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Revista da Graduao
Vol. 5 No. 2 2012 12
Seo: Faculdade de Fsica
Ttulo: TESTE E CARACTERIZAO DE UMA MATRIZ MULTIELETRODO PARA REGISTRO DE SINAIS ELETROFISIOLGICOS IN VITRO
Autor: Carolina de Barros Vidor
Este trabalho est publicado na Revista da Graduao. ISSN 1983-1374 http://revistaseletronicas.pucrs.br/ojs/index.php/graduacao/editor/submission/12422
PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE FSICA
CAROLINA DE BARROS VIDOR
TESTE E CARACTERIZAO DE UMA MATRIZ MULTIELETRODO PARA REGISTRO DE SINAIS ELETROFISIOLGICOS IN VITRO
Porto Alegre 2012
Trabalho de concluso de curso apresentado como requisito parcial para a obteno do ttulo de Bacharel em Fsica Mdica pela Faculdade de Fsica da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Meurer Papalo
Porto Alegre 2012
Trabalho de concluso de curso apresentado como requisito parcial para a obteno do ttulo de Bacharel em Fsica Mdica pela Faculdade de Fsica da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul.
Aprovado em: _____ de ___________________ de ________. BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Ricardo Meurer Papalo (orientador)
_____________________________________
Profa. Dra. Maria Eullia Pinto Tarrag
__________________________________
Me. Daniel Rodrigo Marinowic
__________________________________
Porto Alegre 2012
Dedico este trabalho minha av Ida ( in memorium), cuja vida sempre to dedicada e sofrida me ensinou a mais dura e importante lio que uma mulher deve aprender: a alma feminina no apenas faz perguntas a respeito de ns mesmas, da nossa famlia, dos nossos projetos e da maneira como levamos a vida, mas exige respostas.
Nossa compreenso convencional est baseada em suposies que foram passadas a ns, suposies que dependem de formas convencionais de percepo. Fomos ensinados a dar nome s coisas, atribuindo-lhes uma realidade que no possuem. A mente convencional muito linear, pulando de um pensamento para outro. Podemos nos imaginar como pensadores multifacetados, cujas ideias formam algo como um mosaico, mas somos to somente seres que mudam muito depressa. Todos os conceitos e pensamentos que surgem na mente, na verdade toda a nossa experincia da realidade, no so muito diferentes de desenhos feitos com o dedo sobre a superfcie da gua. No prprio ato em que uma imagem est sendo criada, ela deixa de existir.
Chagdud Tulku Rinpoche
RESUMO O objetivo principal deste trabalho foi caracterizar uma matriz multieletrodo (MEA) e implementar procedimentos de medidas de sinais eletrofisiolgicos in vitro. Esse trabalho foi realizado como etapa preliminar execuo de um projeto de pesquisa que prev o desenvolvimento e o teste de dispositivos MEAs customizados para a investigao in vitro da epilepsia em fatias cerebrais humanas. A caracterizao da MEA foi realizada atravs da obteno de imagens por microscopia ptica e por microscopia eletrnica de varredura, alm de anlise qualitativa de composio qumica atravs de espectroscopia de raios x por energia dispersiva. A implementao de procedimentos de medida exigiu a construo de um interfaceamento eletrnico entre a MEA e o sistema de aquisio de dados. Esse interfaceamento se mostrou eficiente para a realizao de um teste preliminar de utilizao da MEA. O teste foi realizado a partir da estimulao eltrica de clulas mesenquimais em cultura retiradas de medula ssea humana, aps a aplicao um protocolo de neurodiferenciao. A anlise das medidas realizadas consistiu na avaliao qualitativa dos sinais registrados atravs da discriminao e identificao visual de resposta celular eletrofisiolgica. Os resultados obtidos se mostraram promissores. Como perspectiva futura, pretende-se realizar testes sistemticos com estimulao de cultura celular a fim de se avaliar atravs de anlise estatstica os parmetros eletrofisiolgicos envolvidos na resposta celular estimulao eltrica artificial com o uso da MEA.
Palavras-chave: Matriz multieletrodo. MEA. Arranjo de mltiplos eletrodos. Registro eletrofisiolgico. Registro extracelular. Epilepsia.
ABSTRACT The main goal of this work was to describe a multi-electrode array (MEA) and to implement procedures for measuring electrophysiologic signals in vitro. It was conducted as a previous stage for a broader research project that aims to develop and test customized MEAs for in vitro investigation of epilepsy in human brain slices. The MEA characterization was obtained by optical and scanning electrical microscopy images and after qualitative analysis of the chemical composition through energy-dispersive X-ray spectroscopy. The measurements with the sensor required the development of an electronical interface between the MEA and the data collecting system. The developed interfaced proved to be very effective for a preliminary MEA usage test. Electric stimuli were applied to human mesenchymal stem cell culture, which was submitted to a protocol of neural differentiation. The analysis of this work consisted of qualitative evaluation of every registered signal found after visual identification of the electrophysiological cell response. The preliminary recording results proved to be promising. As future perspective, it is intended to conduct additional systematic measurements on cell cultures in order to perform more complex statistical analysis of all the electrophysiological patterns involved in cellular response to artificial electric stimulation with the use of the MEA.
Keywords: Multi-electrode Extracelullar recording. Epilepsy.
array.
MEA. Electrophysiological
recording.
LISTA DE ILUSTRAES Figura 1 Estrutura de um neurnio tpico. ................................................................18 Figura 2 Diagrama representando a gerao e a propagao de um potencial de ao ao longo da membrana axonal. As setas indicam o fluxo inico. Em (a) a membrana est em repouso; em (b) a membrana recebe um estmulo; (c) e (d) mostram a propagao do potencial de ao. .............................................................21 Figura 3 Grfico do potencial de membrana em funo do tempo, mostrando as fases de um potencial de ao. O grfico A representa o potencial de ao terico, enquanto o grfico B representa o potencial de ao conforme medido experimentalmente. .......................................................................................................23 Figura 4 Conduo saltatria do impulso nervoso. As setas indicam o fluxo inico atravs da membrana neuronal. ...................................................................................24 Figura 5 Fluxo de ons sdio Na+ e potssio K+ (indicado pelas setas no desenho A) atravs da membrana celular em repouso e circuito equivalente (mostrado em B). O smbolo Vm indica potencial de membrana e Cm indica capacitncia de membrana......................................................................................................................28 Figura 6 Circuito equivalente representando o fluxo de corrente I entre uma clula e o aparato experimental para registro eletrofisiolgico. As setas indicam o fluxo da corrente. .........................................................................................................................29 Figura 7 Comparao entre (A) a estrutura da membrana celular e (B) um circuito equivalente evidenciando a caracterstica resistiva da membrana em relao ao fluxo inico. A resistncia equivalente R eq resultante da associao em paralelo de dois resistores igual a duas vezes o valor da condutncia G. .........................................30 Figura 8 Comparao entre (A) a estrutura da membrana celular e (B) um circuito equivalente evidenciando a caracterstica capacitiva da membrana, anloga a uma associao em paralelo de capacitores. A capacitncia equivalente (C eq) igual a duas vezes o valor da capacitncia (C). ......................................................................30 Figura 9 Circuito eltrico resistivo-capacitivo (indicado pela letra A) equivalente membrana celular (indicada por B). R e C representam, respectivamente, a resistncia e a capacitncia da membrana. .................................................................31
Figura 10 Circuito equivalente para o modelo de corrente de membrana I m de Hodgkin-Huxley, onde Cm a capacitncia de membrana; V m o potencial de membrana; VNa, VK e VL so os potencias de equilbrio para os ons sdio, potssio e outro ons no determinados, respectivamente; e RNa, RK e R L so as resistncias associadas aos fluxos inicos.......................................................................................32 Figura 11 Esquema de uma micropipeta de vidro para registros intracelulares (sharp electrode). ..........................................................................................................34 Figura 12 Registros intracelulares e extracelulares de potenciais de ao: (A) potencial de ao bifsico registrado por microeletrodo extracelular, caracterstico de um potencial de ao no-propagado; (B) potencial de ao trifsico registrado por microeletrodo extracelular, caracterstico de um potencial de ao propagado; (C) potencial de ao com formato de onda complexa registrado por microeletrodo extracelular, caracterstico de uma composio de potenciais de ao produzidos pela excitao sequencial do segmento inicial e do soma de um neurnio; (D) potenciais de ao registrados por microeletrodo intracelular (a seta indica artefato resultante do estmulo aplicado). ..................................................................................36 Figura 13 Esquema da tcnica current clamp para estimulao intracelular. ........37 Figura 14 Respostas eletrofisiolgicas da membrana celular aplicao artificial de corrente eltrica. A curva mostrada em A pode representar a resposta passiva de uma clula excitvel ou de uma no-excitvel. A curva mostrada em B indica potencias de ao deflagrados em sequncia devido aplicao de um estmulo supralimiar. ....................................................................................................................38 Figura 15 Esquema de aplicao da tcnica voltage clamp. ..................................39 Figura 16 Esquema de um arranjo experimental para a tcnica patch clamp ( esq.). A corrente de juno representa a corrente de fuga que flui atravs da micropipeta, mas no flui atravs da membrana. Essa fuga causa um aumento no rudo eletrnico sobre a corrente medida. O sinal captado est representado direita. ............................................................................................................................41 Figura 17 Diferentes configuraes experimentais da tcnica patch clamp. ..........42 Figura 18 Aplicao da MEA para estimulao de fatia cerebral e de cultura celular. Fatia de hipocampo de rato ( esq.) e cultura de clulas cardacas de rato ( dir.), sobre MEAs com diferentes configuraes de microeletrodos. ..........................43
Figura 19 Corte esquemtico do microchip de uma MEA fabricado pela empresa Qwane Biosciences. ......................................................................................................44 Figura 20 Esquema de clulas sobre MEAs com microeletrodos em configurao 3D ( esq.) e planar ( dir.). ..........................................................................................44 Figura 21 Esquema da cmara de registro sobre a MEA........................................45 Figura 22 Exemplo de uma matriz multieletrodo fabricada pela empresa Qwane Biosciences. A configurao final do dispositivo uma placa com dimenses de 5 cm x 5 cm. .....................................................................................................................45 Figura 23 Esquema do paradigma de estimulao por aplicao de pulsos pareados. .......................................................................................................................22 Figura 24 Registro de campo mostrando o primeiro e o segundo potencial pssinptico excitatrio (EPSP) obtidos atravs do paradigma de estimulao por pulsos pareados. .......................................................................................................................23 Figura 25 Interface do programa CyberAmp para ajuste de parmetros de estimulao....................................................................................................................23 Figura 26 Fotografia mostrando arranjo experimental dos aparatos utilizados e sistema de aquisio de dados, indicados pelos nmeros: (1) fixador de corrente; (2) conversor analgico-digital; (3) amplificador; (4) condicionador de sinais; (5) estimulador programvel; (6) microcoputador; (7) sensor conectado ao sistema de aquisio de dados; (8) mesa antivibracional e (9) gaiola de Faraday. ......................25 Figura 27 Esquema mostrando as partes do sinal obtido em um registro de campo. As letras indicam: (a) pulso de aplicao do estmulo; (b) resposta celular passiva causada pelo componente capacitivo da membrana; e (c) curva de deflexo caracterstica de um EPSP, causada pela resposta ativa da membrana. ..................26 Figura 28 Interface do software Clampfit 9.2 exibindo registro obtido pela estimulao da cultura celular sobre a MEA por aplicao de pulsos pareados........26 Figura 29 Viso geral do microcircuito da MEA. A letra A indica o substrato de vidro e a letra B indica a placa de circuito impresso (PCI). A regio delimitada pelo retngulo indica a conexo entre o microeletro e a PCI; a regio delimitada pelo quadrado mostra a parte central do microcircuito. As setas indicam um dos quatro pares de eletrodos terra. ...............................................................................................18 Figura 30 Arranjo dos microeletrodos da MEA mostrado por microscopia ptica. .19 Figura 31 Arranjo dos microeletrodos da MEA mostrado por microscopia eletrnica de varredura obtida nos modos SE (imagem A) e BSE (imagem B). O nmero 1
