PRACTICA DE LABORATORIO No.

8 LABORATORIO DE GENETICA
Dra. Carmen Ada Martnez

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE I. VISION DE CONJUNTO

Con el estudio y desarrollo de la presente prctica el estudiante estar en capacidad de: 1. Identificar las diferentes tcnicas de laboratorio que permiten el estudio del material gentico en humanos. 2. Describir los pasos generales utilizados para realizar: a. Extraccin de ADN b. PCR, RT-PCR c. FISH d. Inmunofluorescencia e. Cariotipo 3. Comparar la utilidad de las diferentes tcnicas en el diagnstico de enfermedades resultantes por errores congnitos del metabolismo, por deficiencias enzimticas o protenas anormales. 4. Comprender e interpretar los anlisis de ADN para servicios diagnsticos, forenses y genticos en el mbito clnico. En el pasado, los esfuerzos por entender los genes y su expresin se haban dificultado por el inmenso tamao y complejidad del ADN humano. Esto fue un incentivo ms para buscar comprender como estaba integrada la informacin gentica en nuestras clulas y como se trasmita la

herencia biolgica de una generacin a otra. La gentica

fue la ciencia que busc comprender estos procesos. Sin embargo debi pasar mucho tiempo para que se descubrieran los cromosomas en 1950, posteriormente con la introduccin de la tecnologa

del ADN fue posible conocer cada vez ms acerca del ADN y sus funciones. Por ello es que el desarrollo de nuestro conocimiento del ADN, los genes y sus funciones ha ido de la mano de la explosin tecnolgica para el anlisis clnico del ADN y ARN. El esfuerzo ms grande para conocer el genoma humano completo (denominado Proyecto del Genoma Humano) fue posible gracias a diversas tcnicas: en primer lugar, el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin, que permiti la diseccin de enormes molculas de ADN en fragmentos definidos. En segundo lugar, el desarrollo de las tcnicas de clonacin, que proporcionaron un mecanismo de amplificacin de secuencias de nucletidos especficas. Y por ltimo, la capacidad para sintetizar

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sondas especficas, que permitieron la identificacin y manipulacin de secuencias de nucletidos de inters. Estos enfoques experimentales y otros han permitido la identificacin de secuencias de nucletidos normales y mutantes en el ADN, y su conocimiento ha llevado al desarrollo de mtodos para el diagnstico prenatal de enfermedades genticas y a xitos iniciales en el tratamiento de pacientes mediante terapia gnica. La descripcin completa de todos los procesos est fuera del alcance de este documento, si bien examinaremos los que sern observados en la prctica de laboratorio.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

Los actuales mtodos de estudio permiten comprender qu es lo que exactamente ocurre en el ciclo celular, y reproduccin, (meiosis) de los seres vivos y cmo se transmiten las caractersticas biolgicas genotipo y caractersticas fsicas fenotipo, de apariencia y hasta de personalidad. Como los genes, formados por segmentos de ADN (doble hebra) y ARN (hebra simple), tras la transcripcin de ARN mensajero, ARN ribosmico y ARN de transferencia, controlan la estructura y el funcionamiento de cada clula, con la capacidad de crear copias exactas de s mismo, tras un proceso llamado replicacin, en el cual el ADN se replica. Aunque la gentica juega un papel muy significativo en la apariencia y el comportamiento de los organismos, es la combinacin de la gentica replicacin, transcripcin, procesamiento (maduracin del ARN) con las experiencias del organismo la que determina el resultado final. La secuencia de estos nucletidos en la cadena de ADN o ARN es la informacin gentica que heredan los organismos. La secuencia de nucletidos de un gen es traducida por las clulas para producir una cadena de aminocidos, creando protenas el orden de los aminocidos en una protena corresponde con el orden de los nucletidos del gen. Esto recibe el nombre de cdigo gentico. Los aminocidos de una protena determinan cmo se pliega en una forma tridimensional y responsable del funcionamiento de la protena. Las protenas ejecutan casi todas las funciones que las clulas necesitan para vivir. El genoma es la totalidad de la informacin gentica que posee un organismo en particular. Por lo general, al hablar de genoma en los seres eucariotas nos referimos

