APUNTES DE TECNICAS HISTOLOGICAS FIJACIN

Prof. Alondra Donoso

I.- GENERALIDADES 1.- Introduccin La vida es un proceso dinmico por el cual los organismos completan sus ciclos biolgicos, la muerte es el nivel metablico a partir del cual las clulas que componen estos organismos no son capaces de recuperar las funciones vitales que les son propias. Dentro de los fenmenos degradativos que llevan a la completa destruccin del soporte material de los seres vivos, deben distinguirse dos fenmenos conceptualmente diferentes, aunque estrechamente unidos: autlisis y putrefaccin. Autlisis es el proceso mediante el cual, despus de la muerte, se produce la autodigestin enzimtica celular, tras la salida del contenido lisosmico al citoplasma por rotura de la membrana delimitante de estos organelos. Se denomina putrefaccin al efecto ejercido por determinadas toxinas y enzimas bacterianas sobre los tejidos. Los microorganismos que originan esta accin son de carcter saprofito y complementan el efecto ltico de la autolisis hasta conseguir la total destruccin celular. Sobre la autlisis y la putrefaccin influyen diversos factores que dependen, por una parte, de la localizacin y la naturaleza del tejido considerado y por otra parte, de la temperatura existente en el medio donde se encuentra el tejido. As el tejido rico en enzimas digestivas, como el pncreas, o que fisiolgicamente contienen gran cantidad de grmenes, como el intestino, sufren de estos fenmenos con mayor intensidad. De igual forma, a mayor temperatura ambiente, mayor velocidad de autlisis y putrefaccin ya que, la temperatura ptima para la actividad enzimtica y bacteriana es entre los 37C y los 42C. 2.- Fijacin tisular: Consiste en interrumpir los procesos de degradacin que aparecen tras la muerte celular, tratando de conservar la arquitectura y composicin tisular lo ms prxima posible a como se encontraba en el organismo vivo. La fijacin es un momento determinado del procesamiento histolgico y que proporciona una imagen esttica del proceso vidamuerte-degradacin orgnica y que debe entregar la fotografa del momento ms prximo al instante de la muerte y por lo tanto, al estado vital de los tejidos. De estas consideraciones sobre el proceso de muerte celular y de fijacin histolgica surgen los conceptos de imagen histolgica real y equivalente. Se denomina imagen real de un tejido a la que mostrara este tejido cuando an se encontraba vivo. Por su carcter dinmico, esta imagen es inalcanzable tras el proceso de fijacin. Imagen

equivalente es la obtenida despus de la manipulacin histolgica de los tejidos, manipulacin que comprende fijacin, inclusin corte y coloracin. Dentro de este complejo procesamiento, la fijacin es la etapa mas esencial y lamentablemente tambin la ms descuidada. Cabe resaltar que en histotecnologa cualquier defecto o error siempre puede ser subsanado, a excepcin de los cometidos durante el proceso de fijacin tisular. El objetivo fundamental de la tcnica histolgica es conseguir la mayor similitud posible entre la imagen real y equivalente, en el caso que no sea as debe considerarse artefacto inducido a lo largo del procesamiento histolgico. Desde el punto de vista de la fijacin, los artefactos ms notables son desgarros y retracciones, provocados por distintos grados de retraccin que ocurren entre las distintas partes de un tejido al ser sometidos a la accin de un agente fijador. Frecuentemente, estos cambios se relacionan son las diferentes proporciones de agua que tienen los tejidos y que resultan potenciados por las diferencias de presin osmtica que existe entre el tejido y el liquido fijador. Existen cuatro postulados fundamentales sobre el proceso de fijacin: No existe un mtodo universal de fijacin. No todos los fijadores conservan indefinidamente los tejidos, ya que fijacin no es equivalente a conservacin tisular. Este error surge ya que la formalina, que es el fijador ms utilizado, es adems de fijador un gran conservante. Un defecto de fijacin, jams podr ser corregido. Es intil realizar un estudio histolgico en una muestra con graves defectos de fijacin. 3.- Tipos de fijacin: Genricamente, los agentes fijadores se clasifican, segn su mecanismo de accin, en fijadores por mtodos fsicos y fijadores por mtodos qumicos. En el primer caso se emplea enfriamiento por congelacin del tejido como mtodo para detener la autlisis y putrefaccin tisular. En el segundo, los agentes fijadores, generalmente en forma lquida, actan desnaturalizando e insolubilizando las protenas tisulares, lo cual bloquea la autolisis por inactivacin enzimtica. Adems, algunos de estos lquidos fijadores impiden el crecimiento bacteriano. La fijacin por mtodos fsicos es el mtodo de eleccin para realizar estudios morfolgicos o funcionales en los que se requieren conservar intacta la estructura antignica del tejido o su contenido enzimtico. La clave de una correcta fijacin por congelacin del tejido radica en que su realizacin sea instantnea: un enfriamiento lento provoca la formacin de microcristales intratisulares de hielo susceptibles de agregarse con el paso del tiempo y de producir dislaceraciones tisulares.

