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MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE PATOLOGA CLNICA

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CONTENIDO Pgina I. PRESENTACIN

Introduccin 3

II. PRCTICAS
1. Reconocimiento de Material y Equipo de Laboratorio. 2. Hemograma. 3. Pruebas de coagulacin 4. Pruebas cruzadas. 5. Urianlisis o Examen General de Orina. 6. Valoracion de la glucemia y su relacin con alteraciones metablicas en los individuos 7. Metabolismo Heptico y Renal. 8. Evaluacion Citolgica y de Acumulacin de lquidos. 51 54 60 4 21 37 43 45

III. BIBLIOGRAFA IV. ANEXOS Valores de referencia para distintos analitos V. ACTUALIZACIN

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FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE PATOLOGIA CLINICA

INTRODUCCION Describir los procedimientos rutinarios realizados en laboratorio clnico condensados en un solo documento para su fcil acceso y consulta por parte de los alumnos que realicen practica en el Laboratorio. Este procedimiento aplica a todas las practicas realizadas por los alumnos de la Unidad de Aprendizaje de patologa clnica con la finalidad de mantener una mejor expectativa en la Unidad de Aprendizaje. El presente manual est dirigido a todo aquel personal (Alumnos) que opera o proporciona mantenimiento preventivo a equipos de laboratorio clnico. En el manual se describen algunos de los equipos ms comnmente usados y sus principales funciones. Algunos de estos son de funcionamiento sencillo tales como: Microscopio binocular, Centrfuga, Balanza Analtica, Espectrofotmetro y Pipetas automticas. Es importante hacer notar que este manual no pretende ser un sustituto del manual del fabricante, sino por el contrario un complemento de l.

OBJETIVOS 1. Mostrar al Alumno el uso adecuado de los equipos, fomentando el seguimiento de las recomendaciones del fabricante. 2. Mostrar los procedimientos para el adecuado mantenimiento y cuidado de los equipos. 3. Darle las Herramientas al Alumno para el desarrollo de las practicas de laboratorio realizadas en la unidad de aprendizaje de Patologia Clinica.

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PRACTICA I. RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO I. Introduccin

Es fundamental conocer el equipo y material de laboratorio comnmente usado en Patologa Clnica para facilitar el desenvolvimiento de los alumnos en prcticas posteriores. II. Objetivos

El discente reconocer el material de laboratorio comnmente usado en Patologa Clnica. El discente desarrollar las habilidades y conocimientos que le permitan identificar y usar el material de laboratorio. El discente reconocer el equipo de laboratorio comnmente usado en Patologa Clnica y aprender a trabajar con el microscopio con la iluminacin de Keler. I.1. Reconocimiento de equipo de laboratorio Describir la operacin de algunos de los equipos El microscopio es un equipo que consta de un juego de lentes que permiten al ojo humano observar detalles que a simple vista es imposible observar. El uso de este equipo en los laboratorios clnicos, permite determinar la presencia de parsitos, larvas, cristales, restos de tejido, componentes de la sangre y otros cuerpos. En el Laboratorio de Anatoma Patolgica, permite el estudio de tejidos para poder determinar enfermedades, malformaciones o deficiencias. El microscopio se compone bsicamente de tres partes (Ver figura 1): Sistema ptico.Constituido por lentes, espejos y prismas dispuestos en un tubo que amplan la imagen. Este incluye: Los oculares, el cuerpo binocular, y los objetivos. Sistema de Iluminacin.Por lo general consta de un bombillo que puede ser de tungsteno (halgeno), el cual es controlado por un interruptor de encendido y un regulador de intensidad; adems consta de un condensador, que tiene como funcin concentrar y enviar un haz de luz perpendicular a la muestra y luego al objetivo. Sistema Mecnico. Es toda la estructura del microscopio y lo compone: El revlver, la base, El Macromtrico y el Micromtrico, la base de platina, la perilla de platina en cruz, la perilla del portacondensador y el brazo.

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Figura 1. Microscopio Binocular

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I.2 Recomendaciones de uso De un buen uso y manejo del microscopio depende el funcionamiento continuo de ste. Es importante tomar muy en cuenta las siguientes recomendaciones: a. El microscopio debe ser cubierto con cobertores de tela, no con plsticos, ya que estos por el calor que producen, permiten la formacin de hongos en los lentes. b. Nunca debe ser expuesto directamente a los rayos del sol, ni cerca de sustancias txicas, ni cerca de lavaderos. Tampoco deben estar en el mismo mueble donde se encuentran equipos que producen vibracin. c. El polvo se encuentra prcticamente en todo lugar, ocasionando serios problemas en las partes mecnicas que se deslizan sobre guas con extrema precisin, si estas guas estn sucias, el polvo con la lubricacin hace las veces de esmeril o lija, ocasionando desajustes en los movimientos, por lo que ser necesario limpiar y lubricar peridicamente. d. Verifique si su equipo funciona correctamente:

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Revise en forma visual que el tomacorriente macho se encuentre conectado al tomacorriente hembra de la pared, de modo que se establezca un buen contacto. Accione el interruptor (switch), compruebe que la lmpara encienda. Mueva de izquierda a derecha el regulador de intensidad y compruebe su funcionamiento. Revise si las partes mecnicas y pticas funcionan adecuadamente: movimientos macromtricos y micromtricos, desplazamientos libres de la platina en cruz, portacondensador, diafragmas, revolver. Cualquier anormalidad en el microscopio, reprtela al Departamento de Mantenimiento. Nunca trate de corregirla o que la corrijan personas que no poseen los conocimientos tcnicos necesarios. e. No se debe fumar cerca del microscopio, ya que eventualmente los lentes, llegan a cubrirse con una capa de material no combustible, mezclado con residuos de carbn. Lo que produce decoloracin y un campo borroso. f. No se deben usar cantidades exageradas de aceite de inmersin, pues si ste no se quita cuando se termina el trabajo, se secar sobre los lentes y producir problemas para el microscopista. En la mayora los casos, es suficiente usar una gota de aproximadamente 5 mm de dimetro. NOTA: Favor de no rotar el objetivo 10 X 40X, sobre el aceite de inmersin, por lo tanto girar primero al lado contrario para utilizar el objetivo 100X con aceite. g. Cuando hay necesidad de movilizar el microscopio de un sitio a otro, ste debe sostenerse en posicin vertical, y tomarlo por el brazo y por la base, que son las partes ms slidas del equipo. La movilizacin inadecuada puede desviar los prismas y su arreglo solo puede hacerlo un experto. h. La calidad del microscopio depende de la calidad de los objetivos. Estos objetivos son lentes muy costosos y se debe tener un excesivo cuidado para evitar que se rallen. Siempre se debe comenzar enfocando con el objetivo de menor aumento y luego pasar al de mayor aumento. Enfoque siempre hacia arriba y no hacia abajo, pues el lente puede golpearse y rallarse con la lmina o la platina. i. Las lmparas no deben usarse al mximo de intensidad, ya que se acorta su vida til. Lo que se debe hacer es centrar, enfocar y subir el condensador o diafragmas para lograr optimizar al mximo la luz.

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I.3 Mantenimiento preventivo por parte del operador De los elementos que componen el microscopio, los sistemas de lentes son las partes que exigen mayor nmero de cuidados especiales. Los componentes mecnicos y de iluminacin pueden ser reemplazados y ajustados sin que para ello se realicen grandes esfuerzos; en cambio el deterioro de un componente ptico es un hecho lamentable, cuyo costo es considerable y no puede compararse al de los otros tipos de fallas. Debido a esto, a continuacin se detalla el procedimiento para realizar un buen mantenimiento preventivo para mantener en optimas condiciones los diferentes sistemas que forman el microscopio: a. Limpie la superficie del equipo con un trapo humedecido con agua, no use alcohol, acetona u otra sustancia demasiado fuerte, ya que la pintura puede desprenderse. b. Verifique que el cable de conexin no presente ningn deterioro en su aislante, especialmente en sus extremos, si se presenta cmbielo o reprtelo a Mantenimiento. c. Compruebe el buen funcionamiento de l o los diafragmas, y el correcto montaje del condensador. Cntrelo si es necesario. d. Verifique los desplazamientos mecnicos de la platina y el portaobjetos; limpie y lubrique con grasa fina las cremalleras o guas visibles. e. Es recomendable tener a la mano un bombillo de repuesto, para no interrumpir el trabajo cuando se queme el que est en uso. f. Desmontar los objetivos y oculares para su limpieza, segn se detalla: f.1 Objetivos: ! Con un ocular en posicin invertida observar el lente externo del objetivo, conservando un ngulo de aproximadamente 30, para detectar partculas de polvo o aceite, rayones u hongos. ! Con un hisopo humedecido ligeramente en agua destilada frotar el lente externo del objetivo en forma circular y luego pasarle un hisopo seco para secar el lente. ! Con una perilla insufladora sopletear cualquier partcula de polvo o algodn interna y externamente del objetivo. ! Por ningn motivo desarme el objetivo, porque puede daarlo o hasta desajustarlo. ! Si la suciedad persiste, reprtelo de inmediato al Departamento de Mantenimiento.

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f.2 Oculares: ! Para determinar si los oculares se encuentran sucios, montar una lmina con cualquier muestra en el portaobjeto de la platina y observarla con el objetivo 40x, una vez enfocado el objeto hacer girar un ocular a la vez y si se observan partculas que giran, es signo de suciedad en los lentes de los oculares. ! Cuando se retiren los oculares, cubrir los orificios donde estos se encuentran para que no entre polvo en los prismas del cuerpo binocular del microscopio. ! Sobre una franela o pedazo de tela desarme cuidadosamente el ocular, teniendo especial cuidado de conservar el orden y posicin en la que se encuentran los lentes y separadores. ! Cada lente debe limpiarse con un pedazo de algodn ligeramente humedecido con agua destilada y luego secarlo con algodn seco, teniendo el cuidado de no tocar los lentes con la yema de los dedos, porque quedaran impresas sus huellas digitales. ! Con la pera insufladora sopletear los lentes para retirar cualquier partcula de polvo o algodn. ! Armar cuidadosamente de nuevo el ocular, conservando el orden, de manera inversa a la cual se desarmo. ! Nunca use sustancias como acetona, xilol, alcohol 90, ter u otro para limpiar los lentes; estas sustancias solamente son usadas por personal de Mantenimiento tcnicamente capacitados. ! Si la suciedad persiste y dificulta demasiado la visualizacin del objeto, reprtelo al Departamento de Mantenimiento del Laboratorio.

I.4 CENTRFUGAS I.4.1 Descripcin del Equipo Las centrfugas son equipos mdicos utilizados en los laboratorios, clnicas y otros, para la separacin de solutos de sus solventes. Por ejemplo en la rama de laboratorio clnico, para el anlisis de sangre, por lo general es necesario separar el plasma de los otros componentes para poder ser analizado. Existen varios tipos bsicos:

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Centrfugas Clnicas (para separacin de sueros o plasma) de baja velocidad (Macrocentrfuga, entre 2,000 y 6,000 R.P.M. aproximadamente), Centrfugas para microhematcritos (Microcentrfuga entre 10,000 y 18,000 R.P.M. aprox.) y las ultracentrfugas (de 20,000 hasta 75,000 R.P.M.) para la separacin de protenas. Tambin pueden ser catalogadas basndose en otras caractersticas, como: grandes, medianas y pequeas; o de piso. En la figura No. 2, se muestra una centrfuga tpica, con sus partes. Las partes principales de este equipo son las siguientes (Ver figura 2):

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Figura 2. Centrfuga 1. Tapadera 2. Cmara o gabinete 3. Base 4. Interruptor de encendido 5. Marcador de tiempo 6. Tacmetro 7. Freno 8. Control de velocidad

Tapadera. Impide el acceso a las muestras, mientras estas estn en movimiento. En la mayora de modelos funciona en forma automtica, de modo que no pueda ser abierta mientras la centrfuga est en funcionamiento. Cmara o gabinete. Es el espacio fsico donde se realiza el proceso de centrifugacin.Dentro de esta gira el rotor (araa).