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TECNICAS DE LABORATORIO USADAS EN GENETICA slo al ADN contenido en el ncleo, organizado en cromosomas. Pero no debemos olvidar que tambin la mitocondria contiene genes llamado genoma mitocondrial. El genoma humano est organizado en 46 cromosomas que constan de 22 pares de cromosomas autosmicos (que estn presentes en ambos sexos) y los cromosomas X y Y, que determinan el sexo. Un juego de cromosomas autosmicos procede de cada progenitor. Un cromosoma X procede de la madre, mientras que el otro cromosoma X, o el cromosoma Y, proceden del padre. Los cromosomas autosmicos se numeran en funcin de su tamao, de modo que el 1 es el ms grande. Cada cromosoma contiene genes entremezclados y a menudo con regiones grandes de ADN que no codifican protenas. La mayora de los genes de los mamferos constan de varios exones, que son las porciones que, a la larga, constituyen el ARNm maduro, y de intrones, que separan los exones y que son eliminados del transcrito primario mediante corte y empalme. Sorprendentemente, los clculos ms actualizados demuestran que los 3.000 millones de pares de bases que conforman el genoma humano solo albergan entre 20,000 y 25,000 genes codificadores de protenas.

Fig. 1: relacin entre las diferentes omas.

No obstante, las clulas de los mamferos utilizan mtodos de corte y empalme alternativos, as como promotores gnicos alternativos para generar de 4 a 6 ARNm diferentes a partir de un solo gen, por lo que el nmero de ARNm codificadores de protenas, o transcriptoma, puede llegar a 100,000. Esta complejidad se amplifica an ms a nivel proteico gracias a las modificaciones postraduccionales y a la protelisis

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dirigida, que podran generar entre 500,000-1,000,000 de entidades proteicas funcionalmente diferentes, que constituyen el proteoma. Se calcula que entre un 10-15% de estas protenas actan en el metabolismo, en lo que, colectivamente, se conoce como procesos generadores de energa y los bloques de bajo peso molecular para la construccin celular, como aminocidos, cidos grasos y azcares. Tambin se incluyen los procesos que convierten las sustancias exgenas, como frmacos o sustancias qumicas ambientales. Se describen aproximadamente 2,500 metabolitos, que son el objeto de estudio del metaboloma, aunque se desconoce el tamao real. Este aumenta con el nmero de sustancias ambientales al que se ve expuesto un organismo.

TECNICAS DE EXPLORACIN DEL ADN En el proceso de anlisis del ADN, se estudian las regiones polimrficas del ADN, de esta manera se comparan los genes biolgicos entre dos individuos. En cada gen humano, se encuentran fragmentos llamados locus y marcadores genticos que son examinados por los cientficos para detectar el patrn hereditario del gen. Anteriormente, la manera de estudiar los marcadores genticos en el anlisis de ADN (examen de ADN), era mediante la tcnica de hibridacin con sondas, pero este mtodo requera grandes cantidades de ADN y que no estuviera degradado. El avance en gentica ha permitido, mediante el mtodo por reaccin en cadena de polimerasa (PCR), la extraccin de ADN incluso desde cantidades mnima. Las estructuras de ADN se pueden extraer a travs de muestras de piel, uas, pelo, sangre, etc. Actualmente, utilizando laboratorios de alta tecnologa, el anlisis de ADN se puede realizar desde muestras muy pequeas. Una vez recibidas las muestras en el laboratorio, el proceso de anlisis se realiza inmediatamente. El procedimiento consiste en: 1. Extraccin y purificacin del ADN 2. Cuantificacin 3. Amplificacin del ADN por PCR 4. Separacin de las molculas

5. Anlisis

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PROCEDIMIENTO
En PCR, el cido desoxirribonucleico (ADN) es el analito. Por tanto, una buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtencin de esta molcula a partir de material biolgico. La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la mayora de elementos que pueden interferir en la PCR. La extraccin del ADN de las clulas o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos procedimientos analticos y diagnsticos.