indica um microeletrodo, o nmero 2 indica uma trilha do microcircuito e o nmero 3 indica o substrato de vidro. ...........................................................................................20 Figura 32 Imagens de um microeletrodo de estimulao e registro obtidas por MEV nos modos SE (imagem A) e BSE (imagem B). O nmero 1 indica o microeletrodo e o nmero 2 indica a trilha do microcircuito. .......................................21 Figura 33 Detalhe de um microeletrodo terra mostrado por MEV no modo SE. As marcaes na imagem indicam as regies da MEA nas quais se aplicou identificao de composio qumica por EDS: (1) microeletrodo; (2) trilha do microcircuito e (3) substrato. .......................................................................................................................22 Figura 34 Identificao por EDS da composio qumica do substrato do sensor. O resultado indica predominncia de silcio (Si) e menores quantidades de carbono (C) e oxignio (O). A presena de ouro (Au) causada pela metalizao do sensor. O grfico representa o nmero de contagens (eixo y) por energia (eixo x) da ordem de kilovolts (kV). .................................................................................................................22 Figura 35 - Identificao por EDS da composio qumica do microeletrodo (imagem A) e da trilha do microcircuito do sensor (imagem B). O resultado indica predominncia de platina (Pt) no microeletrodo e predominncia de ouro (Au) na trilha,com menores quantidades de carbono (C) e oxignio (O). Os grficos representam o nmero de contagens (eixo y) por energia (eixo x) da ordem de kilovolts (kV). .................................................................................................................23 Figura 36 Configurao experimental construda para utilizao do sensor, mostrando a MEA (1), a placa de Petri (2) e o cabo IDE 40 vias (3). .........................24 Figura 37 Interface entre o sensor e o sistema de aquisio de dados. A numerao indica: (1) sensor; (2) cabo IDE 40 vias; (3) chave dip switch; (4) protoboard; (5) cabos com terminais BCN. ..................................................................24 Figura 38 Registro obtido aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de 10ms entre si. possvel constatar a deflagrao de EPSP (indicado pela seta) aps o segundo estmulo. ......................................................................................................25 Figura 39 - Registro obtido aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de tempo de 20ms entre si. possvel constatar a deflagrao de EPSP (indicado pela seta) aps o segundo estmulo. ....................................................................................26 Figura 40 Registros obtidos aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de tempo de 40ms entre si. A imagem A mostra a ausncia de resposta ativa da
membrana celular; por outro lado, a imagem B mostra a deflagrao de EPSPs (indicados pelas setas). ................................................................................................26 Figura 41 - Registros obtidos aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de tempo de 100ms (imagem A) e 120ms (imagem B) entre si. A deflagrao de EPSPs (indicados pelas setas) ficou evidente..........................................................................27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BDNF - fator neurotrfico derivado de crebro (do ingls brain derived neurotropic factor) BSE detector de eltrons retroespalhados (do ingls backscattered scanning electron) CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico CEMM - Centro de Microscopia e Microanlises da PUCRS CMI - Centro de MicroNano Tecnologia da EPFL DMEM meio de cultura celular ECG eletrocardiografia EDS - espectroscopia de raios X por disperso de energia (do ingls energydispersive X-ray spectroscopy) EEG - eletroencefalografia EMG - eletromiografia ENoG - eletroneurografia EOG - eletro-oculografia EPFL cole Politechnique Fdrale de Lausanne ERG eletrorretinografia EPSP - potencial sinptico ps-excitatrio (do ingls excitatory postsynaptic potencial) GCSF - fator estimulador de colnia de granulcitos (do ingls granulocyte colony stimulating factor) HH Modelo dinmico de membrana de Hodgkin e Huxley HSL Hospital So Lucas da PUCRS hMSC - clulas-tronco mesenquimais humanas (do ingls human mesenchymal stem cell) InsCer Instituto do Crebro IPB Instituto de Pesquisas Biomdicas do HSL LMN - Laboratrio de Materiais e Nanocincias LMIS4 - Laboratrio de Microsistemas 4 da EPFL MEA matriz multieletrodo ou arranjo de mltiplos eletrodos (do ingls multielectrode array) MEV microscopia eletrnica de varredura NANOPUC Grupo de Nanoestruturas e Nanoscopia da PUCRS NeuroLab - Laboratrio de Neurocincias
OMS Organizao Mundial da Sade PCI placa de circuito impresso PUCRS Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul RPMI meio de cultura celular desenvolvido pelo Instituto Roswell Park Memorial (do ingls Roswell Park Memorial Institute) SE eltrons secundrios (do ingls secondary electrons ) TECNOPUC Parque Tecnolgico e Industrial da PUCRS TMC - Technical Manufacturing Corporation
LISTA DE SMBOLOS Ag - prata AgCl cloreto de prata Au - ouro C capacitncia eltrica Ceq capacitncia equivalente Ca++ - ons clcio Cl- - ons cloro Cm capacitncia de membrana cm - centmetro F - constante de Faraday G condutncia inica G - gigaohm HH modelo de membrana e Hodgkin-Huxley IK corrente resultante do fluxo de ons potssio I corrente eltrica IL corrente resultante do fluxo de ons no especificados (do ingls linkage current) Im corrente total de membrana Iion - corrente inica de membrana Ic - corrente capacitiva de membrana INa corrente resultante do fluxo de ons sdio [on]ext - concentrao inica no meio extracelular [on]int - concentrao inica no meio intracelular K+ - ons potssio [K+]ext - concentrao do on potssio no meio extracelular [K+]int - concentrao do on potssio no meio intracelular KCl cloreto de potssio kV - kilovolt mA miliampre mL - mililitro mm - milmetro ms milissegundo mV milivolt
M - megaohm Na+ - ons sdio [Na+]ext - concentrao do on sdio no meio intracelular [Na+]int - concentrao do on sdio no meio intracelular pA picoampre pF - picoFarad Pk permeabilidade relativa ao on potssio PNa - permeabilidade relativa ao on sdio Pt - platina Qm - carga mxima do capacitor de membrana q(t) - carga do capacitor em um instante de tempo t qualquer R - constante universal dos gases R resistncia eltrica RC circuito resistivo-capacitivo Req resistncia equivalente Rm resistncia de membrana RK - resistncia de membrana passagem de ons potssio RNa - resistncia de membrana passagem de ons sdio T - temperatura absoluta t tempo VK potencial de equilbrio para o on potssio VL potencial de equilbrio para ons no especificados Vm potencial de membrana ou potencial transmembrana VNa potencial de equilbrio para o on sdio z - carga (nmero de valncia) do on m - micrmetro
SUMRIO
1 INTRODUO ...........................................................................................................18 1.1 Justificativa ..............................................................................................................20 1.2 Objetivos ..................................................................................................................21 1.2.1 Objetivo geral .....................................................................................................21 1.2.2 Objetivos especficos ........................................................................................21
2 FUNDAMENTAO TERICA ................................................................................18 2.1 Clulas neuronais....................................................................................................18 2.1.1 Potencial de repouso .........................................................................................20 2.1.2 Potencial de ao ...............................................................................................21 2.2 Bioeletricidade .........................................................................................................25 2.2.1 Potencial de membrana ....................................................................................25 2.2.2 Corrente de membrana......................................................................................27 2.2.3 Resistncia de membrana e condutncia inica ...........................................29 2.2.4 Capacitncia de membrana ..............................................................................30 2.2.5 A membrana como circuito resistivo-capacitivo ...........................................31 2.3 Modelo dinmico de Hodgkin-Huxley (HH) ............................................................32 2.4 Registros eletrofisiolgicos .....................................................................................34 2.4.1 Clampeamento de corrente (current clamp) ..................................................37 2.4.2 Clampeamento de voltagem (voltage clamp) .................................................39 2.4.3 Fixao de membrana (patch clamp) ..............................................................40 2.4.4 Matriz multieletrodo (MEA) ...............................................................................43
3 MATERIAIS E MTODOS .........................................................................................18 3.1 Procedimento experimental ....................................................................................18 3.1.1 Caracterizao dos sensores ...........................................................................18 3.1.2 Interfaceamento entre o sensor e o sistema de aquisio de dados .........19 3.1.3 Cultura celular ....................................................................................................19 3.1.4 Teste preliminar para registro eletrofisiolgico ............................................21 3.2 Aparato experimental ..............................................................................................24
16 3.3 Anlise dos dados preliminares ..............................................................................25
4 RESULTADOS ...........................................................................................................18 4.1 Caracterizao dos sensores .................................................................................18 4.2 Interfaceamento entre o sensor e o sistema de aquisio de dados ....................23 4.3 Cultura celular .........................................................................................................25 4.4 Teste preliminar para registro eletrofisiolgico ......................................................25
5 CONCLUSES ..........................................................................................................18
6 PERSPECTIVAS FUTURAS .....................................................................................18
REFERNCIAS .............................................................................................................19
18 1 INTRODUO O estudo dos princpios fsico-qumicos da bioeletrognese constitui a base para a compreenso dos processos eletrofisiolgicos que ocorrem no corpo humano. Diversos testes clnicos - como eletrorretinografia (ERG), eletro-oculografia (EOG), eletroencefalografia (EEG), eletrocardiografia (ECG), eletromiografia (EMG),
eletroneurografia (ENoG), entre outros - esto fundamentados no registro e na interpretao de sinais bioeltricos provenientes da propagao de potenciais de ao em rgos e tecidos especializados. O registro de potenciais de ao in vivo pode ser realizado atravs do uso de eletrodos dispostos externamente ao corpo sobre a superfcie da pele, por exemplo - ou internamente, diretamente sobre um rgo como o caso do corao. O registro in vitro, por sua vez, pode ser feito atravs de microeletrodos conectados diretamente a fatias de tecidos ou cultura celular (NEUMAN, 2000). Basicamente, o potencial de ao gerado a partir de uma perturb ao do estado de repouso da membrana celular, com consequente fluxo de ons, por meio da membrana e alterao da concentrao inica nos meios intra e extracelular (KRUEGER-BECK et al, 2011). As manifestaes bioeltricas ou eletrofisiolgicas que ocorrem no corpo humano so aquelas relacionadas conduo de potencias de ao em tecidos nervosos, em tecidos musculares e nos rgos responsveis pelos sentidos. Os neurnios so as clulas especializadas na gerao e transmisso de sinais eltricos nos tecidos nervosos. A principal caracterstica do tecido nervoso que a excitao celular a partir de um estmulo localizado rapidamente transmitida s outras regies do tecido, e o registro desse sinal pode ser feito diretamente na clula nervosa. Os potenciais gerados nos tecidos musculares so similares queles nos tecidos nervosos, porm seu registro s pode ser realizado a partir de grupos de fibras, o que implica na medida de uma soma de potenciais eltricos em vez de um nico potencial. As clulas sensoriais, por sua vez, s podem ser excitadas a partir de estmulos especficos (luz, som, odor, calor, presso, etc). Esses estmulos causam alteraes eltricas nas clulas, as quais acabam por deflagrar a gerao do impulso nervoso sensorial (GRINGS, 1954). Alm da compreenso de processos eletrofisiolgicos normais, o
entendimento da dinmica de conduo nervosa a partir de modelos animais experimentais e a caracterizao eletrofisiolgica de diferentes clulas possibilitam
19 principalmente a elucidao da fisiopatogenia de diversos transtornos. Nessa perspectiva, a Neurologia uma das reas mdicas que mais se beneficia com estudos eletrofisiolgicos. Tais estudos auxiliam a indicar o diagnstico de desordens neurolgicas, a detectar leses estruturais no crebro, a monitorar a integridade funcional de determinadas estruturas neurais durante um procedimento operatrio, a avaliar a acuidade visual ou auditiva de pacientes incapazes de cooperar com testes comportamentais, entre outras utilidades clnicas
(GREENBERG et al, 1996). Alm disso, tambm possibilitam o desenvolvimento e a avaliao de novas estratgias teraputicas para o tratamento dessas desordens. As diversas pesquisas realizadas atualmente propondo o uso de clulas-tronco ou o emprego de novos frmacos, por exemplo, no representariam alternativas teraputicas s neuropatologias caso os mecanismos de excitao celular no fossem investigados (ENGEL et al, 2005) Dentre as disfunes cerebrais mais frequentes, est a epilepsia, doena que afeta cerca de 50 milhes de pessoas no mundo todo e caracterizada clinicamente por alteraes comportamentais sbitas conhecidas como crises epilpticas . A epilepsia considerada pela Organizao Mundial da Sade (OMS) uma questo de sade pblica, pois um problema que ocorre com alta frequncia na populao, acarreta um risco significativo de morte ou invalidez e sobrecarrega o indivduo afetado, sua famlia, comunidade e a sociedade como um todo (WORLD HEALTH ORGANISATION, 2012). Apesar de serem publicados anualmente inmeros livros e artigos cientficos retratando as ltimas pesquisas relacionadas ao diagnstico e ao tratamento de diversos aspectos da epilepsia, pouco tem sido feito em relao busca e disseminao de estratgias que possam ter um impacto importante sobre o controle de crises epilpticas e sua preveno. A imprevisibilidade de ocorrncia de crises epilpticas expe o paciente a danos fsicos e psicolgicos, causando assim um impacto negativo sobre o seu desenvolvimento social, integrao e qualidade de vida em geral (ENGEL et al, 2005). Desta maneira, de extrema importncia que sejam desenvolvidas intervenes capazes de prever e prevenir a ocorrncia de crises epilpticas. Novas abordagens teraputicas como a infuso local de drogas antiepilpticas e a estimulao eltrica direta do crebro, por exemplo, exigem a compreenso dos