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Base. Est construida generalmente de materiales pesados, y con sistemas de fijacin a las superficies, de modo que brinda estabilidad al equipo. Generalmente aqu estn ubicados los controles. Interruptor de encendido. Permite controlar el suministro de energa al equipo, a modo de encenderlo, apagarlo, y generalmente incluye seleccin de modo de operacin. Control de Tiempo. Permite controlar el tiempo de centrifugacin. Generalmente tambin permite visualizar el tiempo transcurrido o pendiente para que finalice un proceso seleccionado. Tacmetro. Muestra la velocidad a la que gira el rotor, es decir la velocidad de centrifugacin (en revoluciones por minuto, RPM). Freno. Algunas centrfugas, dependiendo del modelo, presentan este control, el cual permite ya sea hacer ms rpido el proceso de paro de la centrfuga, o detenerla en situaciones de emergencia. Su funcin especfica es determinada por el fabricante, por tanto debe ser utilizado con precaucin segn las instrucciones de ste. Otras partes no mostradas en la figura, pero importantes en la centrfuga son: El rotor. Tambin conocido como araa, es la parte en la cual se colocan los porta muestras. Para su conservacin es importante seguir las instrucciones de cargado de la centrfuga (seccin IV.2). Porta muestras. Son una especie de recipientes donde se colocan las muestras. Su tamao depende de la aplicacin para la que est diseado el equipo: Banco de sangre, hematcrito, etc. Estos componentes pueden ir variando dependiendo de la complejidad y calidad del equipo. I.4.2 Cargado de la Centrfuga El cargar la centrfuga en una forma adecuada es muy importante para el funcionamiento correcto de la misma, y su preservacin. Un procedimiento incorrecto de cargado, ocasiona que la centrfuga vibre durante el proceso de centrifugacin, lo que ocasiona que el rotor sufra daos que pueden llevar a su sustitucin. Un procedimiento de cargado correcto, implica el colocar las cargas en el rotor de forma balanceada. Las centrfugas estn diseadas para obtener un balance cuando estn en movimiento. Para esto es necesario cumplir los siguientes requisitos: a) Colocar las cargas de modo que las cargas que tienen la misma masa o peso queden colocadas de forma opuesta en el rotor. Si tiene un nmero impar de muestras para ser cargadas, busque otra muestra de igual peso a modo de siempre formar pares opuestos de igual peso; nunca coloque un

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nmero impar de muestras dentro de la centrfuga. Utilice la balanza para estar seguro de la igualdad de los pesos. b) Adems de tener la misma masa (peso), deben tener el mismo centro de gravedad, es decir: no coloque tubos y recipientes como pares contrapuestos, que tengan diferente forma, tamao, espesor, etc. c) Utilice la centrfuga colocando todos los accesorios en el rotor, ya que estos equipos han sido diseados para trabajar con estos. d) Utilice el rotor y accesorios originales del equipo. Las piezas no originales pueden producir un desbalance y acortamiento de la vida til del equipo. e) Complemente estas recomendaciones con las instrucciones del fabricante. I.4.3 Otras Recomendaciones de Uso Adems de seguir las recomendaciones de la seccin I.4.2, es importante tomar en cuenta otras para mantener la centrfuga en las condiciones adecuadas: 1. Mantenga la centrfuga limpia de restos de muestras, vidrio o polvo. 2. Cuando est centrifugando mantenga cerrada la tapadera. Si algo se rompe apague inmediatamente el equipo y no lo abra hasta que se detenga o el indicador de apertura de la tapadera lo indique. 3. Reemplace los recipientes metlicos que estn deformados, pues producen una presin no uniforme sobre el tubo de muestra. 4. No utilice equipo de vidrio rallado o agrietado, porque la presin centrfuga puede producir una ruptura en estos puntos, pulverizando el vidrio y contaminando las otras muestras. 5. Reemplace los tapones amortiguadores de los portamuestras. Cuando se deterioren y/o se rompa un tubo de vidrio, limpie los restos (macrocentrfuga). 6. Compruebe que la superficie donde tiene el equipo est perfectamente nivelada, ya que si sucede lo contrario causara vibraciones. 7. Compruebe el funcionamiento del equipo realizando los siguientes pasos: ! Cargue la centrfuga correctamente y cirrela.

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! Asegrese que la centrfuga est bien cerrada. ! Accione el interruptor de encendido, fijando previamente la velocidad y/o el tiempo de centrifugacin (s el equipo cuenta con estos controles). ! Observe detenidamente el funcionamiento; si no existiese ningn problema contine con su trabajo. ! Si existen problemas de vibracin, balancear correctamente los portamuestras.Si no funciona el equipo, revisar el cable de conexin elctrica, carbones o fusibles. I.4.4 Mantenimiento Preventivo por parte del operador 1. Tome un pauelo humedecido con agua y limpie internamente la cmara y la superficie externa; luego pase suavemente un pauelo seco. Si tiene manchas pngale al pauelo humedecido, un poco de detergente, si las manchas persisten reprtelas a mantenimiento. Recuerde que la orina y la sangre son altamente corrosivas, por lo tanto, cuando se derramen limpie inmediatamente como se detall anteriormente. 2. Revise que el mecanismo de seguridad de la puerta funciona correctamente. 3. Verifique el funcionamiento y exactitud del control de tiempo y velocidad, si los tuviese. 4. Revise el estado del freno automtico o manual, si lo tuviera. 5. Revise l o los empaques de hule, en la mayora de los casos el tubo capilar (en la microcentrfuga) perfora el empaque, botando la muestra de sangre, la plastilina y/o pulverizando el tubo capilar. No hay necesidad de cambiar el empaque, basta con despegarlo con mucho cuidado y girarlo un tercio del espacio entre marca y marca de un tubo capilar y el otro; pegarlo nuevamente con pega de zapatero. Este procedimiento puede hacerse hasta dos veces, despus cmbielo. 6. Verifique la alimentacin elctrica del equipo para detectar posibles peladuras, cortes o degradacin del material aislante. 7. Para cambiar los carbones, algunas centrfugas tienen acceso directo a ello, y basta con desmontar las tapaderas de los portacarbones y verificar el estado de estos. Si estuviesen bien gastados (entre un 60% y 75% de su tamao normal), agrietados o astillados, cmbielos inmediatamente. Siempre se cambian los dos carbones, nunca debe cambiarse solo uno. En la mayora de las centrfugas el acceso a los carbones se tiene por la parte de abajo del equipo, basta con retirar los portamuestras e invertir el equipo, con un destornillador plano o Phillips (segn sea el

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caso), retirar los tornillos de la tapa inferior; verificar los carbones usando el criterio anterior. Antes de realizar este procedimiento es importante que el tcnico de mantenimiento le haya explicado cmo hacerlo, de lo contrario reporte la falla a mantenimiento. 8. Verifique que al centrifugar las muestras, no exista vibracin excesiva. Si la hay, verifique las cargas; si estas estn bien y la vibracin persiste, reprtelo al departamento de Mantenimiento del laboratorio.

1.5 BALANZA GRANATARIA 1.5.1 Descripcin del Equipo Se estudia la balanza granataria en el presente manual por ser un equipo que tiene importancia en el Laboratorio Clnico, ya que de su buen uso depende la exactitud en la preparacin de reactivos y de estndares. La balanza granataria (Ver figura 3) es la que nos proporciona mayor exactitud, es por eso que es usada de preferencia en ambientes como los laboratorios clnicos, en donde se requiere de gran precisin en la medida.

Figura 3. Balanza Analtica

1. Botn de liberacin de platos 2. Botn de liberacin del fiel 3. Escala de centsimas de gramo

4. Soporte de platillos 5. Tornillos de base 6. Botn de movilizacin de caballete

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7. Platillos

8. Escala de dcimas de gramo

Cabe observar que la balanza analtica manual de dos platillos, es muy delicada, ya que todas sus piezas van colocada desequilibrarla. 1.5.2. Operacin del Equipo a) Antes de iniciar el uso de la balanza, asegrese que todo el sistema est a 0 (calibrado). b) Para pesar un reactivo, debe pesarse primero el papel para film o papel encerado y a ese peso sumarle la sustancia que se desea pesar. c) Se coloca la sustancia que se va a pesar, en el platillo de la izquierda y en el platillo de la derecha las unidades de gramo. d) Cuando se inicia el proceso de pesado primero se liberan los platillos de sus soportes con el botn lateral y luego se libera el fiel, con el botn central. e) Cuando se ha liberado el fiel, nos indica de acuerdo a su desplazamiento, si la sustancia que estamos pesando, necesita mayor o menor peso. f) Las unidades de gramos, las colocamos sobre el platillo de la derecha, las dcimas sobre la escala superior. g) Para obtener las centsimas y milsimas de gramos, se busca en la escala colocada al lado derecho de los platillos, se toma como referencia el 0 de un pequeo nonius colocado bajo la escala. 1.5.3. Cuidados del Equipo a) La balanza debe protegerse de las variaciones de temperatura y humedad, exposicin a la luz solar, no colocarse cerca de hornos, baos de Mara, etc., tanto al almacenarse como en su uso, ya que los objetos calientes o tibios tienen un peso menor que cuando estn fros, debido a corrientes que se establecen con el aire que los rodea. b) Debe colocarse en una mesa que sea firme y protegerla de vibraciones (de ser posible una mesa exclusiva para ella). sobre pequeas cuas, lo que hace que una vibracin fuerte, cerca de ella pueda

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c) Los platillos y el fiel deben descansar en sus soportes, siempre que no se est utilizando la balanza. d) La campana debe permanecer siempre cerrada. e) Mientras la balanza est oscilando, la sustancia a pesar no debe colocarse sobre los platillos, ni removerse. Para colocar el peso, debe de estar cerrado el fiel y los platillos colocados sobre los soportes. f) Si se derrama algn reactivo durante la pesada, hay que limpiar de inmediato con un pao limpio y seco. g) No manipular con los dedos, hay que utilizar las pinzas que se encuentran en la caja de pesas. h) Para mantener un ambiente libre de humedad dentro de la campana, colocar en las esquinas de la misma dos beakers (de 100 ml.) llenos de slica gel o Carbonato de Sodio. i) Los pesos mayores de 1 gr deben ser aadidos estando el brazo en posicin de reposo, pues de lo contrario se puede daar la porcin oscilante que une el platillo al brazo. El brazo siempre debe soltarse suave y lentamente. j) Se debe observar si hay una marcada oscilacin del platillo despus de soltarse el brazo, pues esto indica falta de alineacin. La alineacin debe hacerla personal capacitado. Reprtela al departamento de mantenimiento. k) La balanza debe protegerse de corrientes de aire, pues estas producen inestabilidad. Se requiere ms o menos 15 minutos con 30 segundos para que el flujo de aire cese despus de que se ha cerrado la puerta. I.6 PIPETAS AUTOMATICAS I.6.1 Descripcin del equipo El creciente aumento en las enfermedades de alto riesgo (VIH y Hepatitis B) hace necesario que el personal que trabaja en los laboratorios clnicos tome muy en serio las recomendaciones dadas por la OMS. Una de las ms importantes recomendaciones es la prohibicin de usar pipetas con la boca. Es por ello que se hace necesario el conocimiento del uso de las pipetas automticas y de las pro-pipetas (Ver figura 8).