Extraccin y purificacin del ADN:

Se separa la molcula de ADN del resto de los componentes celulares. Hay varias substancias que pueden afectar en este proceso, bien sea los soportes donde se encuentra la muestra biolgica (ropa) o los propios reactivos para la extraccin. La tcnica requerir de ms tiempo o resultar ms costosa en dependencia de tipo de muestra. La sangre o saliva tiene un proceso de extraccin ms rpido y por tanto ms econmico que un hueso o diente.

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Cuantificacin:
Posterior a la extraccin de ADN se realiza la cuantificacin de ADN, es decir mesurar la cantidad de ADN aislado y valorar en qu estado se encuentra (completo o roto). Uno de los mtodos ms utilizados para la cuantificacin del ADN es el anlisis de la absorcin UV, ya que los nucletidos poseen mximos de absorcin alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm). Este mtodo proporciona una estimacin simple y precisa de la concentracin de una muestra. Se considera una muestra adecuada entre 50-200 ng/l.

Amplificacin del ADN o tambin conocido como anlisis por reaccin en cadena de polimerasa (PCR):

Esta tcnica se utiliza para ampliar un fragmento de ADN, es muy til en caso de no tener suficiente muestra de ADN, en ese caso, se hacen copias de los marcadores del mismo ADN para proceder a estudiarlo (es posible amplificarlo hasta un milln de veces). De manera general, la cantidad ptima de ADN est en torno a los 5 ng, siempre y cuando se conozca una parte de la secuencia de los nucletidos. El proceso consiste en varias fases de altas y bajas temperaturas alternadas mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin. En estos tubos, se pone el ADN original junto con una mezcla que contiene nucletidos, polimerasa e iniciadores (conocido ms en ingls comoprimers). Los iniciadores o primers, son molculas de ADN sintetizadas de forma qumica que se adhieren a la plantilla del ADN, permitiendo reconocer la zona variable y propiciando el inicio de la reaccin de repeticin. Los nucletidos y polimerasa permiten la extensin y multiplicacin de la cadena de ADN.

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Separacin de las molculas:

La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico. La separacin

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puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa. La electroforesis se usa en una gran mayora en los fragmentos del ADN amplificado por PCR, Se utiliza comnmente para el anlisis de

mezclas de protenas o de cidos nucleicos, como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.

Anlisis:
Los fragmentos amplificados por PCR se corrieron en la electroforesis. Las molculas de DNA grandes viajan despacio a travs del gel, mientras que las molculas pequeas viajan ms aprisa. El gel est orientado de modo que las bandas ms lentas (molculas mayores) estn arriba. Se coloca en el primer carril de la derecha un conjunto de patrones de DNA, obtenidos por digestin de una molcula grande de DNA (49 kb) con una enzima de restriccin. Se conoce el tamao de todos estos fragmentos, y se ha anotado junto al gel. Se comparando los fragmentos desconocidos de la primera calle con estos patrones, pudiendo determinar el

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TECNICAS DE LABORATORIO USADAS EN GENETICA tamao de los fragmentos desconocidos y compararlos con varias muestras.

APLICACIONES
1. Secuenciacin Una de las razones ms comunes para el uso de la PCR es la formacin de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciacin. Es mucho ms sencillo y rpido que la clonacin en clulas. 2. Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir rboles filogenticos. El PCR tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3. Huellas dactilares del ADN. Mediante esta tcnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta tcnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biolgicas, como sangre, semen, piel o cabellos. Tambin se utiliza en las pruebas de paternidad.

HIBRIDACIN IN SITU FLUORECENTE (FISH)

La Hibridacin es el proceso de unin de dos hebras complementarias de cidos nucleicos de origen distinto. Una de ellas ser el ADN diana, y la otra una sonda. La tcnica se basa en la hibridacin de una sonda de ADN monocatenario marcada con un compuesto fluorescente sobre su secuencia complementaria en el genoma, bien en la metafase o en el ncleo en interfase. Las sondas de ADN utilizadas pueden ser centromricas (marcan nicamente los centrmeros), de secuencias nicas (marcan regiones concretas del cromosoma) o de pintado cromosmico (marcan todos los cromosomas). La tcnica ms importante, y de la que derivan todas las dems, es la Hibridacin In

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situ Fluorescente (FISH). Comparada con la determinacin convencional del cariotipo, la tcnica de FISH es ms sensible, y no necesita clulas en metafases, aunque como inconveniente cabra sealar que detecta nicamente la alteracin especfica que buscamos. Por lo tanto, es un complemento adecuado cuando no se ha podido disponer del cariotipo (por ausencia de metafases) o bien ste es muy complejo (caso de algunos tumores). El inters de esta tcnica consiste en que permite diagnosticar alteraciones cromosmicas o gnicas indetectables mediante la citogentica convencional, o hacerlo de manera ms rpida.