El congelamiento directo en nitrgeno lquido tampoco es aconsejable, ya que el tejido se torna quebradizo en exceso. El procedimiento idneo para fijar tejidos por congelacin consiste en utilizar isopentano a -50 C, el nitrgeno lquido tiene -70 C, las muestras a congelar no deben sobrepasar los 3 cm de superficie y 3 mm de espesor, de modo que el proceso de congelacin no debe llevar ms de 10 segundos en completarse, de esta manera se evita la formacin de cristales de hielo en el interior del tejido. La mantencin de isopentano debe realizarse en un congelador a -70 C, para que quede compensada el alza de temperatura que se produce al extraer el lquido del congelador. En cuanto a la fijacin qumica debemos observar algunas caractersticas que deben poseer estos fijadores: Capacidad de detener rpidamente la autlisis: cuanto mayor sea esta capacidad mejor ser el fijador: este efecto del fijador depende principalmente de su capacidad de producir la desnaturalizacin o floculacin proteca; de forma que la actividad enzimtica del tejido quede paralizada. Que tenga efecto antimicrobiano. Que no provoque retraccin o distorsin que determinen deformacin de la arquitectura tisular. Que favorezca la inclusin, corte y coloracin del material histolgico. La primera cualidad se relaciona con la velocidad de penetracin y velocidad de fijacin que tenga el agente fijador. Se denomina velocidad de penetracin a la rapidez con la que un fijador se difunde en el interior de un tejido, lo que en gran medida condiciona el proceso de fijacin. As el tamao de la muestra debe ser proporcional a la velocidad de penetracin del fijador. Si el fijador es de lenta penetracin, el tamao de la muestra a fijar debe ser pequeo. Hay que tener en cuenta que, aunque en la superficie de la muestra la fijacin sea muy rpida, el fijador no llega al interior de la muestra hasta algn tiempo despus de iniciada la autolisis, lo que puede hacer imposible el diagnstico histolgico en piezas de gran tamao. La velocidad de penetracin de los distintos fijadores es muy variable, el ms veloz es el alcohol y la acetona; la formalina penetra a una razn de 0.9 a 1 mm/hora y el cido pcrico y los sublimados lo hacen a razn de 0.3 mm/hora. La velocidad de fijacin de un agente qumico no siempre est en concordancia con su velocidad de penetracin; la formalina por ejemplo penetra con cierta rapidez, y lo fija con relativa lentitud: esto se explica porque el proceso de fijacin es un fenmeno qumico determinado por el tiempo que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los componentes qumicos de los tejidos. La capacidad de un fijador para provocar fenmenos de retraccin o distorsin tisular depende principalmente de los cambios inducidos sobre la presin osmtica de los