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Figura 8. Pipetas automticas de diferentes volmenes I.6.2 Operacin del Equipo Tcnica de pipeteo para lquidos claros: a. Se presiona el botn superior suavemente hasta el primer tope. b. Se sumerge la punta, en la solucin que se necesita pipetear estando seguros que la punta este bien colocada y que no haya ningn tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta. c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solucin. d. Para descartar la solucin de la punta presione el botn hasta el segundo tope. e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas. Tcnica de pipeteo para lquidos con alta viscosidad: a. Presione el botn superior hasta el segundo tope. b. Sumerja la punta en la solucin (2-3 mm) y suelte el botn despacio. La punta tiene que estar bien llena. c. Descarte el lquido de la punta presionando suavemente el botn superior hasta el primer tope.

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I.6.3 Cuidados y Mantenimiento del Equipo a. Iniciar el da limpiando la parte externa de las pipetas de polvo o suciedad. b. Use solamente etanol al 70% para la limpieza de la pipeta. Otro tipo de solvente no es aconsejable. c. Utilizar las puntas adecuadas a las pipetas y a la cantidad de solucin que se va a medir. d. El pistn y el cilindro pueden ser chequeados al menos una vez al ao si la pipeta es usada diariamente.

EQUIPO Microscopio binocular

FALLA a) No enciende

POSIBLES SOLUCIONES -Revise que el cordn est bien conectado al toma-corriente -Remueva el foco, inspeccione visulamente si est quemado s es as reemplazelo

b) Luz parpadea c) Hongos en los lentes y S no estn muy daados limpiar con lquido a base de alcohol ter Centrfuga a) Vibracin fuerte, quiebra -Revisar patas de hule -Poner iguales todos los tapones de hule en los portamuestras -Pesar y balancear pesos de los b) Funciona muy lento portamuestras -Revisar si los electrodos de carbn estn gastados y cambiar carbones Balanza analtica No se puede calibrar -Revisar el agua de preferencia que est centrada -Centrarla con los tornillos que sirven de base tubos de ensayo prismas

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TCNICAS DE HEMATOLOGA

PRACTICA II. - HEMOGRAMA

I.

Introduccin

El hemograma es un estudio rutinario realizado para el diagnstico clnico de algunas entidades patolgicas o como medio de seguimiento de evolucin de las mismas. Los datos que aporta de manera importante es la presencia de anemia o eritrocitosis, as como la evidencia de enfermedades inflamatorias y ocasionalmente alrgicas, asi como tambin permite identificar agentes etiolgicos (Babesia spp.). Consta de partes importantes, el eritrograma (Hematocrito, eritrocitos e ndices de Wintrobe), el leucograma (Leucocitos totales y clculo diferencial) as como la evaluacin de las plaquetas y la medicin de slidos totales por refractometra. A continuacin se describen las tcnicas para obtener los distintos valores del hemograma. II. Objetivo

El discente desarrollar las habilidades necesarias para hacer un hemograma obteneniendo el hematocrito, el nmero de eritrocitos, los ndices de Wintrobe, conteo de leucocitos, as como el diferencial, para clasificar las anemias o en su caso policitemias presentes en el paciente, procesos inflamatorios y/o infecciosos, para asi tomar decisiones teraputicas sobre los pacientes.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL MICROHEMATOCRITO III. MATERIAL NECESARIO Tubos capilares Microcentrfuga Plastilina o un encendedor Sangre con EDTA o heparina

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TECNICA 1. Llenar un tubo capilar liso (75 mm x 1.0 mm), hasta 3/4 partes de su capacidad con sangre anticoagulada con EDTA o heparina, sosteniendo el tubo en una posicin casi horizontal para facilitar el llenado. a. Como una alternativa puede obtenerse sangre por puncin capilar de la oreja, la ua o dedo utilizando tubos heparinizados. 2. Limpiar el exceso de sangre del exterior del capilar. 3. El extremo capilar que tiene el anillo coloreado debe sellarse con plastilina manteniendo el capilar en posicin horizontal e introduciendo este extremo seco en la placa con el compuesto sellador en un ngulo de 90, girar el capilar ligeramente y retirar la placa. El tapn formado debe tener menos de 4 mm de longitud. a. Tambin puede ser sellado acercndolo a la flama de un mechero (o encendedor en su defecto) teniendo cuidado de no calentar la sangre. 4. Colocar el capilar en la microcentrifuga con la parte sellada hacia la periferia. Identificar bien los tubos. 5. Fijar el cabezal de la centrfuga y cerrar la tapa. 6. Centrifugar durante 5 minutos entre 12.500 y 15.000 rpm. no usar el freno para detener la centrfuga. 7. Se retiran los tubos de la centrifuga y se lee el porcentaje de hematocrito o tambin conocido como PVC (packed cell volume). Utilizando la tabla para su lectura.

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8. Se debe leer el nivel de eritrocitos centrifugados; no incluir la capa rica en leucocitos y plaquetas (buffy coat). El valor del hematocrito se calcula dividiendo la longitud de la capa de eritrocitos entre la longitud total constituida por los eritrocitos, buffy coat y plasma.

Valor de referencia Perros adultos = 0.37 0.55 L/L (37 a 55%) Cachorros perros y gatos = (4 a 6 semanas) 0.24 a 0.34 L/L (24 a 34%) Gatos adultos = 0.30 a 0.45 (30 a 45%) Estos valores son ligeramente ms bajos en hembras, y dependen de la localidad donde se evalen, por lo que se recomienda realizar tablas de referencia para valores hematolgicos. RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS MATERIAL NECESARIO Hematocitmetro Neubauer Pipeta de Thomas Tubo de hule y boquilla Sangre con EDTA Diluyente de Harem (cloruro de mercurio 0.5g, cloruro de sodio 1.0g, sulfato de sodio 5.0g, y agua destilada 200ml) solucin salina o cmara de

TCNICA 1. Se ensambla el equipo, uniendo la boquilla al tubo de hule y este a la pipeta de Thomas. 2. Mezclar la sangre. 3. Aspirar la sangre con la pipeta hasta la marca de 0.5 usando una suave succin.

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4. Se debe limpiar la sangre del exterior de la pipeta con un trozo de papel filtro. a. Si se rebasa la marca se debe ajustar eliminando el exceso de sangre con un papel filtro o un algodn, aun as pueden quedar adheridas clulas a la pipeta y la cuenta podra resultar ms alta. 5. Despus se aspira el diluyente de Harem sino tenemos utilizar solucin salina, con una succin uniforme hasta la lnea de 101 por encima del bulbo y se debe girar suavemente mientras se llena.

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6. La pipeta se retira del diluyente de forma horizontal y se tapan los orificios con los dedos, toda la sangre debe estar en el bulbo. 7. La pipeta debe agitarse por 2 o 3 en un agitador mecnico, si se hace manual debe ser formando 8s con la mueca.

Conteo de eritrocitos 1. La cmara y el cubreobjetos debern limpiarse cuidadosamente quitando la pelusa y grasa. 2. Se coloca el cubreobjetos especial con los extremos ms largos paralelos y sobre los bordes de apoyo de la cmara, manejndolo solo de los extremos ms largos paralelos y sobre los bordes de apoyo de la cmara, manejndola solo de los extremos largos. 3. Inmediatamente despus de agitada la pipeta se desechan 3 gotas y se limpia la punta de la pipeta con un algodn. 4. Con la punta de la pipeta se toca el espacio entre el cubreobjetos y la cmara dejando fluir el lquido por capilaridad, sin que se derrame por los bordes, y se retira la pipeta.

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5. Si se derrama hay que repetir este paso, previamente limpiando la cmara. 6. Se esperan 3 minutos para que sedimenten las clulas, pasado ese tiempo inicia la evaporacin. 7. Con el objetivo de 10x del microscopio se localiza el cuadro central de los 9 cuadros grandes y una distribucin homognea de las clulas. 8. Con el objetivo de 40x se deben contar los eritrocitos en 5 de los 25 cuadros pequeos del rea central. 9. Cada uno de los 5 cuadros est limitado por lneas dobles y triples y se dividen en 16 ms pequeos. a. Se cuenta iniciando a la izquierda de la fila superior de los cuatro cuadros pequeos, luego de derecha a izquierda en la siguiente fila y as sucesivamente. b. En la lnea triple: no se cuentan las clulas que toquen las lneas internas superior e izquierda. c. En la lnea doble: no se cuentan las que toquen las lneas interna inferior y derecha y si se cuentan las que toquen las lneas externas superior e izquierda.

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d. Clculo Eritrocitos/Litro= Clulas contadas 100 (0.1mm de profundidad) X 5 (1/5 de mm cuadrado) X 200 (dilucin de 1:200) Lo que es igual a 1 x10 /L la suma de las clulas contadas en los 5 cuadros = Eritrocitos / micro litro Si existe anemia marcada (Hto < 0.2 L/L) la pipeta se llena con sangre hasta la marca de 1 de la pipeta y se diluye hasta 101 y las clulas contadas se multiplican por 5000. Cuando son demasiados eritrocitos o muy grandes la sangre se extrae hasta la marca de 0.3 y se diluye hasta la marca de 101 y la dilucin que se usa en el clculo es de 1:333.
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INDICES ERITROCITARIOS Volumen globular medio (VGM) VGM= Hto (L/L) x 1000 /recuento de eritrocitos (x 10 /L) VGM= Hto (%) x 10 /recuento de eritrocitos (x 10 /L) Valores de referencia Perros adultos 60 a 77 Femtolitros (fL). Perros recin nacidos 95 a 100 fL hasta los 2 meses de edad. Gatos adultos 39 a 55 fL. Gatos recin nacidos 90 fL hasta el mes de edad.
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Concentracin media de hemoglobina globular (CMHG) CMHG (g/dL) = hemoglobina (g/dl) x 100 / Hto (%) CMHG (g/L) = hemoglobina (g/L) / Hto (L/L) Valores de referencia Los valores de las clulas normocrmicas varan de 320 a 370 g/L, de las clulas hipocrmicas son menores a 320 g/L y los de clulas hipercrmicas son mayores que 370 g/L.

