CENTRO EDUCACIONAL ADVENTISTA DE LOS ANGELES

ESPECIALIDAD DE LABORATORIO QUIMICO

PROF. PRISCILLIA JARA
Lorena Cabezas Baeza
Tcnico laborante


LABORATORIO DE MICROBIOLOGA.
Tincin Gram


Introduccin.

La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa
para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo
dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin
bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y
Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.


Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) Bacterias Clostridium perfringens
vistas al microscopio tras ser teidas (Gram positivas)
con la tincin de Gram.



Objetivo.

Conocer y aplicar la tcnica de Tincin Gram para poder visualizar bacterias gram positivas y gram
negativas. .


Fundamento Terico.

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si
sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la
pared para la retencin o el escape del colorante.
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El
alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram
positivos y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gram negativas, los lpidos
de la pared (ms abundantes que en las clulas gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que
permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo.

1.- Siembra inicial en medios de cultivo.
Las muestras sern sembradas en medios de cultivo mejorados. Estos se utilizan en el aislamiento
primario de la mayor parte de los microorganismos presentes en una muestra. Las dos primeras
caractersticas que debe reunir esta siembra son:


a).- Asepsia: Esto implica la operacin destinada a impedir la contaminacin del medio de cultivo
expuesto al medio ambiente y de la muestra a sembrar. La operacin es asptica cuando 1) se expone lo
ms brevemente posible el medio de cultivo al ambiente. 2) se flamean los tubos y pipetas de vidrio.
3) se calientan a temperatura elevada (hasta color rojo) las asas metlicas en el mechero.


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Lorena Cabezas Baeza
Tcnico laborante


b).- Diseminacin de la muestra a sembrar: con el instrumento (asa metlica o pipeta Pasteur
acodada) debe sembrarse en lneas paralelas muy juntas, alejndose paulatinamente del punto de
siembra, con lo cual se agota la carga bacteriana. Girando al mismo tiempo la placa a sembrar, se logra
la separacin de clulas bacterianas sobre la superficie de la placa de tal manera que se obtienen
colonias perfectamente aisladas despus de la incubacin correspondiente.

2.- Incubacin.
El material sembrado debe incubarse a la temperatura ptima (35 37C) durante 18 24 horas. Las
placas se incuban con la tapa hacia abajo, para impedir la evaporacin del agua que contiene el agar
con medio de cultivo.

3.- Examen visual de desarrollo bacteriano.
Las placas sembradas se observan cuidadosamente despus del periodo de incubacin, tratando de
visualizar:
- presencia de colonias
- tamao aproximado de las colonias (muy pequeas, pequeas, medianas, etc.)
- color de las colonias (blancas, amarillas, grises, doradas, etc.)
- superficie (hmeda, seca viscosa, etc.)
- invasividad sobre la placa (velo fino de desarrollo en la superficie)
- otras caractersticas como por ejemplo: hemlisis si el medio contiene sangre, la hemolisina se
observa mejor mirando el medio de cultivo a trasluz. Etc.


Materiales: Reactivos:
Microscopio * cristal violeta
Portaobjetos * lugol
Cubreobjetos * alcohol - acetona
Asa de siembra * safranina
Pinzas * cultivo bacteriano
Piseta * agua destilada
Mechero
Papel de filtro

Procedimiento.

1. Preparar los frotis bacterianos.
2. Teir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de
perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teir con safranina 1min.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparacin.
11. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.
Preguntas.

1.- Mencione las diferencias que existen entre las bacterias gram positivo y gram negativo.
2.- Seale al menos 3 ejemplos de bacterias gram positivo y gram negativo.
3.- Por qu las bacterias teidas se lavan con alcohol?
4.- Dibuje y explique lo observado en el microscopio.