tejidos. En condiciones normales, la presin osmtica de los tejidos es de 300 miliosmoles y se relaciona con el contenido de sales y protenas: por esto cuando se somete un tejido a la accin de un fijador y la presin osmtica de ambos no es coincidente; se establece un flujo de agua entre el fijador y el tejido en funcin de un fenmeno osmtico, hasta que las dos presiones queden equilibradas. Si la presin del tejido es superior a la del fijador, el agua es arrastrada hacia el interior del tejido, produciendo su aumento de volumen (hinchamiento). En el caso contrario; el agua fluye hacia el fijador y ocurre una retraccin tisular. La induccin sobre el tejido de efectos potenciadores de la coloracin se conoce como efecto mordiente, por el cual y a travs de mecanismos muy diversos, se produce un incremento de la tincin provocada por un colorante determinado. A causa de este ultimo efecto, para cada tcnica de coloracin se seleccionan fijadores de preferencia. 4.- Reglas generales a considerar en el empleo de lquidos fijadores Para evitar la autlisis, el tejido debe ser colocado lo ms rpido posible en el lquido fijador. El tejido debe estar seccionado en lminas de 0.5 mm de espesor mximo. Si se desea fijar un rgano en bloque (mayor superficie), se deben realizar incisiones sobre su superficie y apertura de las cavidades internas a fin de que el lquido fijador alcance lo ms rpidamente posible el interior del tejido o realizar fijacin por perfusin que es ms indicado que realizar incisiones que pueden distorsionar la arquitectura del tejido. El volumen necesario de fijador est determinado por el volumen del tejido que se va a fijar. La relacin entre el volumen del fijador y el de la muestra debe ser 20:1 o en casos de extrema necesidad 10:1. La presin osmtica del lquido fijador y la del tejido sern equivalentes; si es necesario debe compensarse la presin del liquido fijador utilizando soluciones salinas como agente de disolucin. El ph del lquido fijador debe aproximarse al ph fisiolgico; salvo que su composicin deba contener cidos. El tiempo de fijacin es especfico para cada fijador, pero existe un tiempo mximo de fijacin que no debe ser sobrepasado. 5.- Lavado postfijacin Es el aclarado que se realiza despus de la fijacin para eliminar los residuos del agente fijador, se debe hacer abundantemente luego de fijar con alcoholes, cidos o metales pesados. Este lavado se puede realizar con distintos lquidos a indicar, alcohol, agua u otro.

II.- LQUIDOS FIJADORES 1.- Alcohol, Acetona, Cloroformo Por ser sustancias altamente higroscpicas, actan eliminando tanto el agua libre, como el agua ligada a las protenas, de forma que las protenas precipitan. Este cambio proteco se conoce como desnaturalizacin y provoca importantes alteraciones en la organizacin de las estructuras celulares y tisulares. Por lo tanto, estos agentes fijadores inducen grandes cambios en la morfologa orgnica, sobre todo si se emplean como agentes fijadores aslados. Sin embargo algunos conservan muy bien la estructura antignica tisular (por ejemplo la acetona) esto se debe principalmente a que los fenmenos inducidos por la floculacin proteica son reversibles tras la rehidratacin tisular. El fundamento molecular de la accin deshidratante de los alcoholes y la acetona se fundamenta en la competicin que realizan con las protenas por las molculas de agua cuando se encuentran en solucin concentrada. El fenmeno se debe a que las sustancias higroscpicas tienden a la estabilizacin molecular cuando forman puentes de hidrgeno utilizando los iones dipolares del agua sustrada a las protenas. El alcohol etlico y la acetona se usan como fijadores simples. El alcohol metlico se emplea exclusivamente para la fijacin de extensiones hematolgicas y el cloroformo se usa formando parte de mezclas fijadoras y sobre todo como lquido intermediario durante la inclusin en parafina. Las ventajas que presentan estos fijadores es que fijan y deshidratan al mismo tiempo, poseen una gran velocidad de penetracin, precipita muy rpido las protenas y el glicgeno y es un gran agente antimicrobiano (bactericida). Indicados en histoqumica e inmunohistoqumica, especialmente la acetona, en cuyo caso la fijacin se debe realizar a 4 C y por no mas de dos horas. Las contraindicaciones que podemos mencionar incluyen el endurecimiento y contraccin tisular, no fija adecuadamente la cromatina ya que disuelve los cidos nuclecos, adems es un fuerte reductor y por consecuencia incompatible con fijadores oxidantes como el dicromato de potasio y el tetrxido de osmio, no presentan efecto mordiente y desplaza algunas sustancias como el glicgeno, fenmeno conocido como polarizacin del glicgeno. 2.- Acido actico, Acido tricloroactico, Acido crmico