RETICULOCITOS En los casos en que es diagnosticada una anemia (Hto < 0.37 L/L) es imperativo determinar si esta es regenerativa, por lo que se debe realizar un conteo de reticulocitos y calcular todos los parmetros que este conteo ofrece. MATERIAL NECESARIO Colorante (Nuevo azul de Metileno NAM, Azul de cresilo brillante) Sangre completa con EDTA Pipeta automtica

TECNICA 1. Colocar 50 microlitros de sangre en un tubo de ensayo. 2. Agregar 50 microlitros del colorante. 3. Homogenizar la mezcla y tapar el tubo. 4. Dejar reposando por 15 minutos. 5. Realizar un frotis y secarlo al aire 6. Teirlo con Wright *. inmersin. 8. Se realiza el conteo de 500 eritrocitos incluyendo reticulocitos. Se debe calcular el: a. Porcentaje relativo de reticulocitos b. El valor absoluto (n de reticulocitos real en 1 litro de sangre) c. Cuando el hematocrito esta bajo, el porcentaje de reticulocitos puede elevarse de forma artificial porque la sangre entera tiene menos eritrocitos y por lo tanto se usa un factor de correccin que considera al hematocrito normal de 0.45 L/ L 7. Enfocar con el objetivo de 10X y realizar el conteo con el objetivo 100x utilizando aceite de

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* EL FROTIS PUEDE OBSERVARSE SIN NECESIDAD DE TEIR NUEVAMENTE CON WRIGHT. Clculo % de reticulocitos = N de reticulocitos X 100 / 500 Valor absoluto de reticulocitos (reticulocitos x10 /L) = Eritrocitos totales X porcentaje de reticulocitos X 10. Si el valor es mayor a 60 x10 /L se considera una anemia regenerative. Reticulocitos corregidos= Porcentaje de reticulocitos X Hto. observado (L/L)/ Hto. Normal (0.45L/L perro; 0.35 L/L en gato). Este valor corrige para casos donde existe destruccin de eritrocitos maduros de forma aguda. ndice de produccin de reticulocitos (IPR) Representa el incremento de la produccin de eritrocitos: es decir, un IPR de 4 significa que la produccin de eritrocitos es 4 veces mayor que la tasa normal.
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IPR =

Recuento de reticulocitos (%) x valor de Hto observado (L/L) Tiempo de maduracin

Hto (L/L)

Hto (%)

Tiempo de maduracin reticulocitaria 1 1.5 2 2.5

0.45 0.35 0.25 0.15

45 35 25 15

Interpretacin: IPR < 2 = anemia no regenerativa; IPR > 2 = anemia regenerativa; IPR > 3 = sugerente a anemia hemoltica

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RECUENTO DE GLOBULOS BLANCOS MATERIAL NECESARIO Hematocitmetro o cmara de Neubauer Pipeta de Thomma para blancos Tubo de hule y boquilla Sangre con EDTA Microscopio Solucin de Turk (cido actico glacial 3ml, violeta de genciana al 1% 1ml, agua destilada c.b.p. 100 ml)

TCNICA 1. Se sigue la misma tcnica que con los eritrocitos solo que la pipeta tiene una marca de 11 por encima del bulbo.

!
2. La sangre se aspira hasta la marca del 0.5 y diluida hasta la marca de 11 con la solucin de Turk. 3. Se desechan 2 o 3 gotas de la pipeta antes de llenar la cmara. 4. Se deja 1 minuto para que los eritrocitos se lisen y que los leucocitos sedimenten. 5. Con el objetivo de 10x se cuentan las clulas de cada uno de los 4 cuadros grandes de las esquinas como se muestra en la siguiente figura.

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a. Se debe reducir la iluminacin para detectar a los leucocitos como objetos uniformes y oscuros. b. La regla de incluir y excluir las clulas es la misma que la de los eritrocitos.

Clculo Leucocitos totales /x10 /L= Clulas contadas x 0.05. Lo que es igual a 50 por la suma de las clulas contadas en los 4 cuadrados= Leucocitos totales /microlitro. Cuando se encuentran ms de 5 eritrocitos nucleados en el diferencial, la cuenta leucocitaria se debe corregir de la siguiente manera: ! Cuenta corregida = Leucocitos totales X 100 / 100 + Glbulos rojos nucleados observados.
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RECUENTO DIFERENCIAL Este conteo permite saber los porcentajes y valores absolutos de las distintas lneas de leucocitos, que permitira determinar la presencia de diferentes reacciones. MATERIAL NECESARIO Portaobjetos Cubreobjetos Tincin de Wright Sangre con EDTA

TCNICA 1. Hacer una extensin de sangre bien mezclada con sangre con anticoagulante EDTA o capilar con el mtodo de atraer y arrastrar. 2. Seque rpidamente al aire o en una corriente de aire tibio. 3. Tia el frotis con la tcnica indicada en el apartado de tinciones soluciones. 4. Formas incorrectas de extendido de frotis:

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Examen microscpico En 10x examinar calidad global del frotis, color y distribucin de clulas, la formacin de rodillos por los eritrocitos o la aglutinacin de los mismos, debe revisarse con rapidez en busca de cualquier clula anormal grande o incluso parsitos inesperados. En 40x se selecciona la zona correcta del extendido donde se debe iniciar el recuento y evaluar la morfologa celular. Para ello se selecciona el rea en la que los eritrocitos estn superpuestos de 2 a 3 pero que la mayora estn separados entre s.

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En 100x se coloca una gota de aceite de inmersin y se enfoca con este objetivo, se cuentan y clasifican 100 leucocitos y se informan como porcentajes de leucocitos (valores relativos). La morfologa de eritrocitos y plaquetas as como la estimacin de estas ltimas se hacen tambin con este.

Diferencial leucocitario Cuando el recuento leucocitario es mayor a 40.0 x 10 /L se debe realizar el conteo diferencial en 200 clulas. El barrido del frotis debe hacerse en forma de almena para lograr que la observacin sea representativa como se muestra en la figura siguiente.
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Es importante incluir los bordes laterales para incluir las clulas ms grandes como monocitos, linfocitos reactivos y clulas inmaduras.

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Tambin se informan anomalas de leucocitos, granulaciones toxicas (se informan como ligeras a marcadas o 1+ a 3+), cuerpos de Dohle, linfocitos reactivos (pueden reportarse como porcentajes o como aislados o abundantes).

La formula para convertir valores relativos en absolutos nunca debe omitirse ya que son los valores ms tiles para la interpretacin es la siguiente: Lnea celular/x10 /L= % de lnea celular contado X total de leucocitos (x10 /L)/ 100 La morfologa eritrocitaria se informa de acuerdo a las formas encontradas y adems en cantidad como ligera, moderada y abundante o en escala de 1+ a 3+
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PROTEINAS PLASMTICAS MATERIAL NECESARIO Tubo capilar Sangre con EDTA Refractmetro Tornillo calibrador (Flecha blanca)

TCNICA 1. Se realiza la tcnica para medir el microhematocrito mencionada anteriormente. 2. Una vez separados los componentes se revisa el color del plasma sobre un fondo blanco. Se pueden observar las coloraciones siguientes: amarillo plido o paja, transparente, amarillo intenso, rosado o rojizo, blanco lechoso o turbio, rosa lechoso. 3. Posteriormente el tubo capilar se rompe por encima del Buffy coat.

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4. Se depositan 1 o 2 gotas del plasma sobre el prisma del refractmetro por la parte contraria a la que se rompi el tubo capilar. 5. Se observa y se registran los niveles de protenas plasmticas en g/dl para multiplicarlos por 10 para obtener el valor en g/L. Nota: los valores pueden estar falsamente elevados en hiperlipidemia, hemlisis y/o hiperbilirrubinemia. Las protenas plasmticas y el hematocrito deben interpretarse en forma conjunta. Se tiene que calibrar antes de la lectura el refractometro, aplicando una gota de solucin buffer, ajustando el tornillo (flecha blanca), despues de la lectura se realiza la limpieza con solucion fisiologica y secar perfectamente el refractmetro.

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PRACTICA III. - PRUEBAS DE COAGULACIN I. Introduccin

La evaluacin de los tiempos de coagulacin es una prctica ideal para conocer los distintos tipos de coagulopatas que podran presentarse en la prctica clnica. Aunque no son enfermedades comunes si son situaciones que ponen en peligro la vida de los pacientes y deben ser reconocidas correctamente. II. Objetivo

El discente desarrollar las habilidades necesarias para evaluar los tiempos de coagulacin y poder diferenciar las vas afectadas de dicha coagulacin.

TIEMPO DE PROTROMBINA (PT TEST) III. MATERIAL REQUERIDO: Plasma citratado (tubo azul) Tromboplastina tisular (reactivo refrigerado) simplastin Cubetas pequeas Equipo (Trombotimer)

TCNICA El trombotimer- 1 debe ser encendido 10 minutos previos al inicio del anlisis. Centrifugar la sangre a 1500 a 2000 rpm por 3 minutos. 1. Colocar 100 microlitros de plasma citratado en 1 cubeta pequea y posicionarla en el trombotimer en el lado derecho. 2. Colocar 200 microlitros de reactivo (tromboplastina tisular- TP) en una cubeta grande y posicionarla en el trombotimer en el lado izquierdo. 3. Colocar el Baln en la cubeta con el plasma y comprimirla. 4. Eso har que el foco de LED se encienda indicando el inicio de la incubacin. El foco comenzar a parpadear cuando ya este por terminar la incubacin y se apagara cuando as sea.

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5. Cuando termine la incubacin, pasar la cubeta pequea con el plasma y el baln al orificio central (lector) e inmediatamente detener el conteo oprimiendo RESET. 6. Agregar los 200 microlitros del reactivo PT incubado en la cubeta grande a la cubeta pequea que se encuentra en el lector, posteriormente este se comprime. 7. Registrar el tiempo de coagulacin.

El porcentaje y el ndice de coagulacin es el siguiente: Tiempo de protrombina 6.3 segundos 8.1 segundos 15.9 segundos 29.4 segundos % del pool de5 animales sanos 100 % 50 % 25 % 12.5 % Interpretacin Normal Normal

GH! J*%6/

G'(+:(!I!

J5K!

J5K!

Valores de referencia Perro 7 a 10 seg. Gato 7 -12 seg.

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TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL (PTTA TEST) MATERIAL REQUERIDO: Plasma citratado (tubo azul) Reactivo refrigerado APTT Dade Actin Cloruro de Calcio refrigerado Cubetas pequeas Equipo (Trombotimer)

TECNICA Centrifugar la sangre a 1500 a 2000 rpm por 3 min. 1. Colocar 100 microlitros de plasma citratado en 1 cubeta pequea ms 100 microlitros de reactivo (APTT) y posicionarla en el trombotimer en el lado derecho. 2. Colocar 100 microlitros de Cloruro de calcio en una cubeta pequea y posicionarla en el trombotimer en orificio inferior derecho. 3. Colocar el Baln en la cubeta con el plasma y comprimirla. Eso har que el foco de LED se encienda indicando el inicio de la incubacin. El foco comenzar a parpadear cuando ya este por terminar la incubacin y se apagara cuando as sea. 4. Cuando termine la incubacin, pasar la cubeta pequea con el plasma mas el APTT y el baln al orificio central (lector) e inmediatamente detener el conteo oprimiendo RESET. 5. Agregar los 100 microlitros del cloruro de calcio incubado a la cubeta pequea que se encuentra en el lector, posteriormente este se comprime. 6. Registrar el tiempo de coagulacin. Valor Normal: < 20 segundos.

J5K!

G'(+:(!I!LGHHI!0('M2! J*%6/)! -(-'! J5K!

