as cinticas da tanase imobilizada em prolas de vidro. Suas caractersticas foram avaliadas visando alcanar a melhor condio de atuao para utilizao no desenvolvimento de um biossensor enzimtico para que este possa ser aplicado no futuro na monitorao de taninos hidrolisveis.

Objetivo

CAPTULO 2

OBJETIVO

O objetivo principal deste trabalho foi alcanar o desenvolvimento preliminar de um Biossensor Enzimtico, capaz de quantificar a concentrao de taninos hidrolisveis, para que futuramente, este possa ser integrado a um biorreator para monitorar continuamente de forma adequada a concentrao de taninos. Para o desenvolvimento preliminar do biossensor para taninos foram realizadas vrias etapas iniciais, que esto descritas a seguir: Seleo mediante pesquisa bibliogrfica do componente biolgico a ser utilizado, baseado na sua reao biolgica. Imobilizao do componente biolgico e estudo da eficincia da imobilizao, usando suporte inorgnicos, prolas de vidro. Avaliao do tempo de vida til do componente imobilizado Estudo comparativo da eficincia do mtodo de imobilizao e avaliao do reuso do suporte. Avaliao das melhores condies de atuao do componente biolgico imobilizado (pH, temperatura, etc.).
6

Objetivo

Determinao da faixa de concentrao do substrato a ser medida atravs tambm da determinao da atividade do componente biolgico.

Teste da estabilidade da enzima tanase imobilizada sob condies de estocagem.

Seleo do transdutor apropriado para medio, baseado nos produtos das reaes biolgicas e realizao de testes preliminares usando o transdutor mais adequado.

Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 3

REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 - TANINOS Nos vegetais encontramos quantidades relativamente importantes de compostos fenlicos. Seu papel essencialmente proteger os tecidos contra o ataque de insetos, fungos ou de bactrias (Haslam, 2007; Pinto et al.,2005; Lekha e Lonsane, 1997), sendo considerado um sistema de defesa passiva relativamente eficaz. As plantas podem igualmente produzir grandes quantidades de fenis a partir de uma alterao na superfcie das clulas vivas: a defesa ativa. O melhor exemplo dado pela picada dos insetos nas folhas que so a origem da formao das galhas (Haslam 2007). O termo tanino possui diferentes definies, Lekha e Lonsane (1997) definem taninos como sendo, compostos fenlicos com alto peso molecular (500 a 3000 Kda.) que possuem a propriedade de combinar-se com protenas, celulose e pectina formando um complexo insolvel. J Bate-Smith definem taninos como compostos fenlicos solveis em gua, com peso molecular entre 500 e 3000 u.m.a e habilidade para precipitar protena. Mais especificamente os taninos so compostos de alto peso molecular, que contm suficientes grupamentos hidroxila fenlica, para

Reviso Bibliogrfica

permitir a formao de ligaes cruzadas estveis com protenas (Mueller-Harvey, 2001). Na forma no oxidada os taninos reagem com as protenas atravs de pontes de hidrognio e/ou ligaes hidrofbicas. Quando oxidados os taninos se transformam em quinonas, as quais formam ligaes covalentes com alguns grupos funcionais das protenas, principalmente os grupos sulfidrilos da cistena e amino da lisina (Sgarbieri, 1996). Esta classe de compostos fenlicos o quarto mais abundante constituinte vegetal, depois da celulose, hemicelulose e lignina (Haslam, 2007). Atuam como parte do mecanismo de defesa dos vegetais contra microrganismos, herbvoros e condies ambientais hostis. As plantas que contm altos nveis de taninos apresentam vantagem evolucionrias significativas sobre seus predadores e outras espcies vegetais, que competem pelo mesmo nicho. Altas quantidades de taninos esto associadas com a resistncia de vegetais ao ataque microbiano (Aerts et al.,1999; Pansera et al., 2003). Os taninos so compostos presentes em alimentos e bebidas, principalmente na cerveja, ch e vinho (Pansera et al., 2003). Esses componentes so muito importantes na indstria de alimentos, principalmente pelas influncias que apresentam sobre suas caractersticas fsico-qumicas, por formarem precipitados com protenas e alguns sais e estarem sensorialmente ligados a adstringncia de certos frutos, alm de apresentarem ao antioxidante. A propriedade que os taninos possuem de causar adstringncia est envolvida diretamente com a sua capacidade de interagir com protenas, gerando principalmente uma interao covalente (Poncet-Legrand et al. 2006). A
9

Reviso Bibliogrfica

adstringncia a percepo sensorial da presena de taninos, sendo que tal percepo na boca no ocorre de forma imediata, requer um determinado tempo para se desenvolver (Bate-Smith, 1954) A perda da adstringncia a principal mudana que ocorre durante o amadurecimento das frutas comestveis. Tal fato pode estar associado, ou no, reduo do contedo de taninos. Frutas como caqui (Diospuros Kako) e o caj (Anacarduim occidentale), por vezes so adstringentes mesmo quando maduros (Haslam e Lilley, 1988; Pinto, 2003) Uma classificao baseada nos tipos estruturais,divide os taninos em hidrolisveis e condensados.

3.1.1 TANINOS HIDROLISVEIS So polisteres de acido glico e diferentes carboidratos que podem ser hidrolisados por cidos, bases ou enzimas (por exemplo a tanase) acares ou alcois e cidos carboxlicos fenlicos. A molcula com um poliol, em geral glicose, compe o ncleo central, cujos radicais hidroxil podem estar parcialmente ou totalmente esterificado com radical galoil. Para serem considerados taninos necessrio que pelo menos 3 grupamentos hidroxil da molcula de glicose estejam esterificados para exibir a capacidade de se ligar e precipitar protenas (MuellerHarvey, 2001; Aguilar e Guitirrez-Snchez 2001). Existe na natureza uma grande nmero de molculas de taninos hidrolisveis. A variao de estruturas entre estes componentes causada por reaes oxidativas de unidades de cidos glico vizinhos ou por oxidao do anel aromtico. A Figura
10

Reviso Bibliogrfica

3.1 mostra um exemplo desses dois tipos de reaes. As reaes de acoplamento oxidativo podem produzir taninos hidrolisveis longos e complexos (Mueller-Harvey, 2001).

Figura 3.1: Reao de oxidao do anel aromtico de unidades de cido glico (Mueller-Harvey, 2001). A Figura 3.2 mostra a estrutura qumica de um tanino hidrolisvel formado pela unio oxidativa entre duas molculas de cidos glico, cada qual unida por diferente anis de glicose. Cabe ressaltar que a maioria das determinaes colorimtricas dos taninos hidrolisveis detecta somente o grupo galoil, mas no os produtos mais complexos da reao descritos nas Figuras 3.1 e 3.2.

11

Reviso Bibliogrfica

Figura 3.2: Reao oxidativa de formao de um tanino hidrolisvel (MuellerHarvey, 2001) Os taninos hidrolisveis de acordo com a sua estrutura, podem ser divididos em duas sub-classes : galotaninos e elagitaninos (Figura 3.3). Nos galotaninos, os grupos fenlicos que esterificam o ncleo glicosdico so constitudos pelo acido glico, ou pelo cido diglico, estando as duas unidades galoil unidas por ligaes depsdicas. Nos elagitaninos, os grupos fenlicos utilizados so molculas de cido hexahidroxidifnico que podem se desidratar espontneamente para formar sua dilactona estvel, o cido elgico.

12

Reviso Bibliogrfica

Figura 3.3: Diviso dos taninos hidrolisveis (Mueller-Harvey, 2001).

3.1.2 TANINOS CONDENSADOS PROANTOCIANIDINAS Proantocianidinas tambm conhecidas como taninos condensadas, so oligmeros ou polmeros de unidades flavonides unidas por ligaes carbonocarbono, no suscetveis clivagem por hidrlise (Figura 3.4). O tamanho das molculas pode ser descrito pelo seu grau de polimerizao. Ao contrrio dos taninos hidrolisveis, proantocianidinas no contm resduos de carboidratos. Contm de 2 a 50 ou mais unidades flavonides, podendo atingir massas moleculares superiores a 20 KDa (Lekha e Lonsane, 1997).

13

Reviso Bibliogrfica

Figura 3.4: Taninos condensados (Mueller-Harvey, 2001) Proantocianidinas so de grande interesse na medicina e na nutrio pela sua potente capacidade de agir como antioxidante e possveis efeitos sobre a proteo da sade humana. Recentemente foi relatada a hiptese de que as

proantocianidinas podem reduzir o risco de doenas cardiovasculares, cncer e coagulao sangunea, alm de que, alguns de tipos podem auxiliar no trato urinrio. Estudos anteriores constataram que houve uma relao direta entre atividade antioxidante destes compostos fenlicos totais presentes em ervas, legumes e frutas selecionadas (Barahona et al., 2006, Ferwerda et al., 2006). As proantocianidinas apresentam uma diversidade estrutural devido ao grande nmero de grupos hidroxilas presente em cada unidade, estereoqumica dos trs centros quirais do anel B (Figura 3.4), localizao das ligaes interflavanas e em menor proporo, as possveis derivatizaes como Ometilalao ou de O-glicosilaes. Em razo de suas estruturas qumicas, sem a
14

Reviso Bibliogrfica

presena de ligaes ster e depsdica, as proantocianidinas no so suscetveis a hidrlise pela enzima tanase. (Barahona et al., 2006; Aguilar e Guitirrez-Snchez 2001, Pinto et al,2005).

3.1.3 TANINOS NA INDSTRIA Os taninos industriais so extrados a partir de um grande nmero de espcies vegetais e so encontrados nas partes lignificadas, nos frutos e nas protuberncias de origem patgena apresentadas como forma de marcas ou cicatrizes em frutos e nas folhas. Seu campo de utilizao compreende as indstrias agro-alimentares, farmacolgicas e de curtimento de couros. Na indstria alimentcia os taninos so usados como antioxidante em sucos de frutas e bebidas, como corantes txteis na produo de borrachas e como coagulantes e floculantes na tratamento de gua em barragens (Santos e Melo, 1999). Tambm podem ser aplicados no curtimento do couro, em funo da sua capacidade de se combinar com protenas da pele animal, ou seja, na associao dos polifenois com a protena do colgeno que ir inibir o processo de putrefao da pele (Khandnbabaee e Ree, 2001). Tambm so considerados potentes inibidores de enzimas devido a sua complexao com protenas enzimticas (Naczk et al., 1994). Os taninos condensados esto presentes na frao da fibra alimentar de diferentes alimentos e podem ser considerados indigerveis ou pobremente digerveis. Em leguminosas e cereais os taninos tm recebido considervel ateno, devido aos seus efeitos adversos na cor, sabor e qualidade nutricional (Salunkhe et al., 1982).
15

Reviso Bibliogrfica

3.1.4 MTODOS DE QUANTIFICAO DE TANINOS Bate- Smith (1977) descreveram um procedimento para determinao de taninos hidrolisveis em plantas da espcie Aces, na qual produz uma cor rosa aps a reao com KIO3. Hagerman et al. (1997) notou que esta anlise no seria compatvel com misturas complexas de taninos, j que estes tentem a adquirir uma colorao marrom frente a cor rosa. Alm disso, esta anlise no considerada confivel pois o desenvolvimento da cor criticamente dependente da temperatura e do tempo de reao. Willis e Alen (1998) re-examinaram tal metodologia de anlise em detalhes e sugeriram um aperfeiomento do protocolo para determinao de galotanino e elagitanino. Inoue e Hagerman (1988) relataram um mtodo para determinao de galotaninos, que envolve a formao de um complexo entre rodanina e o cido glico, liberado aps uma etapa de hidrlise cida do tanino. O complexo, que possui absorbncia mxima a 520 nm, resulta da reao da rodanina com os grupos hidroxil vicinais do cido glico. As molculas de rodanina que no reagiram, no apresentam em soluo bsica absorbncias em comprimentos de onda superiores a 450 nm. A rodanina apresenta baixa ou nenhuma afinidade pelos grupos hidroxil de radicais galoil presentes na estrutura dos taninos e tambm pode reagir, em solues alcalinas, com quinonas ou hidroquinonas, sendo que os produtos destas reaes absorvem em comprimentos de onda maiores (Thies e Fischer, 1973). Desta forma, este mtodo muito til para anlises rotineiras, pois apresenta alta especificidade (sem interferncia dos compostos vegetais fenlicos), sensibilidade e preciso.

16

Reviso Bibliogrfica

Wilson e Hagerman (1990) relataram um aperfeioamento da anlise com o reagente NaNO2 que foi primeiramente descrido por Bate-Smith para determinao de elagitaninos. Com as modificaes feitas por Wilson e Hagerman (1990) a anlise tornou-se seletiva somente para determinao do cido elgico de forma que o cido glico, galotaninos, elagitaninos, taninos condensados e flavonides no iram mais interferir na quantificao. A carncia de mtodos analticos prticos, rpidos e seguros para a quantificao de taninos e ainda metodologias que sejam capazes de discrimin-los torna necessria a busca por tcnicas ou instrumentos de medidas alternativas e mais eficientes como por exemplos os chamados biossensores.

3.2 BIOSSENSORES O uso de enzimas para fins analticos vem crescendo a cada dia, desde a dcada de 60 quando Clark e Lyons (1962) tiveram a idia de usar uma enzima aliada a um eletrodo para determinao de glicose para controle de diabetes. Neste caso um sensor foi desenvolvido baseado na oxidao de glicose a cido glicnico, envolvendo consumo de oxignio e formao de perxido de hidrognio por ao da enzima glicose oxidase, de forma que o oxignio ou perxido consumido poderiam ser detectados. Posteriormente os dispositivos criados a partir da juno de uma enzima com um eletrodo receberam o nome de Eletrodos Enzimticos. Contudo, com o desenvolvimento intensivo na busca de novos sensores fsico-qumicos, em

17

Reviso Bibliogrfica

especial, utilizando-se reaes enzimticas variadas, foi introduzido um termo mais genrico e abrangente, o de Biossensor (Alfaya et.al, 2002; Rosatto, 2000). A cincia dos biossensores uma rea multidisciplinar para a qual no existe forma delineada. A rpida proliferao dos biossensores e sua diversidade podem justificar as vrias formas de definio de um biossensor que se encontram na literatura, mas de forma geral trata-se de uma ferramenta analtica que combinam biomolculas imobilizadas com transdutores qumicos ou fsicos para criar uma superfcie que permita a medio direta, possivelmente contnua, de um analito especfico. Assim um biossensor combina a especificidade de um componente biolgico ativo para o analito de interesse com a sensibilidade de um transdutor para converter o sinal biolgico em um sinal eltrico proporcional concentrao do analito (Salgado, 2001). Um biossensor deve ser claramente diferenciado de um sistema bioanalitico que requer etapas adicionais de processamento, tais como, adio de reagentes e o componente biolgico no esta necessariamente ligado diretamente ao detector. Os biossensores fornecem informaes analticas quantitativas usando um elemento biolgico reconhecedor incorporado a um transdutor que deve ser capaz de converter a resposta qumica em um sinal apropriado. O elemento chave do biossensor a camada sensora, constituda por biomolculas, que permite avaliar a concentrao de componente desejado contido na amostra. A escolha do material biolgico e do transdutor adequado depende de cada amostra e do tipo de medida em que se tem interesse. O biocomponente determina o grau de seletividade ou especificidade do biossensor. O reconhecimento seletivo a principal caracterstica da tecnologia dos biossensores. Diferentes materiais e transdutores tem sido

18

Reviso Bibliogrfica

empregados na construo dos biossensores sendo os eletroqumicos os mais populares, pois apresentam resposta rpida, possuem a vantagem de serem econmicos e a possibilidade de automao, permitindo sua aplicao em um grande nmero de amostras (Mello et.al, 2007; Perez, 2000). O desenvolvimento dos biossensores em particular definido pelas exigncias regulatrias e natureza da aplicao destes e alguns fatores desempenham um papel decisivo na arquitetura do sensor como sensibilidade, meio ambiente de amostra, custo, tempo de vida til e uso especifico. Alm disso, para ser usado como instrumento de anlise o biossensor deve apresentar as seguintes caractersticas: seletividade, exemplificada pela especificidade das enzimas; faixa de sensibilidade; acurcia e preciso; tempo de resposta e de recuperao; freqncia de amostragem; estabilidade operacional e reprodutibilidade dos resultados, entre outros. (Arya et al., 2008, Rosatto, 2000)

3.2.1 FUNCIONAMENTO DE UM BIOSSENSOR Uma caracterstica dos biossensores que os diferencia dos sensores qumicos a especificidade da anlise. As divises da qumica analtica e fsico-qumica da UIPAC propuseram uma definio para biossensores: um biossensor um dispositivo que capaz de fornecer informao analtica especifica, quantitativa ou semi-quantitativa usando um elemento de reconhecimento biolgico (receptor bioqumico) o qual est em contato espacial direto com um elemento de transduo. Ento, de um modo geral, um biossensor formado de duas partes: o componente biolgico e o transdutor. O componente biolgico faz o reconhecimento da substncia de interesse por meio de uma reao qumica gerando um sinal que
19

Reviso Bibliogrfica

pode resultar de uma variao na concentrao de prtons, liberao de gases, emisso ou absoro de luz, emisso de calor, variao de massa, mudana de estado de oxidao, etc. o transdutor converte este sinal em uma resposta mensurvel tal como: corrente, potencial, variao de temperatura, etc. (Salgado, 2001; Perez, 2000). O funcionamento de um biossensor de uma forma geral envolve a especificidade e alta sensibilidade do componente biolgico com o substrato de interesse. Em seguida como produto desta interao entre a molcula biolgica e o substrato, variaes de um ou mais parmetros fsico-qumicos so convertidos em um sinal eltrico quantificvel e processvel pelo uso de um transdutor adequado (Figura 3.5) (Arya et al., 2008).