CARIOTIPO
El anlisis espectral de los cariotipos (o SKY) se trata de una tecnologa de citogentica molecular que permite el estudio y visualizacin de los 23 pares de cromosomas en forma simultnea.

Sondas marcadas fluorescentemente son hechas para cada cromosoma al marcar DNA especfico de cada cromosoma con diferentes fluorforos. Debido a que hay un limitado nmero de fluorforos espectralmente distintos, un mtodo de etiquetado combinatorio es usado para generar muchos colores diferentes. Las diferencias espectrales generadas por el etiquetado combinatorio son capturadas y analizadas usando un interfermetro agregado a un microscopio de fluorescencia. El programa de procesamiento de imgenes entonces asigna un pseudocolor a cada combinacin espectralmente diferente, permitiendo la visualizacin de cromosomas coloreados.4 Esta tcnica es usada para identificar aberraciones estructurales cromosmicas en clulas cancergenas y otras patologas cuando el bandeo con Giemsa u otras tcnicas no son lo suficientemente precisas. Este tipo de tcnicas mejorar la identificacin y diagnstico de las aberraciones cromosmicas en citogentica prenatal as como en clulas cancerosas.

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INMUNOHISTOQUMICA

La inmunohistoqumica es un procedimiento histopatolgico que se basa en la utilizacin de un anticuerpo especfico, previamente marcado mediante un enlace qumico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno, aplicado a una muestra de tejido orgnico, correctamente fijada e incluida en parafina. Con la utilizacin de alguna de las tcnicas especficas (peroxidasa, antiperoxidasa, fluorescena, etc.), el complejo antgeno - anticuerpo as formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citolgicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antignicos caractersticos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular y se determina el tipo de clula involucrado en la muestra. Esto puede utilizarse para localizar una protena de inters.

GLOSARIO
Realice su glosario con los trminos con la letra en color celeste y con aquellos que desconozca.

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Caso forense:
Un caso de violacin llega a juicio y en el proceso la vctima no puede reconocer a su agresor, y el abogado defensor del sospechoso asegura que a su defendido se le est acusando sin evidencia. Sin embargo al momento de su arresto se le encontr con la ropa ensangrentada a lo cual el argumento que era suya pues se haba cortado trabajando. Se analiz la sangre encontrada en su ropa y se compar con la de la vctima y con la propia.

Anlisis forense: La imagen a la par es una fotografa de la electroforesis de la prueba de ADN que se le realiz a la ropa del sospechoso. Comentario: Despus de la extraccin del ADN de las manchas de sangre se purific y se cuantific, como la muestra era muy escasa se amplific con la tcnica de PCR, posteriormente se corri la electroforesis donde se evidenci que ADN de la sangre encontrada en la ropa corresponda con los patrones de banda del ADN de la vctima.

E= Escala allica (referencia) V=Perfil Victima S=Perfil sospechoso m= Mancha de sangre en el sospechoso

Lecturas recomendadas:
1. Baynes J. y Dominiczak M. (2011) Bioqumica Mdica. 3era. Edicin. Editorial Elsevier Mosby. 2. Jorde L. et. al. (2009) Gentica Mdica. 3era Edicin. Editorial Elsevier 3. Harvey R. y Ferrier D. (2011) Bioqumica. 5ta Edicin. Editorial Lippincott. 4. Turnpenny P y Ellard S (200). Elementos de Gentica Mdica. 13 Edicin. Editorial Elsevier.

Pginas Web:
1. http://www.microbialsystems.com 2. http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp5.pdf 3. http://es.wikipedia.org/wiki/Gentica

4. http://www.easydna.es/dnanews.php/analisis-adn

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