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Valores de referencia Perro < 11 seg Gato < 15 seg

RECUENTO PLAQUETARIO MATERIAL NECESARIO Sangre venosa con EDTA Realizarse entre los primeros 30 min a 6 hrs de colectada la muestra. Pipeta para conteo de eritrocitos Caja de petri y papel filtro Hematocitometro o cmara de neubauer normal

TECNICA 1. Con la pipeta de eritrocitos se aspira sangre capilar que fluye hasta la marca de 0.5 y se diluye hasta la marca con oxalato amnico. 2. Se mezcla durante 5 minutos, de preferencia en un rotor mecnico. 3. Se desechan las primeras 3 o 4 gotas y se llena la cmara. 4. En la caja de petri con el papel filtro hmedo sobre la tapa o bien la hoja de papel hmedo en la parte de abajo y la cmara sobre dos soportes que la separen del papel filtro hmedo, y encima la tapa de la caja de petri para evitar la entrada de detritus y basura. 5. Ah se deja reposar la cmara por 15 minutos para que las clulas sedimenten 6. Se cuentan todos los trombocitos en toda el rea rayada reservada para la cuenta de eritrocitos. Se utiliza microscopia de contraste con el aumento de 40x. 7. Deben contarse ambos lados del hematocitometro y los recuentos no deben diferir en ms de un 10% 8. Como se us una dilucin 1:100 se observa 0.1mm , el valor de trombocitos es el mismo para concentracion de x 10 /L.
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Valores de referencia Perros Gatos Trombocitopenia leve Trombocitopenia grave 200 a 575 230 a 680 100 175 < 20 x10 /L x10 /L x10 /L x10 /L en el cual puede haber signos clnicos.
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Estimacin plaquetaria 1. Se lleva a cabo sobre el frotis de sangre teido con Wright 2. Se evala el final del frotis en busca de agregados plaquetarios en caso de observarlos se seala que hay una cantidad adecuada o suficiente 3. Si no se observan estos se hace la lectura en 10 campos homogneos en el objetivo de 100x en donde se tiene una sola capa celular y se divide entre 10 para obtener un promedio y el promedio se multiplica por 20. 4. Cada plaqueta contada por campo a 100 X equivale a 20 x 10 /L plaquetas.
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Valores de referencia Perros 8 " 15 plaquetas por campo Gatos 8 " 15 plaquetas por campo

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PRUEBA DE FIBRINOGENO 1. El tiempo de trombina mide la cantidad de fibringeno funcional. 2. Mtodo de Millar. Se calienta el plasma a 56 C en un tubo capilar para microhematocrito para precipitar el fibringeno: medicin sencilla y bastante confiable del fibringeno. a. Se colecta la sangre con EDTA y se pone en un tubo de microhematocrito, se sella uno de los extremos b. Se hace girar por 5 minutos en una centrifuga de microhematocrito c. Se coloca el tubo en un bao de agua a 56 C ( 1) por 3 minutos. Asegurando se la columna de plasma quede completamente bajo la superficie del agua. d. El fibringeno precipitado queda empacado arriba de una capa amortiguada por centrifugacin, esto dura 3 minutos. e. Una vez precipitado por temperatura y centrifugado se obtiene el suero y se hace la lectura en el refractometro.

La diferencia de las proteinas plasmaticas observadas antes y despues de la incubacion es el valor de fibrinogeno en la muestra.

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PRCTICA IV. -

PRUEBAS CRUZADAS

I.

Introduccin

La anemia es una entidad clnica sumamente comn en la prctica diaria, en ocasiones esta anemia puede ser tan grave que los mecanismos compensatorios podran verse superados y por tanto poner en riesgo la vida del paciente. La transfusin sangunea es una tcnica que se lleva a cabo siempre que existe un dficit de eritrocitos que transporten suficiente cantidad de oxgeno a los tejidos. Una de sus principales desventajas es la existencia de incompatibilidades que deben ser evaluadas previamente a la administracin de sangre entre individuos, para hacer a esta prctica ms segura. No se debe transfundir a un paciente simplemente con base a un hematocrito (Hto), sino tambin tomar en cuenta la causa y si persiste la prdida de sangre, si est respondiendo al tratamiento sintomtico, etc. El funcionamiento renal, cardiaco y pulmonar tambin deben ser tomados en cuenta antes de realizar una transfusin. Cuando el Hto es menor a 0.30 L/L se encuentra deprimida la funcin ventricular, sin embargo, la extraccin de oxgeno y la presin venosa central de O2, permanecen normales hasta que se alcanza un Hto de 0.20 L/L (2, 3). El volumen sanguneo circulante (plasma + eritrocitos) normal en perros es de 85 a 90 ml/kg., y en el gato es de 65-75 ml/kg (4). II. Objetivo

El discente desarrollar las habilidades necesarias para identificar las posibles incompatibilidades sanguneas entre individuos de la misma especie, antes de realizar la transfusin sangunea. III. " " " " " " " " Material 2 Mililitros de sangre con EDTA de cada paciente (donador y receptor). Solucin salina Microscopio clnico Centrfuga clnica Laminillas Cubreobjetos Pipetas automticas 20-200 L Pipetas pasteur

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Tcnica Procedimiento para las pruebas cruzadas 1. Se deben extraer al menos 2 mililitros de sangre con EDTA de cada paciente (donador y receptor). 2. Se centrifugan las muestras a 3500 r.p.m. durante un minuto, a partir de aqu se separa el plasma. 3. Se realiza un lavado con solucin salina de los eritrocitos, se homogeinizan, se vuelve a centrifugar y se elimina el sobrenadante, esta accin se repite tres veces. 4. Del concentrado de eritrocitos de cada paciente se obtienen 20 L de eritrocitos se mezclan con 980 L de solucin salina (Eritrocitos al 2%). De ambos el receptor y el donador. 5. Prueba cruzada MAYOR Se agregan 150 L de eritrocitos del donador (solucin al 2%) a 150 L del plasma del receptor. 6. Prueba cruzada MENOR Se agregan 150 L de solucin de eritrocitos (solucin al 2%) del receptor a 150 L de plasma del donador 7. Prueba CONTROL Se agregan 150 L de eritrocitos del donador a 150 L de plasma del donador. (Figura 1). 8. Se incuban las tres preparaciones a 25 C durante 30 minutos. 9. Evaluar la presencia de hemlisis o aglutinacin, tanto macro como microscpicamente en las tres pruebas. Colocar en un portaobjetos 10 L de cada reaccin y cubreobjetos encima.

Interpretacin La aglutinacin o hemlisis indica un resultado de incompatibilidad. El desarrollo de alguna de estos fenmenos es indicativo de la presencia de anticuerpos contra uno o ms de los antgenos de superficie de los eritrocitos, tanto del donador como del receptor, por lo que se corre un alto riesgo de desarrollo de reacciones adversas post-tranfusionales.

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Eritrocitos y Plasma Receptor

Eritrocitos Y Plasma Donador

Preguntas para discusin: Cuantos tipos de sangre tiene la especie de la que se realiz la prueba? Existen anticuerpos naturales en la especie contra otros grupos sanguneos? A que pueden deberse las reacciones adversas a parte de los grupos sanguneos?

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PRCTICA V.- URIANLISIS O EXAMEN GENERAL DE ORINA

I.

Introduccin

El Urianlisis como herramienta diagnstica, permite evaluar distintos rganos y sistemas tales Como la sangre, el pncreas endocrino, el hgado y el sistema inmunolgico, as como algunas enfermedades neoplsicas y musculares. Lo anteriormente descrito indica que se deben interpretar correctamente los resultados para poder tomar decisiones diagnsticas y/o teraputicas.

II.

Objetivo

El discente desarrollar las habilidades necesarias para evaluar las alteraciones presentes en el Urianlisis que le permitirn diferenciar los orgenes de estas.

III. " " " " " "

Material 5 mililitros de orina. Tubos de ensayo Refractmetro Microscopio clnico Centrfuga clnica (1500-3000 rpm) Tiras reactivas de orina (diferentes marcas)

IV.

Tcnica

El examen de la orina est conformado por tres partes, un examen fsico, uno qumico y uno microscpico, que se realizan en ese orden. El procedimiento entiende de la obtencin de 5 mililitros de orina por diferentes tcnicas como son: Miccin espontnea Ventajas " " Fcil. No traumtico.

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Desventajas " " " " " Cistocentesis Ventajas " " " " " " " Rpida. Asptica. Sin contaminacin uretral. Fcil de realizar cuando la vejiga esta moderadamente distendida adecuadamente sujeto. Riesgo mnimo de hematuria e iatrogenia. Experiencia Desventajas Contraindicado cuando hay Trombocitopenia o la vejiga esta hiperdistendida (obstruccin del tracto urinario inferior) no est suficientemente llena. el paciente Falta de cooperacin del animal. Necesidad de evitar el residuo del final de la miccin. Riesgo de hematuria y rotura de la vejiga con la presin manual. Volumen variable. Riesgo de contaminacin fecal/muestra no adecuada para cultivo.

Cateterizacin Ventajas " " " " Sin riesgo de contaminacin Experiencia Riesgo de infeccin e iatrogenia, hematuria por lesin en la mucosa Coste del equipo y del catter desechable. Desventajas

Una vez obtenida la muestra esta debe ser vertida en un tubo de cristal nuevo o limpio que no contenga ningn tipo de aditivo. En este tubo es donde se observarn las distintas pruebas a realizar en la orina.

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EXAMEN FSICO Evaluar las caractersticas organolpticas de la orina 1. Color.- suele ser ensayo. 1. Amarilla (clara, plida, oscura) 2. Incolora 3. Caf-amarillenta o rojiza 4. Verde 5. Rojo 6. Azul 7. Lechoso 2. Olor.- (este paso suele evitarse) pero se determina por medio del olfato indirectamente al verter la muestra de orina al tubo, debe hacerse con distancia y puede reportarse: 1. Normal o caracterstico 2. Amoniacal 3. Dulce 4. Putrefacto 5. A frmacos 3. Aspecto.- hay que comparar el aspecto de la orina fresca en los perros y gatos normales, la cual suele ser transparente durante la miccin; puede presentar cierto grado de turbidez debido a factores como cristales, clulas, lpidos, etc. Puede reportarse: 1. Transparente 2. Ligeramente turbia 3. Turbia 4. Muy turbia 4. Densidad urinaria, Refraccin urinaria o Gravedad especfica.- se determina mejor utilizando un refractmetro (Fig.1), el cual tiene una escala de densidad calibrada segn el ndice de refraccin, que es lo que realmente mide. Se debe utilizar un refractmetro compensado para temperatura, el cual debe calibrarse diariamente equilibrando con agua destilada y poniendo la base a cero con el tornillo calibrador. amarilla, plido o mbar, depende de la concentracin urinaria y se debe interpretar junto con la densidad urinaria. El color se determinan al observar la orina en el tubo de

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Tcnica: " " " " " Despus de centrifugar la muestra a 1500 rpm durante 3 minutos. Con un pipeta se toma una pequea cantidad de orina fresca Colocar una(s) gota(s) sobre el prisma del refractmetro Se observa el lente del mismo y se anota la densidad observada Al terminar la lectura se limpia el prisma con un algodn humedecido con agua destilada y despus de seca con otro seco, cuidando de no rayar el prisma. Si la lectura sale de la escala, se diluye un pequeo volumen de orina con igual volumen de agua destilada, se toma la lectura de nuevo y se multiplica por 2 las ltimas cifras.

Fig. 1 Refractmetro EXAMEN QUMICO Tcnica manual: " " Realizar el examen qumico dentro de la primera hora de recolectada la orina. La muestra de orina deber depositarla en un tubo de ensayo, lo suficiente para poder introducir la tira reactiva de orina y esta se humedezca de manera correcta y completa; retirarla inmediatamente para evitar que se disuelvan los reactivos. " " " " " Al momento de sacar la tira deslice el borde de la tira contra el canto del recipiente para eliminar el exceso de orina. Mantenga la tira en una posicin horizontal para prevenir posibles mezclas de los reactivos y/o contaminar las manos con orina. Leer visualmente comparando las reas reactivas con la correspondiente escala de color de la carta adherida al frasco a los tiempos especificados ms adelante. Mantenga la tira cerca de los bloques de color y compare cuidadosamente Evitar tocar la carta de color con la tira para que no se deteriore la carta.