Estos tres tipos de fijadores actan a nivel proteco. Las protenas son molculas anfteras cuyo punto isoelctrico global se encuentra en torno a un ph de 5.8. En este punto, la estabilidad de las molculas en mnima y su disociacin es mxima. La escasa estabilidad molecular se debe a que las protenas en este punto se desprenden del agua ligada o endgena porque no mantienen la disociacin electrosttica que fija los iones dipolares del agua a sus estructuras moleculares. Por este motivo, las soluciones coloidales precipitan en presencia de determinados cidos, que disminuyen el ph de la solucin, hasta alcanzar el punto isoelctrico de las molculas en disolucin coloidal. Estos tres fijadores son de carcter cido, se emplean formando parte de mezclas fijadoras y poseen una gran velocidad de penetracin en los tejidos y algn poder de descalcificacin. El acido actico en estado purificado recibe el nombre de acido actico glacial. Se utiliza diluido y formando parte de mezclas fijadoras o soluciones descalcificantes. Es ideal para conservan nucleoprotenas y cidos nuclecos. No es higroscpico, por lo tanto, precipita las protenas sin sustraer el agua de los tejidos, produce en los tejidos un cierto edema que compensa la excesiva retraccin causada por otros agentes fijadores. El cuidado que se debe tener en consideracin es que destruye las mitocondrias. El acido tricloroactico es un excelente medio de descalcificacin y es indicado para todo tipo de estructuras nerviosas. Como contraindicacin se puede mencionar que produce un excesivo aumento del volumen de los tejidos, provocando numerosos artefactos tras la deshidratacin previa a la inclusin en parafina. Es un fuerte agente oxidante, acta como mordiente en tinciones que emplean colorantes bsicos, pero tiene escasa velocidad de penetracin e impregna de una coloracin verdosa los tejidos, por lo que hay que lavarlos abundantemente en agua destilada tras usar este acido. 3.- Cloruro de mercurio o sublimado, Dicromato de potasio En el caso de estos dos fijadores el agente fijador es un catin metlico, fundamentalmente cromo o mercurio que son susceptibles d formar proteinatos metlicos con los tejidos. Por lo general, todos los agentes de este grupo poseen una gran velocidad de fijacin, ya que la formacin de la sal se produce instantneamente. La precipitacin metlica sobre el tejido provoca un notable endurecimiento, lo que obliga a emplear estos fijadores en mezclas que amortigen este efecto. Para el cloruro mercrico el efecto fijador se logra por la combinacin de los iones de mercurio con los grupos cidos de las protenas, especialmente con los de carcter carboxlico, hidroxilo, sulfhidrilo y residuos fosfricos de las nucleoprotenas. El cloruro de mercurio es el fijador por excelencia para patologas hematopoyticas y renales, en las que el diagnstico se apoya usualmente en la observacin de finos detalles nucleares y citoplasmticos, es adems un excelente mordiente, ya que los