20 mecanismos de gerao das crises (epileptognese), do local no crebro onde os estmulos devem ser aplicados e a determinao de que tipo de estimulao seria mais eficaz a fim de modular ou inibir a funo neuronal. Com base nessas consideraes, encontra-se em andamento um projeto de pesquisa1 realizado em acordo de cooperao bilateral entre o Brasil (Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul - PUCRS) e a Sua (cole Polytechnique Fdrale de Lausanne EPFL). O objetivo principal do projeto desenvolver e testar sensores customizados para a investigao in vitro da epilepsia em fatias cerebrais humanas ( human brain slices ). Mais especificamente, os sensores empregados correspondem a matrizes multieletrodo (ou arranjos de mltiplos eletrodos, do termo em ingls multi-electrode array MEA). A proposta da pesquisa baseia-se na aplicao dos sensores para a deteco de alteraes eletroqumicas relacionadas aos diferentes estados eltricos do tecido epilptico, a fim de elucidar aspectos-chave relacionados epileptognese. Este trabalho, portanto, insere-se no mbito da referida pesquisa e corresponde a um estgio anterior execuo do projeto inicialmente proposto. Desta maneira, pretende-se investigar as variveis envolvidas na utilizao das matrizes multieletrodo para o registro de sinais eletrofisiolgicos in vitro.
1.1 Justificativa
As tcnicas usualmente disponveis em um laboratrio de neurocincia para o registro de sinais eletrofisiolgicos in vitro apresentam limitaes inerentes que dificultam o estudo dos mecanismos associados epileptognese, como a impossibilidade de se avaliar diferenas especficas de regies (site-specific differences) e padres de atividade neuronal atravs de fatias de crebro. Nesse contexto, o uso de MEAs pode evidenciar as diferenas e interconexes no interior de redes de epilepsia.
Development of Biosensors to Investigate Mechanisms of Epileptogenesis: Addressing Neglected Issues in Epilepsy. Este projeto atende ao edital do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico) N 01/2011 para Pesquisa, Desenvolvimento e Inovao no mbito da cooperao cientfica e tecnolgica com a Sua.
21 1.2 Objetivos
1.2.1 Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho caracterizar uma matriz multieletrodo (MEA) e implementar procedimentos de medidas de sinais eletrofisiolgicos in vitro utilizando esse dispositivo.
1.2.2 Objetivos especficos
Caracterizar a MEA. Construir a interface entre a MEA e o sistema de medida. Testar o uso da MEA para registro de sinais eletrofisiolgicos in vitro atravs da estimulao eltrica de clulas em cultura.
18 2 FUNDAMENTAO TERICA Este captulo introduz os conceitos bsicos necessrios ao entendimento dos mecanismos biolgicos responsveis pela gerao e transmisso de sinais eltricos no tecido nervoso e descreve os principais mtodos utilizados para a estimulao de clulas e registro de sinais eletrofisiolgicos in vitro.
2.1 Clulas neuronais
Os diferentes tipos celulares que compem o sistema nervoso podem ser classificados de forma geral em dois grupos: neurnios e clulas gliais. Estima-se que existam cerca de 100 bilhes de neurnios no encfalo humano, os quais so responsveis principalmente pela recepo e transmisso de estmulos entre o exterior e o interior do corpo. As clulas gliais esto presentes no encfalo em quantidade aproximadamente dez vezes superior ao nmero de neurnios, e contribuem para a atividade enceflica principalmente por isolar, sustentar e nutrir os neurnios vizinhos (BEAR et al, 2008). A Figura 1 representa de maneira simplificada um neurnio, tambm chamado de clula nervosa.
Figura 1 Estrutura de um neurnio tpico.
Fonte: adaptado de HowStuffWorks International, Inc. (2012).
Um neurnio tpico pode ser dividido em trs regies principais: corpo celular (tambm chamado de soma), dendritos e axnio. Nos neurnios mielinizados, o axnio envolto de maneira descontnua pela bainha de mielina, formada por
19 camadas sobrepostas de membranas de clulas gliais. Os espaos nos quais a bainha de mielina interrompida, deixando pequenas regies da membrana axonal expostas, so chamados de ndulos de Ranvier. Os neurnios mielinizados so comumente referidos como fibras nervosas, e feixes de fibras nervosas so chamados de nervos. A estrutura da clula nervosa est fortemente relacionada sua funo. O corpo celular, regio central da clula, detm as organelas celulares (ncleo, mitocndrias, ribossomos, aparelho de Golgi, retculo endoplasmtico liso e retculo endoplasmtico rugoso), o citosol (fluido aquoso coloidal rico em potssio) e o citoesqueleto (formado por microtbulos, microfilamentos e neurofilamentos, responsveis pela forma caracterstica do neurnio). Os dendritos so prolongamentos do soma designados coletivamente pelo termo rvore dendrtica . Esse conjunto especializado na recepo de informao, pois a membrana dendrtica recoberta de protenas responsveis pela deteco de neurotransmissores na fenda sinptica (regio que separa as membranas pr- e ps-sinpticas). Os axnios, por sua vez, so estruturas altamente especializadas nos processos de transferncia de informaes ao longo do sistema nervoso. A parte inicial do axnio (conectada ao soma) o cone de implantao, seguido por uma regio intermediria (o axnio propriamente dito) e finalmente pelo terminal axonal. Essa extremidade faz a juno especializada, chamada de sinapse, do axnio com outros neurnios ou tipos celulares. O lado pr-sinptico representado pelo terminal axonal, enquanto o lado ps-sinptico pode ser um dendrito ou o soma de outro neurnio, ou qualquer outra clula que faa a ligao sinptica com o neurnio. A transmisso sinptica consiste na transferncia de informao atravs de uma sinapse, de maneira que:
[] quando um impulso nervoso chega ao terminal axonal prsinptico, so liberadas molculas de neurotransmissores das vesculas sinpticas na fenda sinptica. Os neurotransmissores ento se ligam a protenas receptoras especficas, desencadeando a gerao de sinais eltricos ou qumicos na clula ps-sinptica (BEAR et al, 2008, p. 39).
Alm das estruturas apresentadas anteriormente, destaca-se tambm a membrana neuronal, que desempenha papel fundamental na transmisso do
20 impulso nervoso. Ela recobre todo o neurnio (embora sua composio protica varie de acordo com a regio da clula), delimita o citosol dos fluidos externos e semipermevel passagem de algumas substncias, como ons sdio (Na+ ), potssio (K+), clcio (Ca++), cloro (Cl -), protenas e glicose, entre outras (KRUEGERBECK et al, 2011). As protenas inseridas na membrana neuronal podem formar dois tipos de estruturas funcionais, que so responsveis pelo estabelecimento dos gradientes de concentrao inica: os canais inicos e as bombas inicas. Os canais inicos funcionam como portes que se abrem e fecham atravs da membrana a fim de permitir ou impedir o fluxo de ons a favor do gradiente de concentrao, e funcionam de maneira seletiva, ou seja, cada canal especfico (ou permevel) a determinado on. Por sua vez, as bombas inicas so mecanismos que gastam energia para transportar ons atravs da membrana contra o gradiente de concentrao (BARR, 2000). Desta maneira, o movimento de ons atravs da membrana neuronal pode ocorrer por dois fenmenos distintos: difuso a favor do gradiente de concentrao ou diferena de potencial eltrico atravs da membrana. Define-se potencial de membrana (Vm - tambm designado potencial transmembrana) como sendo o potencial eltrico atravs da membrana neuronal em qualquer momento, causado pela distribuio desigual de carga eltrica (diferentes concentraes inicas). As diferentes concentraes de ons ao logo da membrana neuronal garantem as condies necessrias transmisso do impulso nervoso ou potencial de ao, que representa uma breve inverso do potencial de repouso da membrana. Ambos os fenmenos sero descritos nos subitens a seguir.
2.1.1 Potencial de repouso
O potencial de repouso da membrana neuronal representa a situao na qual a membrana encontra-se polarizada, ou seja, o citosol em contato com a superfcie interna da membrana possui carga eltrica negativa em relao ao exterior, e no h transmisso de impulso nervoso. Em um neurnio tpico, o valor do potencial de repouso de aproximadamente Vm = - 65 mV (BEAR et al, 2008). Nessa situao, o
21 on K+ apresenta maior concentrao no meio intracelular, enquanto os ons Na+ e Ca++ apresentam maiores concentraes no meio extracelular. A fim de manter o potencial de repouso, a atividade da bomba de sdio e potssio produz e mantm um alto gradiente de concentrao de potssio atravs da membrana. Uma vez que a membrana neuronal em repouso altamente permevel ao on K+ devido existncia de canais de potssio, o movimento do on atravs da membrana, a favor do gradiente de concentrao, deixa o interior do neurnio carregado negativamente (BEAR et al, 2008).
2.1.2 Potencial de ao
O potencial de ao (spike potential) da membrana neuronal a situao na qual ocorre uma rpida inverso do potencial de repouso, de modo que a regio da membrana em contato com o interior celular torna-se carregada positivamente em relao ao exterior celular. Essa condio, caracterizada pela despolarizao da membrana, acontece devido abertura de canais de sdio, o que permite o influxo de ons Na+ e, por conseguinte, torna a membrana menos negativa. A repolarizao, por sua vez, causada pelo efluxo de ons K+ da clula. O fluxo inico atravs da membrana axonal est representado esquematicamente na Figura 2.
Figura 2 Diagrama representando a gerao e a propagao de um potencial de ao ao longo da membrana axonal. As setas indicam o fluxo inico. Em (a) a membrana est em repouso; em (b) a membrana recebe um estmulo; (c) e (d) mostram a propagao do potencial de ao.
Fonte: adaptado de Damask (1978).
Inicialmente em repouso (situao a), a membrana rece be um estmulo em determinada regio (situao b), causando o influxo de Na + e tornando o interior celular localmente positivo. Assim, ocorre uma reduo no potencial de
22 membrana na regio prxima ao local estimulado, provocando o efluxo de ons K+ . Quando a diferena de potencial atingir determinado limiar, essa regio da membrana se tornar permevel ao sdio e estimular a regio adjacente e assim sucessivamente (situaes c e d), at que a onda de despolarizao percorra toda a membrana (DAMASK, 1978). No entanto, a gerao de um potencial de ao ocorrer somente quando a despolarizao alcanar ou superar determinado nvel crtico, denominado potencial limiar excitatrio ou limiar de despolarizao (ASSIS et al, 2010). Tal processo conhecido como efeito tudo-ou-nada (all-or-none response), pois a aplicao de uma despolarizao crescente a um neurnio no causar a transmisso de um impulso nervoso a menos que seja atingido o limiar. Em situaes nas quais o neurnio sofre despolarizao contnua acima do nvel do limiar de despolarizao, so gerados sucessivos potenciais de ao. A intensidade do estmulo despolarizante determina a taxa de gerao (frequncia de disparo) dos potenciais de ao. Alm da despolarizao causada pelos diferentes mecanismos biolgicos de entrada de ons na clula, um neurnio tambm pode ser despolarizado ao receber aplicao de corrente eltrica, observando-se que a intensidade da corrente eltrica aplicada seja o suficiente para atingir o potencial limiar excitatrio (PURVES et al, 2010). O comportamento eltrico da membrana axonal durante a gerao de um potencial de ao pode ser representado em um grfico do potencial de membrana em funo do tempo, conforme demonstrado na Figura 3 a seguir. O grfico A apresenta a resposta neuronal de acordo com o modelo terico. A fase ascendente corresponde rpida despolarizao da membrana, causada pela entrada de ons Na+ atravs de canais de sdio dependentes de voltagem. O termo overshoot indica situao na qual o potencial de membrana positivo, e o valor mximo (pico) atinge cerca de V m = 40 mV. A fase descendente causada pela inativao dos canais de sdio e a sada de ons K+ atravs de canais de potssio dependentes de voltagem, e representa uma rpida repolarizao da membrana, atingindo um potencial mais negativo do que o potencial de repouso (aproximadamente Vm = 80 mV). A fase de hiperpolarizao representa a restaurao gradual do potencial de repouso (BEAR et al, 2008; PURVES et al, 2010).
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Figura 3 Grfico do potencial de membrana em funo do tempo, mostrando as fases de um potencial de ao. O grfico A representa o potencial de ao terico, enquanto o grfico B representa o potencial de ao conforme medido experimentalmente.
Fonte: adaptado de Wikipdia (2012).
O grfico B mostra de que modo a membrana do axnio reage aplicao de um estmulo eltrico, conforme mensurado em um experimento de registro eletrofisiolgico intracelular (esse paradigma de estimulao ser explicado no item 2.4 deste trabalho). O potencial de repouso da clula considerada de V m= -75 mV, e o pulso de estimulao aplicado teve durao constante. O limiar indicado nos grficos representa o potencial no qual se inicia a rpida entrada de Na + na clula (potencial limiar ou limiar de excitao celular). A aplicao de um estmulo