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Los tiempos para estas tiras son: Glucosa 30 Bilirrubina Cetonas Gravedad 45 Sangre 60 30 40 Especfica Protenas Urobilinogeno Nitrito 60 60 60 pH 60

NOTA: Estos tiempos pueden variar con la marca productora de la tira reactiva. Tcnica con el aparato: " Prender el aparato, posterior introducir el nombre del ID del operador y 2 veces el ID del paciente, al tener estos datos proceder a los siguiente. " Realizar mismo procedimiento, de colocar la muestra de orina en un tubo de ensayo " Introducir la tira reactiva lo suficiente para que se humedezca y retirar de inmediato, para evitar las complicaciones antes mencionadas. " Oprimir la opcin INICIO y colocar la tira reactiva sobre la repisa que sobre sale del aparato (hay que retirar el exceso de orina con papel de bao). Esperar los 10 segundos. " " " Se te pedir que introduzcas las caractersticas de la orina. Al tener los datos, oprimir la opcin IMPRIMIR. Es importante resaltar que para que los resultados por este equipo sean validos, debe utilizarse la marca de tiras reactivas compatible que en la mayoria de los casos es la misma marca del equipo. EXAMEN MICROSCPICO Para interpretar el sedimento urinario deber de ser de manera inmediata o bien centrifugar la muestra y recoger el sedimento para comenzar a examinarlo. Si se demora para hacer la inspeccin las clulas pueden lisarse, cambiar el pH y la precipitacin de cristales sin trascendencia.

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Tcnicas: hay dos planteamientos de la microscopia, cada uno de los cuales requiere una interpretacin diferente. T1: Microscopia directa " " Mezclar una muestra de orina reciente por inversin Poner con una pipeta una gota en un portaobjetos limpio y cubrirlo con un cubreobjetos. La gota de la orina debe ser lo suficientemente grande para ocupar toda la superficie del cubreobjetos pero no tan grande que este flote. " Explorar el portaobjetos a baja intensidad con contraste de fases o reduccin de la luz mediante cierre parcial del diafragma y moviendo el condensador hacia abajo, si no dispone de un microscopio de contraste de fases. " " Examinar primero los campos con un objetivo de 10X y posterior 40X para identificar cilindros, clulas y cristales. Formarse una impresin subjetiva de leucocitos y eritrocitos por campo.

T2: Sedimento centrifugado " En un tubo de ensayo aadir aproximadamente 5 ml de orina en un tubo de ensayo limpio y utilizar otro tubo de ensayo que contenga la misma cantidad (para equilibrar la centrifuga) y centrifugar de 1,500 a 2, 000 rpm durante 3 minutos. " " " " " Una vez centrifugado reportar la cantidad de sedimento como escaso, moderado o abundante. Se deber decantar la muestra y con una pipeta de Pasteur mezclar el sedimento y recolectar aproximadamente 0.5-1 ml del sobrenadante. Sobre un portaobjetos limpio colocar una gota de la orina y colocar encima un cubreobjetos. Examinar la muestra primero con un objetivo de 10X y posterior con 40X. Los hallazgos pueden reportarse como cantidad promedio que se observa por campo o escasos, varios y abundantes.

Interpretacin u Observaciones Examen Qumico Los resultados se deben reportar de manera cualitativa (como 1+, 2+, 3+, etc.) ya que la determinacin del color es apreciativa del tcnico y la concentracin depende de la gravedad especfica o densidad urinaria). Slo debern colocarse concentraciones aproximadas cuando se utilicen aparatos pticos para la lectura de las tiras reactivas.

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Examen Microscpico La muestra se observa en un objetivo 10X, para encontrar el plano donde hay sedimento, determinar la cantidad del sedimento y encontrar elementos de mayor tamao como cilindros y agregados celulares, se debe examinar el rea completa bajo el cubreobjetos debido a que los cilindros tienden a flotar en el extremo de cubreobjetos. Estos se reportan como el nmero medio observado en el objetivo poco aumentado. Para detectar la presencia de bacterias e identificar algunos cristales y diferenciar observado por un objetivo de muchos aumentos. Las bacterias se registran como escasas, moderas o abundantes y su morfologa (coco, bacilo, filamento, etc). tipos celulares es

necesario el objetivo 40X. las clulas epiteliales, los eritrocitos y leucocitos se reportan como nmero medio

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PRCTICA VI.VALORACIN DE LA GLUCEMIA Y SU RELACIN CON ALTERACIONES METABLICAS EN LOS INDIVIDUOS.

DETERMINACIONES BIOQUIMICAS Las determinaciones bioqumicas en nuestro laboratorio se realizan utilizando suero como principal muestra, se prefiere trabajar con suero porque este se hemoliza menos probablemente que el plasma, adems no contiene anticoagulantes los cuales pueden interferir en las determinaciones que se vayan hacer o pueden extraer el agua de las clulas sanguneas originando la dilucin de los constituyentes. Sin embargo, el plasma puede ser utilizado en las determinaciones de urea y glucosa porque no existe una diferencia muy marcada en la concentracin de estos metabolitos en los eritrocitos y en el plasma, pero la diferencia en las concentraciones de otros constituyentes es mas elevada. En nuestro laboratorio se realizan con mayor frecuencia y con fines diagnsticos las siguientes determinaciones: GLUCOSA I. Introduccin

El nivel de glucosa sangunea refleja las condiciones nutricionales, emocionales y endocrinas del sujeto. Despus de la comida aumenta hiperglucemia alimentaria en animales monogstricos, pero no en los rumiantes. Durante la excitacin aumenta probablemente como efecto de la liberacin de norepinefrina. Por esta razn es costumbre obtener la sangre de individuos post-absortivos quietos, para determinar la glucosa sangunea en ayunas. La concentracin de glucosa en los eritrocitos se aproxima a la concentracin de glucosa en plasma en la mayora de los monogstricos y rumiantes jvenes. Los eritrocitos de los equinos contienen tambin poca glucosa, la concentracin de glucosa en el plasma excede generalmente a la de glucosa en sangre en 10 a 30 mg/dL en rumiantes y caballos adultos. La concentracin de glucosa sangunea aumenta por la norepinefrina, epinefrina y glucagn, tres substancias glucogenolticas, y por los glucocorticoides que inhiben la utilizacin de la glucosa y estimulan la gluconeognesis. Tambin se elevan los valores de glucosa por diabetes mellitus asociada con hiperadrenocorticalismo, debido a una hipersecrecin de las hormonas adrenocorticales por neoplasia o superdosificacin de corticoesteroides, se asocia tambin con hipertiroidismo y convulsiones. La concentracin de glucosa disminuye por el ayuno o por el ejercicio prolongado, por el exceso de insulina ya sea por un insulinoma o por dosis altas de insulina como terapia; en toxemia, inanicin y lesiones hepticas; tambin disminuye en hipoadrenocorticalismo debido a una reduccin en la secrecin de las glndulas adrenales o a una produccin reducida de ACTH por la glndula pituitaria.

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II.

Objetivo

La medicin de la glucemia en muestras sanguneas en animales domsticos, tanto en suero como plasma y describir las diferencias encontradas III. " " " " " " Material 2 mililitros de sangre con EDTA o suero de distintas especies domsticas Tiras reactivas dextrostix Espectrofotmetro con varios canales para la medicin por qumica hmeda Tubos de reaccin de 3 ml 5 mililitros de orina. Pipetas automticas con volumen variable.

IV.

Mtodo. GOD-POD. Test color - enzimtico. Glucosa - oxidasa - peroxidasa. Principio. La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa (GOD), en cido glucnico y en perxido de hidrgeno, el cual en presencia de peroxidasa (POD), oxida el cromgeno (4-aminofenazonal/ fenol), convirtindolo en un compuesto de color rojo, el cual es cuantificado por el fotmetro del equipo. MUESTRA. Suero o plasma con EDTA. EQUIPO. QUICK LAB REACTIVOS. 1 reactivo (tampn/enzimas/cromgeno) 1-A Fenol La solucin 1 es estable a 2-8C durante 2 meses y a 15 -25C durante 2 semanas.

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CONDICIONES. El animal en lo posible debe estar en ayunas. (Mnimo 8 horas). Evitar en lo posible la fuerza en el momento de la toma de muestra, para minimizar las condiciones de estrs, que pueden alterar el metabolismo de los carbohidratos. LINEALIDAD. La linealidad del mtodo se obtiene hasta 500mg/dl. PROCEDIMIENTO Preparar fotmetro a una temperatura de 37C. Blanco Standard Muestra Solucin 1 Solucin standard Suero problema 1000 l --1000l 10l -1000l -10l

Incubar a 37C en bao de Mara por 15 min, o a temperatura ambiente por 30 min. Colocar el Blanco en la cubeta de reaccin y presionar la tecla BLANK, luego colocar el estndar y presionar la tecla CALIBRATE, por ltimo colocar la muestra y presionar la tecla ANALYSE. EXPRESION DE RESULTADOS. Los resultados para esta prueba en nuestro laboratorio, se expresan en mg/dl. Para convertirlo al sistema internacional de Unidades debe multiplicarse por 0.051 o dividirse entre 18 (mg/dL a mmol/L) V. Interpretacin u observaciones Las concentraciones de glucemia evalan indirectamente la actividad endocrina del pncreas, adrenales, hipfisis y el estado nutricional del individuo. Valores de hiperglucemia pueden indicar insuficiencia de insulina o efecto esteroidal endgeno o exgeno. Valores de hipoglucemia pueden indicar desnutricin severa, insuficiencia heptica o consumo in vitro, por lo que se recomienda interpretar los resultados a la luz de la historia clnica de cada individuo.

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PRCTICA VII.- METABOLISMO HEPTICO Y RENAL. UREA La urea es un compuesto orgnico relativamente simple producido por los mamferos en el hgado como producto final del catabolismo de las protenas. Es una de las substancias ms difusibles en el cuerpo y se encuentra en todos los lquidos del cuerpo. Es relativamente atxica, aunque en concentraciones altas desnaturaliza protenas con la formacin de productos txicos. La urea se elimina principalmente por los riones, pero una porcin de ella por la piel, sobre todo en los animales que sudan. Se ha observado que el nitrgeno ureico sanguneo no se eleva en perros, salvo pocas excepciones, hasta que al menos el 75% del rin funcional se ha destruido, y se aconseja hacer la determinacin en todos los pacientes quirrgicos de mas de 5 aos y en toda enfermedad en perros viejos antes de iniciar el tratamiento. La urea se aumenta en sangre por trastornos renales como la insuficiencia renal crnica y aguda; por obstruccin de las vas urinarias; excesiva destruccin de protenas como en estados de fiebre, toxicidad o sepsis extensa. Tambin se pueden aumentar los niveles de urea por una hemoconcentracin debida generalmente a graves vmitos o diarreas; cuando existe alteracin de la funcin cardiaca que reduce el flujo de sangre a travs del rin se ve aumentada la concentracin de urea en sangre. El descenso en los niveles de urea son raros, tericamente pueden presentarse en asociacin con graves enfermedades hepticas o malnutricin de protenas. II. Objetivo La evaluacin orgnica de los distintos sistemas es importante al interpretar los cambios clnicos observados en el paciente, la evaluacin heptica y renal son dos de las pruebas que se realizan ms frecuentemente en la clnica veterinaria. III. Material " IV. Tcnica METODO. UV a tiempo fijo. PRINCIPIO. La urea se hidroliza en presencia de ureasa, en amoniaco y dixido de carbono. El amoniaco

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producido en esta reaccin se combina con !-cetoglutarato y NADH en presencia de deshidrogenasa de glutamato, para producir glutamato y NAD. La cantidad consumida de NADH determinado por la disminucin de absorbancia en el ultra violeta es proporcional a la cantidad de urea en la muestra. MUESTRA. Suero, plasma con EDTA y orina diluida 1:50 con agua destilada. EQUIPO. QUIK LAB REACTIVOS 1 ENZIMAS/ COENZIMA/ SUBSTRATO 1 A Tampn PATRON: Urea 80mg/dl. Listo para su uso. La solucin 1 se mantiene estable durante 4 semanas de 2- 8C y durante una semana de 1525C. CONDICIONES. El animal debe tener un ayuno de 12 horas antes de la toma de muestra. Aunque la urea es estable en suero, plasma u orina durante varios das bajo refrigeracin, las muestras, especialmente la orina, debern valorarse a las pocas horas para evitar la contaminacin bacteriana, que podran provocar una perdida rpida de la urea. LINEALIDAD. En suero y plasma la linealidad del mtodo es hasta 300mg/dl y 150 g/l para la orina. Para concentraciones altas, diluir la muestra 1:2 con agua destilada, repetir la valoracin y multiplicar el resultado por 2.