Figura 3.5: Esquema geral de funcionamento de um biossensor (Arya, et al., 2008).

20

Reviso Bibliogrfica

3.2.2 COMPONENTE BIOLGICO A seletividade, habilidade para discriminar um entre diferentes substratos, que uma das caractersticas mais importantes de um biossensor, uma funo principalmente do componente biolgico, embora algumas vezes o transdutor tambm contribua para a seletividade. Por isso, enzimas foram e continuam sendo o elemento biolgico mais usado na construo de biossensores (Du, et al., 2008; Alfaya et.al, 2002). Alguns requisitos bsicos so exigidos na escolha de um biocomposto para atuar como elemento de reconhecimento biolgico, como disponibilidade de um stio reativo que posso reagir/ interagir com o analito, estabilidade face ao meio e as condies de medio e possibilidade de modificao/ imobilizao sobre suporte por mtodo qumicos sem afetar o seu desempenho (Salgado, 2001). Baseado nestas exigncias alguns biocompostos se adquam para o uso na composio dos sensores (Figura 3.6). Assim de acordo com a sensibilidade do biocomposto

utilizado para a sua construo os biossensores podem ser divididos em vrias classes (Figura 3.6), mas dentre as classes existentes quatro so as mais desenvolvidas, que so dos biossensores enzimticos, microbiolgicos, os quimioreceptores e os imunossensores.

21

Reviso Bibliogrfica

Figura 3.6: Classificao dos biossensores de acordo com o Elemento Biolgico Sensvel (Salgado, 2001). Biossensores Enzimticos A maior parte dos biossensores desenvolvidos utiliza como componente biolgico enzimas, em geral imobilizadas. A vantagem do uso deste componente que as enzimas so catalisadores biolgicos altamente especficos e seletivos. Comparados com os catalisadores qumicos, as enzimas apresentam um alto nvel de especificidade com o substrato, devido principalmente ligao forte na molcula de substrato pelo seu sitio ativo envolvendo fatores do meio ambiente reacional tais

22

Reviso Bibliogrfica

como, tamanho da molcula substrato, polaridade, grupos funcionais ligados e relativa energia de ligao. Uma desvantagem em relao ao uso de enzimas na construo de um biossensor o fato de apresentar uma estabilidade relativamente baixa, principalmente no que diz respeito a variao das condies fsico-qumicas do meio reacional, mas que podem ser contornados usando as condies adequada de pH, temperatura e presso que garantam a manuteno da atividade enzimtica.

Biossensores Microbiolgicos Os biossensores microbiolgicos so formados por um microrganismo imobilizado, sensvel e que especificamente reconhece a espcie de interesse, interligada a um adequado sistema de transduo.O princpio de funcionamento dessa classe de biossensores envolve assimilao do composto orgnico pelo microrganismo, acompanhado por uma variao na atividade respiratria ou na produo de metabolitos, que so monitorados diretamente por um transdutor.

Imunossensores Utilizam protenas globulares de soro (tais como imunoglobulinas) que formam parte de um importante grupo de protenas altamente ligveis. Anticorpos ligam-se a substncias particulares (antgenos) com alta especificidade e alta afinidade. O principal problema deste biossensor o elevado peso molecular dos anticorpos que dificulta a sua adaptao ao transdutor.
23

Reviso Bibliogrfica

Quimioreceptores Trata-se de um sistema que utiliza protenas que interagem com espcies qumicas, tais como hormnios, resultando em variaes conformacionais. Apresentam problemas de ligao ao transdutor, dificuldade de manipulao e um tempo de vida curto.

3.2.3 TRANSDUTOR A escolha do transdutor realizada mediante trs requisitos bsicos: que ele seja adequado para adaptao ao material biolgico imobilizado, que seja altamente especifico para o analito de interesse, sendo capaz de detectar alguma variao especfica que ocorra durante a reao biolgica e que esta variao ocorra na faixa de concentrao apropriada (Salgado 1997; Mello e Kubota, 2002). Dos vrios transdutores empregados na construo dos biossensores, os mais utilizados so os eletroqumicos, ticos e calorimtricos. Na Tabela 1.1 encontram-se os vrios sistemas de transduo, seus modos de medio e aplicao tpica (Mascini, et al., 2001; Habermuller, et al. 2000).

24

Reviso Bibliogrfica

Tabela 3.1: Tipos de transdutores empregados em biossensores

Sistema Transduo Modo de Medida Aplicao Tpica

Eletroqumico

Condutimtrico

Condutncia

Reao catalizadas por enzimas

Eletrodo enzimtico

Amperomtrico (corrente)

Substratos enzimticos e sistemas imunolgicos (antgenos/anticorpo)

Transistores de Efeito de campo (FET)

Potenciomtrico (voltagem)

ons, gases, substratos enzimticos e analitos imunolgicos

Eletrodo ons seletivos (ISE)

Potenciomtrico (voltagem)

Ions em meio biolgicos, eletrodos enzimticos, imunoeletrodos

Eletrodo sensveis a gases

Potenciomtrico (voltagem)

Eletrodo de gases, enzimas, organelas, clulas ou tecidos, imunoeletrodos enzimticos

Impedimtrico

Impedncia

Imunosensores enzimticos

Cristais Piezo Eltricos, Equipamentos de superfcie acstica

Variao de massa

Gases volteis, vapores e analitos imunolgicos

Optoeletrnicos, fibras ticas

ticos

pH, substrato enzimticos, analitos imunolgicos

Termistores, Diodos

Termomtrico/ calorimtrico (calor)

Enzimas, organelas, clulas integradas ou tecidos, sensores para substratos, gases, poluentes, Antibiticos, vitaminas, analitos imunolgicos

25

Reviso Bibliogrfica

Assim como os bissosensores foram classificados de acordo com o componente biolgico utilizados, pode-se tambm fazer uma classificao de acordo com o sistema de transduo utilizado. Desta forma, os biossensores podem ser classificados em: Eletroqumicos (Amperometricos, Potenciometrico e

Condutimtrico), Calorimetricos ou ticos.

BIOSSENSORES ELETROQUMICOS Essa classe de biossensores se caracteriza por serem, simples, sensveis, confiveis, de resposta rpida, necessitam de instrumentao de baixo custo, operam em condies em que no necessrio um pr-tratamento da amostra e permitem efetuar determinaes em uma ampla faixa de concentrao. As tcnicas eletrostticas so capazes de fornecer limites de deteco excepcionalmente baixos e uma abundncia de informaes que caracterizam e descrevem eletroquimicamente determinados sistemas, sempre baseado nas propriedades eltricas de uma soluo de analito quando ele esta em contato com uma clula eletroqumica. Tais informaes incluem a estequiometria e a velocidade de transferncia de carga interfacial, a velocidade de transferncia de massa, a extenso de adsoro e de quimissoro e as velocidades e constantes de equilbrio de reaes qumicas. Uma vantagem deste mtodo que clulas eletroqumicas so freqentemente especficas para um estado de oxidao particular e sua instrumentao relativamente barata. Todas estas vantagens fazem com que os biossensores eletroqumicos constituam a grande maioria dos biossensores desenvolvidos (Castilho, 2003).

26

Reviso Bibliogrfica

Dependendo do princpio de medio estes podem ser divididos em amperomtricos, potenciomtricos e condutimtricos.

BIOSSENSORES AMPEROMTRICOS O principio de funcionamento de um biossensor amperometrico a medida da corrente produzida por uma reao qumica entre espcies eletroativas. Esta reao qumica ocorre num potencial determinado e a corrente gerada est relacionada com a espcie em soluo. Assim estes biossensores dependem tipicamente de um sistema biolgico que converta cataliticamente analitos inativos eletroquimicamente em produtos que possam ser oxidados ou reduzidos em um eletrodo operante, o qual mantido em um potencial especfico de acordo com um eletrodo de referncia. A corrente produzida pela reao redox linearmente proporcional concentrao do produto eletroativo, a qual proporcional ao analito (substrato da enzima) no eletroativo (Demir et al., 2008). Todavia, como estes biossensores so operados por difuso, as principais desvantagens apresentadas por eles so: uma faixa dinmica pequena devido cintica de saturao da enzima, os potenciais relativamente elevados podem oxidar espcies diferentes do composto de interesse, a corrente pode ser afetada pela velocidade com a qual o analito difunde at a superfcie do eletrodo. Algumas inovaes tm tentado superar estes problemas, como o uso de membranas limitantes de difuso para manter as concentraes de substrato abaixo dos nveis de saturao da enzima e o uso de mediadores (Perez, 2000).

27

Reviso Bibliogrfica

construo

de

eletrodos

quimicamente

modificados

atravs

do

desenvolvimento de tcnicas de imobilizao tanto das enzimas como dos mediadores fez surgir uma nova classe de transdutores amperomtricos. Os mediadores podem ser incorporados aos eletrodos por adsoro, ocluso em filmes polimricos, ligao covalente ou simplesmente misturadas em pasta de carbono (Romani et al., 2000). Este tipo de biossensor representa a maioria dos dispositivos comerciais disponveis atualmente, isto porque estes eletrodos so baseados em enzimas redox (oxiredutases) e existem um grande nmero destas enzimas comerciais disponveis que podem atuar em cidos graxos, acares, aminocidos, aldedos e fenis.

BIOSSENSORES POTENCIOMTRICOS Os biossensores potenciomtricos em geral utilizam um eletrodo de referncia (inerte) e um eletrodo operante, preferencialmente eletrodos gases ou ons seletivos, ambos em contato com a amostra, e se baseiam no desenvolvimento de um potencial significativo no eletrodo operante por acumulao da carga e portanto, densidade de carga aumentada na superfcie do eletrlito. Desta forma, enzimas consomem ou produzem espcies qumicas fortemente polares ou ons, em decorrncia da catlise, e esta espcies so detectadas pelo eletrodo de ons seletivos e so transformadas em um sinal possvel de ser lido e determinado (Cabral et al, 2003; Arya et al., 2006). Os eletrodos de ons seletivos apresentam as vantagens de serem rpidos, sensveis, de baixo custo e apresentarem simplicidade na medio, onde somente a
28

Reviso Bibliogrfica

medio do pH necessria, no um sistema polarogrfico como requer os sensores amperometricos. Em geral a faixa analtica destes sensores de 10-1 a 105

mol e como sua resposta logartmica, j que o potencial eltrico desenvolvido

pelo eletrodo proporcional ao logaritmo da atividade do on em soluo, a preciso da medida constante por toda sua faixa dinmica (Salgado, 2001)

BIOSSENSORES CONDUTIMTRICOS Poucos biossensores que utilizam transdutores condutimtricos tm sido desenvolvidos, em funo da dificuldade de efetuar medidas condutimtricas com dispositivos simples, do sinal depender fortemente da temperatura (so sensveis a variaes de temperatura na ordem de 1C) e por no poder usar amostras sem diluio prvia. Biossensores baseados na medio de condutncia esto relacionados ao uso de enzimas que produzem ou consomem espcies inicas, nas reaes por elas catalisadas, alterando a condutividade global da soluo. Muitas reaes enzimticas produzem uma variao de condutividade, mas somente poucas oferecem um sinal de magnitude estvel. Equipamentos microeletrnicos contendo a enzima imobilizada tm sido usado no desenvolvimento de biossensores condutimtricos. O principio de funcionamento envolve um par de microeletrodos separados por uma soluo de eletrlito contendo a enzima e a amostra a ser detectada. O campo eltrico gerado pela aplicao de uma voltagem nos microeletrodos, onde ocorrem variaes das concentraes de espcies polarizadas (Cabral et al., 2003).

29

Reviso Bibliogrfica

BIOSSENSORES TICOS A utilizao de fibras ticas e sistemas ticos integrados ou de transdutores para medio em reaes biolgicas tem se tornado extremamente vantajosa, levando os biossensores ticos a terem uma especial ateno. Devido a sua confiabilidade e grande variedade, os mtodos ticos de transduo fsica so muito usados em anlises bioqumicas para quantificao de determinadas substncias. Estes mtodos, tais como, absoro, fluorescncia fosforescncia, polarizao, interferncia, podem ser usados em sensores de estados slidos, atravs do uso de um transdutor tico associado a um componente biolgico imobilizado, juntamente com um indicador ou no, formando um instrumento definido como Biossensor tico. O seu princpio se baseia em que, algumas reaes enzimticas alteram a propriedade tica de determinadas substncias e a luz emitida por este elemento biolgico ou sua resposta a iluminao pode ser convenientemente transmitida via fibra tica e monitorada em equipamento tico (Hall, 1990).

BIOSSENSORES CALORIMTRICO Algumas reaes biolgicas so acompanhadas por uma considervel liberao de energia permitindo que estas sejam quantificada calorimtricamente, relacionando-se a evoluo de calor gerado com a quantidade de substrato reagido ou produto formado. Os biossensores calorimtricos permitem este

acompanhamento, embora tenham as desvantagem de apresentarem altos custos, serem altamente complexos e terem baixa especificidade na anlise, pois toda
30

Reviso Bibliogrfica

variao de entalpia ocorrida seja na reao de mistura ou pelo efeito da diluio e solvatao ou mesmo perda de calor para o exterior, contribui para o resultado final ocasionando possveis erros de anlise (Spink et al., 1976).

3.2.4 APLICAO DOS BIOSSENSORES O emprego industrial dos biossensores tende a crescer, em particular nas indstrias qumicas e demais setores correlatos, o que inclu a indstria farmacutica e de alimentos. Assim um vasto campo de aplicao est em constante desenvolvimento e alguns eletrodos enzimticos, j se apresentaram bem estabelecidos para anlises de diagnsticos. A capacidade destes sensores em determinar de forma seletiva analitos em amostras complexas, apresentarem rapidez de anlise, a diminurem custo e resduos gerados por anlise, tem atrado o interesse de diferentes reas como medicina, ambiental, alimentcia, e da biotecnologia na sua aplicao. A maior motivao a possibilidade de monitorar continuamente in vivo ou on-line estes processos. As caractersticas dos biossensores so vantajosas em relao aos eletrodos convencionais ou a tcnicas off-line que utilizam HPLC ou

espectroscopia de massa, uma vez que estas tcnicas convencionais requerem preparao da amostra, equipamentos caros e um longo tempo de processamento. Na rea de analises clnica uma aplicao importante dos biossensores est relacionada com o controle de glicose em pacientes com diabete e mais recentemente no controle do colesterol (Arya et al.,2008).

31

Reviso Bibliogrfica

Na indstria biotecnolgica, os biossensores tm sido largamente utilizados para deteco de vrios nutrientes, em especial podemos citar fontes de carbono (glicose, amido, etc.) presentes nos meios de cultivo de bactrias, leveduras e fungos filamentosos e na indstria alimentcia e fermentativa de levedura de po, de cerveja e vinho (Campanella et al., 2008; Cabral et al., 2003). Na rea ambiental, os biossensores so usados na monitorao e controle do ambiente, principalmente na deteco de metais pesados em amostras de solo e herbicidas e pesticidas em amostras de gua de rios e lagoas. Mais recentemente, os biossensores tem tido uma utilizao crescente com o desenvolvimento de dispositivos analticos com capacidades de resposta em tempo real, na deteco e monitorao de agentes qumicos e biolgicos perigosos. Da grande maioria dos biossensores utilizados nas mais diferentes reas, os biossensores enzimticos eletroqumicos apresentam-se como predominantes.