puentes de hidrogeno intramoleculares de las protenas quedan preservados tras la fijacin y pueden reaccionar luego con los colorantes. Por este motivo, producen una intensa y brillante coloracin nuclear y citoplasmtica. Como contraindicacin cuenta que no es un agente bactericida y es de lenta penetracin, lo que requiere que el tejido no tenga ms de 5 mm de espesor, contar y endurece excesivamente los tejidos, por esto no se debe sobrepasar las 4 horas de fijacin con este agente. Luego de la fijacin los tejidos se pueden conservar indefinidamente en alcohol etlico de 70. En contraposicin a estas ventajas el cloruro de mercurio provoca precipitados metlicos de color pardo sobre los tejidos, estos precipitados pueden ser removidos mediante un tratamiento del tejido previo a la coloracin con soluciones alcohlicas yodadas semejantes al lugol. Puede dificultar el reconocimiento de las zonas con necrosis tisular. La fijacin con dicromato de potasio el ion cromo tiende a formar complejos con el agua. A su vez estos grupos constituyen quelatos con las protenas al reaccionar con los grupos aminos y carboxilos de estas. El ph ptimo de actuacin para este fijador se sita por debajo de 4,4. Este fijador posee un efecto mordiente al oxidar los grupos alcohlicos de las grasas y polisacridos a aldehdos, es un excelente fijador para mielina. Es indispensable su uso para demostrar la reaccin cromafn y para la impregnacin argntica de las clulas del sistema nervioso central. Presenta el inconveniente de endurecer escasamente y penetrar a baja velocidad en los tejidos, provoca la aparicin de artefactos tisulares como vacuolas citoplasmticas, retracciones y cambios en la morfologa nuclear. Despus de su fijacin, los tejidos han de ser lavados abundantemente en solucin salina o tamponada para evitar el depsito de pigmentos verde tras reducirse el trixido crmico a oxido crmico en el curso de la inclusin o coloracin tisular.

4.- Acido pcrico El acido pcrico es un derivado orgnico que forma picratos con los tejidos, se conoce con el nombre de 2,4,6-trinitrofenol. En el comercio se encuentra en forma de agujas cristalizadas de color amarillo, muy txico y de carcter explosivo. Acta coagulando las protenas a travs de la formacin de picratos, que les confieren gran apetencia por los colorantes cidos, lo que le entrega la cualidad de actuar como mordiente. Este fijador conserva muy adecuadamente la composicin proteca de los tejidos. Produce una ptima contraccin de los tejidos lo que favorece el procesamiento histolgico. Aunque la penetracin tisular es lenta, posee muy buena velocidad de fijacin, no disuelve el glucgeno ni los lpidos, posee una leve accin descalcificante, por lo cual puede emplearse como fijador para las muestras de tejido seo. Para su estabilidad se debe manejar en solucin para su reserva. El acido pcrico es explosivo si en su estado puro se somete al calor y no se debe dejar que se evaporen sus disoluciones. Antes de la inclusin en parafina debe eliminarse el exceso de acido de los tejidos mediante lavados sucesivos en alcohol de 70 u 80 o en una solucin saturada de carbonato de litio en

alcohol de 70. La fijacin con este agente hace que el sea incompatible la inclusin en celoidina.

5.-Fijadores que actan por reticulacin de las protenas El proceso denominado reticulacin de las protenas sobreviene cuando la desnaturalizacin de estas molculas se produce no por precipitacin, sino porque el agente que provoca este fenmeno induce la rotura masiva de los puentes de hidrogeno determinantes de la estructura helicoidal de las molculas proteicas y la formacin ulterior de una malla reticular polipeptdica por asociacin qumica entre los grupos activos desenmascarados por el liquido fijador. Por lo comn, el propio agente contribuye a la formacin de la red actuando como nexo de unin entre molculas adyacentes. Los principales agentes fijadores que actan por este mecanismo son aldehdos o potentes oxidantes como el tetrxido de osmio. Formaldehido o formol (CHOH) En estado puro se trata de un gas toxico y muy irritante para las mucosas que se disuelven fcilmente en agua. En este estado, en concentraciones entre 35% a 40% y estabilizado con metanol, se denomina formalina pura o formol. Por accin del frio la formalina pura tiende a precipitar al polimerizarse a paraformaldehdo, condicin que es reversible aadiendo unas gotas de hidrxido de sodio y calentando la mezcla. Como agente fijador, el formaldehido se emplea en una concentracin del 4%. Sin embargo, como se parte de una solucin de formalina, esta concentracin se obtiene diluyendo una parte de esta ultima en nueve de agua, solucin salina o tampn (en algunos casos se ha utilizado esta formalina diluida en cuatro partes de agua obtenindose resultados ptimos de fijacin). Desde el punto de vista qumico, el formaldehido en disolucin acuosa se hidrata a radical metilenglicol, que es su forma reactiva. Esa sustancia tiende a formar enlaces qumicos con todos los grupos qumicos, excepto con los de carcter cido. Por este motivo, tras la rotura de los puentes de hidrogeno intramoleculares constituye puentes metlicos entre las molculas proteicas adyacentes, de forma que los surgidos entre grupos amino, imino, imido, guanidil, hidroxilo, carboxilo y sulfhidrilos son reversibles. Por el contrario los que forman entre aminocidos aromticos, como la tirosina, triptfano, fenilalanina e histidina son irreversibles. Todos los fenmenos descritos provocan un profundo cambio en la actividad funcional y en la estructura antignica de las molculas proteicas. Accin que es reversible mediante recuperacin antignica con buffer citrato en baos de vapor a 95 C aprox.