24 supralimiar deflagrou na clula a resposta ativa. Uma vez que o estmulo foi capaz de elevar rapidamente o potencial de membrana acima do repouso, houve uma queda acentuada da resistncia da membrana. Nesse momento, ocorreu um grande influxo de ons sdio, o que tornou o meio intracelular positivo e causou a gerao do potencial de ao. O processo de conduo do impulso nervoso dura em mdia 2 ms, contudo esse valor varia de acordo com o tipo de neurnio (KRUEGER-BECK et al, 2011). O perodo necessrio para a membrana restaurar seu potencial de repouso chamado de perodo refratrio, e est relacionado s permeabilidades relativas dos ons. Durante o perodo refratrio absoluto, mesmo que a membrana receba o estmulo necessrio, ser impossvel a gerao de um novo potencial de ao. Caso a clula esteja sujeita a um perodo refratrio relativo, o potencial de ao ocorrer novamente apenas mediante um estmulo muito intenso (REILLY et al, 1997). Apesar de o impulso nervoso representar a transmisso de um sinal eltrico, as propriedades eltricas dos neurnios so fundamentalmente diferentes daquelas verificadas em um condutor metlico. Nos neurnios, a conduo nervosa ocorre de maneira muito mais lenta, regular e sem mudanas de intensidade (ASSIS et al, 2010, p. 1307-1). Alm disso, o isolamento eltrico da membrana axonal causado pelo envoltrio de mielina faz com que a conduo nervosa ocorra de maneira saltatria atravs da despolarizao dos ndulos de Ranvier, diferindo assim fundamentalmente do fluxo de eltrons nos condutores metlicos (KRUEGER-BECK et al, 2011). O fluxo inico atravs do axnio mielinizado est representado esquematicamente na Figura 4.
Figura 4 Conduo saltatria do impulso nervoso. As setas indicam o fluxo inico atravs da membrana neuronal.
Fonte: adaptado de Damask (1978).
25 Finalmente, a informao transmitida pelo impulso nervoso codificada no sistema nervoso atravs da frequncia de disparo e do padro dos impulsos eltricos transmitidos, alm da distribuio e do nmero de neurnios disparando potenciais de ao em determinado nervo ou regio cerebral (MICHELI-TZANAKOU, 2000).
2.2 Bioeletricidade
O termo bioeletricidade comumente empregado para designar
os
fenmenos eltricos produzidos por organismos vivos. Nestes, os processos bioeltricos naturais so responsveis por suas funes nervosas e musculares, resultantes das propriedades especializadas da membrana celular e que ocorrem devido a dois fatores fundamentais: as diferentes concentraes de ons nos meios intra e extracelular e a presena de molculas especializadas (canais inicos, bombas inicas e transportadores de carga) capazes de transportar esses ons atravs da membrana (REILLY et al, 1997; BARR, 2000). A fim de avaliar os movimentos inicos sob uma perspectiva eltrica, os principais conceitos em eletricidade envolvidos na descrio dos mecanismos subjacentes conduo nervosa so apresentados a seguir.
2.2.1 Potencial de membrana
O potencial de membrana ou potencial transmembrana ( Vm) de uma clula resultado do gradiente de concentrao inica e corresponde diferena de potencial entre os meios intracelular e extracelular. Em clulas tpicas o valor de Vm normalmente da ordem de milivolts (mV ou 10 -3 V). Devido ao fato de a membrana ser seletivamente permevel a alguns ons, o fluxo difusional (passagem do meio de maior concentrao para o meio de menor concentrao) de um on gera uma diferena de potencial eltrico entre os lados da membrana. Assim, origina-se tambm um gradiente de potencial eltrico, cujo fluxo eltrico resultante ir se opor ao fluxo difusional. O potencial de repouso da membrana, portanto, representa a situao na qual no h fluxo lquido de corrente (o influxo e o efluxo de ons se igualam) atravs da membrana, constituindo assim uma condio de equilbrio eletroqumico. O potencial de ao, por sua, representa
26 uma breve perturbao desse equilbrio, seguida pelo fluxo inico necessrio para restaurar o potencial de equilbrio. O potencial de equilbrio eletroqumico Vion de determinado on representa a condio na qual o seu fluxo atravs da membrana nulo e pode ser calculado pela equao de Nernst-Planck (equao 1):
onde R a constante universal dos gases (R=8,31 J/mol.K); T a temperatura absoluta (T=310 K, considerando-se a temperatura mdia do corpo humano); z a carga (nmero de valncia) do on; F a constante de Faraday (F=96500 C/mol); [on] ext e [on] int indicam a concentrao inica nos meios extra e intracelular, respectivamente (REILLY et al, 1997). Em concentraes diludas, ons em solues aquosas se comportam como molculas gasosas. Por essa razo, a constante universal dos gases R aplicada na modelagem do fluxo inico celular (VARGHESE, 2000). Por no considerar a permeabilidade inica, a equao de Nernst-Planck supe o equilbrio eletroqumico para determinado on como se a membrana fosse permevel somente a este on. No entanto, essa situao no representa a realidade. Desta maneira, o clculo do potencial de repouso exige que sejam consideradas tambm as permeabilidades relativas a cada on envolvido no processo, conforme proposto pela equao de Goldman-Hodgkin-Katz (equao 2), que prediz o valor do potencial de repouso medido experimentalmente em um neurnio:
onde R, T e F so os mesmos parmetros da equao (1); Pk e PNa so as permeabilidades relativas aos ons potssio e sdio, respectivamente; [K+]ext e [K+]int so as concentraes do on potssio nos meios extra e intracelulares; [Na+]ext e [Na+] int so as concentraes do on sdio nos meios extra e intracelular (PURVES et al, 2010). Tendo em vista que os canais inicos determinam o influxo e o efluxo de ons atravs da membrana, e conseqentemente so responsveis pela manuteno da
27 diferena de potencial entre os meios intra e extracelular, pode-se considerar que essas estruturas moleculares atuam como baterias nas clulas (MDS ANALYTICAL TECHNOLOGIES, 2008). Essa analogia elucidada pelo modelo dinmico de Hodgkin-Huxley (HH), conforme ser apresentado posteriormente neste trabalho.
2.2.2 Corrente de membrana
A corrente que flui por clulas est relacionada a dois fatores. O primeiro diz respeito ao fluxo de ons atravs de canais inicos e obedece Lei de Ohm, pois a corrente atravs da membrana diretamente proporcional diferena de potencial aplicada entre os meios intra e extracelular. O segundo fator refere-se corrente de natureza capacitiva correspondente estrutura dieltrica lipdica da membrana, que atua como um capacitor de membrana (VARGHESE, 2000; GARCIA, 2002). Esse aspecto ser elucidado no subitem 2.2.4 deste trabalho. Portanto, tem-se que a corrente total de membrana (Im) dada pela equao (3), onde Iion corresponde corrente inica e Ic corresponde corrente capacitiva:
Durante o repouso, a corrente total Im que atravessa a membrana nula, pois o influxo de ons sdio INa equilibrado pelo efluxo de ons potssio IK, conforme representado na equao (4):
A diferena de potencial que atua como gradiente causador da corrente inica igual diferena entre o potencial de membrana (V m) e o potencial de equilbrio do on (Von). Considerando-se que a membrana oferece resistncia (R ion) passagem de determinado on, tem-se, para Na+ (equao 5) e K+ (equao 6) que:
Esse fluxo de corrente pode ser representado atravs de um circuito eltrico equivalente, conforme mostrado na Figura 5. A situao A representa a membrana em repouso, quando o meio intracelular se encontra negativo em relao ao meio
28 extracelular. Nessa situao, h baixa concentrao de ons sdio (Na +) e alta concentrao de ons potssio (K + ) no interior da clula, enquanto essas concentraes so opostas no meio extracelular. As setas indicam o sentido do fluxo inico. O circuito equivalente a esse modelo representado em B , onde C m indica a capacitncia de membrana e Vm indica o potencial de membrana. Os canais inicos so representados pela bateria do circuito.
Figura 5 Fluxo de ons sdio Na e potssio K (indicado pelas setas no desenho A) atravs da membrana celular em repouso e circuito equivalente (mostrado em B). O smbolo Vm indica potencial de membrana e Cm indica capacitncia de membrana.
+ +
Fonte: adaptado de Varghese (2000).
Um valor tpico de corrente de membrana normalmente da ordem de picoamperes (pA ou 10 -12A). Por exemplo, estima-se que, quando um nico canal de sdio aberto, cerca de 10 4 ons Na+ atravessam a membrana por segundo, o que equivale a uma corrente eltrica de 1,6pA (MDS ANALYTICAL
TECHNOLOGIES, 2008). Alm disso, a corrente ( I) que flui entre a clula e o aparato experimental, quando se realiza o estudo do potencial de membrana in vitro, tambm pode ser representada por um circuito equivalente, conforme mostrado na Figura 6 a seguir.
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Figura 6 Circuito equivalente representando o fluxo de corrente I entre uma clula e o aparato experimental para registro eletrofisiolgico. As setas indicam o fluxo da corrente.
Fonte: adaptado de MDS Analytical Technologies (2008).
2.2.3 Resistncia de membrana e condutncia inica
A resistncia de membrana (R ) est relacionada resistncia oferecida passagem de ons atravs da membrana. Um valor tpico da faixa de 1.000 a 8.000 cm2 (GARCIA, 2002). Contudo, esse fluxo inico usualmente discutido em termos de condutncia inica G, que representa a grandeza inversa resistncia e est intimamente relacionada, embora no seja idntica, permeabilidade da membrana ( PURVES et al, 2010, p. 46). Assim, a corrente inica que flui atravs da membrana ser nula quando no houver gradiente eletroqumico (V m Vion = 0) e ou quando esta for impermevel a determinado on ( G = 0). Durante o repouso, a condutncia inica permanece constante, e o potencial de membrana normalmente invarivel. Quando diversos canais inicos esto abertos simultaneamente na membrana, a condutncia equivalente ou total corresponde soma das condutncias dos canais inicos abertos individualmente. Essa situao pode ser representada por um circuito equivalente, conforme mostrado na Figura 7.
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Figura 7 Comparao entre (A) a estrutura da membrana celular e (B) um circuito equivalente evidenciando a caracterstica resistiva da membrana em relao ao fluxo inico. A resistncia equivalente Req resultante da associao em paralelo de dois resistores igual a duas vezes o valor da condutncia G.
2.2.4 Capacitncia de membrana
A configurao da membrana celular em bicamada lipdica responsvel por sua qualidade dieltrica. Essa caracterstica, aliada permeabilidade relativa aos diferentes ons e assimetria na distribuio inica entre os meios intra e extracelular permite membrana apresentar propriedades capacitivas. Alm disso, quanto maior o tamanho da clula, maior a sua propriedade capacitiva. Esse fato permite uma analogia entre a membrana celular e uma associao de capacitores em paralelo, conforme demonstrado na Figura 8. Um valor de capacitncia celular tpico da ordem de 0,01 pF/m2 (10-8 F/m2) (MDS ANALYTICAL TECHNOLOGIES, 2008).
Figura 8 Comparao entre (A) a estrutura da membrana celular e (B) um circuito equivalente evidenciando a caracterstica capacitiva da membrana, anloga a uma associao em paralelo de capacitores. A capacitncia equivalente (Ceq) igual a duas vezes o valor da capacitncia (C).
31 O componente capacitivo (Ic) da corrente de membrana ocorre somente durante o intervalo de tempo t no qual h variao do potencial de membrana (dVm/dt). Assim, Ic nulo durante o potencial de repouso, contudo deve ser considerado no-nulo durante os processos de despolarizao e repolarizao celular. Ento a corrente que passa pelo capacitor de membrana dada pela equao (7):
2.2.5 A membrana como circuito resistivo-capacitivo
As consideraes apresentadas anteriormente permitem concluir que a membrana celular apresenta comportamento eltrico passivo semelhante a uma associao do tipo resistor-capacitor em paralelo (circuito RC), conforme representado na Figura 9.
Figura 9 Circuito eltrico resistivo-capacitivo (indicado pela letra A) equivalente membrana celular (indicada por B). R e C representam, respectivamente, a resistncia e a capacitncia da membrana.
Nesse caso, a corrente que flui atravs do resistor de membrana aquela causada pelo descarregamento do capacitor de membrana, e varia conforme a equao (8), onde q(t) a carga do capacitor em um instante de tempo t qualquer; Qm a carga mxima do capacitor; e R mC m o produto entre a resistncia e a capacitncia de membrana e representa a constante de tempo do circuito:
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2.3 Modelo dinmico de Hodgkin-Huxley (HH)
O primeiro modelo que props uma explicao para a dinmica de conduo nervosa fundamentada nos mecanismos de base inica foi o modelo desenvolvido em 1952 por Alan Lloyd Hodgkin e Andrew Fielding Huxley. Os pesquisadores ganharam o Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina no ano de 1963 por esse trabalho, que serve de base at hoje para muitos outros modelos de predio da excitao e conduo nervosA (KRUEGER-BECK et al, 2011). Aps realizarem estudos sobre o fluxo de corrente eltrica atravs da membrana de um axnio gigante de lula ( Loligo forbesi o axnio dito gigante, pois apresenta dimetro de cerca de 1 mm, enquanto neurnios humanos apresentam dimetro entre 0,01 e 0,05 mm), Hodgkin e Huxley (1952) concluram que o comportamento eltrico da membrana poderia ser descrito por um circuito equivalente conforme representado na Figura 10. O experimento que os conduziu a esse resultado ser detalhado no item 2.4.2 deste trabalho.
Figura 10 Circuito equivalente para o modelo de corrente de membrana Im de HodgkinHuxley, onde Cm a capacitncia de membrana; Vm o potencial de membrana; VNa, VK e VL so os potencias de equilbrio para os ons sdio, potssio e outro ons no determinados, respectivamente; e RNa, RK e RL so as resistncias associadas aos fluxos inicos.
Im
Fonte: adaptado de Hodgkin e Huxley (1952).
33 Nessa descrio, os pesquisadores consideraram que a membrana neuronal apresentava a propriedade de armazenar cargas como se fosse um capacitor, e tambm era capaz de resistir ao fluxo de cargas, como um resistor. Assim, o fluxo de corrente na membrana seria possvel quando o capacitor de membrana estivesse carregado ou quando houvesse movimento de ons atravs das baterias em paralelo com o capacitor. Ou seja, as diferenas de concentraes dos ons atuam como baterias com foras eletromotrizes correspondentes aos potenciais de equilbrio calculados pela equao de Nernst (SORIANO et al, 2006, p. 29). Ento VNa, VK, V L representam, respectivamente, o potencial de equilbrio para o on sdio, para o on potssio e outros ons no previamente determinados; e RNa, R K e R L so as resistncias associadas aos fluxos desses ons. A corrente inica total Im a soma das correntes inicas resultantes do movimento de ons sdio ( INa) e de ons potssio ( IK), e ainda por uma corrrente de fuga ( leakage current - IL) causada por cloretos e outros ons. A corrente de fuga se apresenta como uma complicada combinao de correntes, cujos detalhes ainda no so totalmente compreendidos (HOBBIE e ROTH, 2006). Cada componente da corrente inica pode ento ser estimado como uma diferena de potencial eltrico e um coeficiente de permeabilidade nas mesmas dimenses da condutncia inica. Desta maneira, a corrente inica Iion causada pelo fluxo de determinado on igual condutncia G ion para este on multiplicada pela diferena entre o potencial de membrana Vm e o potencial de equilbrio inico V ion. Para o fluxo de sdio (9) e de potssio (10) tem-se que:
O modelo HH estabeleceu as bases para o surgimento do conceito de canal inico, at ento inexistente, por constatar que as condutncias associadas aos ons sdio e potssio eram variveis e altamente dependentes da voltagem aplicada atravs da membrana neuronal. As condutividades para esses ons foram ento descritas por um conjunto de equaes diferenciais no-lineares capazes de predizer com grande aproximao os valores medidos nos axnios gigantes de lula. Entretanto, evidncias diretas da existncia de canais inicos s foram obtidas
34 dcadas mais tarde a partir da realizao do experimento desenvolvido por Erwin Neher e Bert Sakmann, conforme ser detalhado no subitem 2.4.3 deste trabalho.
2.4 Registros eletrofisiolgicos
Clulas excitveis podem ser estimuladas ao receberem a aplicao de corrente eltrica externa. Esse fato permite o estudo in vitro das propriedades eletrofisiolgicas de clulas isoladamente, quando os estmulos so aplicados em cultura celular; ou o estudo do comportamento de agrupamentos celulares, quando so utilizadas fatias cerebrais (brain slices) (BASHIR e VIGNES, 1997). O registro de um potencial de ao pode ser realizado a partir de duas configuraes bsicas: intracelular ou extracelular. Na configurao intracelular, um microeletrodo colocado em contato com o citosol, isto , ocorre o empalamento da clula. Nesse caso, o microeletrodo deve ser pequeno o suficiente para no causar dano membrana celular capaz de alterar seu funcionamento normal (MILLAR, 1997). Os microeletrodos comumente utilizados para registros intracelulares so micropipetas de vidro (Figura 11), cuja haste possui dimetro de aproximadamente 1 a 2 mm e preenchida com soluo salina concentrada a fim de proporcionar alta condutividade eletroltica e que tem composio inica similar ao fluido intracelular (usualmente utiliza-se cloreto de potssio - KCl). Alm disso, em ambas as configuraes (intracelular e extracelular), um fio metlico inserido na micropipeta de vidro para conectar a soluo eletroltica ao circuito de amplificao e processamento do sinal eletrofisiolgico captado (MILLAR, 1997).
Figura 11 Esquema de uma micropipeta de vidro para registros intracelulares (sharp electrode).
Fonte: adaptado de Bretschneider e Weille (2006).
Considerando-se que o dimetro de neurnios humanos varia de 5 m a 50 m, dependendo do tipo do neurnio, a ponta da micropipeta intracelular deve idealmente ter dimetro entre 0,1 e 1 m, a fim de se evitar ruptura brusca da membrana neuronal e o consequente extravasamento do contedo intracelular. Para
35 que essa ponta extremamente fina seja obtida, a micropipeta deve ser submetida imediatamente antes da utilizao (devido a sua extrema fragilidade) a um estirador (puller), um equipamento especial que aquece a micropipeta e estica a parte fundida do vidro, at formar a estrutura necessria. Por essa razo, o uso da micropipeta intracelular tambm conhecido como sharp electrode technique (tcnic a do eletrodo pontudo), e permite apenas o registro de sinais provenientes de uma nica clula (single-unit recording (HUMPHREY e SCHMIDT, 1991). As micropipetas intracelulares apresentam alta resistncia, que pode variar entre 10 e 500 M. Esse valor est relacionado condutividade do fluido salino usado para preencher a haste e rea seccional da ponta, e serve como referncia para determinar a qualidade da micropipeta. Quanto maior a resistncia obtida, maior ser o rudo eletrnico gerado. Micropipetas que apresentam resistncia da ordem de 50M, normalmente tambm exibem rudo de cerca de 0,5 a 1mV (MILLAR, 1997). Consequentemente, filtros eletrnicos devem ser acoplados ao sistema de registro de sinais para diminuir o rudo do sinal captado. Na configurao extracelular, o eletrodo localizado prximo clula, mas no ocorre o empalamento. Uma vez que a atividade eltrica celular caracterizada pelo fluxo de ons atravs da membrana neuronal, essa atividade pode ser detectada sem que o eletrodo penetre na clula e a danifique, o que representa uma vantagem em relao aos registros intracelulares. No entanto, a intensidade dos potenciais de ao detectados nessa situao pode ser de 10 a 100 vezes menor quando comparado aos registros intracelulares, uma vez que a deteco do sinal depender da localizao do eletrodo em relao ao corpo c elular ou ao axnio do neurnio (MILLAR, 1997). Os microeletrodos utilizados para registro extracelular podem ser
micropipetas de vidro (cujas pontas so relativamente maiores do que as micropipetas intracelulares, pois apresentam cerca de 1 a 5 m de dimetro) preenchidas com soluo de cloreto de sdio (NaCl); ou podem ser microeletrodos metlicos, usualmente de tungstnio ou fibra de carbono. Outra vantagem da micropipeta extracelular em relao intracelular a possibilidade de se registrar o sinal proveniente de duas ou mais clulas ao mesmo tempo ( multi-unit recording), devido ao maior dimetro da ponta.
36 Normalmente, nas tcnicas de registro extracelular d-se preferncia ao uso de microeletrodos metlicos, pois a alta resistncia da micropipeta de vidro causa um rudo eletrnico ainda maior quando utilizada para registros extracelulares. Contudo, necessrio considerar que os microeletrodos metlicos, por serem condutores, trocam eltrons da sua superfcie em contato com a soluo eletroltica, o que permite aos ons gerarem uma capacitncia na soluo. Assim, o registro extracelular exige que haja um controle rgido da temperatura, do pH e da concentrao inica da soluo para se evitar um rudo elevado na captao do sinal (MILLAR, 1997). Tanto na realizao de registros intracelulares quanto extracelulares, as medidas eltricas podem ser realizadas de dois modos: (a) empregando-se dois eletrodos, sendo que um utilizado para estimular e captar a resposta eletrofisiolgica, e o segundo imerso na soluo que banha ( bathing medium) a clula ou a fatia de tecido e serve como referencial terra (eletrodo de referncia); ou (b) empregando-se trs eletrodos, de modo que dois so dispostos sobre a cultura celular ou fatia de tecido, sendo um deles utilizado para a aplicao do estmulo e o outro para o registro da resposta eletrofisiolgica, enquanto o terceiro usado como eletrodo de referncia. A Figura 12 compara a forma do sinal captado quando o registro da resposta eletrofisiolgica feito no meio intracelular ou extracelular.
Figura 12 Registros intracelulares e extracelulares de potenciais de ao: (A) potencial de ao bifsico registrado por microeletrodo extracelular, caracterstico de um potencial de ao no-propagado; (B) potencial de ao trifsico registrado por microeletrodo extracelular, caracterstico de um potencial de ao propagado; (C) potencial de ao com formato de onda complexa registrado por microeletrodo extracelular, caracterstico de uma composio de potenciais de ao produzidos pela excitao sequencial do segmento inicial e do soma de um neurnio; (D) potenciais de ao registrados por microeletrodo intracelular (a seta indica artefato resultante do estmulo aplicado).
Fonte: adaptado de Wood (2011).
Percebe-se que os registros extracelulares (imagens A, B e C da Figura 12) apresentam picos negativos, enquanto registros intracelulares apresentam picos
37 positivos (imagem D). Essa diferena devido ao fato de que, na realizao de medidas extracelulares, o sinal captado representa no a atividade individual de um neurnio, mas sim o comportamento geral da populao neural, chamado de potencial de campo local. Desta maneira, o registro do potencial de campo local fornece a diferena relativa de cargas no meio extracelular antes e aps a aplicao do estmulo, causada por disparos conjuntos de potenciais de ao da populao de neurnios (potencial de ao coletivo ou population spike).
2.4.1 Clampeamento de corrente (current clamp) A tcnica de current clamp (mtodo de fixao ou clampeamento de corrente) consiste na estimulao nervosa atravs da aplicao de uma corrente (constante ou varivel) por meio de um microeletrodo, seguida do registro da resposta eletrofisiolgica pelo mesmo eletrodo, conforme mostra a Figura 13. Essa tcnica pode ser utilizada para a obteno de registros intracelulares ou extracelulares. Atravs da aplicao de corrente, o potencial de membrana livre para variar, e o amplificador registra qualquer voltagem que a clula tenha gerado como resposta ao estmulo aplicado. O current clamp muito utilizado para simular a corrente eltrica produzida pelas conexes sinpticas.
Figura 13 Esquema da tcnica current clamp para estimulao intracelular.
Um fio de prata (Ag) inserido na micropipeta de vidro a fim de conectar eletricamente a soluo de cloreto de potssio (KCl) ao amplificador. Fonte: adaptado de Damask (1978).
38 A Figura 14 demonstra as possveis respostas eletrofisiolgicas obtidas quando uma corrente aplicada a uma clula atravs de um microeletrodo intracelular. A situao apresentada em A pode ser interpretada de duas maneiras: (i) a clula no excitvel, logo o sinal obtido representa apenas a resposta passiva resultante das caractersticas capacitivo-resistivas da membrana; (ii) a clula excitvel, mas o potencial aplicado no foi intenso o suficiente para atingir o limiar de excitao celular, no deflagrando assim o disparo de um potencial de ao. Por outro lado, a situao B representa a resposta obtida quando uma clula excitvel (por exemplo, um neurnio) estimulada adequadamente. A sequncia de potenciais de ao gerados determinada pela intensidade do estmulo aplicado, quando o limiar excitatrio da clula ultrapassado.
Figura 14 Respostas eletrofisiolgicas da membrana celular aplicao artificial de corrente eltrica. A curva mostrada em A pode representar a resposta passiva de uma clula excitvel ou de uma no-excitvel. A curva mostrada em B indica potencias de ao deflagrados em sequncia devido aplicao de um estmulo supralimiar.
Fonte: adaptado de Huguenard e McCormick (1994).
39 2.4.2 Clampeamento de voltagem (voltage clamp) A tcnica de voltage clamp ( mtodo de fixao ou clampeamento de voltagem) foi desenvolvida no final da dcada de 1940 por Hodgkin, Huxley e colaboradores com o propsito de analisar o comportamento da membrana neuronal quando o potencial de membrana fosse mantido constante. O experimento foi realizado inserindo-se dois eletrodos metlicos em um axnio gigante de lula, um para a corrente e outro para a tenso, e um eletrodo adicional no meio extracelular como referncia. A estimulao foi feita utilizando-se um amplificador com sistema de feedback que permitia aplicar a corrente necessria para que a tenso fosse mantida constante em um valor pr-determinado. A aplicao do mtodo est demonstrada na Figura 15 a seguir.
Figura 15 Esquema de aplicao da tcnica voltage clamp.
Fonte: adaptado de EBME (2012).
A anlise dos dados obtidos permitiu a Hodgkin e Huxley (1952) conclurem que, variando-se a concentrao inica no meio extracelular, era possvel separar a corrente inica fluindo atravs da membrana nas suas componentes causadas pelo fluxo de ons, e a partir de ento determinar como a permeabilidade inica variava de acordo com o tempo e com o potencial de membrana. Apesar de esse mtodo no reproduzir uma condio fisiolgica como o current clamp, seu desenvolvimento possibilitou um enorme avano no entendimento dos processos de conduo nervosa por permitir o controle do parmetro
40 responsvel pela abertura e fechamento dos canais inicos. Alm disso, a fixao da tenso aplicada permitiu eliminar brevemente a corrente capacitiva gerada na membrana, o que possibilitou o estudo da corrente de membrana(MDS
ANALYTICAL TECHNOLOGIES, 2008). Assim, Hodkin e Huxley comprovaram que o fluxo de corrente inica atravs da membrana, quando esta se encontrava despolarizada, era determinado por trs diferentes processos sensveis voltagem: (1) ativao da condutncia de Na+ , (2) ativao da condutncia de K+ e (3) inativao da condutncia de Na+ (PURVES et al, 2010, p. 48).
2.4.3 Fixao de membrana (patch clamp) A tcnica de patch clamp (mtodo de fixao de membrana) foi desenvolvida por Erwin Neher e Bert Sakmann na dcada de 1970 com o propsito de registrar a corrente de membrana que flui por um nico canal inico, e assim investigar os mecanismos moleculares responsveis pela gerao e transmisso do impulso nervoso. Por este trabalho (SAKMANN e NEHER, 1984), os pesquisadores conquistaram o Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicina em 1991. Baseado no mtodo de voltage clamp, a tcnica de patch clamp utiliza o controle experimental do potencial de membrana para caracterizar a dependncia da voltagem dos canais inicos, e permite a obteno de registros eletrofisiolgicos intracelulares sem a necessidade de se penetrar a clula. Por conseguinte, a aplicao desta tcnica difere fundamentalmente dos outros mtodos anteriormente empregados no estudo de potencias de ao por exigir o uso de um aparato experimental especial. A micropipeta de vidro deve possuir a ponta polida com cerca de 1 a 5 m de dimetro, e deve apresentar resistncia relativamente baixa (idealmente cerca de 10 M). Essa micropipeta pressionada contra a membrana neuronal e ento uma leve suco aplicada de modo a causar a aderncia firme (tight seal) entre a pipeta e a membrana. Caso essa aderncia seja estabelecida adequadamente, a membrana em contato com a micropipeta ir formar uma juno de alta resistncia (aproximadamente 50 G, razo pela qual essa juno dita gigaseal). Essa configurao denominada cell-attached recording (mtodo de medio aderida clula). Alm da micropipeta prpria para a tcnica, faz-se necessrio tambm o uso de um amplificador especfico, capaz de mensurar os baixos valores de corrente que
41 fluem por um nico canal inico. A amplitude da corrente medida est relacionada condutncia do canal inico, e a durao da corrente depende do tempo em que o canal permanece aberto para a passagem dos ons. A Figura 16 demonstra a aplicao da tcnica, e os resultados obtidos de acordo com a qualidade da aderncia estabelecida entre a membrana e a micropipeta.
Figura 16 Esquema de um arranjo experimental para a tcnica patch clamp ( esq.). A corrente de juno representa a corrente de fuga que flui atravs da micropipeta, mas no flui atravs da membrana. Essa fuga causa um aumento no rudo eletrnico sobre a corrente medida. O sinal captado est representado direita.
corrente de juno corrente inica