3.3 ENZIMAS Enzimas so, em sua maioria, protenas de elevado peso molecular, com propriedades catalticas especficas presentes em todos os seres vivos. Elas possuem uma estrutura tridimensional complexa de uma ou vrias cadeias polipeptdicas. Muitas enzimas tambm contm constituintes no peptdicos, como por exemplo, uma considervel quantidade de resduos de carboidratos. Como outros catalisadores elas aceleram as reaes promovendo o alcance do equilbrio sem alter-las, atravs da diminuio da energia de ativao. Alm da sua funo cataltica, enzimas so caracterizadas por sua alta especificidade. Elas catalisam
32

Reviso Bibliogrfica

uma certa espcie de reao qumica com um nico reagente ou um nmero de reagentes estruturalmente similares. Dessa forma, a razo principal para o amplo uso de enzimas em biossensores envolve sua especificidade e suas propriedades catalticas. As reaes catalisadas por enzimas podem ser usadas para a determinao de substratos, ativadores, inibidores e tambm da prpria enzima (Lehninger, 1989.). A classificao de enzimas envolve uma diviso de seis grupos principais de acordo com o tipo de reao que elas catalisam: 1 xido redutase , 2 transferase , 3 hidrolase, 4 liases, 5 isomerase, 6 ligase. Dentro de uma classe, por exemplo, as xido redutases, so subdivididas conforme o grupo prosttico: flavina, quinona, heme ou cobre. Muitas so as enzimas que podem ser utilizadas em biossensores. Os reagentes consumidos ou produtos formados podem ser detectados ou medidos atravs de transdutores. Contudo, existe uma classe de enzimas que, em comparao com os outros grupos, tem sido especialmente utilizado: as xidoredutases. Este grupo de enzimas catalisa reaes de oxido-reduo ou redox que envolvem processos de transferncia de eletrons na converso enzimtica do reagente em produto (Lehninger, 1989; Cabral, 2003). Atualmente cerca de 50 tipos de enzimas entre elas podemos citar as fosfatases, esterases, nucleases, descarboxilase, vm sendo estudadas visando sua futura utilizao na confeco dos biossensores. Isto se deve ao crescente aumento da utilizao de enzima nos diagnsticos clnicos, j que para tais fins estas devem possuir elevado grau de pureza, implicando na utilizao de processos de purificao complexos e dispendiosos
33

Reviso Bibliogrfica

3.3.1 ATIVIDADE ENZIMTICA Dentre os parmetros analisados de uma enzima a atividade enzimtica, corresponde a um ponto chave para avaliao do potencial de aplicao desta no desenvolvimento de um biossensor. A velocidade inicial de uma reao enzimtica diretamente proporcional ao numero de stios ativos presentes, quando a concentrao de substrato no esta em nveis de saturao e outras variveis so otimizadas e mantidas (Lehninger, 1989). A saturao do substrato (elevada concentrao) limita a reao apenas pela concentrao da enzima. Nestas condies, a atividade enzimtica pode ser estimada pelo acompanhamento da velocidade reacional. A atividade enzimtica funo direta da estruturas terciria e quaternria da enzima. Todo tratamento que modifique a conformao da enzima como aquecimento, alterao do pH do meio e outros, modifica tambm a estrutura do stio ativo diminuindo suas propriedade catalticas. A unidade de atividade enzimtica, U, estabelecida atravs da medida da velocidade de reao a partir de uma quantidade de substrato consumido (ou produto formado), em uma unidade de tempo. Geralmente definido como quantidade de enzima capaz de converter 1 umol de substrato por minuto em pH e temperatura adequada para cada tipo de enzima. Um grande nmero de outras definies de unidade de atividade tem sido usados. Uma nova unidade internacional para atividade enzimtica recomendada pela Enzyme Commission (Lehninger 1989) denominada Kat que definida como a quantidade de enzima que transforma 1mol por segundo de substrato a 25C. A
34

Reviso Bibliogrfica

nova unidade est de acordo com as dimenses das constantes de velocidade em cintica qumica, sendo expressa tambm em termos de seus submltiplos, mili (m), micro () e nano (n) katals. Assim, 1 kat igual a 6 x 107 unidades de atividade ou a 6 x 107 umol/min de substrato. O kat no usado freqentemente, embora seja uma unidade recomendada pelo Sistema Internacional de Unidade. Ainda segundo Lehninger (1989) outras expresses de atividade tambm podem ser usadas. Atividade especfica expressa em unidade de enzima por miligrama de protena (U/mg). Atividade molecular expressa como unidade por mol de enzima em condies timas de substrato (nmero de molculas de substrato transformado por minuto por molcula de enzima). Existem fatores que afetam as reaes enzimticos atuando no mecanismo cintico dessas reaes, podendo aumentar ou diminuir a velocidade reacional, pela modificao na estrutura dos stios das diferentes enzimas e conseqentemente alterando a atividade cataltica. Os principais fatores so: concentrao do substrato, concentrao de enzima, presena ou ausncia de ativadores e inibidores, temperatura, pH e fora inica da soluo (Lehninger, 1989; Cabral et al, 2003).

3.3.2 TANASE Tanino-acil-hidrolase (E.C. 3.1.1.20), usualmente chamada de tanase, uma enzima que catalisa a hidrlise de ligaes steres e depsdicas de vrios taninos hidrolisveis, como o cido tnico. Esta enzima pode ser encontrada em diferentes vegetais, porm seus principais produtores so os microrganismos, destacando-se
35

Reviso Bibliogrfica

os fungos filamentosos dos gneros Aspergillus e Penicillium. (Chang et al. 2006; Leka e Losane, 1997; Aguilar e Guitirrez-Snchez 2001, Pinto et.al,2005) A aplicao indstrial da tanase, (E.C. 3.1.1.20), bastante diversificada, sendo usada na produo industrial de cido glico cujo ster utilizado como agente conservante, na indstria de alimentos para remover certas substncias indesejveis, na indstria de rao animal, e no tratamento de efluentes de curtumes. Na indstria de alimentos sua maior aplicao no tratamento de folhas ou extratos de folhas de ch, para reduzir o surgimento de turbidez em bebidas geladas, devido a presena de taninos. A tanase apresenta tambm grande potencial de aplicao em sucos de frutas tropicais ricos em taninos.

3.3.2.1 AO DA ENZIMA TANASE A decomposio de taninos hidrolisveis mediada por duas enzimas. Uma com atividade estersica sobre a ligao ster entre o grupo anel aromtico e o resduo de glicose e outra depsidsica sobre a ligao ster entre os anis aromticos (Figura 5.1). Haslam e Stragroom (1966) identificaram que a Tanase era a responsvel pelas duas atividades. Tambm relataram em seu trabalho que a proporo entre duas fraes podia variar de acordo com as condies de cultivo. Beverini e Metche (1990), utilizando colunas de afinidade, fracionaram duas isoformas de Tanase fngica. Ambas apresentaram as duas atividades, contudo a Tanase I possui maior caracterstica estersica, enquanto na Tanase II a atividade depsdica mais pronunciada.
36

Reviso Bibliogrfica

OH O M eO C OH HO OH d e p s id a s e HO H O 2C OH O C OH OH O

e s te re a s e

Figura 3.7: Atividade estersica e depsidase da Tanase (Pinto et al, 2005)

A Figura 3.8 apresenta um modelo proposto para a degradao do cido tnico pela Tanase. Inicialmente, a Tanase rompe as ligaes depsdicas da molcula de cido tnico liberando, 1,2,3,4,6-pentagaloilglicose e quatro molculas de cido glico. Em seguida, os demais resduos galoil, ligados ao ncleo glicosdico, so seqencialmente removidos at a liberao da molcula de glicose e de outras cinco molculas de cido glico (Leka e Losone, 1997; Pinto et al., 2005).

37

Reviso Bibliogrfica

HC

R1 R2 O R1 O R2

HC

R1 R1 O R1

HC O R2 O CH HC HC H2C O O

HC O CH HC HC O

R2

H2C

R1

CHO HC O R1 O CH HC HC H2C O

R1 O R1

CHO HC O CH HC HC O OH O R1

cido Glico + Glicose

OH O R1

H2C

Figura 3.8: Etapas da degradao do cido tnico pela Tanase

3.3.2.2 FONTE DE OBTENO DA ENZIMA TANASE A tanase pode ser obtida a partir de fontes vegetal, principalmente em plantas rica em taninos, de animal, que pode ser extrada da mucosa do intestino dos ruminantes ou fonte microbiana (Sasakia, et al., 2005;). A principal fonte de obteno de tanase a microbiana, pois a produo desta enzima mais estvel do que as similares obtidas a partir de outras fontes. Alguns microrganismos podem produzir tanase em grandes quantidades e de modo constante. Alm disso, os microrganismos podem sofrer modificaes a partir de

38

Reviso Bibliogrfica

novas tcnicas, como a manipulao gentica, que poder resultar em um aumento na produo e na atividade da tanase (Leka e Losone, 1997). A tanase pode ser sintetizada por algumas bactrias, leveduras e fungos filamentosos. relatado que bactrias so muito sensveis presena de cido tnico, mas apenas bactrias da espcie Bacillus, Corybacterium, Streptococcus bovis e Selenomonas ruminantium foram capazes de crescer na presena deste composto e degrad-lo (Sasakia et al., 2005; Aguilar e Guitirrez-Snchez 2001). Candida sp. foi a nica levedura que produziu tanase na presena de acido tnico. A classe de microrganismo mais estudada para a produo de tanase a dos fungos filamentosos entres eles podemos citar Ascochyta, Aspergillus, Chaetomium Mucor, Myrothecium, Neurospora, Rhizopus, Trichothecium e Pencillium. Apesar de vrios microrganismos produzirem tanase, estas no so igualmente ativas com todos os taninos hidrolizveis. As tanases de levedura so efetivas somente na decomposio do cido tnico, em contrapartida as tanases bacterianas e fngicas so eficientes na degradao de cido tnico e outros taninos hidrolizveis que ocorrem na natureza (Pinto, et al. 2005).

3.3.2.3 - PROPRIEDADES DA ENZIMA TANASE A tanase um glicoproteina formada por um mistura de esterase e depsidade. O contedo de carboidratos pode variar de 25,4 a 66,2% do peso total da enzima O papel exato desses elevados contedos de carboidratos no conhecido, suspeitase que seja a maneira de proteger o ncleo protico da ao desnaturante dos taninos hidrolisveis e de direcionar o substrato ao centro ativo da enzima para
39

Reviso Bibliogrfica

possibilitar a quebra desse em seus respectivos componentes, glicose e cido glico (Aguilar e Guitirrez-Snchez, 2001) A tanase apresenta ponto isoeltrico entre 4,0 e 4,5 e peso molecular entre 186 e 300 KDa. Contudo certas propriedade da enzima depende das condies de cultivo. Sua estabilidade em diferentes valores de pH pode variar entre faixas estreitas (5,0 a 5,5) e amplas (3,5 a 8,0), dependendo da fonte de obteno da enzima. Em geral apresenta pH timo em torno de 5,5, porm em alguns relatos da literatura observado a presena de dois picos de pH timos. Tal falto atribudo dupla especificidade de ao da tanase. Um dos valores corresponderia a tima atividade estersica enquanto o outro corresponderia a atividade depsidsica (Lekha e Lonsane, 1997, Pinto, et al., 1997). A temperatura tima para atividade desta enzima ocorre, em geral, prxima a 30oC e 40C (Chang et al., 2006). A estabilidade da tanase ao pH ocorre em uma ampla faixa para vrias linhagens microbianas. Entretanto, as tanases produzidas por A. flavus IFO 5839, A. niger AN11 e P. chrysogenum enquadraram-se em faixas bem mais estreitas (5,0 a 5,5; 5,0 a 6,5 e 4,5 a 6,0, respectivamente). Para a temperatura, a estabilidade da tanase ocorre basicamente entre 10oC e 45C (Aguilar e Guitirrez-Snchez 2001) A tanase tem a sua atividade inibida por ons metlicos como Cu2+, Zn2+ , Fe3+ , Mn2+ e Mg2+ e inativada por diferentes substncias como o-fenantrolina, PMSF, EDTA, 2-mercaptoetanol, etileno diamina e tioglicolato de sdio (Bratali Kar, et al., 2003).

40

Reviso Bibliogrfica

3.4 IMOBILIZAO DO COMPONENTE BIOLGICO

A imobilizao de enzimas teve um desenvolvimento muito grande nos ltimos anos, visto que as vantagens desta tcnica vm sendo, ao longo deste tempo, avaliada e utilizada nas, mais diversas reas. Uma das razes para a grande expanso da tecnologia da imobilizao est ligada ao material de suporte, que pode agir sobre a estabilidade e a eficincia da enzima imobilizada. Quando a enzima est em soluo seu comportamento igual ao de qualquer soluto em que h uma disperso na soluo e os movimentos so livres, porm quando imobilizadas estes movimentos so restritos (Giorno e Drioli, 2000). Para um biossensor a escolha de um mtodo de imobilizao apropriado depende do tipo de transdutor usado, da natureza do analito e das suas condies de operao. Algumas propriedades devem ser observadas na escolha da matriz de imobilizao, tais como: caractersticas fsicas (rea superficial, no compressibilidade,

resistncia, grau de porosidade), qumicas (hidrofibicidade, grupos funcionais passveis de modificao), estabilidade (mecnica e de estocagem), aspectos econmicos (custo beneficio, impacto ambiental, equipamentos e reagentes requeridos) e reaes (limitaes de transferncia de massa, de substncia, de cofatores e de produtos) (DSouza, 2002). As enzimas podem ser imobilizadas sobre um transdutor ou em uma matriz suporte atravs de mtodos fsicos e qumicos. Mtodos como ocluso e adsoro provocam pouca perturbao sobre a funo e a estrutura da enzima e podem ser aplicados a muitas delas (Kennedy et al. 1988). J os qumicos so mais drsticos e podem levar a uma perda da atividade enzimtica, por isso devem ser utilizados com
41

Reviso Bibliogrfica

cautela. O uso dos mtodos qumicos de imobilizao geralmente conferem ao biossensor melhor estabilidade operacional (Yesiloglu, 2005). Nestes mtodos esto includos os de ligaes cruzadas e ligaes covalentes. Quando uma enzima imobilizada, algumas de suas caractersticas podem alterar-se (Worsfold, 1995): Estabilidade a velocidade de desnaturao de uma enzima imobilizada menor do que de uma livre, pois est protegida como se estivesse em seu ambiente natural. Constante de Michaelis-Menten geralmente h um aumento no valor de Km devido modificao na estrutura tridimencional da enzima o que reflete diretamente no abaixamento da atividade cataltica. pH o pH timo para a atividade enzimtica sofre uma mudana, podendo aumentar a faixa, onde no h perda de atividade da enzima imobilizada, em at uma unidade de pH. A utilizao de enzimas em qumica analtica tem sido cada vez mais explorada no sentido de converter enzimas solveis em imobilizadas, aprisionado-as nos mais diversos suportes inertes, nos quais as enzimas mantm suas propriedades catalticas por maior tempo, podendo ser empregada em um maior nmero de anlises (Mateos et al., 2000; Fernandez-Lorente et al., 2001). Cada enzima nica em suas caractersticas e isto influencia na escolha do procedimento de imobilizao. Entretanto, a obteno de um biossensor com estabilidade operacional depende, da estabilidade do suporte e do tipo de amostra, a qual pode conter diferentes ativadores e/ou inibidores. Como no existe um mtodo
42

Reviso Bibliogrfica

ideal ou procedimento geral para a imobilizao do componente biolgico, a diversidade de mtodos existentes permite a escolha de um que promova uma melhor imobilizao e menor perda da atividade enzimtica (Mateo, et.al, 2000). Dentre os mais importantes destacam-se: ligao covalente, ligao covalente cruzada, ocluso, adsoro e encapsulao (Figura 3.9)

Figura 3.9: Classificao dos mtodos de imobilizao de enzimas

3.4.1 IMOBILIZAO POR ADSORO Neste mtodo, a imobilizao ocorre principalmente atravs de interaes entre o suporte e a enzima. Estas interaes so do tipo Van der Walls ou pontes de hidrognio, que embora fracas ocorrem em nmero suficiente para que a imobilizao seja possvel. Entre os adsorventes mais utilizados esto o quartzo, o vidro, o carvo, a slica-gel , a celulose e as resinas de troca inicas (Kennedy et al.,

43

Reviso Bibliogrfica

1998). A grande vantagem do mtodo reside na simplicidade e nas condies brandas como realizado, preservando a atividade enzimtica. Alem disso, rpido, simples e barato ( Bailiy e Ollis, 1986). Apesar destas vantagens, devido as interaes envolvidas, com o decorrer do tempo h uma dessoro progressiva das molculas de enzimas, alm de serem altamente afetadas pelo pH, fora inica do meio, temperatura ou mesmo pelo substrato da enzima. Por isso, importante o conhecimento e controle destes fatores para conseguir a imobilizao das enzimas e mant-las adsorvidas com atividade (Kennedy et al., 1998; Yesiloglu et al., 2005).