La fijacin con formalina es la eleccin por excelencia ya que se trata de un fijador muy econmico, es un buen desinfectante y no endurece excesivamente los tejidos, es un medio optimo para conservar y almacenar biopsias y piezas quirrgicas, provoca escasa retraccin tisular, posee una velocidad media de penetracin, que es de 1 mm/hora aprox. y no altera la coloracin tisular, resulta excelente fijador para tejido adiposo y lpidos en general y se emplea como de eleccin para fijar el tejido nervioso, clulas enterocromafines y en general para impregnaciones argnticas. El proceso de fijacin con formalina puede ser acelerado o retrasado, sin graves inconvenientes, modificando la temperatura. As a temperatura ambiente se consigue una fijacin completa a partir de las 36 horas; a 35 C entre 12 y 24 horas y a 55 C solo 3 horas. Por este motivo, la formalina es un fijador de eleccin cuando se emplean hornos de microondas en histotecnologia. Se debe tener algunos cuidados al momento de trabajar con formalina ya que esta es de carcter irritante sobre la conjuntiva y la mucosa nasal, por accin de la luz y del oxgeno atmosfrico se transforma progresivamente en cido frmico. Esta sustancia tiene la propiedad de disolver rpidamente la cromatina nuclear, por este motivo, con el paso del tiempo los ncleos celulares adoptan un aspecto de fantasma. Para evitar este inconveniente el formol debe guardarse en frascos opacos o emplearse en forma de solucin neutra o tamponada. Debido a que se incorpora progresivamente al tejido en forma de puentes metilnicos, el formaldehido se consume durante el proceso de fijacin, por lo cual debe encontrarse siempre en exceso. Tras la utilizacin prolongada de formalina y por su conversin en cido frmico, puede producirse una reduccin masiva de la hemoglobina y de los pigmentos derivados de ella, hasta originar un precipitado cristalino birrefringente y de color pardo negruzco que dificulta la observacin microscpica y recibe el nombre de pigmento formlico (hematena acida de formaldehido). Este pigmento se elimina fcilmente con un tratamiento de los cortes en solucin alcohlica saturada de acido pcrico, sumergindolos cerca de 5 minutos en esta solucin. Uso de formalina: La formalina se debe usar diluda al 10% (4%) y en mezclas estabilizadoras como: a) Formol salino: Se utiliza para prevenir el efecto osmtico que provoca el empleo de disoluciones de formaldehido en agua destilada. Se prepara disolviendo 9 gr. de cloruro de sodio en 1000 ml. De formalina al 10% b) Formalina neutra: Se aade a la solucin de formalina al 10% una pequea cantidad de carbonato de calcio insoluble que queda depositado en el fondo del recipiente contenedor. Esta sal neutraliza el exceso de acido frmico generado por la oxidacin espontanea del