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PROCEDIMIENTO. Preparar el fotmetro a una temperatura de 30C. Standard Muestra Solucin de trabajo Solucin Standard Suero problema 1000 l 10l -1000l -10l

Leer inmediatamente colocando muestra por muestra. EXPRESION DE RESULTADOS. Los valores en el laboratorio se expresan en mg/dl.

CREATININA La creatinina esta en el cuerpo principalmente en forma de fosfato de alta energa. En los msculos es fuente de energa. En animales jvenes de crecimiento se encuentra en mayores cantidades. La creatinina es una substancia muy difusible y distribuida de manera uniforme en el agua corporal. Se elimina del plasma aproximadamente en la tasa de filtracin glomerular. Al estudiar la excrecin de creatinina, tiene valor el hecho de que los niveles sricos de creatinina casi no son afectados por la creatinina exgena de los alimentos, por la edad, el sexo, el ejercicio o la dieta. Por lo tanto los niveles elevados solamente se presentan cuando se altera la funcin renal. La medicin de los niveles de creatinina en sangre proporcionan la misma informacin para el diagnstico y pronstico de la funcin renal que la obtenida por la medicin del nitrgeno ureico. MTODO. Picrato alcalino con desproteinizacin PRINCIPIO. La creatinina reacciona en un medio alcalino que no contenga protenas con picrato, para formar un compuesto rojo anaranjado (Reaccin de Jaff).

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MUESTRA. Suero o plasma. Orina: diluida: 1:50 con agua destilada EQUIPO. QUIK LAB REACTIVOS. 1 Picrato de sodio............ 44mmol/L 2 Hidrxido de sodio....... 4.0 N PATRON: Creatinina 2 mg/dl. Listo para ser utilizado. Los reactivos 1 y 2 son estables a temperatura ambiente de 15 a 25C hasta la fecha de caducidad que viene indicada en la etiqueta. CONDICIONES. No requiere ayuno previo, porque su excrecin depende muy levemente de la alimentacin y la diuresis. No debe estar el animal sometido a estrs intenso que puede ser causado en el momento de la toma de muestra, por la resistencia que el animal ejerza. LINEALIDAD. El mtodo es lineal hasta 12 mg/dl de creatinina. Para concentraciones mayores mezclar un volumen de la muestra con un volumen igual de agua destilada, repetir el ensayo y multiplicar el resultado por 2. PROCEDIMIENTO. Prepara el fotmetro a una temperatura de 30C. Standard Solucin de trabajo Solucin Standard 1000 l 100l Muestra 1000l --

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Suero problema

--

100l

Leer inmediatamente colocando muestra por muestra. Colocar la solucin standard y presionar la tecla CALIBRATE, luego colocar la muestra y presionar la tecla ANALYSE. EXPRESION DE RESULTADOS Los resultados dependiendo del tipo de muestra se expresan as: SUERO: Se expresa en mg/dl o mol/L. ORINA: Se expresa en mg/Kg de peso en 24 horas.

ALANINA AMINO TRANSFERASA TRANSAMINASA GLUTAMICA PIRUVICA (ALT-GPT) Esta enzima cataliza la transferencia de un grupo a- amino de la alanina al cido a-cetoglutarico. La enzima se encuentra en el hialoplasma de todas las clulas y existe una relacin lineal entre la GPT heptica y el peso del animal. Siendo este el caso la determinacin de GPT es casi especifica del hgado del perro y el gato, mientras que es de escaso o de ningn valor en las enfermedades de bovinos y equinos. Se ha encontrada muy elevada en la necrosis heptica. Es una enzima muy estable, y en estado de congelacin se conserva largo tiempo. La ictericia no estorba la determinacin de la enzima, pero debe evitarse la hemlisis. Las enfermedades hepticas que producen niveles elevados de GPT comprenden neoplasias malignas, cirrosis y hepatitis, incluyendo la que se produce en el perro por el virus de la hepatitis canina infecciosa (HCI)

METODO. Test cintico UV PRINCIPIO. !-cetoglutarato + L- alanina en presencia de GPT produce Lglutamato + piruvato, este a su vez NADH + H en presencia de LDH produce lactato + NAD.
+

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MUESTRA. Suero, plasma con EDTA. EQUIPO. QUIK LAB REACTIVOS. 1 Reactivo Tampn / substrato. 1 A NADH/LDH 2 a - cetoglutarato PIRIDOXAL 5-FOSFATO La solucin 1 es estable de 2-8C durante 3 meses y de 15-25C durante 1 semana. La solucin 2 es estable de 2-8C durante 4 meses y de 15-25C durante 1 mes. CONDICIONES. El animal debe tener un ayuno de 8 horas como mnimo. LINEALIDAD. Para concentraciones mayores de 265 y 271 U/L a una absorbancia de 340 y 334 nm respectivamente, realizar una dilucin 1:10. PROCEDIMIENTO Preparar el fotmetro a una temperatura de 37C. Muestra Solucin 1 Suero Problema 1000 l 100 l

Incubar en bao de Mara a 37C

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Solucin 2

100 l

Colocar a temperatura ambiente durante 30 segundos. Leer muestra por muestra, colocar la muestra en la cubeta de reaccin y presionar al tecla START. EXPRESION DE RESULTADOS Los resultados para esta prueba se expresan en U/L.

FOSFATASA ALCALINA (ALP) Esta enzima hidroliza los fosfatos orgnicos en fosfato inorgnico y la fraccin orgnica. Es una enzima muy estable y puede ser congelada con poca o ninguna prdida de actividad se halla gran cantidad en el hgado, rin, mucosa intestinal y hueso. En la mayora de los animales, quiz con excepcin del gato se elimina en su forma natural por el hgado por lo tanto cualquier obstruccin al flujo de la bilis causa aumento de la enzima en el suero. El problema es determinar la fuente de esta elevacin cuando no es patente la enfermedad heptica. Se producen elevaciones de la enzima en el suero, en enfermedades del bazo, hgado, rin, mucosa intestinal o hueso. En la obstruccin biliar se eleva notablemente, las neoplasias seas malignas causan a veces niveles elevados. Tambin se puede elevar la ALP por una mayor actividad de los osteoclastos durante el crecimiento del esqueleto, por enfermedades seas degenerativas en animales adultos, raquitismo, osteomalacia y en osteosarcoma. Durante interferencias con la excrecin heptica, debida a una destruccin de las clulas hepticas o a una destruccin del conducto biliar. Los resultados se interpretan mejor en conjuncin con los niveles de GPT, que generalmente se encuentran aumentados en estos casos. MTODO. Colorimtrico. PRINCIPIO. P-nitrofenilfosfato + H2O en presencia de fosfatasa alcalina produce fosfato + P-nitrofenol. MUESTRA. Suero o plasma heparinizado.

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EQUIPO. QUIK LAB REACTIVOS. 1 TAMPON 1 A substrato CONDICIONES. El animal debe tener un ayuno mnimo de 8 horas. LINEALIDAD El mtodo tiene una linealidad de 1492U/I, valores superiores a este realizar diluciones 1:10. PROCEDIMIENTO Preparar el fotmetro a una temperatura de 37C. Muestra Solucin 1 Suero Problema 1000 10 l l

Incubar en bao de Mara a 37C 60 segundos. Solucin 2 100 l

Colocar a temperatura ambiente durante 30 segundos. Leer muestra por muestra, colocar la muestra en la cubeta de reaccin y presionar la tecla START. ACCIONES CORRECTIVAS PARA RESULTADOS INACEPTABLES. EXPRESION DE RESULTADOS. Los resultados se expresan en U/l.

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La utilizacin del equipo depende del tcnico laboratorista preparado, por lo que se recomienda siempre leer el manual del usuario. Para corregir algunos problemas se presentan las siguientes acciones:

ACCIONES CORRECTIVAS PARA RESULTADOS INACEPTABLES. _ Calibracin del equipo.(Remitirse al manual del equipo). _ Centrifugar muestras lo ms rpido posible. _ Cambio de lote de sueros multicalibradores y reactivos, realizar nueva calibracin del equipo. _ Verificar reactivos que correspondan a la prueba pedida y evitar agotamiento de los mismos. _ Rechazar muestras hemolizadas e insuficientes. _ Muestras que no se preparan el mismo da, refrigerar a 4C. _ Confirmar la linealidad de la prueba y si es necesario realizar las diluciones respectivas. _ Asegurar el mantenimiento del equipo.

V. Interpretacin u observaciones

Incrementos en la Urea y Creatinina se asocian a estados de hiperfusin renal y posiblemente lesin activa, es importante compara estos resultados con la concentracin urinaria dada por el resultado de refractometra: densidad urinaria (ver Urianlisis).

La estructura heptica evaluada a travs de la medicin de la actividad enzimtica srica de las transaminasas y la fosfatasa alcalina permite determinar en la mayora de la especies un dao heptico.

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Prctica VIII.- Evaluacin Citolgica y de acumulacin de lquidos

I.

Introduccin

La evaluacin citolgica de los lquidos corporales, de los tejidos y de las lesiones tumorales se ha convertido en una opcin muy importante en medicina veterinaria. Sobre todo desde hace casi 20 aos. Se trata de un medio de diagnstico muy rpido, fcil de realizar, barato, con un mnimo de riesgos y que permite con frecuencia evaluar las muestras e interpretarlas antes de que el paciente se retire de la sala de examen, e identificar el proceso como neoplsico o inflamatorio. En algunos casos se pueden establecer los procedimientos indicados para llegar a un diagnstico final, como el realizar una biopsia, una evaluacin microbiolgica, un examen radiolgico, etc. Con revisiones peridicas se puede efectuar un seguimiento de la evolucin del caso, as como un control del tratamiento, determinando si ste es eficaz o se debe reemplazar por otro. En una gran proporcin de casos, la citologa permite llegar a un diagnstico final y establecer un pronstico.

Aquellos clnicos que se inician en el muestreo citolgico, frecuentemente obtienen muestras no significativas, contaminadas con sangre u otros tejidos o por microorganismos, etctera, esto disminuye el entusiasmo por el empleo de la citologa. Si no se realiza con la asepsia adecuada existe la posibilidad de que se contaminen tejidos sanos con microorganismos, o si se punciona un absceso, que se ocasionen fstulas u otros abscesos.