3.4.2 IMOBILIZAO POR OCLUSO Na ocluso, a imobilizao da enzima acontece durante o processo de reticulao de um polmero insolvel em gua. A rede polimrica forma espaos vazios dentro dos quais a enzima fica livre na soluo, diferente da adsoro e da ligao covalente, porm seus movimentos so limitados pela estrutura da rede (Yesiloglu, 2005; Boadi et al, 2001). A grande dificuldade de transporte do substrato e do produto,atravs da estrutura do polmero, aumenta o tempo de resposta, assim como a perda contnua de enzimas pelos poros, constituem duas grandes desvantagens do mtodo (Zanin, 1989; Mateo et al., 2000).

44

Reviso Bibliogrfica

3.4.3 - IMOBILIZAO POR ENCAPSULAO Neste mtodo, a enzima, fica dentro de microcpsulas delimitadas por uma membrana semipermevel que permite a passagem do substrato e dos produtos reacionais. Os principais tipos de membranas usadas so: acetato de celulose, policarbonato, colgeno, Teflon e Nylon. A difuso das espcies envolvidas no processo e a reteno de produtos dentro da cpsula so as principais desvantagens do mtodo, uma vez que podem levar a um rompimento da membrana (Boadi, et.al, 2001; Zanin, 1989). 3.4.4 IMOBILIZAO POR LIGAO COVALENTE CRUZADA Neste mtodo de imobilizao, as molculas de enzimas ligam-se entre si por pontes intermoleculares, formando uma ampla rede tridimensional. A ligao cruzada envolve a formao de ligao covalente entre enzimas, utilizando para tal, agentes bi ou multifuncionais (glutaraldedo, hexa-metil-diisocianato entre outros). O grande problema destes reagentes sua toxicidade que limita o seu uso em clulas vivas e em diversas enzimas (Mateo et al., 2000; Yesiloglu, 2005). O glutaraldedo , dos reagentes polifuncionais, um dos mais utilizados devido ao baixo custo e baixa toxicidade quando comparado com os demais. As ligaes que se formam entre a enzima e o glutaraldedo so estveis diante dos efeitos de pH, fora inica, solvente e temperatura. A maior desvantagem que muitas enzimas so sensveis reao e podem perder a atividade cataltica, quando utilizado glutaraldeido, j que no existe um procedimento especfico para cada enzima. Entretanto, a efetividade da imobilizao
45

Reviso Bibliogrfica

depende das condies experimentais em que o procedimento realizado, devido multiplicidade de estrutura qumicas possveis em cada situao (Fernandez-Lorente et al., 2001).

3.4.5 IMOBILIZAO POR LIGAO COVALENTE A imobilizao por ligao covalente ocorre entre grupos reativos do suporte e grupos funcionais da enzima, que no sejam essenciais para a atividade cataltica da mesma. Os grupos funcionais potencialmente presentes na enzima esto mostrados na Figura 5.4. Basicamente, dois passos esto envolvidos na ligao covalente entre a enzima e o suporte. No primeiro, o suporte ativado com o reagente especifico e no segundo, a enzima adicionada para formao da ligao (Kennedy et al., 1988).

Figura 3.10: Grupamentos funcionais presentes nas enzimas

46

Reviso Bibliogrfica

Esta tcnica simples e ocorre em baixas temperaturas, baixa fora inica e dentro do pH fisiolgico. A escolha de reagente para promover a imobilizao tem como pr-requisito o conhecimento do aminocido presente no centro ativo da enzima, isto porque este aminocido no deve reagir com o reagente de imobilizao. Assim, se a enzima utilizar o grupo carboxil do centro ativo para participar da catlise, conveniente que a ligao covalente entre a enzima e o suporte se faa atravs do grupo amino (Mateo et al. 2000; Kennedy et.al, 1988).

3.4.6 - INFLUNCIA DO GLUTARALDEIDO Um dos agentes de ligao para estruturas proticas mais disponveis comercialmente, o glutaraldeido, tem encontrado ampla aplicao no processo de imobilizao enzimtica (covalente ou cruzada) em suportes slidos para biossensores, tanto em reatores enzimticos, como em cromatografia por bioafinidade e em pesquisa de imunossensores (Junior, 1999; Walt e Agayn, 1994). A efetividade da imobilizao com glutaralteido, depende diretamente das condies experimentais em que tal procedimento aplicado, devido, como j citados, multiplicidade das estruturas qumicas possveis em cada situao. Diferentes publicaes tem mostrado que solues aquosas de glutaralteido (25% ou 70%) representam misturas de multicomponentes. O pH desta soluo de aproximadamente 3,1 e pode ser explicado j que alguns dos grupos aldedos so parcialmente oxidados a seus cidos carboxlicos correspondentes, da a reduo do pH da soluo.
47

Reviso Bibliogrfica

A Figura 3.11 e 3.12 mostra algumas estruturas do glutaraltedo em soluo aquosa, cida ou neutra. Todas as formas propostas para o glutaraltedo podem reagir com protenas formando produtos com estruturas monomricas ou polomricas

Figura 3.11: Formas propostas para o glutalradedo aquosa, (I) liner-mono (II) e dihidratos (III), um hemiacetal cclico (IV) e oligmeros (V).

Figura 3.12: Estrutura do glutaraltedo em soluo cida e neutra

48

Reviso Bibliogrfica

Sob condies bsicas, o glutaraltedo submete-se a condensaes aldlicas para formar aldedos multimricos ,-insaturados de estruturas complexas, que podem reagir com grupos proticos atravs da formao de bases de Schiff estabilizadas. As estruturas do glutaraltedo polimrico em ambas as formas, linear ou cclica, mostram melhores capacidades de agente imobilizante em relao ao produto puro, sendo que o uso de glutaraltedo para imobilizao enzimtica tornase especfico para cada estrutura protica em particular, bem como sua aplicao. Aps a imobilizao enzimtica apropriada, necessrio remover-se o excesso de glutaraltedo no reagente, pelo uso de uma soluo de glicina, para evitar problemas de interferncia na determinao analtica. Na confeco dos biossensores reaes de imobilizao de enzimas com agentes bifuncionais como glutaraltedo em suporte slidos tem sido amplamente aplicada mostrando eficincia no processo e mantendo o biocomponente ativo sem que haja perdas do mesmo durante a analise (Salgado, 1997; Folly, 1996, Alhadeff, 2005)

49

Materiais e Mtodos

CAPTULO 4

MATERIAIS E MTODOS

No presente captulo, esto apresentados os principais materiais e reagentes utilizados, bem como a descrio das metodolgicas aplicadas ao estudo de imobilizao, caracterizao e determinao das condies timas atuao do componente biolgico utilizado e na seleo do sistema de transduo a ser utilizado no desenvolvimento de um biossensor enzimtico para taninos

hidrolisveis.

4.1 MATERIAIS E REAGENTES. 4.1.1 Enzima A enzima tanase foi adquirida a partir do produto comercial Biopectinase CT, gentilmente doada pela Quest International, produzida por Aspergillus niger, batelada 502051.

50

Materiais e Mtodos

4.1.2 - Suporte O suporte utilizado (Figura 4.1) para o processo de imobilizao foi prolas de vidro aminopropil com tamanho de poro de 700 Ao/ 80-120 m adquiridos da Sigma.

Figura 4.1: Fotografia do suporte utilizado Prola de vidro.

4.1.3 - Reagentes A rodanina, e glutaraltedo foram adquiridos da Sigma Chemical Co., Aldrich e enquanto que cido glico e o cido tnico foram adquiridos da Vetec.. O Etanol 99% foi adquirido da Merck.

4.2 METODOLOGIAS 4.2.1 DETERMINAO DA ATIVIDADE DA TANASE LIVRE A atividade enzimtica da tanase livre foi determinada pela quantificao de cido glico, liberado a partir da hidrlise de cido tnico (Figura 5.2), utilizando

51

Materiais e Mtodos

rodanina em soluo alcolica, segundo mtodo descrito por Sharmat et al. (2000) e adaptado por Pinto et al. (2006). A reao enzimtica deu-se em 10ml da soluo de cido tnico 0,02% (p/v) em tampo acetato 20mM pH 5,0, onde foi adicionado 0,25mL do complexo enzimtico. A reao de hidrlise foi paralisada com a soluo etanlica de rodanina 0,666% (p/v) que forma um complexo com o cido glico liberado (Figura 4.2). O complexo formado possui absorbncia mxima a 520 nm, e as molculas de rodanina que no reagiram, no apresentam em soluo bsica, absorbncia em comprimentos de onda superiores a 450nm. A reao foi conduzida a 30C por 10 minutos (Anexo 01).
O

OH HO OH OH

O N H

CIDO GLICO-RODANINA+ EXCESSO

OH-

cido Glico

Rodanina

Figura 4.2: Formao do complexo: cido Glico com a Rodanina

Neste trabalho, definiu-se que uma unidade (U) de atividade enzimtica a quantidade de enzima que libera 1mol de cido glico por minuto de reao a pH 5,0 e 30C. O clculo da atividade da enzima livre foi realizado atravs da Equao 4.1.

ATIV =

(Absamostra Absbranco) x Dil x f x 21__ 170,1 x 10

Equao 4.1

52

Materiais e Mtodos

Onde: ATIV Atividade da tanase (U/mL)

Absamostra Absorbncia da amostra Absbranco Dil f Absorbncia do branco (Anexo 02) Diluio do complexo enzimtico Fator de converso da curva padro de cido glico (mg/L)

Na equao os valores 21, 170,1 e 10 representam a diluio da enzima no meio reacional, o peso molecular do cido glico (u.m.a) e tempo de reao (min), respectivamente. 4.2.1 TCNICA DE IMOBILIZAO O processo de imobilizao utilizado no presente trabalho consistiu na ligao covalente da enzima a um suporte vtreo (prola de vidro), no qual este suporte sofreu uma ativao anterior. O processo de ativao do suporte com o glutaraltedo ocorre formando grupamentos aldedicos necessrios ligao da enzima (Figura 4.3).

53

Materiais e Mtodos

OC2H5 OH + H5C2O - Si - (CH2)3NH2 + COH - (CH2)3 - COH + H2NI I

OC2H5
Silica

Prola de vidro

ATPS

Glutaraldedo

Enzima

OC2H5
I

NO - Si - (CH2)3N=HC - (CH2)3 - HC=

I

OC2H5
Enzima imobilizada

Figura 4.3: Descrio qumica da reao no processo de imobilizao

A tcnica de imobilizao consiste em primeiramente ativar o suporte (prola de vidro) com soluo de glutaraldedo a 2,5% v/v em tampo fosfato 0,1M pH 7,0 por uma hora 30C na razo de 12,5mL de soluo por grama de suporte, em seguida as prolas so lavadas e colocadas em contato com uma soluo de tanase em tampo acetato 20mM (pH 5,0) por 24h na razo de 20mL por grama de suporte. A eficincia da imobilizao foi determinada em termos de atividade total do sobrenadante transferida para o suporte. Para avaliar o processo de imobilizao, quantificou-se a atividade hidroltica da soluo de enzima fornecida ao suporte e do sobrenadante ao final do processo de imobilizao e da enzima imobilizada (derivado imobilizado). A partir destes resultados foi possvel calcular a atividade recuperada da enzima imobilizada e o rendimento de imobilizao que sero demonstradas no item a seguir.

54

Materiais e Mtodos

4.2.2 DETERMINAO DE ATIVIDADE DA TANASE IMOBILIZADA A atividade da tanase imobilizada foi determinada de acordo com Melo et al (2005), que adaptou o mtodo de rodanina em soluo alcolica para tanase livre descrito por Sharmat et al. (2000) e adaptado por Pinto et al (2006). O mtodo consiste, na reao de hidrlise da soluo de cido tnico 0,05% (p/v) pela tanase imobilizada (Figura 3.8) que ocorre em tampo acetato 20 mM pH 5,0, sob agitao, 50oC por 30 minutos. Em 20 mL de substrato (cido tnico), foi adicionado 0,1 g de tanase imobilizada. A determinao da atividade da tanase imobilizada foi realizada atravs da quantificao do cido glico liberado aps ao da enzima sobre o cido tnico utilizando rodanina em soluo alcolica (Anexo 03). Para esta metodologia, definiu-se que uma unidade (U) de atividade enzimtica a quantidade de enzima que libera 1 mol de cido glico por minuto de reao a pH 5,0 e 50C. O clculo da atividade da enzima imobilizada, foi realizado atravs da Equao 4.2. Coef * fator 170,1 * massa

Ativ Derivado =

Equao 4.2

Onde: AtivDerivado Atividade do derivado imobilizado (enzima imobilizada) (U/g) Coef. Coeficiente angular da curva que relaciona Abs x tempo de reao fator Fator de converso da curva padro de cido glico (mg/L)

170,1 Peso molecular do cido glico (u.m.a.) massa massa do derivado (g) (enzima imobilizada )
55

Materiais e Mtodos

O percentual de enzima que foi ligada covalente ao suporte foi calculado atravs da Equao 4.3 que expressa o rendimento de imobilizao (Rend.). O rendimento de imobilizao a relao entre a diferena da atividade do sobrenadante antes e depois do processo de imobilizao e a atividade inicial do sobrenadante. ( Ativinicial Ativ final ) Ativinicial

Re nd =

x 100

Equao 4.3

Onde: Rend. Rendimento de imobilizao (%) Ativ.inicial Atividade livre inicial do sobrenadante (U/mL)

Ativfinal Atividade livre final do sobrenadante (U/mL)

A partir da Equao 4.4 foi possvel determinar atividade recuperada da enzima imobilizada (Ativ
recuperada

). Atividade recuperada pode ser definida como a

relao entre a quantidade de atividade retida no suporte e a diferena da quantidade de atividade presente no sobrenadante antes e depois do processo de imobilizao.

Ativ recuperada . = (

Ativ.derivado ( Ativ.inicial Ativ. final )

x f x 100

Equao 4.4

56

Materiais e Mtodos

Onde: AtivRecuperada Atividade recuperada do derivado imobilizado Ativderivado Ativ.inicial Ativfinal f Atividade do derivado imobilizado (enzima imobilizada) (U/g). Atividade livre inicial do sobrenadante (U/mL)

Atividade livre final do sobrenadante (U/mL) fator que correlaciona a quantidade de uporte e o volume de

imobilizao utilizados (g/mL) Em todos os experimentos os valores de atividade medidos foram expressos em percentuais, considerando como 100% o valor mximo da atividade medida e os demais em percentuais calculados relacionados a este. A esta medida

denominamos atividade resdual.