formaldehido. Aunque puede utilizarse todava para la conservacin de tejidos, en la prctica cotidiana ha sido reemplazada por las soluciones tamponadas c) Formol tamponado: Es la solucin ms empleada hoy da para prevenir el choque osmtico que provoca la disolucin de formalina en agua destilada, as como el depsito de pigmentos formlico que ocurre a ph inferior a 6. d) Formalina acida: Se emplea fundamentalmente para fijar tejido nervioso en la preparacin de algunas tcnicas de impregnacin argntica. Se prepara aadiendo 1 ml de acido actico glacial en 99 ml de formalina al 10%, con esto se logra un ph cercano a 2. e) Formol clcico (solucin de Baker) En este caso los iones de calcio previenen la difusin de los fosfolpidos y estabilizan las molculas enzimticas, de forma que, empleado a 4 C, este formol se utiliza como el fijador de eleccin en algunas tcnicas de histoenzimologia. Se prepara aadiendo cloruro clcico al 1% a una solucin de formalina al 10% Glutaraldehdo Es un lquido oleoso que en el comercio se encuentra en disolucin al 25%. Su mecanismo de actuacin es anloga al del formaldehido. Se debe emplear en concentracin de 1% a 3%. Es el primer fijador de eleccin para microscopa electrnica, aunque utilizado en mezclas fijadoras junto al paraformaldehdo. Tambin se emplea en fijacin por perfusin en patologa experimental. En este caso los fragmentos a fijar no pueden tener un volumen superior a unos pocos milmetros cbicos ya que tiene una velocidad de penetracin excepcionalmente baja. Posee una gran capacidad de retraccin y endurecimiento tisular que impide fijar ms all de 3 horas. Se debe utilizar en soluciones amortiguadoras como el tampn cacodilato, ya que posee una baja presin osmtica. Tetrxido de Osmio Acta por reticulacin de las protenas y grasas al formar perxidos con ellas. Se debe emplear al 1% en tampn fosfato. Es utilizado luego del glutaraldehdo para la fijacin de microscopa electrnica. Tiene algunas desventajas como ser muy caro y descomponerse en presencia de la luz, adems, es muy toxico y en estado cristalino emite vapores que son altamente irritantes para la crnea y mucosa respiratoria, tiene muy baja capacidad de penetracin, tiene baja presin osmtica, por lo tanto se debe utilizar en solucin tamponada. Es incompatible con la reaccin de PAS. Como fija por reticulacin de las protenas inactiva casi completamente las enzimas y altera notablemente la composicin antignica tisular. 6.- Mezclas fijadoras

La combinacin de diversos fijadores puros simples en soluciones complejas pretende sumar las ventajas de cada uno de ellos amortiguando sus inconvenientes estableciendo mezclas fijadoras. Las mezclas fijadoras se pueden agrupar dependiendo si contienen o no formalina en su composicin. Mezclas fijadoras que contienen formol a) Liquido de bouin Es una solucin muy utilizada como alternativa a la formalina, cuando no se pude utilizar mezclas con sublimado a causa de su elevado poder de endurecimiento. Por esto este fijador es ideal para fijar tejidos como piel, rganos endocrinos, testculo y tejido embrionario en general. Sin embargo no est indicado para la fijacin de biopsias renales sobre las que provoca severas alteraciones. Se prepara con acido pcrico en solucin acuosa saturada, formalina concentrada y acido actico glacial, el ph final de la mezcla fijadora es alrededor de 2,2. Tras la fijacin se debe lavar abundantemente en alcohol de 70, hasta la decoloracin de las muestras (cuando se utiliza acido pcrico como fijados las muestras quedan de color amarillo) una vez fijado el tejido se puede almacenar el etanol de 80. La fijacin no debe sobrepasar las 24 horas, pero esto siempre ira en funcin del tamao de la muestra a fijar. b) Fijador de bouin-hollander Es una variante del liquido de bouin y est especialmente indicado para la fijacin de los cilindros de medula sea, en este fijador se puede exceder el proceso por incluso 48 horas sin provocar distorsin del tejido ni endurecimiento. Para su preparacin a los reactivos contemplados para la preparacin de bouin se debe aadir acetato neutro de cobre.. Para preparar la solucin primero se debe disolver la sal de cobre en agua destilada, luego se aade el acido pcrico y tras filtrarlos, se aade el formol y finalmente el acido actico glacial. c) Bouin alcoholico (duboscq-brasil) Cuando la pieza a fijar es relativamente voluminosa se necesita aumentar la velocidad de penetracin del lquido fijador, esta propiedad la entrega el alcohol, por esto esta mezcla fijadora es vlida para estos casos. Se debe utilizar alcohol etlico de 80. d) Liquido de gendre Es otra variacin de bouin que est especialmente indicado para la fijacin de glucgeno y pigmentos derivados de la hemoglobina. e) Fijador de Mller Es la disolucin de dicromato de potasio con adicin de sulfato sdico, su importancia radica en que se emplea para fabricar los fijadores de Orth y de Zenker. Si se desea fijar