Una importante limitante es que en algunos casos es necesario recurrir a una biopsia para la evaluacin histolgica, ya que es prcticamente imposible distinguir un adenoma o una hiperplasia; lo mismo sucede cuando una neoplasia maligna es bien diferenciada y citolgicamente no podemos ver la estructura histolgica ni la presencia de invasin a vasos o tejidos circundantes.

II.

Objetivo

El discente desarrollar las habilidades necesarias para reconocer cuando las lesiones tumorales y en su caso lesiones susceptibles de ser muestreadas, para diferenciar eventos inflamatorios o neoplsicos.

III.

Material Jeringa de 10 ml Aguja No. 21 Laminas portaobjetos Pistola para citologa

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IV.

Tcnica Tcnicas de coleccin de muestras Existen varios tipos de preparacin de laminillas para su evaluacin. El que se emplea con mayor frecuencia en citologa es el frotis o extendido, similar al que se realiza en hematologa. Se deben emplear laminillas limpias, no melladas, sin huellas (porque la grasa hace impermeable a la laminilla e impide que se adhiera la pelcula celular a sta).

Aspiracin de lesiones con aguja fina La aspiracin es la tcnica en citologa ms usual para la obtencin de muestras de lesiones inflamatorias o neoplsicas de la mayora de tejidos, pues en general permite una muy buena conservacin de la morfologa celular y con muy poca destruccin.

Se introduce una aguja directamente en la lesin, se aplica una presin negativa de algunos cm (en general de 5 a 8), dependiendo de la consistencia de la masa: mientras ms slida, mayor presin; si es muy dura la masa se puede mantener la presin efectuando en corto un "raspado" con la aguja, para obtener mejores muestras y ms celulares. Generalmente se ejerce presin negativa jalando el mbolo dos o tres veces, se suelta y se permite que regrese a su posicin original antes de retirar la aguja de la masa, de lo contrario, la muestra pasar al barril de la jeringa y ser prcticamente imposible recuperarla. Si ejercemos demasiada presin negativa y nos esperamos hasta ver sangre en el barril, las muestras estarn muy contaminadas. Las muestras ms "limpias", es decir, con menor contaminacin sangunea, se obtienen cuando se percibe ligeramente un lquido en la base plstica de la aguja. en ese momento se debe dejar de ejercer la presin negativa. Son an mejores las muestras si el lquido celular accede solamente a la parte metlica de la aguja. Cuando la lesin cuenta con varias consistencias (dura. turgente, suave o blanda) se recomienda efectuar las aspiraciones cambiando la direccin de la aguja para obtener material del centro, de un lado, de la periferia, de las partes slidas, de las blandas, con la finalidad de conseguir una imagen completa de la lesin. En la mayora de los casos no es necesario efectuar este tipo de maniobra, ya que el tejido para las muestras en general es homogneo. Extendido (frotis) Antes de efectuar el frotis, se ensaya el deslizamiento sin tocar la muestra para detectar imperfecciones en el lavado o el borde de la laminilla en que se va a extender y poder reemplazarla cuando no deslice libremente. Se aplica en lquidos con una densidad parecida a la sangre, tambin en material de lesiones tumorales aspirado con aguja fina. La fuerza de separacin es de moderada a ligera, dependiendo del ngulo que se emplee para su confeccin. En general, debe ser de alrededor de 45 para lquidos como la sangre, >45 para lquidos poco celulares o en tejidos muy

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delicados y <45 cuando se desea mayor fuerza de separacin celular para su extendido adecuado y su cmoda evaluacin.

Sedimentacin Se coloca un cilindro (por ejemplo 0.5 mL de una jeringa), se adhiere a la laminilla con cera, asegurndose de que sea hermtico para evitar la salida de la muestra en la unin cilindro y laminilla, se coloca hasta 0.5 mL del lquido que se va a evaluar y se deja reposar 30 minutos.

Impresiones Se pueden realizar directamente de una lesin cutnea o de un rgano interno o llevarse acabo a partir de biopsias. En las biopsias, las impresiones se realizan con una porcin del tejido de inters de una dimensin 3 no mayor de 1 cm , se toma con las pinzas de diseccin y se hacen unas impresiones sobre papel absorbente para eliminar el exceso de lquido y que exista mayor poder de adhesin de las clulas al vidrio de la laminilla.

Se hacen impresiones en secuencia en el papel, cada vez es menor la cantidad de lquido que se desprende, hasta que se encuentra casi seco siguiendo la direccin de las flechas.

Raspados Se realizan en lesiones duras, con una hoja de bistur para obtener mayor nmero de clulas. El raspado se efecta con ligeros movimientos en corto hasta obtener una pasta celular.

Posteriormente se lleva a cabo la extensin de esa "pasta celular", con delicadeza para evitar un destrozo celular.

Hisopados Esta tcnica est reservada para lesiones fistulosas o para rganos tubulares como vagina. tero, canal auditivo, fosas nasales; inclusive se ha llegado a emplear en muestreos de trquea bajo una tcnica particular. Se verifica que el hisopo estril de algodn est bien adherido al palillo para evitar que se quede por accidente dentro de la luz del rgano que se est muestreando, posteriormente se introduce y se gira suavemente para descamar clulas del epitelio o canal, se retira y se deposita

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sobre la laminilla, se ejerce una ligera presin con el ndice y se rueda hasta el otro extremo, se puede efectuar hasta 3 veces sobre la misma laminilla.

LQUIDOS SINOVIALES, CEFALORRAQUDEOS Y DE LAVADOS Estos tipos de lquidos son habitualmente poco celulares: para su evaluacin se requiere de un mtodo de concentracin eficaz, que no afecte la morfologa celular.

La citocentrifugacin es el mtodo de eleccin empleado para los diferentes tipos de lquidos, a excepcin de los que se encuentran muy turbios o viscosos. La ventaja es que puede concentrar las clulas en un rea aproximada a la de un confeti, todos los elementos formados (clulas, microorganismos, cuerpos extraos, etc.) que se encuentren en 0.3 a 0.5 ml de muestras, se encontrarn en el "confeti celular", por lo tanto, la evaluacin citolgica completa se lleva a cabo en unos minutos.

V.

Interpretacin u Observaciones

La evaluacin precisa de lesiones en el laboratorio requiere de una descripcin apropiada, la ubicacin anatmica, un muestreo con la tcnica adecuada para el tipo de lesin y finalmente de una proteccin de esas muestras para que lleguen a su destino en buenas condiciones.

Es necesario incluir la resea del animal (especie, raza, gnero, edad), ya que ciertas neoplasias no se encuentran en todas las especies o son particulares para una de ellas. Tambin es importante conocer la raza, ya que algunas son ms propensas que otras a ciertos tumores; lo mismo ocurre con el gnero y la edad.

El objetivo principal de la evaluacin citolgica es determinar si las lesiones son Inflamatorias, degenerativas o neoplsicas; para ello se requiere conocer las diferentes clasificaciones y los criterios para una interpretacin apropiada.

Clasificacin de la inflamacin segn el tipo celular a) Neutroflica. Con valores de los neutrfilos superiores a 85%.

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b) Neutroflica-Macrofgica. Cuando hay predominio de los neutrfilos y se acompaan con valores de 30-50% de macrfagos. c) Macrofgica. Cuando hay predominio de macrfagos y en presencia de clulas epitelioides o de clulas gigantes. d) Eosinoflica. Cuando se observa una cantidad superior a 20% de eosinfilos o de 5% de mastocitos.

Clasificacin de la inflamacin en cuanto a la presencia o no de microorganismos a) Sptica. Cuando se observen bacterias intracelulares o, en su defecto, cuando no se observen microorganismos, los neutrfilos deben presentar diferentes grados de degeneracin rpida (por toxinas) como la degeneracin hidrpica nuclear, vacuolacin de citoplasma o la cariolisis (es decir, la destruccin del ncleo). b) No sptica. Cuando la muerte de los neutrfilos ocurre en forma lenta (muerte natural) donde se observan los ncleos de los neutrfilos en picnosis o en cariorrexis (picnosis de cada lbulo).

Caractersticas clnicas de las lesiones neoplsicas Clasificacin de las neoplasias a) Epiteliales. Las muestras en estos casos suelen ser bastante celulares. Estas clulas se distinguen por ser polidricas, son angulares cuando estn bien diferenciadas y pueden encontrarse en forma individual o en sbanas o en ambas. Pueden ser epiteliales: papilomas.si son benignas o carcinomas, si son malignas; o glandulares: adenomas o adenocarcinomas, si son benignas o malignas, respectivamente. Las clulas glandulares en general muestran una fragilidad del citoplasma superior a las otras clulas, el citoplasma se encuentra en cantidad de moderada a abundante y con frecuencia se observan ncleos desnudos. En ocasiones se aprecia en el citoplasma material de secrecin. Asimismo, pueden encontrarse clulas con el ncleo excntrico y oprimido por la gran cantidad de material de secrecin.

b) Mesenquimatosas. En general la celularidad suele ser muy escasa, por lo tanto, de mayor dificultad para la evaluacin. Las clulas se presentan comnmente en forma individual y se caracterizan por ser fusiformes, en general, y tener una membrana citoplsmica no aparente. El ncleo es principalmente cntrico ovalado o fusiforme.Ejemplos de estos tumores son los benignos, con el sufijo oma, y los malignos.con el sufijo sarcoma (osteoma, osteosarcoma; condroma, condrosarcoma; fibroma, fibrosarcoma; hemangioma, hemangiosarcoma).

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c) Clulas redondas. Este tipo de tumores presenta, por lo general, muestras con una celularidad elevada, la forma es redonda como su clasificacin lo dice. Este tipo de clulas se caracteriza por tener una membrana citoplsmica evidente, el citoplasma en cantidad moderada y un ncleo redondo generalmente cntrico. Como ejemplos de tumores de clulas redondas estn los histiocitomas, melanomas, tumores venreos transmisibles, mastocitomas, linfosarcomas y sarcomas de plasmocitos (mielomas mltiples).

Criterios de malignidad Existen criterios generales de malignidad como la anisocitosis, macrocitosis, la hipercelularidad y el pleomorfismo, que no tienen gran peso en la interpretacin final, al igual que los criterios de malignidad del citoplasma como la basofilia, vacuolacin y la membrana citoplsmica ms espesa.

Los criterios de importancia capital en la interpretacin son los nucleares y los nucleolares, los ltimos tienen mayor peso en la designacin final.

Criterios de malignidad nucleares y nucleolares a) Macrocariosis. Es la presencia de ncleos de mayor dimensin que los de la estirpe celular normal. b) Anisocariosis. Ncleos de diferente tamao. e) Relacin ncleo/citoplasma. Aumentado por incremento del tamao nuclear. el) Multinucleacin. Clulas que presentan dos o ms ncleos. Criterio ms importante si la misma clula presenta, adems, anisocariosis. e) ndice mittico. Elevado. En general no se observan clulas en mitosis. f) Mitosis anormales. Criterio de mucho peso para la designacin de maligno. g) Cromatina granular gruesa, en cordones o en terrones. Indica alta actividad o capacidad mittica de las clulas. h) Anisonucleolosis. Nuclolos de diferente tamao. i) Macronucleolosis. Cuando los nuclolos son mayores que un eritrocito (>5Jlm). j) Numero diferente de nuclolos k) Nuclolos angulares

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ANEXOS

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V. ACTUALIZACIN Manual de Prcticas de Laboratorio de Inmunologa. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autnoma del Estado de Mxico. Toluca, Mxico; 25de febrerode 2013. Primera Edicin

Director: Dr. en C. Jos Mauro Victoria Mora Elabor: M en C. Lemuel Len Lara Revis:

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