4.2.3 DETERMINAO DO EFEITO DA IMOBILIZAO SOBRE O PERFIL DE ATIVIDADE DA ENZIMA. 4.2.3.1 - pH A variao do pH do meio de reao pode provocar mudanas conformacionais no stio ativo da enzima ou ainda alterar as concentraes entre espcies carregadas, substrato, produto, ons hidrognio, ons hidroxila, tanto no microambiente da enzima imobilizada quanto no meio reacional (macroambiente). Para avaliar o efeito do pH do meio reacional na atividade da enzima imobilizada, as solues de substrato (cido tnico) foram preparadas usando diferentes solues tampo de valores de pH variando de 3.0 a 8,0. Para solues na faixa de pH entre 4 e 6, utilizou-se soluo de tampo acetato. Para valores
57

Materiais e Mtodos

acima e abaixo desta faixa, utilizaram-se solues de tampes citrato e fosfato, respectivamente. A atividade cataltica foi determinada segundo procedimento descrito no item 4.2.2 a 30C por 30 minutos. 4.2.3.2 TEMPERATURA Uma reao catalisada por enzimas, diferentemente de uma reao nocatalisada, possui duplo efeito na relao temperatura-reao. At uma dada faixa de temperatura, o efeito predominante ser o aumento da velocidade da reao, como prev a teoria da cintica qumica representada atravs da equao de Arrhenius. A partir de um determinado ponto, um fator oposto, a desnaturao trmica, tornando-se cada vez mais importante, at que, acima de um certo limite, a rpida desnaturao destruir a funo cataltica da enzima. Mas as faixas de temperatura onde ocorrero tais fenmenos dependem do tipo de enzima. Assim para avaliar a influncia da temperatura na atividade da enzima imobilizada, foram realizados ensaios em diferentes valores de temperatura variando de 15 a 70oC em tampo acetato 20mM pH 5,0 por 30 minutos de acordo com o procedimento descrito no item 4.2.2.

4.2.4

DETERMINAO

DO

EFEITO

DE

FATORES

EXTERNOS

OPERACIONAIS SOBRE A ESTABILIDADE DA ENZIMA IMOBILIZADA. 4.2.4.1 - pH A estabilidade da enzima imobilizada para hidrlise do cido tnico com relao ao pH, foi estudada incubando a enzima imobilizada em solues de tampo acetato 20mM nos valores de pH 4,0 a 6,0 a 30C durante 5 horas. A cada 30
58

Materiais e Mtodos

minutos at completar duas horas, e depois de hora em hora at completar 5 horas, foi determinado a atividade cataltica de hidrlise da tanase imobilizada usando metodologia descrita no item 4.2.2.

4.2.4.2 - TEMPERATURA Um aumento de temperatura geralmente corresponde a um aumento na taxa de reao por unidade de enzima. Entretanto, a elevao de temperatura e o tempo de exposio tambm podem promover o aumento na taxa de desativao trmica da enzima. A fim de avaliar a estabilidade trmica da tanase imobilizada, a mesma foi incubada a uma faixa de temperatura entre 30 e 60C em soluo de tampo acetato 20 mM pH 5,0 durante 5 horas. A cada 30 minutos, at completar duas horas e depois de hora em hora ate completar 5 horas, foi determinada a atividade cataltica de hidrlise da tanase imobilizada usando metodologia descrita no item 4.2.2.

4.2.4.3 OPERACIONAL A fim de avaliar a estabilidade operacional da tanase imobilizada foram realizados reaes de hidrlise do cido tnico em regime de bateladas consecutivas com a reutilizao da enzima imobilizada. O poder cataltico da tanase imobilizada foi determinado atravs da hidrolise do cido tnico em soluo de tampo acetato 20 mM, pH 5,0 30 e 50C com cada batelada durando 30 minutos. Foram realizadas 8 bateladas.

59

Materiais e Mtodos

4.2.5 AVALIAO DA INFLUNCIA DA IMOBILIZAO SOBRE OS PARMETROS CINTICO DA ENZIMA Para caracterizao da tanase imobilizada foi determinada a taxa de reao em diferentes concentraes de substrato, a velocidade mxima (Vmax) de reao e a constante de Michaelis-Mentes (Km) para o substrato.

4.2.5.1 DETERMINAO DA TAXA DE REAO (VO) Os parmetros cinticos das catalises enzimticas so determinados tradicionalmente pelo uso da velocidade inicial (Vo), quando diferentes

concentraes de um substrato so utilizadas. A taxa de reao foi determinada mantendo-se fixa a quantidade de enzima imobilizada em 50mg (0,2mg/ml de protena) e variando a concentrao de substrato, em tampo acetato 20mM, pH 5,0 a 30 e 50C. A atividade da enzima imobilizada foi determinada nas concentraes de 100 a 1000mg/L de acido tnico. Os dados obtidos para cada concentrao foram representados graficamente, a partir destes, calculada a velocidade da reao (Vo) pela equao de regresso linear. Assim foi possvel determinar o efeito do substrato na velocidade inicial da reao, podendo-se, ento, calcular a velocidade mxima (Vmax) da reao e a constante de Michaelis-Menten (Km).

4.2.5.2 DETERMINAO DE VMAX E KM A partir dos valores de velocidade da reao e concentrao de substrato (S), os coeficientes cinticos, velocidade mxima (Vmax) e constante de Michaelis-Menten
60

Materiais e Mtodos

(Km) foram calculados utilizando o mtodo Lineweaver-Burk. A equao da reta foi determinada, sendo y = 1/Vo; x = 1/S; a declividade (a) = Km/Vmax; e o intercepto b = 1/Vmax.

4.2.6 AVALIAO DO TEMPO DE VIDA TIL DA ENZIMA IMOBILIZADA O tempo de vida til da tanase imobilizada foi avaliado por um perodo de 90 dias. Para isto foram realizados testes de medida do poder cataltico da tanase imobilizada nas suas melhores condies de atuao (pH 5,0/ 50C/30min de reao), como descrito no item 4.2.2, a cada 30 dias, sendo a mesma estocadas entre as analise a 10C em soluo de tampo acetato 20mM pH 5,0.

4.2.7 AVALIAO DA REUTILIZAO DO SUPORTE Para que o uso dos componentes imobilizados torne o processo produtivo necessrio que estes sejam viveis por um maior tempo possvel e ainda que os suportes aps a inativao do componente biolgico possam ser reutilizados.Para avaliar a possibilidade de reutilizao do suporte, as prolas de vidro contendo a enzima j sem atividade cataltica foram lavadas com a gua destilada e secadas a 100C por 12hs. Aps este tratamento a mesma foi submetida a um novo processo de imobilizao de acordo com o item 4.2.1. A capacidade de sua reutilizao foi determinada avaliando a sua eficincia de imobilizao, atividade do derivado e atividade recuperada de acordo com o procedimento descrito no item 4.2.2.

61

Materiais e Mtodos

4.2.8 DETERMINAO DA VARIAO DE pH USANDO O TRANSDUTOR (ELETRODO DE pH) PELA AO DA ENZIMA TANASE LIVRE E IMOBILIZADA. Para verificar a variao de pH na soluo de cido tnico pela ao da enzima tanase livre e imobilizada em prolas de vidro, foram realizados testes estticos com a enzima livre e imobilizada em contato com a soluo de cido tnico preparada com gua destilada variando as concentraes de 10 a 100mg/L, na temperatura de 25C por 5 minutos para a tanase livre e 15 minutos para a tanase imobilizada. As variaes de pH ocorridas foram registradas usando o eletrodo de pH marca Actron (transdutor). A quantidade de enzima utilizada para os testes foram: 0,66 mg de protena/mL (ou 0,679 U/ml) para a enzima tanase livre e de 0,26 mg de protena por grama de suporte (ou 0,3243 U/g) para a enzima tanase imobilizada. Nos ensaios realizados com a enzima tanase imobilizada, as solues de cido tnico foram testadas de forma crescente e decrescente em valores de concentrao, e ainda, com e sem lavagem da enzima imobilizada com gua destilada no volume de 300 mL durantes as medidas. A cada concentrao testada a variao de pH ( pH) foi registrada atravs da leitura do sinal de sada do transdutor, ou seja, pela diferena entre o sinal de pH antes e aps a reao enzimtica.

4.2.9 DETERMINAO DA VARIAO COLORIMTRICA PELA AO DA ENZIMA TANASE IMOBILIZADA. A fim de avaliar a possvel utilizao de um colormetro com comprimento de onda fixo em 490 nm, como sistema de transduo junto com a tanase imobilizada, foram realizados ensaios com a enzima imobilizada em contato com a soluo de cido
62

Materiais e Mtodos

tnico preparada com tampo acetato 20 mM pH 5,0 variando as concentraes de 50 a 500 mg/L, na temperatura de 50C por 15 minutos e o produto da reao determinado em espectrofotmetro (DR 4000UV, HACH) a 490.A quantidade de enzima tanase imobilizada utilizada foi de 0,26 mg de protena por grama de suporte (ou 0,3243 U/g) Os ensaios foram realizados, de forma que as solues de cido tnico fossem testadas de forma crescente e decrescente em valores de concentrao do cido tnico, e ainda com e sem lavagem da enzima imobilizada com gua destilada no volume de 300 mL durantes as medidas. A cada nova concentrao testada a variao da intensidade da cor resultante do produto obtido da reao enzimtica foi determinada a 490 nm, em valores de delta de absorbncia (Abs), obtidos pela diferena entre as leituras da absorbncia antes e aps a reao enzimtica.

63

Resultados e Discusses

CAPTULO 5

RESULTADOS E DISCUSSES

Os resultados preliminares obtidos para o desenvolvimento do biossensor enzimtico proposto esto apresentados no decorrer deste captulo. A escolha do componente biolgico, baseado no elemento medido e a caracterizao deste componente, bem como a imobilizao, a determinao do tempo de vida do biocomponenete e a seleo do transdutor, foram alguns dos testes preliminares realizados. Em todos os resultados apresentados a seguir foram obtidos em triplicata.

5.1- IMOBILIZAO DO COMPONENTE BIOLGICO (ENZIMA TANASE) E AVALIAO DA TCNICA UTILIZADA SOB DIFERENTES ASPECTOS Devido a sua natureza protica, as enzimas so altamente sensveis as variaes de pH, temperatura, concentrao de substrato, entre outros fatores. Portanto, o conhecimento da influncia destes parmetros sobre a reao enzimtica permite explorar melhor as suas propriedades catalticas.
64

Resultados e Discusses

Qualquer que seja o mtodo de imobilizao da enzima o que se deseja preservar, tanto quanto possvel, a atividade biocataltica da mesma e a sua especificidade. Apesar da superioridade das enzimas imobilizadas sobre as livres em diversos aspectos, o processo de imobilizao pode modificar a cintica e as propriedades fsico-qumicas da enzima, normalmente, reduzindo a sua atividade especfica. As modificaes das propriedades enzimticas ocasionadas pelo processo de imobilizao devem-se aos seguintes fatores (Gomes et.al, 2006): efeitos conformacionais modificaes conformacionais da molcula da enzima devido alteraes na sua estrutura terciria em funo de alteraes na estrutura terciria do stio ativo; efeito estequereoqumicos - uma parte da molcula da

enzima imobilizada em uma posio tal que o stio ativo relativamente inacessvel ao substrato; efeitos microambientais (efeitos de partio) interaes eletrostticas entre o suporte e o substrato, neste caso, as condies do microambiente prximo enzima so diferentes daqueles da soluo reacional; e efeitos difusionais ou de transferncia de massa tm origem na resistncia de difuso do substrato at o stio cataltico da enzima, e do produto para a soluo (Brigida, 2006;Gomes et.al, 2006; Rodrigues, et al 2008). Para verificar as alteraes causadas pelo processo de imobilizao foram determinados as influncias do pH e da temperatura na atividade da tanase imobilizada, bem como estimados os parmetros cinticos. Em quase todos os ensaios os efeitos ocasionados pelo processo de imobilizao foram avaliados comparando os resultados obtidos com a tanase imobilizada e em soluo (tanase livre).

65

Resultados e Discusses

5.1.1- Avaliao do Procedimento de Imobilizao A imobilizao por ligao covalente o resultado da reao de um grupamento funcional do suporte com um grupamento presente na enzima. Dependendo do grupamento disponvel no suporte, a ligao pode ocorrer com os grupos aminas, hidroxilas e/ou tiis da enzima que iro influenciar na sua atividade quando imobilizada. O critrio utilizado para avaliar o desempenho do mtodo de imobilizao do componente biolgico selecionado foi descrito no item 4.2.2 e os resultados obtidos esto apresentados na Figura 5.1 e na Tabela 5.1, bem como os valores da atividade da enzima tanase imobilizada (atividade do derivado), seu percentual de atividade recuperada, e o rendimento da imobilizao.

120 Atividade residual (%) 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 Tempo (horas) 20 25 30

Figura 5.1: Atividade residual de tanase no sobrenadante ao longo do processo de imobilizao

66

Resultados e Discusses

Tabela 5.1: Atividade da tanase imobilizada no suporte avaliado Atividade Transferida do sobrenadante para o suporte (U/mL) Rendimento de imobilizao (%) Derivado (U/g) Recuperada (%) Prola de vidro 0,404 99 0,1636 40,5

Assim, analisando a Figura 5.1 podemos verificar que houve uma rpida reduo na atividade do sobrenadante, apresentando um rendimento de

imobilizao em torno de 99%. Porm, a partir de clculos posteriores observou-se que apesar da alta reduo da atividade da tanase no sobrenadante foi possvel obter apenas 40,5% de atividade recuperada (Tabela 5.1), tal fato pode ser atribudo a problemas de limitaes difusionais, como dificuldades do substrato em difundir at a matriz imobilizada, ou a resistncia em liberar o produto para fora da matriz (Cabral et al, 2003, Gomes et al 2006). Rodrigues et al (2008) observaram que dependendo do suporte utilizado, bem como dos grupamentos formados na superfcie do suporte, ocorre uma diferena nos valores de atividade recuperada da enzima lipase em relao ao valor de rendimento de imobilizao. Este fato corrobora os dados obtidos no presente estudo, onde obtem-se altos rendimentos de imobilizao com menores valores de atividade recuperada. 5.1.2 Avaliao do Tempo no Processo de Imobilizao Aps formadas as primeiras ligaes entre a enzima e o suporte, esta comea a perde flexibilidade e novas ligaes se tornam mais difceis de serem

estabelecidas. Desta forma, o tempo de imobilizao implicaria em mais ligaes

67

Resultados e Discusses

formadas entre a enzima e o suporte e como conseqncia, uma diminuio da atividade enzimtica devido mudanas conformacionais tornando a estrutura da enzima mais rgida, como seria esperado. Porm, por outro lado, pode ocorrer tambm um aumento na estabilidade trmica e alcalina da enzima imobilizada em funo do aumento do tempo de imobilizao. A fim de avaliar a influncia do tempo do processo de imobilizao no rendimento do mesmo, a atividade do derivado e a atividade recuperada, foram determinados realizando testes reduzindo o tempo de contato entre o suporte e a soluo enzimtica. Analisando a Tabela 5.2 constata-se que com a diminuio do tempo de imobilizao foi possvel obter um aumento no valor da atividade do derivado, embora a atividade recuperada no foi afetada. Rodrigues et al (2008) avaliaram tambm a influncia do tempo de imobilizao sobre a atividade recuperada da lipase imobilizada e verificaram que quando a enzima lipase foi imobilizada em agarose e quitosana ocorreu uma diminuio da sua atividade aps 24 h. Tal fato pode ser justificado pela possvel ocorrncia de mudanas conformacionais da enzima quando esta foi exposta a um tempo maior de imobilizao. Tabela 5.2: Efeito do tempo do processo de imobilizao na atividade da enzima tanase imobilizada Atividade Rendimento de imobilizao (%) Derivado (U/g) Recuperada (%) Tempo de imobilizao (horas) 24 5 99 0,1636 40,5 97,8 0,2716 43

68

Resultados e Discusses

5.1.3-Efeito do pH na Atividade da Enzima Tanase Livre e Imobilizada Sabe-se que mudanas de pH provocam alteraes no carter inico dos grupamentos aminos e carboxlicos das protenas, afetando o stio cataltico e a conformao da enzima. Tais mudanas conformacionais influenciam na interao enzima-substrato afetando a atividade enzimtica, a taxa de reao mxima e a estabilidade da enzima. Diante de tais influncias foi avaliado o efeito do pH no perfil de atividade e na estabilidade da tanase imobilizada em comparao com o efeito dos mesmo fator na tanase livre. 5.1.3.1-Influncia do pH no perfil de atividade da enzima tanase. Na figura 5.2 podemos observar o perfil de atividade da tanase imobilizada em prolas de vidro em diferentes valores de pH do meio reacional e da tanase livre.

120 100
Atividade residual (%)

80 60 40 20 0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

pH

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

Figura 5.2: Perfil da atividade residual da tanase livre () e imobilizada em prolas de vidro () a diferentes valores de pH.