con esta mezcla no debe hacerse ms all de 48 horas, tras la fijacin se debe lavar abundantemente en agua. f) Fijador de orth Se emplea casi en exclusividad para demostrar la reaccin cromafn o en ciertas tcnicas de impregnacin argntica para tejido nervioso, dentro de estas ltimas se emplea especficamente para el mtodo de Golgi rpido. g) Solucin de B5 y zenker-formol (liquido de helly) Ambas mezclas fijadoras son casi idnticas. La denominacin B5, se da por que puede ser utilizada a diario. La mayor utilidad de estos fijadores es que mejora considerablemente la tincin nuclear la fijacin con mezclas de sublimados es de gran ayuda para el diagnstico morfolgico en las patologas del sistema linfoide y hemopoyticos, debido a la gran importancia que se otorga a la observacin de finos detalles nucleares (presencia o no de hendiduras o repliegues nucleares y de nucleolo). As mismo la solucin de B5 o de zenker-formol es el fijador de eleccin para el rin, hgado, las fibras de tejido conectivo y la fibrina. h) Solucin de B5 i) zenker-formol (liquido de helly) Mezclas fijadoras que no contienen formol Liquido de zenker Combina los efectos favorables del sublimado y del dicromato de potasio. En la prctica ha sido sustituido por el B5. Lquido de carnoy Es tal vez el mejor fijador conocido para glucgeno y en general para los hidratos de carbono, pero por sobre todo para miofibrillas. Adems de que su accin fijadora es extremadamente rpida, deshidrata el tejido al mismo tiempo. Provoca retraccin excesiva de los tejidos as como hemolisis masiva, no conserva la estructura de las protenas globulares y el ADN. Se prepara con etanol absoluto, cloroformo y acido actico glacial. Una vez finalizado el proceso de fijacin que no debe sobrepasar las 3 horas, las muestras fijadas deben ser traspasadas directamente a alcohol etlico absoluto. Para evitar la excesiva retraccin se puede sustituir el etanol absoluto de la mezcla fijadora por metanol que provoca menor retraccin, esta variante se conoce como mezcla metacarn o metanol-carnoy. Fijacin en microscopia electrnica En microscopia electrnica los cortes deben ser extremadamente finos, que permita el paso de un haz de electrones que finalmente proyectar la imagen. La fijacin para esta tcnica es muy delicada y debe realizarse en forma inmediata.

Como primer fijador para microscopa electrnica se recomienda el glutaraldehido en tampn fosfato o cacodilato en concentracin de 2,5% a 4% y como segundo fijador el tetrxido de osmio. Para estudio rutinario el glutaraldehido se usa en tampn fosfato y para citoqumica se prefiere el tampn cacodilato. Este ltimo posee la ventaja adicional de contener arsnico que acta como agente antibacteriano, lo que favorece la conservacin de las muestras. Considerando la escasa capacidad de penetracin, tanto el tetrxido de osmio como el glutaraldehdo necesitan que las secciones sean de 1 mm. Se ha postulado como fijador para microscopia electrnica una mezcla de paraformaldehdo y glutaraldehdo (mezcla se karnovsky) que compensa la escasa velocidad de penetracin del segundo agente, fscilitando la fijacin de muestras de mayor volumen. Con tetrxido de osmio, la fijacin es de una hora. Se puede emplear una doble fijacin en glutaraldehdo y en tetrxido de osmio, primero se fija el tejido de 4 a 16 horas en glutaraldehdo en tampn cacodilato. Lego se lava en tres cambios de 5 minutos en la solucin tampn y se fija durante una hora en tetrxido de osmio a temperatura ambiente. Despus de lavar en dos cambios de agua destilada se debe incluir en resina.