A partir da configurao experimental bsica ( cell-attached recording), outras trs formas de medio so possveis com o mtodo de patch clamp, conforme ilustrado na Figura 17 a seguir. No modo inside-out configuration (configurao de membrana com interior para fora), aps a micropipeta estar firmemente aderida mebrana, esta rompida com a retrao da micropipeta. Assim, o interior celular exposto, o que permite o estuda da influncia de molculas intracelulares na funo do canal inico. No modo whole-cell recording (mtodo de medio da clula inteira), a aplicao de uma suco forte causa o rompimento da membra na neuronal, de modo que a parte interna da micropipeta se torna uma continuao do interior celular. Consequentemente, as medidas realizadas indicam o potencial e a corrente de toda a clula. No modo outside-out configuration (configurao de medio de membrana com o exterior para fora), aps a membrana celular ser rompida pelo pulso de suco, a micropipeta retrada, e os pedaos da membrana
42 que ainda estavam aderidos face interna da micropipeta colapsam formando uma pequena vescula. O resultado que essa vescula continua aderida micropipeta, e a face externa da membrana passa a estar conectada ao interior da micropipeta. Isso permite que o exterior da membrana celular seja exposto a diferentes solues, possibilitando portanto a investigao do comportamento de canais inicos ativados por receptores qumicos extracelulares (SAKMAN e NEHER, 19884; PURVES et al, 2012; MALMIVUO, 2012).
Figura 17 Diferentes configuraes experimentais da tcnica patch clamp.
Fonte: adaptado de Malmivuo (2012).
43 2.4.4 Matriz multieletrodo (MEA)
Matrizes multieletrodo ou arranjos de mltiplos eletrodos (MEAs) so dispositivos utilizados para estimular e registrar in vitro a atividade eltrica de clulas e fatias de tecidos excitveis, e consistem em microchips que apresentam configuraes de microeletrodos em diversos arranjos e geometrias. O emprego desses dispositivos para a investigao em eletrofisiologia iniciou na dcada de 1970 (THOMAS et al, 1972; GROSS et al, 1977), a partir do estudo de culturas celulares, e no final da dcada de 1980 (WHEELER e NOVAK, 1986), com o uso de fatias de crebros animais. Essas aplicaes esto demonstradas na Figura 18.
Figura 18 Aplicao da MEA para estimulao de fatia cerebral e de cultura celular. Fatia de hipocampo de rato ( esq.) e cultura de clulas cardacas de rato ( dir.), sobre MEAs com diferentes configuraes de microeletrodos.
Fonte: adaptado de Qwane Biosciences (2011).
As MEAs representam um refinamento do conceito de interface bioeletrnica (BONIFAZI e FROMHERZ, 20022; FROMHERZ, 2003 3 apud RIBEIRO, 2006, p. 50). Uma interface bioeletrnica pode ser descrita como um siste ma onde um pedao de tecido nervoso, geralmente mantido vivo em cultura celular, conectado a um circuito eltrico, na tentativa de estabelecer um intercmbio bidirecional de informao (ibidem). A condio ideal para a utilizao de uma MEA diz respeito ao posicionamento da clula, que deve estar localizada sobre um eletrodo ou entre dois eletrodos. Logo, o substrato do sensor um fator importante a ser considerado
BONIFAZI,P.; FROMHERZ, P. Silicon chip for electronic communication between nerve cells by non-invasive interface and analog-digital processing. Advanced Materials, v. 14, n. 17, p. 11901193, set. 2002. 3 FROMHERZ, P. Neuroelectronic interfacing: semicondutor chips with ion channels, nerve cells, and brain. Nanoelectronics and Information Technology , Berlin, p. 781-810, 2003.
44 durante a fabricao do dispositivo, e deve ser produzido de maneira a promover a aderncia celular (RIBEIRO, 2006). Assim, as MEAs constituem dispositivos de alta tecnologia, que so fabricados em ambiente de sala limpa atravs de tcnicas padro de fotolitografia, corroso qumica mida (wet chemical etching) e deposio de filmes finos metlicos (usualmente de platina ou de ouro) sobre um substrato de vidro ou silicone. A camada metlica usualmente protegida da corroso por uma camada passivadora. Os espaos abertos na camada passivadora e que deixam o metal mostra constituem os microeletrodos (HEUSCHKEL et al, 2002). A Figura 19 mostra o esquema de um microchip fabricado pela empresa Qwane Biosciences, feito a partir da deposio de platina sobre um substrato de vidro. A camada passivadora constituda de epxi SU-8 com 5m de espessura. Os microeletrodos podem ser fabricados em configurao planar ou 3D, conforme representado na Figura 20.
Figura 19 Corte esquemtico do microchip de uma MEA fabricado pela empresa Qwane Biosciences.
Fonte: adaptado de Heuschkel et al (2002). Figura 20 Esquema de clulas sobre MEAs com microeletrodos em configurao 3D ( esq.) e planar ( dir.).
Fonte: adaptado de Hai et al (2010).
Na configurao planar, a clula permanece sobre o microeletrodo, e a resposta eletrofisiolgica captada de maneira extracelular. Na configurao 3D , pontas de vidro com cerca de 60m de altura so fixadas sobre o substrato de vidro,
45 e ento cobertas com microeletrodos de platina ou de ouro. Quando a clula depositada sobre o microeletrodo 3D, ela fagocita a ponta, de maneira a formar uma juno de alta resistncia. Essa configurao permite o registro de sinais intracelulares, ainda que o eletrodo seja extracelular, com a mesma razo sinal-rudo obtida pelas tcnicas tradicionais para registro intracelular (HAI et al, 2010). Para viabilizar a cultura celular sobre o microchip, uma cmara de registro acoplada ao dispositivo. A cmara de registro formada pela parte inferior de uma placa de Petri, colada sobre a placa de circuito impresso (PCI) e vedada com silicone. A aplicao de uma cola condutora garante a conexo eltrica entre o microchip e a cmara de registro, conforme demonstrado na Figura 21.
Figura 21 Esquema da cmara de registro sobre a MEA.
Fonte: adaptado de Heuschkel et al (2002).
Finalmente, os microchips so colados sob placas de circuitos impressos que permitem a conexo com sistemas de aquisio de dados. Um exemplo o dispositivo apresentado na Figura 22.
Figura 22 Exemplo de uma matriz multieletrodo fabricada pela empresa Qwane Biosciences. A configurao final do dispositivo uma placa com dimenses de 5 cm x 5 cm.
Fonte: Qwane Biosciences (2011).
46 As principais vantagens do uso de um dispositivo MEA em relao s tcnicas tradicionais de registro eletrofisiolgico so o fato de permitir o registro simultneo da atividade de vrios neurnios e de no exigir o posicionamento fino de microeletrodos sobre o tecido atravs de micromanipuladores, como no caso das tcnicas de estimulao por sharp electrode e patch clamp. Alm disso, com a MEA h a possibilidade de a cultura celular ser realizada diretamente sobre o microcircuito do dispositivo, o que fornece tempo necessrio s clulas para aderirem firmemente s superfcies dos microeletrodos, sem que seja causado nenhum dado membrana celular (HEUSCHKEL et al, 2002). Contudo, as desvantagens de se cultivar clulas ou tecidos diretamente sobre a cmara de registro so uma possvel perda do arranjo sinptico neuronal, a modificao do tecido, a diminuio da razo sinal-rudo em relao s tcnicas convencionais de registro extracelular e o tempo e os custos necessrios para preparar e manter a cultura, estando o processo sujeito formao de conexes aberrantes, contaminaes e outros problemas. Apesar de a juno necessria entre o microeletrodo e as clulas de uma fatia de tecido poder ser dificultada devido presena de uma camada de clulas mortas na superfcie da fatia, resultante do prprio procedimento de corte, essa dificuldade pode ser superada com uso de dispositivos MEA 3D, pois a ponta de eletrodo capaz de atingir as camadas de clulas mais profundas da fatia de tecido (HAI et al, 2010).
18 3 MATERIAIS E MTODOS Este trabalho foi desenvolvido no Grupo de Nanoestruturas e Nanoscopia (NANOPUC) do Laboratrio de Materiais e Nanocincias (LMN), localizado no Parque Cientfico e Tecnolgico da PUCRS (TECNOPUC) e no Grupo de Pesquisa sobre Epilepsia Experimental do Laboratrio de Neurocincias (NeuroLab), localizado no Instituto de Pesquisas Mdicas (IPB) do Hospital So Lucas (HSL) da PUCRS, entre o perodo de abril a junho de 2012.
3.1 Procedimento experimental
O desenvolvimento deste trabalho foi dividido em quatro etapas: 1) Caracterizao dos sensores atravs da obteno de imagens por microscopia ptica e microscopia eletrnica de varredura; 2) Construo de uma interface eltrica entre o sensor e o sistema de aquisio de dados; 3) Cultura celular; 4) Teste preliminar de medida eltrica in vitro com o sensor. Os procedimentos realizados e os materiais utilizados em cada etapa esto detalhados a seguir.
3.1.1 Caracterizao dos sensores
Os 15 sensores disponveis para a realizao deste trabalho foram inicialmente catalogados. Aps a catalogao, a caracterizao dos sensores foi realizada atravs da obteno de imagens por meio de microscopia ptica e microscopia eletrnica de varredura. As imagens foram obtidas no Centro de Microscopia e Microanlises (CEMM) da PUCRS. As imagens por microscopia ptica foram obtidas por uma cmera de vdeo digital marca Motic modelo Moticam 2500 acoplada a um estereomicroscpio marca Olympus modelo SZ 51, com magnificaes entre 30 e 40 vezes. As imagens por microscopia eletrnica de varredura foram obtidas utilizandose um microscpio eletrnico de varredura (MEV) da marca PHILIPS modelo XL30 com resoluo de 2 mm a 2 m, faixa de aumentos de 10 a 200.000 vezes e tenso
19 de acelerao de 20 kV. Para a realizao das imagens, o sensor foi previamente metalizado pela deposio de uma camada de ouro sobre a MEA. O MEV possui trs detectores acoplados, sendo um para deteco de eltrons secundrios (SE), um para deteco de eltrons retroespalhados (BSE) e outro para realizao de espectroscopia de raios X por disperso de energia (EDS). A caracterizao do sensor foi realizada atravs de anlises qualitativas por EDS e obteno de imagens nos modos SE e BSE.
3.1.2 Interfaceamento entre o sensor e o sistema de aquisio de dados
A segunda etapa consistiu na construo da interface entre o sensor e o sistema de aquisio de dados, de maneira a estabelecer as conexes eletrnicas necessrias para que a MEA pudesse ser usada tanto para estimular as clulas em cultura quanto para captar a resposta eletrofisiolgica recebida. Para tanto, soldou-se um cabo IDE 40 vias marca LU CHIANG modelo 2651 E72332 UNICAB ao sensor, de maneira que cada via do cabo IDE correspondesse a um contato da MEA. O cabo IDE 40 vias foi ento acoplado a uma protoboard e conectado atravs de uma chave dip switch a quatro cabos de udio-frequncia de alta definio 0,50 mm 2 com terminais BNC da marca MULT CABO. Estes cabos foram conectados diretamente ao sistema de aquisio de dados.
3.1.3 Cultura celular
A cultura celular utilizada neste trabalho foi a cultura de clulas-tronco mesenquimais humanas ( human mesenchymal stem cell hMSC) derivadas de medula-ssea e que foram submetidas a um protocolo de neurodiferenciao. Clulas-tronco mesenquimais podem ser obtidas de humanos de maneira relativamente simples, e depois de separadas podem manter-se e expandir-se in vitro quando cultivadas adequadamente (MARINOWIC, 2011). As clulas-tronco de medula ssea foram obtidas de um paciente no Hospital So Lucas da PUCRS aps assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido. A coleta foi realizada atravs de puno da medula ssea utilizando agulha de mielograma e aspirao com seringa de 20 mL contendo 5000 U de
20 heparina (Liquemine). Os processos realizados para separao e cultura da frao mononuclear das clulas obtidas so apresentados a seguir, conforme descrito por Marinowic (2011, p. 30):
Para a separao da frao mononuclear, os materiais coletados foram diludos em meio de cultura RPMI 1640 (1:1) (Gibco). Esta suspenso foi fracionada em um gradiente de densidade gerado por centrifugao sobre Histopaque na densidade de 1,077g/L (Sigma-Aldrich) a 400g durante 30 minutos a 25C. A frao mononuclear situada sobre a interface com o Histopaque foi coletada e lavada duas vezes com soluo salina 0,9% estril. A viabilidade celular foi avaliada pelo mtodo de excluso com azul de tripan 0,4%. A frao mononuclear foi colocada em cultura em meio DMEM (SigmaAldrich) suplementado com L-glutamina, 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina, 100U/mL de estreptomicina e 100 g/mL de gentamicina, com densidade de 10 7 clulas por frasco. A cultura foi mantida em estufa mida a 37C com 5% CO2 por seis dias.
Como resultado dessa cultura obteve-se clulas aderentes mesenquimais. A cultura foi ento tratada com 8 mL de tripsina 0,25% por 5 minutos para que as clulas aderentes se desprendessem do fundo da garrafa de cultura. O contedo foi coletado e centrifugado a 400 g por 5 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram ressuspensos em 1 mL de meio de cultura DMEM suplementado. Realizou-se a contagem da nova suspenso em cmara de Neubauer e a densidade celular do cultivo foi novamente reajustada para 107 clulas em frascos de 75 mm2 (esta etapa foi caracterizada como fase I do experimento). Aps, aplicou-se o protocolo de neurodiferenciao:
O mtodo de neurodiferenciao utilizado foi adaptado a partir daquele descrito por Song et al. 2008 (59). As clulas foram cultivadas em meio DMEM (Sigma-Aldrich) suplementado com 0,001% de -mercaptoetanol (Gibco), 10% de soro fetal bovino, 100 U.I./mL de penicilina, 100U.I./mL de estreptomicina e 100 g/mL de gentamicina. As clulas foram cultivadas por um perodo de trs dias a 37C com 5% CO 2. O trmino desse perodo caracteriza a fase II. A seguir, as culturas foram novamente tratadas com tripsina/EDTA 0,25% e as clulas foram ento cultivadas em meio DMEM/F12 (Gibco), 10% soro fetal bovino, penicilina, estreptomicina e gentamicina nas mesmas concentraes por um perodo de trs dias, estabelecendo assim ao trmino desse perodo a fase III. As culturas foram novamente tratadas com tripsina/EDTA 0,25% e as clulas foram cultivadas em placas de seis poos em meio Neurobasal Medium N5 (Gibco) suplementado com 20ng/mL de fator neurotrfico derivado de crebro (Brain Derived Neurotropic Factor - BDNF) (Sigma-Aldrich), 20ng/mL de fator estimulador de colnia de granulcitos (Granulocyte Colony Stimulating Factor - GCSF) (Bergamo), soro fetal bovino, penicilina, estreptomicina e gentamicina. As culturas foram mantidas sob as mesmas condies por um perodo de sete dias, estabelecendo a fase final do experimento (fase IV) (MARINOWIC, 2011, p. 32).
21
Aps o perodo de neurodiferenciao, as clulas foram consideradas prontas para realizao do teste com a MEA.
3.1.4 Teste preliminar para registro eletrofisiolgico
Para que as clulas pudessem ser depositadas em soluo de cultura sobre o sensor, acoplou-se uma placa de Petri para cultura celular marca MatTek (glass bottom culture dish, coverslip n 0, espessura 0,085 0,13 mm) superfcie da MEA, colando-a com o adesivo de dois componentes PXIPOL. A lamnula de vidro presente sobre a base da placa de Petri foi removida antes da colagem para que a cultura celular pudesse entrar em contato com o microcircuito da MEA. O conjunto formado pelo sensor com a placa de Petri e o cabo IDE 40 vias foi exposto luz ultravioleta (UV) por 30 minutos para controle germicida. Em seguida, as clulas neurodiferenciadas foram transferidas para a placa de Petri sobre o sensor e permaneceram em repouso por aproximadamente 15 horas a fim de viabilizar a aderncia celular ao substrato de vidro da MEA. Aps o perodo de aderncia, a cultura sobre a MEA foi observada com o uso de um microscpio ptico invertido marca ZEISS modelo Axiovert 25 HBO 50 W, com aumento de 10 vezes e contraste de fase Ph 1, a fim de se determinar visualmente quais microeletrodos estavam mais prximos a clulas, e portanto seriam utilizados para aplicao de estmulo. O registro da resposta eletrofisiolgica foi feito atravs do microeletrodo sobre o qual a clula estimulada estava depositada. Em seguida escolha dos microeletrodos para estmulo e registro, a MEA foi conectada ao sistema de aquisio de dados e disposta sobre uma mesa antivibracional (usada para eliminar a trepidao do ambiente) envolta por uma gaiola de Faraday, que isola o sistema do rudo produzido pelos equipamentos eletrnicos do ambiente. A mesa antivibracional e a gaiola de Faraday so da marca Technical Manufacturing Corporation (TMC). A estimulao da cultura celular foi feita atravs da aplicao de pulsos pareados, conforme esquematizado na Figura 23.
22
Figura 23 Esquema do paradigma de estimulao por aplicao de pulsos pareados.
Fonte: o autor(2012)
De acordo com Salamoni (2012, p. 51), a estimulao com pulsos pareados constitui-se num paradigma neurofisiolgico amplamente utilizado para avaliar modificaes extremamente rpidas na eficincia sinptica. A partir da estimulao por pulsos pareados, pode-se registrar o potencial sinptico ps-excitatrio (EPSP, do ingls excitatory postsynaptic potencial). O EPSP difere fundamentalmente de um potencial de ao por representar uma resposta sublimiar da membrana neuronal que decai rapidamente no tempo. Um exemplo de sinal proveniente do registro do primeiro e do segundo EPSP obtidos atravs da estimulao por pulsos pareados em uma populao de neurnios (registro de campo) est demonstrado na Figura 24 a seguir. Para a realizao do teste preliminar com a MEA, os pulsos pareados foram aplicados a uma frequncia de 0,1 Hz e intensidade de corrente de 80 A, cada um com 0,2 ms de durao a intervalos variados de 10, 20, 40, 100 e 120 ms entre os pulsos. Para o registro do sinal, este foi amplificado 5000 vezes, e em seguida submetido a um filtro passa-baixas de 400 Hz e ajuste de offset de