69

Resultados e Discusses

Normalmente, aps sofrer o processo de imobilizao o pH timo de atuao das enzimas tendem a se modificar, um dos motivos para que isso ocorra pode ser atribuido aos grupamentos hidroxilas (-OH) presentes na estrutura do suporte que possuem afinidade pelos hidrognios ionizveis (H+) disponiveis no meio reacional, ocasionando um acmulo desses ons, o que pode afetar o microambiente da enzima, e consequentemente, sua faixa de pH timo de atuao. Por outro lado, os grupos carboxlicos da enzima podem tambm influnciar no acmulo de hidrognios ionizveis. A estabilidade deste microambiente ocorre em pH bsico, permitindo maior reduo da concentrao de ions H+ no sistema imobilizado deslocando, por essa razo, o valor de pH timo de atuao da enzima. Na enzima tanase tal fato tambm foi observado, visto que o valor do pH timo da enzima aps o processo de imobilizao mudou de 4,5 para 5,0. Tambm foi observada uma melhora na atividade resdual da tanase em valores de pH acima do valor timo, ficando em torno de 60% para a tanase imobilizada em pH 7,0, enquanto que a livre apresentou 20% de atividade residual em pH 6,5 (Figura 5.2). O deslocamento em direo a regio alcalina tambm foi observado por Weetall e Detar (1974). Contudo, estes autores destacam que a enzima utilizada em seu estudo, j apresentava como particularidade um patamar timo de atividade da enzima livre que ocorria na faixa de pH entre 6,0 e 7,0, destoando do observado por outros autores, onde o timo acontecia em pH 5,0. Aps imobilizao o timo foi deslocado para 7,0 a 7,5. J Abdel-Naby et al. (1999) observaram uma reduo no valor de pH timo, de 5,5 para 4,5, enquanto Sharma et al. (2007) no observaram alterao no pH timo, permanecendo em 5,0.

70

Resultados e Discusses

Pundir et al (2008) tambm observaram um aumento no valor do pH timo da enzima oxalato oxidase aps processo de imobilizao, passando de 5,0 para 6,5, enquanto Pahujani et al (2008) observaram que o pH timo da lpase aps sua imobilizao imobilizada em Nylon-6 ativado com glutaraldeido deslocou para o lado cido saindo de 8,5 para 7,5. Bayramoglu et al (2008) demonstraram que com o processo de imobilizao o valor do pH timo da enzima cloroperoxidase, bem como o seu perfil de atividades no foi alterado.

5.1.3.2- Estabilidade da enzima tanase sob diferentes valores de pH. Como as enzimas so protenas, mudanas de pH provocam alteraes no carter inico dos grupamentos da enzima de forma a afetar a sua atividade cataltica, atravs de modificaes causadas no stio ativo e na estrutura conformacional. Tais mudanas conformacionais influenciam na estabilidade da enzima, de forma que efeitos puramente inicos provocados por baixos ou altos valores de pH podem causar desnaturao considervel e conseqentemente inativao enzimtica (Mateo et al, 2007). Testes foram realizados visando verificar a estabilidade da enzima tanase a diferentes valores de pH e observou-se que tanto a tanase livre quanto a imobilizada mostraram ter estabilidade na sua atividade hidroltica na faixa de pH estudada (4,06,0) por 5 horas, mantendo a sua atividade residual em torno de 70% ( 4,56 %). Em pH 5,0 foi observado a melhor estabilidade da atividade para ambas, apresentando 92,24% ( 7,68%) de atividade residual para tanase imobilizada e de 88,25% ( 1,89%) para tanase livre aps 5 horas de incubao (Figura 5.3).

71

Resultados e Discusses

120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0 60 120 180 240 300 360

Atividade residual (%)

Tempo (min)
Imob. pH 4,0 Livre pH 4,0 Imob. pH 5,0 Livre pH 5,0 Imob. pH 6,0 Livre pH 6,0

Figura 5.3: Estabilidade da tanase livre e imobilizada em prola de vidro sob diferentes valores de pH . 5.1.4- Efeito da Temperatura na Atividade da Enzima Tanase Livre e Imobilizada. A maioria das reaes qumicas se processam em uma velocidade maior medida que a temperatura aumenta. Um aumento na temperatura imprime maior energia cintica s molculas dos reagentes, ocasionando um maior nmero de colises produtivas por unidades de tempo. As reaes catalisadas por enzimas apresentam um comportamento semelhante as reaes catalisadas quimicamente. Porm, as enzimas so molculas proticas complexas e sua atividade cataltica esta relacionada a necessidade de que sua estrutura terciria seja mantida principalmente por um grande nmero de ligaes no covalentes, como ponte de hidrognio, ligaes dissulfetos e interaes hidrofbicas (Brigida, 2006). Se a molcula absorve excesso de energia, a estrutura terciria se rompe e a enzima

72

Resultados e Discusses

ficar desnaturada, perdendo sua atividade cataltica. medida que a temperatura se eleva o aumento esperado na velocidade, resultante do aumento das colises entre a enzima e o substrato, contraposto pelo aumento da velocidade de desnaturao. Conseqentemente, a curva de atividade-temperatura o resultado lquido dos efeitos opostos resultantes da elevao da temperatura (acelerao da reao) e do aumento da inativao (desnaturao).

5.1.4.1- Influncia da temperatura no perfil da atividade da tanase. A dependncia da atividade da tanase imobilizada e livre em relao a temperatura foi investigada de acordo com o procedimento descrito no item 4.2.3.2 e os resultados obtidos esto apresentados na Figura 5.4.

120 100
Atividade residual (%)

80 60 40 20 0 0 20 40
Temperatura (oC)

60

80

Figura 5.4: Perfil da atividade residual da tanase livre () e imobilizada () a diferentes valores de temperatura.

73

Resultados e Discusses

Na faixa de temperatura estudada (25 a 70C) a tanase apresentou o seu mximo de atividade em torno de 50C para a enzima imobilizada, enquanto que para a enzima livre em torno de 55C (Figura 5.4) A temperatura de 25C foi possvel observar que com o processo de imobilizao ocorreu um aumento na atividade residual da tanase imobilizada, ficando em torno de 32%. A temperatura de 70C, a tanase livre apresentou uma atividade abaixo de 10%, contrastando com a enzima tanase imobilizada, que demonstrou uma reteno de 40% na sua atividade residual. Em temperaturas acima do timo de reao a tanase imobilizada mostrou ter uma melhor reteno de sua atividade. Abdel-Naby et al.(1999) em seus estudos observaram que com o processo de imobilizao houve um aumento no valor de temperatura tima passando de 40 C para 55C, fato inverso ao alcanado em nosso estudo em que o valor da temperatura tima diminuiu com a imobilizao. Contudo, Sharma et al (2007) avaliaram a influncia da temperatura na atividade da tanase de Penicillum variable bruta, purificada e imobilizada e demonstraram que no houve alterao no valor da temperatura tima, apresentando o mximo de atividade em torno de 50C. Tais diferenas nos resultados podem ser justificadas novamente, pelas diferenas conformacionais que cada enzima pode possuir devido a sua fonte de origem, bem como, pela matriz e tcnica de imobilizao utilizada (Fukui, 1975)

74

Resultados e Discusses

5.1.4.2- Estabilidade trmica da enzima tanase. A Figura 5.5 apresenta a variao da atividade da tanase livre e imobilizada aps tratamento trmico de 30 a 60oC por 5 horas realizado de acordo com a procedimento descrito no item 4.2.4.2. possvel verificar que a 30oC ambas, enzimas livre e imobilizada, apresentaram uma reteno de atividade em torna de 95% e 100% aps 1 hora, respectivamente. Aps 5 horas a enzima livre apresentou 88% de atividade residual em relao a sua atividade resdual inicial e a imobilizada 92%. Em contra partida a 60oC a tanase livre, aps 1 hora de incubao apresentou 19% da sua atividade inicial, enquanto que, a imobilizada manteve 40% da sua atividade inicial. J a 50oC, que foi o valor de temperatura timo encontrado para a tanase imobilizada, aps 1 hora de incubao a enzima imobilizada manteve a sua atividade residual em torno de 88% ( 2,57%) e de 64% ( 1,87%) aps 5 horas em relao a atividade inicial.

120 100 Atividade residual (%) 80 60 40 20 0 0 60

Imob. 30oC Livre 30oC

120

180 Tempo (min)

Imob. 50oC Livre 50oC

240

300
Imob. 60oC Livre 60oC

360

Figura 5. 5: Estabilidade trmica da tanase livre e imobilizada e imobilizada.

75

Resultados e Discusses

Esta melhora na estabilidade com a enzima imobilizada tambm foi observada por Abdel-Naby et al. (1999) e Sharma (2007) quando relataram que a estabilidade trmica a 50C aps uma hora e 24 horas de experimento manteve a sua capacidade cataltica em torno de 85%. Godjevargova et al (2006) observaram que a estabilidade trmica da enzima glicose oxidase foi consideravelmente melhorada com o processo de imobilizao, de forma que aps 5 horas de incubao a 60C a enzima apresentou 78% da sua atividade residual enquanto que na forma livre aps 1 hora sua atividade cataltica foi totalmente perdida.

5.1.5- Determinao dos Parmetros Cinticos da Tanase Imobilizada Os valores obtidos de atividade da tanase imobilizada para cada concentrao de cido tnico usada nas duas temperaturas avaliadas de acordo com o procedimento descrito no item 4.2.5 esto apresentados na Figura 5.6.

76

Resultados e Discusses

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 200 400 600 800 1000 1200

Atividade (U/g)

Concentrao de cido tnico (mg/L)

Figura 5.6: Atividade da tanase imobilizada em funo da concentrao de cido tnico nas temperaturas de reao de 30C () e 50C (). Observa-se que a atividade da tanase imobilizada aumentou linearmente at a concentrao de 300 mg/L, iniciando-se a partir dessa concentrao uma diminuio na taxa de reao at a concentrao de 500 mg/L, acima da qual a taxa de reao tente a se estabilizar, sugerindo assim que a atividade da tanase imobilizada para ambas as temperaturas avaliadas (30C e 50C) em funo da concentrao de cido tnico segue cintica do tipo Michaelis-Menten. Os valores de Km e Vmax (Tabela 5.3) foram calculados pelo mtodo de Linewearver-Burk, em que foi plotado o grfico 1/[S] versus 1/Vo tanto para tanase livre como para a tanase imobilizada. O valor mais elevado de Km determinado para tanase imobilizada indica que mediante imobilizao, a afinidade da tanase pelo substrato foi reduzida. Esse comportamento se deve menor transferncia de massa do meio reacional para o sistema imobilizado, pois o processo da

77

Resultados e Discusses

imobilizao reduz a difuso do substrato nos interstcios do suporte (Mateo et. al, 2007). Este fato tambm foi observado por Bayramoglu et al (2008) e Tukel e Alptekin et al (2004) quando observaram que os valores de Km das enzimas cloroperoxidase e catalase, respectivamente foram aumentados aps o processo imobilizao por ligao covalente. Tabela 5.3: Parmetros cinticos da tanase livre e imobilizada. Temperatura Parmetros Livre 30C Equao da reta R2 Vmax (U/mg protena) Km (mg) Vmax/Km y = 0,1175x + 0,0037 0,9894 3,465 317,00 85,1 x 104 30C y = 994,9x + 2,9107 0,9800 1,259 348,81 10,2 x 10-4 Imobilizada 50C y = 1186x + 1,2963 0,9816 2,967 914,88 8,43 x 10-4

Este um perfil tpico dos sistemas imobilizados, tento em vista que a enzima livre exerce sua atividade cataltica em um meio homogneo, enquanto a enzima imobilizada em um suporte slido deve agir em um meio heterogneo. Desta forma o decrscimo da atividade das enzimas imobilizadas pode ser normalmente atribuda as mudanas conformacionais na sua estrutura terciria ou aos impedimentos estricos que resultam na dificuldade de acesso do substrato ao seu sitio ativo (Bayramoglu et. al, 2008; Mateo et. al, 2007).

78

Resultados e Discusses

5.1.5- Determinao do Tempo de Vida til da Tanase imobilizada. Um parmetro importante que deve ser considerado quando se quer desenvolver um biossensor enzimtico o tempo de vida til, durabilidade e estabilidade s condies de estocagem da enzima em questo (Shanet et al 2007; Salgado, 2001). Normalmente as enzimas imobilizadas mantm sua atividade em condies de estocagem quando no so expostas a condies adversas de pH e temperatura (Gomes et al, 2006). A determinao da atividade da tanase livre e imobilizada durante o processo de armazenamento (10C em ph 5,0)pode ser observado na Figura 5.7. Foi verificado que aps 90 dias de estocagem a atividade hidroltica da tanase imobilizada manteve-se estvel, apresentando ainda valores de atividade residual em torno de 94%. Desta forma quando comparada a tanase livre pode-se observar que o procedimento de imobilizao no afetou a atividade hidroltica da enzima.

79

Resultados e Discusses

120 Atividade residual (%) 100 80 60 40 20 0 0 60

Dias

75 Livre

90

Imobilizada.

Figura 5.7: Avaliao do tempo de vida til da tanase livre e imobilizada em prolas de vidro.

Sharma et al (2007) estudaram o tempo de vida til da tanase de P. variable livre e liofilizada armazenadas a 4C e 30C por um perodo de um ano, os

resultados mostraram que aps 15 dias de armazenamento a atividade se manteve em 90%, com 120 dias apresentou uma reteno de 70% da sua atividade resdual e esta permaneceu at um ano durante sua estocagem para ambos os tipos avaliados.

80

Resultados e Discusses

5.1.6- Determinao da Estabilidade Operacional da Tanase Imobilizada Estudos de estabilidade operacional podem mostrar a robustez do processo de imobilizao atravs do reuso de uma mesma enzima imobilizada em vrios ciclos reacionais consecutivos (Rosatto et al. 2001). A estabilidade operacional da tanase imobilizada em prola de vidro foi testada em reaes de hidrlise do cido tnico nas temperaturas de 30oC e 50oC por 30 min. A atividade cataltica da enzima foi calculada ao final de cada ciclo, tomando por base a concentrao de acido glico formado a partir da hidrlise do cido tnico por grama de enzima imobilizada. Assim foi possvel verificar que aps 8 repeties a atividade cataltica do derivado imobilizado a 30C diminuiu 30% ( 3,57 %) enquanto que a 50C sofreu uma reduo de 20% ( 1,63 %) em relao a primeira repetio (Figuras 5.8a e 5.8b).

81

Resultados e Discusses

0,25 Atividade Tanase Imobizada (U/g)

a
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
1 2 3 4 5 6 7 8

Repeties

Atividade Tanase Imobilizada (U/g)

0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 1 2 3 4 5 6 7

Repeties

Figura 5.8: Estabilidade operacional da tanase imobilizada em prolas de vidro a 30C (a) e 50oC (b). Abdel-Naby et al.(1999) aps imobilizar tanase em quitosana observaram que a enzima era capaz de manter o seu alto poder de hidrlise aps 17 repeties de uso da mesma, apresentando apenas um perda de 15% da sua capacidade cataltica. Pahujani et al (2008) observaram que lipase imobilizada em Nylon-6 aps
82

Resultados e Discusses

8 repeties de sua reao de hidrlise, apresentava 85% de sua atividade resdual e aps 13 repeties 20%. Porm no caso do objetivo futuro deste estudo a utilizao da tanase imobilizada na construo de um biossensor enzimtico, a queda de 20% da atividade no compromete o reuso do mesmo lote, j que novas calibraes do instrumento podem ser refeitas adaptando o novo valor, de forma que o mesmo lote poder ser utilizado mais de oito vezes, o que ir diminuir o custo do instrumento.

5.1.7- Estudos de Reutilizao do Suporte para o Processo de Imobilizao Para que o uso dos componentes imobilizados torne o processo de construo do futuro sensor vivel necessrio que estes se mantenham ativos por um maior tempo possvel, e ainda que os suportes aps inativao do componente biolgico possam ser reutilizados (Shanet et al 2007, Salgado 2001; Romani et al, 2000) pois o custo econmico do suporte bem expressivo de forma a encarecer bastante o valor final de tal instrumento. Com isso testes foram realizados para avaliar a eficincia do mtodo de imobilizao com o uso do suporte reutilizado. As prolas de vidros contendo a enzima j sem atividade cataltica foram lavadas com gua destilada e secas a 100C. Aps este tratamento foram submetidas a um novo processo de imobilizao. A cada novo processo realizado foi determinado o rendimento de imobilizao, atividade da enzima imobilizada e atividade recuperada para avaliar a eficincia da reutilizao do suporte. Este mesmo procedimento foi seguido antes de cada reutilizao do suporte

83

Resultados e Discusses

Assim, de acordo com os dados apresentados na Tabela 5.4 podemos verificar que at a terceira reutilizao foi possvel obter um rendimento em torno de 93%, a partir da quarta reutilizao o rendimento caiu, ficando em torno 68%. Porm ao se analisar os valores de atividade do derivado e atividade recuperada podemos verificar que os resultados obtidos na quarta e quinta reutilizaes foram maiores do que o da primeira utilizao do suporte. Esse aumento pode ter ocorrido devido obteno de novas formas estruturais da enzima imobilizada de forma que favorea um melhor acesso do substrato ao stio ativo, bem como a melhor liberao do produto para o macroambiente. Salgado et al (1997) ao utilizadar prolas de vidro para imobilizao de enzimas observaram que com a reutilizao do suporte ocorreu uma queda de 30% no rendimento de imobilizao quando comparadas ao valor obtido com a prola nova. Com isto pode-se concluir que a reutilizao dos suportes possvel o que garante maior economia na fabricao do biossensor, j que sempre que o biocomponente perde totalmente sua eficincia necessria sua substituio.

84

Resultados e Discusses

Tabela 5.4: Rendimento da imobilizao e determinao das atividades com a reutilizao do suporte.

Reutilizao Atividade 1 Rendimento de imobilizao (%) Derivado (U/g) Recuperada (%) 2 3 4 5

99

92,2

95,2

74,9

61,6

0,1636 40

0,1594 26,3

0,1342 20

0,3243 63,7

0,3029 65,9

5.2- TESTES COM TRANDUTORES Baseado no produto da reao enzimtica da enzima tanase sobre o substrato (cido tnico), citada no item 3.3.2.1, foi realizada a seleo do transdutor a ser utilizado visando a construo futura de um biossensor enzimtico para taninos hidrolisveis. Esta seleo busca a utilizao de um transdutor que fosse de fcil implementao e o mais verstil possvel, para que a concentrao de taninos presente no meio analisado pudesse ser determinada sem grandes dificuldades operacionais durante o seu uso, e a construo do biossensor futuramente seja vivel. Na seleo inicial do transdutor foi escolhido o sistema eletrodo de pH com pHmetro. Este eletrodo mede a diferena de potencial entre duas superfcies que variam de acordo com o pH da soluo, na qual esto imersos. Para verificar se o eletrodo respondia as variaes de pH da soluo de cido tnico pela ao da
85

Resultados e Discusses

enzima foram realizadas primeiramente testes estticos com a enzima livre em contato com as solues de substrato (cido tnico) preparadas com gua destilada nas concentraes de 10 a 100 mg/L, na temperatura de 25C por um tempo de reao de 5 minutos. A partir da Figura 5.9 possvel observar que at uma concentrao de 50mg/L de cido tnico foi possvel obter uma linearidade na resposta da variao do pH em relao a atividade da enzima em funo da formao do produto (cido glico). Desta forma seria possvel o uso deste sistema como medida do produto da reao enzimtica, nas condies testadas para concentraes de substrato na faixa de 10 a 50 mg/L.

0,9 0,8 0,7 Delta de pH 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 120 Concentrao de cido Tnico (mg/L)

Figura 5.9: Curva de resposta para o transdutor (eletrodo de pH) a partir de reaes da enzima tanase livre Alm do carter linear da medida outra caracterstica avaliada foi a estabilidade de resposta do eletrodo com relao ao tempo da reao enzimtica. Assim, foram realizados testes sucessivos com solues de cido tnico com a mesma concentrao (200mg/l) e com a mesma quantidade de soluo enzimtica
86

Resultados e Discusses

(0,1 mL) a 25C variando o tempo de reao. Os resultados obtidos apresentados na Figura 5.10 revelaram que com 5; 10 e 15 min de reao enzimtica o eletrodo de pH demonstrou ter uma estabilidade, ou seja, foram obtidos desvios de 2%; 0%, e 3% respectivamente, mostrando que o eletrodo de pH pode ser utilizado para deteco do sinal da resposta biolgica da reao enzimtica da tanase quando esta utilizada na sua forma livre.

0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 1 2 3 Repeties 4 5 6

Figura 5.10: Avaliao da estabilidade de resposta do eletrodo com o tempo de reao () 5 min () 10 min () 15 min. Aps os testes com a enzima livre para verificar as caractersticas de respostas do eletrodo de pH em relao as mudanas que ocorrem no meio em funo das reaes enzimticas, foram realizados ensaios com a enzima imobilizada em prolas de vidro a fim de verificar se tambm nesta condio a resposta se mantinha estvel. Para a IUPAC (Union of Pure Apllied Chemistry , 2001) s
87

Delta de pH

Resultados e Discusses

considerado um biossensor aquele instrumento que apresenta na sua construo o componente biolgico em contato diretamente com elemento transdutor, e para atender tal caracterstica necessrio que este componente biolgico esteja imobilizado na sua superfcie ou prximo ao mesmo (Thevenot et al, 2001). Inicialmente foi realizada a construo da curva de resposta para o sistema eletrodo de pH e a enzima imobilizada testada. A curva de resposta de um instrumento extremamente importante pois esta garante a sua preciso e confiabilidade. Em geral a maior parte dos sensores analticos ou analisadores industriais comercialmente disponveis necessitam ser testados e calibrados antes da sua utilizao, pois se por qualquer motivo ocorrer qualquer alterao nas suas condies padres de operao isto poderia acarretar em erros de medio. Estes testes simulam uma calibrao do mesmo e podem ser realizados facilmente atravs de experimentos sob as condies padres que variam para cada instrumento. Curvas ento podem ser traadas usando um conjunto de pontos experimentais obtidos observando o sinal de sada do instrumento (eletrodo de pH) para um determinado valor do sinal de entrada (concentrao de acido tnico). Estas curvas so chamadas de curvas de calibrao e atravs delas pode-se obter a faixa linear e o grau de linearidade do instrumento. Saber se um instrumento ou no linear indispensvel, pois instrumentos no lineares no possuem relao direta da leitura do sinal de sada com o da entrada. Desta forma para estes instrumentos necessrio obter uma funo de calibrao e a partir dela relacionar valores de sada e entrada. Para a determinao das curvas de resposta ou de calibrao para o futuro biossensor enzimtico, testes foram realizados usando solues de cido tnico na
88

Resultados e Discusses

mesma faixa de concentrao utilizada nos ensaios para a tanase livre (10 a 100 mg/L); sendo estas testadas de forma crescente e decrescente em valores de concentrao, e ainda com e sem lavagem da enzima imobilizada durante as medidas; sendo a variao de pH obtida para cada concentrao testada. As curvas de resposta ou calibrao para o biossensor enzimtico podem se observadas na Figura 5.11

1,2 1 Delta de pH 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120 Concentrao de cido Tnico (mg/L)
CCL DCL CSL DSL

Figura 5.11: Curva de resposta ou calibrao para o sistema transdutor (eletrodo de pH) e a enzima imobilizada usando solues de diferentes concentraes de cido tnico com e sem lavagem entre as medidas. CCL = crescente com lavagem; CSL = crescente sem lavagem; DCL = decrescente com lavagem; DSL = decrescente sem lavagem.

Atravs das curvas obtidas foi possvel verificar que no existe uma resposta linear, bem como uma estabilidade e repetibilidade dos dados obtidos em todas as
89

Resultados e Discusses

formas testadas, de forma que no seria possvel utilizar o eletrodo de pH como transdutor do biossensor. Porm antes de rejeitar a possibilidade de utilizao do eletrodo de pH como transdutor devido aos resultados no satisfatrios obtidos foram feitos novos testes para verificar se tal falta de linearidade e repetibilidade de resposta do sistema no seria causado pelo desconhecimento em relao ao tempo ideal de resposta para a enzima imobilizada, pois caso o tempo usado fosse maior que o necessrio para a medida em cada concentrao, saturaes do sistema (enzima imobilizada) ou da prpria membrana do eletrodo poderiam ocorrer dificultando assim as medidas. Desta forma foi verificado o tempo de resposta do eletrodo com relao ao da enzima imobilizada. O tempo de resposta uma caracterstica dinmica de um instrumento e pode ser definido como o tempo que a leitura deste instrumento leva para ir de um valor inicial a valor final de equilbrio na leitura. Geralmente instrumentos comerciais tm esta varivel, tempo de resposta, como uma varivel especificada. No caso dos biossensores o tempo de resposta em geral maior que o de outros instrumentos, j que leva-se em conta o tempo que a amostra permanece em contato com o componente biolgico. Para determinar o tempo de resposta do eletrodo de pH utilizado em relao a enzima imobilizada, testes foram realizados variando a concentrao da soluo de cido tnico de 10 a 50mg/L em ordem crescente de concentrao e sem lavagem do eletrodo e da enzima. Os resultados podem ser visualizados nas Figuras 5.12a, 5.12b, e 5.12c.

90

Resultados e Discusses

0,6 0,5

Delta de pH

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60

Concentrao de cido Tnico (mg/L)

0,6 0,5

Delta de pH

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60

Concentrao de cido tnico (mg/L)

0,7 0,6 Delta de pH 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 Concentrao de cido Tnico (mg/L)

Figura 5.12: Avaliao do tempo de reao na resposta do sistema eletrodo de pH + enzima tanase imobilizada em prolas de vidro. (a) 5 minutos, (b) 10 minutos e (c) 15 minutos.

91

Resultados e Discusses

Assim podemos constatar que, independente do tempo de resposta utilizado a falta de repetibilidade, estabilidade e linearidade continua, demonstrando que o sistema eletrodo de pH usando a enzima tanase imobilizada em prolas de vidro no adequado para ser utilizado como transdutor do biossensor. Em seguida em funo dos resultados insatisfatrios obtidos com o sistema de transduo inicial, um novo transdutor foi testado usando como base outro produto da reao , citada nos itens 3.3.2.1 e 4.2.1 , um complexo colorido capaz de ser detectado oticamente a 490nm. Desta forma, visando o uso de um colormetro na construo do biossensor de taninos, tendo este comprimento de onda fixo em 490 nm (disponvel no laboratrio de sensores biolgicos do DEB/EQ), testes foram realizados para avaliar este novo sistema de transduo. A construo da curva de resposta para o sistema transdutor (colorimetro + enzima tanase imobilizada) para diferentes solues de cido tnico com e sem lavagem entre as medidas mostrada na Figura 5.13. Neste teste foi fixado o tempo de reao de 15 minutos em variaes crescentes da concentrao de substrato (50 a 500 mg/L), e as medidas foram realizadas em deltas de absorbncia, ou seja, diferenas entre o valor da absorbncia da soluo do substrato puro e da absorbncia da soluo originria da reao enzimtica.

92

Resultados e Discusses

0,120 0,100 Delta de Absorbncia 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0 100 200 300 400 500 600 Conc. cido Tnico (mg/L)
CCL CSL DCL DSL

Figura 5.13: Curva de resposta ou calibrao para o sistema transdutor (colormetro) + enzima tanase imobilizada usando solues de diferentes concentraes de cido tnico com e sem lavagem entre as medidas. CCL = crescente com lavagem; CSL = crescente sem lavagem; DCL = decrescente com lavagem; DSL = decrescente sem lavagem

Ao analisar a linearidade das curvas apresentadas na Figura 5.13 pode-se observar que a curva obtida usando o sistema colormetro mais tanase imobilizada em analise crescente de concentrao d cido tnico e sem lavagem entre as medidas foi a que apresentou maior linearidade, com coeficiente de correlao de R2 = 0,9633. No entanto ao observarmos as linearidade de todas as curvas obtidas (Tabela 5.5) independente das condies dos testes, todas apresentaram coeficiente

93

Resultados e Discusses

de correlao superior a 0,9 o que indica uma boa linearidade do sistema testado, portanto sua elevada sensibilidade.

Tabela 5.5: Equao da reta das curvas obtidas pelo sistema colormetro + tanase imobilizada

Condies dos Testes

Equao da Reta

R2

Crescente com Lavagem

Y = 0,0001x + 0,0375

0,9562

Crescente sem Lavagem

Y = 0,002x + 0,0258

0,9633

Decrescente com Lavagem

Y = 0,0002x + 0,0245

0,9078

Decrescente sem Lavagem

Y = 0,0002 + 0,028

0,9520

Desta forma podemos concluir que na construo do biossensor enzimtico para taninos o sistema detector colorimtrico a 490 nm mais enzima tanase imobilizada em prola de vidro podem ser usadas e aplicadas para a quantificao do cido tnico na concentrao de 50 a 500 mg/L, na temperatura de 50C, pH 5,0 e com 15 minutos de reao. Cabe ressaltar que qualquer variao nestas condies poder afetar o funcionamento do sistema e conseqentemente do biossensor a ser construdo.
94

Concluses e Sugestes

CAPTULO 6

CONCLUSES E SUGESTES

6.1 - CONCLUSES Os resultados obtidos durante a realizao deste trabalho permitem obter varias concluses que so descritas a seguir: A tcnica de imobilizao usada permitiu uma boa eficincia na imobilizao, cerca de 99% mantendo o poder cataltico das enzimas imobilizadas por cerca de 90 dias quando estocadas em tampo fosfato pH 5,0 a 10C. O mtodo tambm permitiu que prolas reutilizadas, prolas com enzimas j sem atividade catalticas e pr-tratadas com lavagem com gua destilada e secagem a 100C, fossem usadas como suporte de imobilizao embora ocorressem quedas em torno de 20% de atividade recuperada e aps a quarta reutilizao ocorra um aumento na atividade recuperada. As melhores condies de atuaes da enzima tanase imobilizada foram: pH timo de atuao 5,0 e temperatura tima de atuao entre 50C e 55C

95

Concluses e Sugestes

A faixa de concentrao de acido tnico suportada pela enzima imobilizada foi de 100 a 500 mg/L de cido tnico mostrando at 500 mg/L de cido tnico aumento linear de sua atividade. Apresentando valores da constante de Michaelis-Menten para ambas as temperaturas avaliadas, 30C e 50C superiores ao valor da enzima livre. O tempo de 5 horas para o processo de imobilizao foi suficiente para que o sistema prola de vidro e enzima tanase atinjisse o equilbrio. Dentro da faixa de valores de pH (4,0 6,0) estudados a enzima tanase imobilizada se mostrou estvel por o tempo de 5 horas, apresentado melhor estabilidade em pH 5,0 (92,24%). A tanase imobilizada apresentou ter estabilidade trmica, mostrando valores de atividade residual aps 5 horas de incubao de 92,24%; 63,23% e 26,92% para as temperaturas de 30C; 50C e 60C respectivamente. Os estudos de estabilidade operacional mostram que a tanase imobilizada aps 8 ciclos de reutilizao em regime de batelada apresentou uma queda de 30% e 20% no valor de sua atividade residual em relao a primeira utilizao nas temperaturas de 30C e 50C respectivamente. O sistema eletrodo de pH mais enzima tanase imobilizada em prolas de vidro no se mostrou adequado para ser utilizado como sistema de transduo, nas condies testadas. Em contra partida o sistema colormetro (490nm) mais enzima tanase imobilizada apresentou em todas das curvas obtidas nos ensaios realizados coeficientes de correlao superiores a 0,9 de forma que se mostrou apto

96

Concluses e Sugestes

para ser utilizado como sistema de transduo para a construo do futuro biossensor. 6.2 SUGESTES Atravs do estudo de imobilizao da enzima tanase e de suas caractersticas foi possvel constatar a sua possibilidade de ser utilizada no desenvolvimento do biossensor para taninos hidrolisveis, porem ainda existem muitos pontos a serem explorado para a obteno de tal instrumento, entre ele podem citar: Otimizao do processo de imobilizao, de forma a avaliar quais seriam as melhores condies para o tcnica de imobilizao utilizada, como quantidade de enzima fornecida ao suporte, tempo de imobilizao, pH do meio de imobilizao. Verificar a utilizao de outros sistemas de transduo para ser utilizado como detector da reao enzimtica. Construo do biossensor enzimtico para taninos hidrolisveis e testa-los em amostras reais, tais como chs, sucos e vinhos. Aplicar o biossensor em uma linha de fluxo de forma a automatizar de maneira simples a tcnica analtica desenvolvida.

97

Referncias Bibliogrficas

CAPTULO 7

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Abdel-Naby, M.A., Sherif, A.A., El-Tanash, A.B., Mankarios, A.T., (1999). Immobilization of Aspergillus oryzae tannase and properties of the immobilized enzyme. J. Appl. Microbiol, v. 87, p. 108114; 1999. Aerts, T.J.; Barry, T.N.; Mcnabb, W.C. Polyphenols and agriculture: beneficial effects of proanthocyanidins in forages. Agriculture, Ecosytems and Environment. V.75, p.112, 1999. Aguilar, C.N. Guitirrez-Snchez, G. Review: sources, properties, applications and potential uses of tannin acly hydrolase. Food Sci. Tech. Int, v. 5, p. 373-382, 2001. Alfaya, A.A. S.; Kubota, L.T. A. Utilizao de materiais pelo processo de sol-gel na construo de biossensores. Qumica Nova, v.25, n 5, v. 835-841; 2008. Arya, S.K.; Datta, M.; Malhotra, B.D. Recent advances in cholesterol biosensor. Biosensors and Bioelectronics, v. 23, p.10831100, 2008. Bailey, J. E.; Ollis, D. F. Biochemical Engineerring Fundamentals. 2. ed. New Yourk: McGrawl-Hill; 1986 Barahona, R; Sanchez, S; Lascano, C. E.; Emyr Owenc; Phillip Morris; Theodorou, M.K., Effect of condensed tannins from tropical legumes on the activity of fibrolytic enzymes from the rumen fungus Neocallimastyx hurleyensis, Enzyme and Microbial Technology, v. 39 p. 281288; 2006
98

Referncias Bibliogrficas

Bate-Smith, E.C. Astringent tannins of Acer species. Phytochemistry, v.16, p. 14211426, 1977. Bayramoglu, G.; Senem, K.; Yilmaz, M.; Toppare, L.; Arica, M. Y.; Covalent immobilization of chloroperoxidase onto magnetic beads: Catalytic properties and stability, Biochemical Engineerring Journal, v. 38, p.180-188; 2008. Boadi, D.K.; Neufeld, R.J.; Encapsulation of tannase for the hydrolysis of tea tannins, Enzyme and Microbial Technology, v. 28 p. 590595; 2001 Brigida, A.I.S. Estudo da imobilizao de lipase tipo B de Candida antartica utilizando fibra da casca de coco de verde como suporte, Dissertao de mestrado, Universidade Federal do Cear, Fortaleza, Cear Cabral, J.M.S.; Aires-Barros, M.R.; Gama, M. Engenharia enzimatica, Lidel, 2003. Campanella, L. Nuccilli, A.; Tomassetti, M.; Vecchio,S. Biosensor analysis for the kinetic study of polyphenols deterioration during the forced thermal oxidation of extravirgin olive oil. Talanta, v.74 v.12871298, 2008. Chang, F., Chen,P.; Chen, R.L.C.; Lu,F.; Cheng, T.; Real-time assay of immobilized tannase with a stopped-flow conductometric device Bioelectrochemistry, v. 69 p.113 116; 2006. Chibata, I. Industrial application of immobilized enzyme-systems. Pure and Applied Chemistry. v. 50, n. 7, p. 667-675. 1978. Chibata, I.; Tosa, T. Immobilisation enzymes and immobilized microbial-cells. Journal of Synthetic Organic Chemistry Japan. v. 36, n. 11, p. 917-930; 1978. DSouza, S. F.; Godbole, S. S. Immobilization of invertese on rice husk using polyethylenimime, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, v. 52, p. 59-62, 2002. Du,P.; Zhou,B.; Cai, C. Development of an amperometric biosensor for glucose based on electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide at the single-walled carbon nanotube/nile blue A nanocomposite modified electrode. Journal of Electroanalytical Chemistry, v. 614, p. 149156; 2008.
99

Referncias Bibliogrficas

Fernndez-Lorente, G.; Fernndez-Lafuente, R.; Palomo, J.M.; Mateo, C.; Bastida, A.; Coca, J.; Haramboure, T.; Hernndez-Justiz, O.; Terreni, M. Guisn, J. M. Biocatalyst engineering exerts a dramatic effect on selectivity of hydrolysis catalyzed by immobilized lipases in aqueous medium. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 11, p. 649-656; 2001 Ferwerda,J.G.; Siderius, W.; Van Wieren, S.E.; Grant,C.C.; Peel, M.; Skidmore, A. K.; Prins, H.H.T.; Parent material and fire as principle drivers of foliage quality in woody plants, Forest Ecology and Management; 2006 Folly, R.O.M.; Valdman, B.; Valero,F.; Sal.; Potentiometric Sensor for On-line Glucose Determination, Biotechnology Techniques, 10(11), p. 867-870; 1996. Giorno, L.; Drioli, E.; Biocatalytic membrane reactor: applications and perspectives. Tibtech, v. 18, p. 339-349; 2000. Godjevargova, T.; Nenkova, R.; Konsulov, V.; Immobilization of glucose oxidase by acrylonitrile copolymer coated silica supports, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 38, p. 59-64; 2006. Hall, E.A.H.; Amperometric Biosensor; Biosensor, Open University Press, Londom, p. 351; 1990. Haslam, E. Vegetal tannins Lessons of a phytochemical lifetime. Phytochemistry, v. 68, p. 2713-2721, 2007 Haslam, E., Lilley, T.H. Natural astringency in foodstuffs a molecular interpretation. CRC Crit. Rev. Food Sci. Nut. 27 (1): 1-40. 1988. Haslam, E. Stangroom, J.E. The esterase and depsidase activities of tanase, Biochem. J., v. 99 p. 28-31; 1966 Hernndez-Jstiz, O.; Fernadez-Lafuente, R.; Terreni, M. E Guisan, J.M. Use of aqueous two-phase systems for in situ extration of water soluble antibiotics during their synthesis by enzymes immobilized on porous supports. Biotechnology and Bioengineering, v. 59, n 1, p. 73-79; 1998.
100

Referncias Bibliogrficas

Huang,W.; Ni, J.; Borthwick, A. G.L.; Biosynthesis of valonia tannin hydrolase and hydrolysis of valonia tannin to ellagic acid by Aspergillus SHL 6, Process Biochemistry, v. 40 p.12451249; 2005. Inoue, K.H., Hagerman, A.E. Determination of gallotannin with rhodanine. Analytical Biochemistry, v. 169, p. 363-369; 1988 Kar, B.; Banerjee, R.; Bhattacharyya, B. C.; Effect of additives on the behavioural properties of tannin acylhydrolase, Process Biochemistry, v. 38 p. 1285-1293, 2003. Kennedy, J. F.; White, C. A.; Melo, E. H. M. The immobilization of enzymes and cells. Chimicaoggo, p. 21-29; 1988. Lehninger, A.L. Princpios de bioqumica. ed. 5 So Paulo: Sarvier, 1989. Cap. 9. Leka P.K.; Lonsane, B.K. Production application of tannin acyl hydrolase: state of the art. Adv. Appl. Microbiol. v. 44 p. 215-260, 1997 Makkar, H. P. S.; Becker, K. Do tannins in leaves os tree and shubs from African and Himalayan regions differ in leves and activity? Agrof. Systems, v. 40, p. 59-68, 1998; Mateo, C; Abian, O. Fernndez-Lafuente, R.; Guisn, J. M. Increase in conformational stability of encimes immobilized on epoxy-activated supports by favoring aditional multipoint covalent attachment. Enzyme and Microbial Technology, v.26, p. 509-515; 2000. Mello,L.D; Kubota, L.T. Biosensors as a tool for the antioxidant status evaluation. Talanta, v. 72, p. 335348; 2007. Melo, A.F; Pinto, G.A.S.; Gonalves, L.R.B; Ferreira, A.L. Mtodo para determinao da atividade de tanase em derivados imobilizados (2005). Comunicado tcnico 16796535. Melo, A. F.; Pinto, G. A. S.; Gonalves, L.R.B; Ferreira, A L.O. (2005) Imobilizao da tanase em suporte vtreos utilizando -aminopropiltrietoxilano (ATPS). Comunicado tcnico 1679-6535.

101

Referncias Bibliogrficas

Mueller-Harvey, I. Analsis of hydrolysable tannins. Animal feed science and technology, v. 91, p. 3-20, 2001. Pahujani, S.; Kanwar, S.S.; Chauhan, G.; Gupta, R.; Glutaraldehyde activation of polymer Nylon-6 for lipase immobilization: Enzyme characteristics and stability, Bioresource Technology, v. 99, p. 2566-2570; 2008. Pansera, M.R.; Santos, A.C.A.; Paese, K.; Wasum, R.; Rossato, M.; Rota, L.D.; Pauletti, G.F.; Serafini, L.A. Anlise de taninos totais em plantas aromaticas e medicinais cultivadas no nordeste do Rio Grande do Sul, Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 13, p. 17-22; 2003 Perez, E.F. Desenvolvimento de um biossensor amperomtrico para oxalate. Dissertao de Mestrado. Universidade Estadual de Campinas, Campinas, So Paulo, 2000. Pinto, G.A.S.; Couri, S.; Leite, S.G.F.; Brito, E.S. Tanase: conceito, produo e aplicao. B.Ceppa, v.23, p. 435-462, 2005 Pinto, G.A.S.; Couri, S.; Gonalves, E.B. Replacement of methanol by ethanol on gallic acid determination by rhodanine and its impacts on the tannase assay. EJEAFChe, ISSN: 1579-4377, 2006 Poncet-Legrand C, Edelmannb, A.; Putauxc,J.L; Cartaladea, D.; Sarni-Manchadoa, P.; Vernheta, A. Poly(L-proline) interactions with flavan-3-ols units: Influence of the molecular structure and the polyphenol/protein ratio. Food Hydrocolloids, v. 20, p. 687697, 2006 Pundir, C. S.; Chauham, N.S.; Bhambi, M.; Activation of polyvinyl chloride sheet surface for covalent immobilization of oxalate oxidase and its evaluation as inert support in urinary oxalate determination, Analytical Biochemistry, v.374, p. 272-277; 2008. Rodrigues, D.S.; Mendes, A A.; Adriano, W.S.; Gonalves, L.R.B.; Giordano, R.L.C.; Multipoint covalent immobilization of microbial lipase on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 51, p. 100-109; 2008.
102

Referncias Bibliogrficas

Romani, A.; Minunni, M.; Mulinacci, N.; Pinelli,P.; Vincieri, F.F. Comparison among differential pulse voltammetry, amperometric bisensor, and HPLC/DAD analysis for polyphenol determination. J. Agric. Food Chem, v.48, p. 1197-1203, 2000.

Rosatto, S.S. Desenvolvimento de um biossensor amperomtrico para fenol a base de peroxidase e silica modificada. Tese de Doutorado Universidade Estadual de Campinas, Campinas, So Paulo, 2000. Sasakia, E.; Shimadab,T.; Osawaa,R.; Nishitania, Y.; Spring, S.; Lang, E.; Isolation of tannin-degrading bacteria isolated from feces of the Japanese large wood mouse, Apodemus speciosus, feeding on tannin-rich acorns, Systematic and Applied Microbiology, v. 28 p.358365; 2005 Santos, S.A; Abreu, L.R.; Chagas, S.J.R. Efeito do armazenamento nos teores de fenlicos em caules de abacaxeiro. Rev. Bras.Agroc., v. 3 p. 107-109, 1997 Salgado, A. M. (2001), Desenvolvimento e aplicao de sensores e sistemas de monitorao de biomassa, etanol e de substrato por modelo. Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil. Sharma, 2007. Spink, C.; Wadso, I.; Methods Biochem. Anal, 23, p1; 1976. Thevenot, D.R.; Toth, K.; Durst, R.A; Wilson, G.S.; Electrochemical biosensor: recommended definition and classification, Biosensor & Bioelectronics, v. 16, p. 121131; 2001. Thies, M.; Fischer, R. Photometric bestimmug von gallassuredurch farbreaktion mit rhodanine. Mikrochimica Acta, v. 5, p.809-814, 1973. Tischer, W.; Kasche, V. Immobilized enzymes: crystal or carriers? Trends in Biotechnology, v. 17, p. 326-335. 1999. S.; Agarwal, L.; Saxena, R. K. Purification, immobilization and

characterization of tannase from Penicillium variable. Bioresouce Technology. Abril

103

Referncias Bibliogrficas

Tukel, S.S.; Alpetekin, O.; Immobilization and Kinetics of catalase ontomagnesium silicate, Process Biochemistry, v. 39, p. 2149-2155; 2004. Vaquero I.; Marcobal, A.; Munoz, R.; Tannase activity by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine, International Journal of Food Microbiology, v. 96 p.199 204; 2004. Weetall, H. H. e C. C. Detar (1974), Immobilization tannase. Biotechonology and bioengineering, v. XVI, p. 1095-1102; 1974. Willis, R. B.; Allen, P. R., 1998. Improved method for measuring hydrolysable tannins using potassium iodate. Analyst, v. 123, p. 435-439. Wilson, T.C., Hagerman, A.E. Quantitative determination of ellagic acid. J. Agric. Food Chem., v.38, p. 1678-1683. 1990. Yesiloglu, Y. Utilization of bentonite as a support material for immobilization of Candida rugosa lipase. Process Biochemistry, v. 40, p. 2155-2159, 2005. Yu, X.; Li, Y.; Wu, D.; Enzymatic synthesis of gallic acid esters using microencapsulated tannase: effect of organic solvents and enzyme specificity, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 30 p.6973; 2004. Zhae, Y.B.; Wen, M.L.; Liu, S.Q.; Liu, Z.H.; Zhang, W.D.; Yao, Y.; Wang, C.Y.; Microbiologi Sensor for determination of Tannic Acid, Microchemical J., v. 60, p. 201209; 1998. Zanin, G. M. Sacarificao de amido em reator de leito fluidizado com enzima amiloglicosidade imobilizada. Tese de Doutorado em Engenharia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas.

104

ANEXOS

Anexo 01: DETERMINAO DA ATIVIDADE DA ENZIMA TANASE EM SOLUO

5,0 mL de soluo 0,02% de cido tnico

Aclimatar em banho termosttico

Adicionar 0,25 mL do complexo enzimtico

Incubar a 30C por 10 min

Transferir 0,4 mL da mistura reacional para tubos contento 0,6 mL de soluo etanlica de rodanina 0,667%
Homogeneizar e deixar em repouso por 5 min

Adicionar 0,4 mL de soluo de KOH 0,5N

Homogeneizar e deixar em repouso por 2,5 min

Adicionar 8,6 mL de gua destilada

Homogeneizar

Ler a 520 nm

Anexo 02: SEQUENCIA DE ANALISE DO BRANCO UTILIZADO NA DETERMINAO DA ATIVIDADE DA ENZIMA TANASE EM SOLUO

5,0 mL de soluo 0,02% de cido tnico

Aclimatar em banho termosttico

Adicionar 0,25 mL do complexos enzimtico

Retirar a cada 5 min ate completar 30 min Incubar a 50C por 30 min

Transferir 0,4 mL da mistura reacional para tubos contento 0,6 mL de soluo etanlica de rodanina 0,667%
Homogeneizar e deixar em repouso por 5 min

Adicionar 0,4 mL de soluo de KOH 0,5N

Homogeneizar e deixar em repouso por 2,5 min

Adicionar 8,6 mL de gua destilada

Homogeneizar

Ler a 520 nm

Anexo 03: DETERMINAO DA ATIVIDADE DA ENZIMA TANASE IMOBILIZADA

10,0 mL de soluo 0,05% de cido tnico

Aclimatar em banho termosttico

Adicionar 0,25 mL do complexo enzimtico

Transferir imediatamente

Transferir 0,4 mL da mistura reacional para tubos contento 0,6 mL de soluo etanlica de rodanina 0,667%
Homogeneizar e deixar em repouso por 5 min

Adicionar 0,4 mL de soluo de KOH 0,5N

Homogeneizar e deixar em repouso por 2,5 min

Adicionar 8,6 mL de gua destilada

Homogeneizar

Ler a 520 nm