Isolamento de Enterobactrias em meios de cultura seletivos

Na natureza, os microrganismos encontram-se formando populaes mistas, isto , microrganismos distintos que pertencem ao mesmo habitat. Por outro lado, o desenvolvimento da microbiologia, assim como de todos os procedimentos laboratoriais para o diagnstico, depende da obteno do crescimento de microrganismos na forma de populaes puras que, quando cultivadas em meios de cultura, denominam-se culturas puras ou axnicas. A obteno de uma cultura pura a partir de uma cultura mista denomina-se isolamento, conseguido atravs da semeadura de microrganismos na superfcies de meios de cultura slidos em placas de petri, o que permitir a formao colnias, populaes isoladas que crescem na superfcie desse meio. Como todos os seres vivos, os microrganismos necessitam de nutrientes apropriados ao seu desenvolvimento bem como de condies fsicas e ambientais favorveis especficas. O meio de cultura deve fornecer, portanto, nutrientes em concentraes adequadas ao desenvolvimento do microrganismo a ser cultivado, alm das condies fsico-ambientais adequadas requeridas: pH, temperatura, tenso de oxignio ou condies anaerbicas, presso osmtica, etc. As enterobactrias so bacilos gram-negativos que fazem parte da microbiota normal do intestino do homem. Uma vez que uma grande parte das doenas infecciosas causada por enterobactrias, a identificao e isolamento destas possibilita adoo de medidas mais eficazes de tratamento e controle de tais doenas. Para isolamento das enterobactrias utiliza-se meios de culturas seletivos para microrganismos gram-negativos. Os meios seletivos impedem o crescimento de determinados grupos num inculo misto, mas permite o desenvolvimento de outros. O meio Agar mac-conkey utilizado para o isolamento de bacilos Gramnegativos. Permite tambm visualizar a fermentao ou no da lactose (meio seletivo-indicador). Sua frmula consiste em: peptona de casena 17g, extrato de carne 3 g, sais biliares (mistura) 1,5 g, lactose 10 g, cloreto de sdio 5 g, vermelho neutro 0,03 g, cristal violeta 0,001g, agar-agar 13,5 g, gua destilada 1000 mL, pH final = 7,1. Os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento da microbiota Gram-positiva por ventura existente no material. A lactose junto com o indicador de pH (vermelho neutro) serve para comprovar a degradao (fermentao) deste carboidrato - o que feito por apenas parte dos microrganismo. Quando ocorre a fermentao, a bactria classificada como Lac +. O meio de cultura vem na frmula comercial de p desidratado, no havendo necessidade de ser formulado. Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Colocar em balo e aquecer levemente sob agitao constante at completa dissoluo. Tampar o balo, identificar e autoclavar a 120 C por 15 minutos.

Aps autoclavao, retirar da autoclave, resfriar a 80 C, distribuir assepticamente cerca de 20 25mL deste meio em placas estreis de 90 mm. Deixar solidificar a temperatura ambiente. As placas de petri devem ser inoculadas pela tcnica de esgotamento e incubadas por 18 a 24 horas. Se negativo aps 24 horas, reincuba-las por mais 24 horas. As colnias lactose-positivas (LAC +) fermentam a lactose provocando acidificao do meio, originando colnias de cor rosa com halo central mais claro (p. ex., E. coli, Klebsiella, Enterobacter). As colnias lactose-negativas (LAC -) no degradam lactose, formando colnias incolores e transparentes. As colnias assumem a colorao do meio, que se apresentar um pouco alterado, devido a utilizao dos outros componentes que no a lactose (p.ex., Proteus, Salmonella, Shigella).