aproximadamente -2 mV (usado para equalizar a linha de base), conforme demonstrado na Figura 25, que representa a interface de controle de parmetros do software CyberAmp (MOLECULAR DEVICES, 2012).
23
Figura 24 Registro de campo mostrando o primeiro e o segundo potencial ps-sinptico excitatrio (EPSP) obtidos atravs do paradigma de estimulao por pulsos pareados.
Fonte: Salamoni (2012). Figura 25 Interface do programa CyberAmp para ajuste de parmetros de estimulao.
Fonte: o autor (2012).
24 3.2 Aparato experimental
Os sensores utilizados neste trabalho so matrizes multieletrodo modelo MEA60 200 Pt fabricadas pela empresa Qwane Biosciences SA . Esta empresa spin-off do Centro de MicroNano Tecnologia (CMI) da cole Polytechnique Fdrale de Lausanne (EPFL), sendo os sensores fabricados no Laboratrio de
Microsistemas 4 (LMIS4) vinculado universidade. O sensor MEA60 200 Pt consiste em um microcircuito impresso sobre um substrato de vidro (15 mm x 15 mm x 0,7 mm), no qual microeletrodos de platina so dispostos em um arranjo de matriz 8 x 8 sem os eletrodos dos c antos, totalizando 60 eletrodos, dos quais 52 so utilizados para estimulao e registro e oito so utilizados como eletrodos de referncia (terra). A geometria de cada eletrodo de estimulao e registro planar e circular com 40 m de dimetro e espaamento de 200 m entre cada eletrodo (distncia de centro a centro). A impedncia nominal desses eletrodos a 1 kHz varia na faixa de 600 a 800 k, e o rudo eletrnico de aproximadamente 25 a 30 A (QWANE BIOSCIENCES, 2011). Os registros eletrofisiolgicos dos potenciais de campo foram realizados com os seguintes equipamentos, conforme ilustrado na Figura 26. A numerao apresentada indica: (1) fixador de corrente Iso-Flex A.M.P.I.; (2) Digidata 1200B (Molecular Devices, LLC), responsvel pela aquisio de dados e converso do sinal analgico em digital; (3) amplificador AxoClamp 2B (Molecular Devices, LLC); (4) condicionador de sinais programvel CyberAmp 380 (Molecular Devices, LLC); (5) estimulador programvel Master 8 (A.M.P. Instruments), utilizado para a estimulao eltrica atravs de rotinas pr-programadas, conforme a finalidade do protocolo de estudo; (6) microcomputador equipado com os softwares AxoScope 9 (Molecular Devices, LLC), para a anlise em tempo real, na tela do computador, do sinal capturado, e Clampfit 9.2 (Molecular Devices, LLC), para interpretao offline dos traados; (7) interface eltrica entre a MEA e o sistema de aquisio de dados (antes de o sensor ser colocado sobre a mesa antivibracional para estimulao da cultura celular); (8) mesa antivibracional e (9) gaiola de Faraday. Os demais instrumentos utilizados foram especificados durante a descrio dos procedimentos experimentais.
25
Figura 26 Fotografia mostrando arranjo experimental dos aparatos utilizados e sistema de aquisio de dados, indicados pelos nmeros: (1) fixador de corrente; (2) conversor analgicodigital; (3) amplificador; (4) condicionador de sinais; (5) estimulador programvel; (6) microcoputador; (7) sensor conectado ao sistema de aquisio de dados; (8) mesa antivibracional e (9) gaiola de Faraday.
5 9 6 4 3 1 2 8
3.3 Anlise dos dados preliminares
A anlise dos registros obtidos durante o teste preliminar de utilizao da MEA consistiu na avaliao qualitativa dos sinais registrados atravs da discriminao e identificao visual de potenciais sinpticos ps-excitatrios (EPSPs). A anlise foi realizada a partir da visualizao em tela dos registros conforme apresentados pelo software Clampfit 9.2 (MOLECULAR DEVICES, 2012). Os EPSPs so representados por uma curva de deflexo caracterstica do brao descendente do sinal registrado. Essa curva est demonstrada e especificada na Figura 27 a seguir. A regio identificada pela letra a representa o pulso negativo gerado pela aplicao artificial do impulso eltrico; a regio identificada pela letra b representa a resp osta passiva gerada pelo componente capacitivo da
26 membrana celular; e a regio identificada pela letra c representa a curva caracterstica de um EPSP, causada pela resposta ativa da membrana celular.
Figura 27 Esquema mostrando as partes do sinal obtido em um registro de campo. As letras indicam: (a) pulso de aplicao do estmulo; (b) resposta celular passiva causada pelo componente capacitivo da membrana; e (c) curva de deflexo caracterstica de um EPSP, causada pela resposta ativa da membrana.
A Figura 28 apresenta a interface do software Clampfit 9.2, mostrando a visualizao de um dos registros obtidos. O grfico apresenta o potencial de membrana (IN2) em funo do tempo.
Figura 28 Interface do software Clampfit 9.2 exibindo registro obtido pela estimulao da cultura celular sobre a MEA por aplicao de pulsos pareados.
27
18 4 RESULTADOS Os resultados obtidos em cada etapa deste trabalho so apresentados e discutidos a seguir.
4.1 Caracterizao dos sensores
A imagem mostrada na Figura 29 apresenta a estrutura do microcircuito da MEA, na qual possvel identificar o substrato de vidro (indicado na figura pela letra A) colado sob a placa de circuito impresso (indicado pela letra B). A imagem mostra a parte inferior do dispositivo, de maneira que possvel observar a conexo entre os 60 sensores do microcircuito e a placa de circuito impresso (regio delimitada na imagem pelo retngulo lateral). Observa-se que os oito eletrodos terra se combinam em pares (indicados pelas setas) de maneira a formar quatro eletrodos de referncia na regio central do microcircuito (regio delimitada pelo quadrado central).
Figura 29 Viso geral do microcircuito da MEA. A letra A indica o substrato de vidro e a letra B indica a placa de circuito impresso (PCI). A regio delimitada pelo retngulo indica a conexo entre o microeletro e a PCI; a regio delimitada pelo quadrado mostra a parte central do microcircuito. As setas indicam um dos quatro pares de eletrodos terra.
A regio central delimitada pelo quadrado na Figura 29 mostrada ampliada na Figura 30, porm obtida a partir do lado superior da MEA (lado sobre o qual
19 depositada a cultura celular). A imagem a seguir permite identificar o arranjo dos 56 microeletrodos que formam a parte central do microcircuito, dispostos de maneira simtrica sobre a MEA. Os eletrodos menores (circulares) so os eletrodos de estimulao e registro. Os eletrodos maiores (dos cantos) so os eletrodos terra.
Figura 30 Arranjo dos microeletrodos da MEA mostrado por microscopia ptica.
As imagens obtidas por microscopia ptica mostraram que todos os sensores analisados apresentam estrutura semelhante e regular, sem presena de falhas ou anormalidades. Desta maneira, optou-se por realizar as imagens por microscopia eletrnica de varredura (MEV) de apenas um dos sensores disponveis. As imagens obtidas por MEV no modo SE permitiram obter informaes sobre a topografia da MEA (devido ao contraste em funo do relevo), enquanto as imagens obtidas no modo BSE forneceram informaes sobre a composio do dispositivo (devido ao contraste em funo do nmero atmico dos elementos). As imagens mostradas na Figura 31 a seguir apresentam a mesma perspectiva geral do arranjo dos microeletrodos da MEA obtida na imagem por microscopia ptica, porm a partir de imagens obtidas por microscopia por varredura eletrnica no modo SE (imagem A) e no modo BSE (imagem B). A imagem por BSE permite inferir que os microeletrodos e as trilhas do microcircuito so formadas por
20 elementos com maior peso atmico em relao ao substrato de vidro, formado por elementos com pesos atmicos mais baixos.
Figura 31 Arranjo dos microeletrodos da MEA mostrado por microscopia eletrnica de varredura obtida nos modos SE (imagem A) e BSE (imagem B). O nmero 1 indica um microeletrodo, o nmero 2 indica uma trilha do microcircuito e o nmero 3 indica o substrato de vidro.
A 1
As imagens obtidas nos modos SE (imagem A) e BSE (imagem B) mostradas na prxima figura (Figura 32) permitem observar de maneira mais detalhada um dos microeletrodos de estimulao e registro. A imagem A
21 evidencia a geometria planar e circular do microeletrodo, enquanto a imagem B evidencia o contraste entre o microeletrodo (indicado pelo nmero 1) e a trilha do microcircuito (indicada pelo nmero 2).
Figura 32 Imagens de um microeletrodo de estimulao e registro obtidas por MEV nos modos SE (imagem A) e BSE (imagem B). O nmero 1 indica o microeletrodo e o nmero 2 indica a trilha do microcircuito.
A 2
22 A identificao qualitativa dos elementos qumicos presentes no sensor foi feita por EDS. As regies da MEA s quais se aplicou EDS, conforme ilustrado na Figura 33, foram: (1) microeletrodo; (2) trilha do microcircuito; e (3) substrato.
Figura 33 Detalhe de um microeletrodo terra mostrado por MEV no modo SE. As marcaes na imagem indicam as regies da MEA nas quais se aplicou identificao de composio qumica por EDS: (1) microeletrodo; (2) trilha do microcircuito e (3) substrato.
3 1 2
Os resultados obtidos (conforme mostrado nas Figuras 34 e 35) indicaram que o elemento qumico predominante no microeletrodo a platina; a trilha do microcircuito composta basicamente por ouro; e o substrato formado predominantemente por silcio. A presena de ouro na composio do substrato possivelmente referente metalizao do sensor.
Figura 34 Identificao por EDS da composio qumica do substrato do sensor. O resultado indica predominncia de silcio (Si) e menores quantidades de carbono (C) e oxignio (O). A presena de ouro (Au) causada pela metalizao do sensor. O grfico representa o nmero de contagens (eixo y) por energia (eixo x) da ordem de kilovolts (kV).
23
Figura 35 - Identificao por EDS da composio qumica do microeletrodo (imagem A) e da trilha do microcircuito do sensor (imagem B). O resultado indica predominncia de platina (Pt) no microeletrodo e predominncia de ouro (Au) na trilha,com menores quantidades de carbono (C) e oxignio (O). Os grficos representam o nmero de contagens (eixo y) por energia (eixo x) da ordem de kilovolts (kV).
4.2 Interfaceamento entre o sensor e o sistema de aquisio de dados
A configurao final do conjunto formado pelo sensor, a placa de Petri e o cabo IDE 40 vias mostrada na Figura 36 a seguir (imagem A). A interface total construda para conectar o sensor ao sistema de aquisio de dados mostrada na Figura 37.
24
Figura 36 Configurao experimental construda para utilizao do sensor, mostrando a MEA (1), a placa de Petri (2) e o cabo IDE 40 vias (3).
3 2
1
Fonte: o autor (2012). Figura 37 Interface entre o sensor e o sistema de aquisio de dados. A numerao indica: (1) sensor; (2) cabo IDE 40 vias; (3) chave dip switch; (4) protoboard; (5) cabos com terminais BCN.
4 5 2 1
Apesar de 40 microeletrodos terem sido conectados atravs do cabo IDE interface eletrnica com o sistema de aquisio de dados (conforme possvel
25 observar na imagem B da Figura 36), apenas oito puderam ser efetivamente utilizados, devido limitao do nmero de contatos da chave dip switch.
4.3 Cultura celular
Foram realizadas tentativas de neurodiferenciao das clulas coletadas, contudo apenas uma delas foi completada com sucesso. Desta maneira, a realizao do teste estimulao da cultura celular sobre a MEA foi possvel somente em carter preliminar.
4.4 Teste preliminar para registro eletrofisiolgico
A partir da avaliao visual dos registros obtidos, constatou-se que a deflagrao de potencias de campo excitatrios (EPSPs) variou de acordo com o intervalo de tempo entre a aplicao dos pulsos pareados. Em geral, nos intervalos de 10 e 20 ms, somente o segundo pulso aplicado causou a gerao de um EPSP, porm de baixa intensidade; no intervalo de 40 ms, os registros mostraram que houve ou a gerao de EPSPs em ambos os pulsos ou em nenhum deles; nos intervalos de 100 e 120 ms a deflagrao de EPSPs foi evidente. A Figura 38 e a Figura 39 apresentam registros obtidos com intervalo de tempo de 10 e 20 ms, respectivamente, nos quais possvel perceber a aplicao dos pulsos pareados e a subsequente resposta capacitiva da membrana seguida da resposta ativa. possvel observar a curva de deflexo caracterstica de EPSP (indicada pela seta) somente aps a aplicao do segundo pulso.
Figura 38 Registro obtido aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de 10ms entre si. possvel constatar a deflagrao de EPSP (indicado pela seta) aps o segundo estmulo.
26
Figura 39 - Registro obtido aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de tempo de 20ms entre si. possvel constatar a deflagrao de EPSP (indicado pela seta) aps o segundo estmulo.
A Figura 40 apresenta dois registros obtidos com intervalo de 40 ms entre os pulsos pareados. O grfico indicado pela letra A mostra que no houve resposta ativa da membrana celular aplicao dos estmulos, enquanto o grfico B mostra a gerao de EPSPs (indicados pelas setas) aps a aplicao dos pulsos pareados.
Figura 40 Registros obtidos aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de tempo de 40ms entre si. A imagem A mostra a ausncia de resposta ativa da membrana celular; por outro lado, a imagem B mostra a deflagrao de EPSPs (indicados pelas setas).
27 A Figura 41 apresenta registros obtidos com intervalos de tempo de 100 ms (imagem A) e 120 ms (imagem B) entre a aplicao dos pulsos pareados, nos quais a gerao de EPSPs (indicados pelas setas) ficou evidente.
Figura 41 - Registros obtidos aps a aplicao de pulsos pareados com intervalo de tempo de 100ms (imagem A) e 120ms (imagem B) entre si. A deflagrao de EPSPs (indicados pelas setas) ficou evidente.
18 5 CONCLUSES Este trabalho consistiu na caracterizao e na realizao do teste de um sensor (matriz multieletrodo - MEA) utilizado para estimular eletricamente e registrar a resposta eletrofisiolgica de clulas mesenquimais neurodiferenciadas in vitro. Essas aes foram realizadas como etapa preliminar execuo de um projeto de pesquisa cujo objetivo principal desenvolver e testar MEAs customizadas para a investigao in vitro da epilepsia em fatias cerebrais humanas. Para tanto, apresentou-se inicialmente o embasamento terico necessrio compreenso dos mecanismos biolgicos responsveis pela gerao e transmisso de impulsos eltricos no tecido nervoso. Em seguida, os principais mtodos utilizados atualmente para a estimulao de clulas e registro de sinais eletrofisiolgicos in vitro foram descritos, a fim de ser possvel estabelecer uma comparao entre o uso dessas tcnicas e a MEA, que representa um dispositivo tecnolgico inovador em meio aos estudos de eletrofisiologia. A caracterizao do sensor utilizado permitiu conhecer a microestrutura da MEA e confirmar as especificaes do fabricante. O interfaceamento eletrnico construdo entre a MEA e o sistema de aquisio de dados de mostrou eficiente e suficiente para a realizao do teste preliminar, contudo este deve ser melhorado de maneira a permitir o uso de todos os microeletrodos de estimulao e registro. A obteno de registros eletrofisiolgicos a partir da cultura celular foi prejudicada devido ao surgimento de dificuldades relativas neurodiferenciao das clulas coletadas, de maneira que apenas um teste de estimulao da cultura celular sobre a MEA pode ser realizado. Entretanto, os registros obtidos a partir do teste preliminar mostraram resultados promissores, permitindo a identificao de respostas eletrofisiolgicas. O protocolo de estimulao aplicado com intervalos de tempo variados permitiu identificar que as clulas neurodiferenciadas respondem melhor aplicao de pulsos pareados quando estes so aplicados com intervalos de tempo de 40, 100 ou 120 ms entre si. A utilizao de intervalos de 10 e 20 ms se mostrou ineficiente obteno de resposta celular ativa.
18 6 PERSPECTIVAS FUTURAS
Pretende-se dar continuidade s aes desenvolvidas neste trabalho, ainda no mbito do projeto de pesquisa j citado. Dentre os objetivos futuros, pode-se citar: Caracterizao eltrica da MEA atravs da realizao de espectroscopia por impedncia eletroqumica, visto que a impedncia uma caracterstica de dispositivos eletrnicos que interfere diretamente na medida de parmetros eletrofisiolgicos. Esta tcnica permite a anlise dos processos eletroqumicos que ocorrem na interface entre o eletrodo e a soluo eletroltica na qual se encontra a cultura celular ou a fatia de tecido; Construo de um interfaceamento eletrnico entre o sensor e o sistema de aquisio de dados que permita o uso simultneo de todos os microeletrodos de estimulao e registro; Realizao sistemtica de testes de estimulao de clulas
neurodiferenciadas e de neurnios em cultura sobre a MEA, de maneira a ser possvel a anlise estatstica dos potenciais ps-sinpticos excitatrios (EPSPs) registrados. Os parmetros a serem avaliados so a amplitude e a inclinao (slope) da curva de deflexo caracterstica do EPSP. Construo de uma microcmara de perfuso a ser acoplada ao sensor, de maneira a apresentar a mesma funcionalidade das cmaras de perfuso utilizadas para estimulao e obteno de registros eletrofisiolgicos a partir de fatias de crebro ( brain slices). Essas cmaras permitem a manuteno da fatia de tecido viva por at seis horas mediante o controle de temperatura e o fluxo constante de carbognio (mistura de 95% de gs oxignio com 5% de gs carbnico) sobre a fatia.
19
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Revista da Graduao

Vol. 5 No. 2 2012 12

Seo: Faculdade de Fsica

Este trabalho est publicado na Revista da Graduao. ISSN 1983-1374 http://revistaseletronicas.pucrs.br/ojs/index.php/graduacao/editor/submission/12422

PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE FSICA

CAROLINA DE BARROS VIDOR

Porto Alegre 2012

CAROLINA DE BARROS VIDOR

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Meurer Papalo

Porto Alegre 2012

CAROLINA DE BARROS VIDOR

Aprovado em: _____ de ___________________ de ________. BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr. Ricardo Meurer Papalo (orientador)

Profa. Dra. Maria Eullia Pinto Tarrag

Me. Daniel Rodrigo Marinowic

Porto Alegre 2012

Chagdud Tulku Rinpoche

Keywords: Multi-electrode Extracelullar recording. Epilepsy.

16 3.3 Anlise dos dados preliminares ..............................................................................25

6 PERSPECTIVAS FUTURAS .....................................................................................18

1.2.1 Objetivo geral

1.2.2 Objetivos especficos

2.1 Clulas neuronais

Fonte: adaptado de HowStuffWorks International, Inc. (2012).

2.1.1 Potencial de repouso

Fonte: adaptado de Damask (1978).

Fonte: adaptado de Wikipdia (2012).

Fonte: adaptado de Damask (1978).

O termo bioeletricidade comumente empregado para designar

2.2.1 Potencial de membrana

2.2.2 Corrente de membrana

Fonte: adaptado de Varghese (2000).

Fonte: adaptado de MDS Analytical Technologies (2008).

2.2.3 Resistncia de membrana e condutncia inica

Fonte: adaptado de MDS Analytical Technologies (2008).

2.2.4 Capacitncia de membrana

Fonte: adaptado de MDS Analytical Technologies (2008).

2.2.5 A membrana como circuito resistivo-capacitivo

Fonte: adaptado de MDS Analytical Technologies (2008).

2.3 Modelo dinmico de Hodgkin-Huxley (HH)

Fonte: adaptado de Hodgkin e Huxley (1952).

2.4 Registros eletrofisiolgicos

Fonte: adaptado de Bretschneider e Weille (2006).

Fonte: adaptado de Wood (2011).

Fonte: adaptado de Huguenard e McCormick (1994).

Fonte: adaptado de EBME (2012).

corrente de juno corrente inica

Fonte: adaptado de Malmivuo (2012).

43 2.4.4 Matriz multieletrodo (MEA)

Fonte: adaptado de Qwane Biosciences (2011).

Fonte: adaptado de Hai et al (2010).

Fonte: adaptado de Heuschkel et al (2002).

Fonte: Qwane Biosciences (2011).

3.1 Procedimento experimental

3.1.1 Caracterizao dos sensores

3.1.2 Interfaceamento entre o sensor e o sistema de aquisio de dados

3.1.3 Cultura celular

3.1.4 Teste preliminar para registro eletrofisiolgico

Fonte: o autor (2012).

24 3.2 Aparato experimental

Fonte: o autor (2012).

3.3 Anlise dos dados preliminares

Fonte: o autor (2012).

Aprovado em: _ de _______ de . BANCA EXAMINADORA: