Caracterizao imunofenotpica das subpopulaes de linfcitos do lavado broncoalveolar de pacientes com silicose ARTIGO ORIGINAL

Caracterizao imunofenotpica das subpopulaes de linfcitos do lavado broncoalveolar de pacientes com silicose*
NGELA F ERREIRA 1, J OSE DA S I LVA M OREIRA 2, R EGINA C AETANO 3, J OS M ANOEL G ABETTO 4, T HEREZA Q UIRICO -S ANTOS 5

A lavagem broncoalveolar um procedimento simples e seguro, na avaliao das pneumopatias relacionadas exposio a poeiras minerais. O objetivo do estudo foi caracterizar as subpopulaes celulares no lavado broncoalveolar (LBA) de pacientes silicticos. A lavagem broncoalveolar foi realizada em 26 trabalhadores com diferentes formas de silicose: forma simples (n = 12), complicada (n = 13) e um paciente com a forma aguda da doena. Como grupo controle, foram includos sete indivduos sadios. Os pacientes com silicose apresentaram intensa pleocitose com predomnio de macrfagos alveolares e tendncia linfocitose. As subpopulaes de linfcitos presentes no lavado broncoalveolar (LBA) dos indivduos sadios apresentaram fentipo de clulas maduras. A grande maioria era constituda por clulas CD2+TCR (87,3%) e somente 2,9% das clulas T apresentaram marcao CD2+TCR. A relao CD4/CD8 foi de 1,8, com poucas (16%) clulas T imaturas duplo-negativas CD4CD8. Em contraste, pacientes com silicose apresentaram reduo acentuada das subpopulaes dos linfcitos maduros CD2+CD4+, CD2+CD8+ e aumento marcante (47%) de clulas imaturas (DN) duplo-negativas (CD4CD8). No foi observado aumento das clulas NK (CD56+). A anlise do contedo protico e a determinao da relao Ig/albumina permitiram caracterizar produo local de imunoglobulinas no microambiente pulmonar. Como no foi observado aumento percentual de plasmcitos e linfcitos B (CD19+) no LBA desses pacientes, possvel concluir que as clulas produtoras de imunoglobulinas esto possivelmente localizadas no interstcio pulmonar. Estes resultados sugerem que, durante a evoluo da silicose, ocorre o desenvolvimento de linfopoese extratmica e surgimento de rgo linfide tercirio, no microambiente pulmonar desses pacientes. ( J Pneumol 2000;26(3):107-112)

Phenotypic characterization of lymphocyte subsets in bronchoalveolar lavage of patients with silicosis

Bronchoalveolar lavage is a safe and simple technique to evaluate lung disease related to exposure to mineral dusts. The aim of this study was to characterize the lymphocyte subsets in bronchoalveolar lavage of patients with silicosis. Bronchoalveolar lavage was carried out in 26 workers with different forms of silicosis: simple form (n = 12), complicated (n = 13) and 1 patient with acute form of the disease. As a control group, 7 healthy individuals were included. Compared to the control group, silicotic patients showed intense pleocytosis constituted mainly by alveolar macrophages with slight lymphocytosis. Lymphocyte subsets present in the bronchoalveolar fluid (BAL ) of normal individuals were mature lymphocytes with phenotype CD2 +TCR (87.3%) and only 2.9% were CD2 +TCR . CD4 /CD8 ratio was 1.8 with few (16%) immature double negative T cells subsets (CD4 CD8 ). In contrast, silicotic patients showed reduction of the more mature lymphocyte

Departamentos de Medicina Clnica, Patologia, Radiologia e Biologia Celular e Molecular da Universidade Federal Fluminense, Rio de Janeiro, e Curso de Ps-Graduao em Medicina: Pneumologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil. Suporte financeiro: CAPES. 1 . Prof. Adjunto do Departamento de Medicina Clnica da UFF. 2 . Coordenador do Curso de Ps-Graduao em Medicina: Pneumologia da UFRGS. 3 . Chefe do Laboratrio de Hematologia do Hospital Universitrio Antnio Pedro.
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4 . Prof. Titular do Departamento de Radiologia da UFF. 5 . Prof. Titular do Departamento de Biologia Celular e Molecular da U F F. Endereo para correspondncia ngela Santos Ferreira, Rua Marqus de Paran, 303 7 andar 24030-120 Niteri, RJ. Fax (21) 719-0951; E-mail: nani@ax.ibase.org.br Recebido para publicao em 22/7/99. Reapresentado em 26/10/99. Aprovado, aps reviso, em 4/1/00.

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subset CD2 +CD4 +, CD2 +CD8 + and a great increase (47%) of immature ( CD4 CD8 ) T cell subsets. No increase in the NK (CD56 +) cell population was observed. Biochemical analysis of protein contents and determination of the Ig/albumin ratio characterized local immunoglobulin production within the pulmonary microenvironment. Furthermore, lack of increase of plasma cells, as well as the maintenance of the percentage of B lymphocyte population (CD19+) in the BAL of silicotic patients, favors the hypothesis that the cells responsible for Ig production are possibly located in the interstitial space. Altogether the results suggest development of lymphopoiesis and tertiary lymphoid tissue within the pulmonary microenvironment during the clinical course of silicosis.
Descritores lavagem broncoalveolar, subpopulaes de linfcitos, silicose, imunofenotipagem Key words bronchoalveolar lavage, lymphocyte subsets, silicosis, immunophenotyping Siglas e abreviaturas utilizadas neste trabalho LBA lavado broncoalveolar FCS soro fetal bovino PBS tampo fosfato-salina BALT sistema linfide associado ao brnquio FITC isotiacianato de fluorescena RD rodamina TCR receptor de antgeno de linfcito T

INTRODUO
A silicose tem sido descrita como doena pulmonar ocupacional crnica causada pela exposio a partculas de slica cristalina(1). Formas mais graves da doena, muitas vezes fatais, esto geralmente relacionadas a certos tipos de ocupao em que h elevada concentrao de partculas de slica livre no ambiente de trabalho(2). Na orla da baa da Guanabara, no Estado do Rio de Janeiro, existem inmeros estaleiros cujos jateadores de areia, encarregados da limpeza dos cascos de navios, esto expostos a altas concentraes de poeira mineral. Esses trabalhadores desenvolvem, na faixa etria de maior produtividade, formas graves da doena, que acabam incapacitando o indivduo para atividades profissionais, vida familiar e social(3,4). A presena de grupos de radicais reativos nos planos de clivagem na slica recm-fraturada parece conferir maior toxicidade a esta. Isto, de certa forma, explicaria a alta patogenicidade da doena nos jateadores de areia(5). Ainda so obscuros os mecanismos celulares envolvidos no processo de inflamao e fibrognese, no microambiente pulmonar. Estudos com lavado broncoalveolar (LBA) obtido de animais e pacientes com doena relacionada exposio slica indicam que os macrfagos alveolares so importantes mediadores da fibrose, participando ativamente na fagocitose e, provavelmente, na liberao de fatores quimiotticos para outras clulas. A interao entre as populaes de linfcitos e macrfagos, via elaborao de mediadores (e.g.: citocinas, quimiocinas), expresso de integrinas e induo de adressinas, promove maior interao com clulas endoteliais, epiteliais e fibroblastos, influenciando a patognese da injria e regenerao, em resposta slica(6). A presena de linfcitos circundando as leses granulomatosas na silicose humana conhecida h bastante tempo, mas no o fentipo nem os mecanismos implicados no recrutamento das clulas envolvidas na patognese da leso. Estudos realizados por diferentes grupos, utilizando

modelo animal(7-9) e indivduos com silicose(10-12), mostram resultados contraditrios, na caracterizao imunofenotpica das clulas presentes no lavado broncoalveolar. Este trabalho teve por objetivo realizar a caracterizao imunofenotpica das populaes celulares presentes no lavado broncoalveolar de trabalhadores portadores de silicose com diversas formas clnicas da doena.

P ACIENTES

E MTODOS

Foram includos neste estudo 26 trabalhadores portadores de silicose, em acompanhamento clnico mensal, no ambulatrio de pneumopatias ocupacionais do Hospital Universitrio Antnio Pedro (HUAP ) da Universidade Federal Fluminense (UFF). Todos os pacientes eram do sexo masculino, com mdia de idade de 44,3 anos (21-62 anos) e predomnio (65,4%) da cor branca. A maioria (76,9%) dos doentes silicticos era de jateadores de areia e trabalhava num dos estaleiros situados na orla da baa da Guanabara. O tempo de exposio poeira de slica variou de 3 a 28 anos, com mdia de 16,2 anos. Doze pacientes (46,2%) desenvolveram a doena, em at 15 anos de exposio, sendo que o mais jovem (21 anos), com apenas trs anos de exposio poeira, desenvolveu a forma aguda e mais grave da doena. O diagnstico de silicose foi baseado na histria ocupacional de exposio slica e na radiografia de trax, apresentando alteraes compatveis com a doena(13). De acordo com as alteraes radiolgicas do trax, os pacientes foram assim agrupados: grupo 1 pacientes com silicose simples, apresentando pequenas opacidades no parnquima pulmonar; grupo 2 pacientes com silicose complicada, caracterizada pela presena de grandes opacidades no parnquima pulmonar. Tambm foi includo no estudo um paciente com silicose
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aguda, com comprometimento alveolar consolidativo radiografia de trax. Sete voluntrios sadios do sexo masculino, moradores na regio do Grande Rio, foram selecionados como grupo controle, segundo os critrios de Ettensohn et al.(14), com mdia de idade de 32,4 anos (25 a 42 anos), sendo cinco indivduos brancos e dois pretos. Todos os indivduos includos no estudo deram seu consentimento por escrito para participar no projeto aprovado pelo comit de tica do Hospital Universitrio da UFF.

LAVAGEM

B R O N C O A LV E O L A R

As broncofibroscopias foram sistematicamente realizadas pelo mesmo profissional. O broncofibroscpio (Pentax BF 18X, Japo) foi cuidadosamente introduzido pela cavidade oral e fixado no segmento ou subsegmento do lobo mdio ou lngula, nos casos de comprometimento difuso radiografia de trax ou na rea em que a doena era mais proeminente. A lavagem foi realizada com a infuso de 100ml (cinco volumes de 20ml) de soluo salina estril atravs do canal do broncofibroscpio. O lquido de lavagem, cuidadosamente aspirado por suco manual, foi coletado em tubos de polipropileno, acondicionados em banho de gelo.

marcador das subpopulaes de linfcitos T CD4+ auxiliar/efetor e dos linfcitos CD8+ citotxico/supressor; NK1RD : marcador de clulas NK CD56 +; TiGamma A.1-FITC : marcador da cadeia do TCR dos linfcitos T. Aps incubao com o anticorpo, as clulas foram lavadas trs vezes com PBS-2% FCS gelado e o boto ressuspenso em fixador PBS-formol contendo 0,05% de azida sdica. A anlise da fluorescncia, na superfcie de pelo menos 104 clulas, foi determinada utilizando-se o programa LYSYS II verso 1.0 11/90, no citmetro de fluxo (Scalibur , Becton Dickinson, San Jose, EUA ), com laser de argnio ajustado para 488nm, correspondendo faixa de emisso de eltrons dos fluorocromos FITC e RD. As clulas mortas foram excludas da anlise, tendo como base o ajuste fino do feixe de luz.

A NLISE

DAS PROTENAS DO LBA

PROCESSAMENTO

D O LBA

O sobrenadante foi filtrado em membranas MSI (Ultrafuge filter, Westboro, MA, EUA), em centrfuga refrigerada (spin VI, Incibrs, So Paulo, Brasil) a 400xg, durante 10 minutos, visando excluir protenas de peso molecular menor que 10kDa. As protenas totais foram determinadas pelo mtodo de Lowry modificado(15) e a albumina e imunoglobulinas IgG e IgA, por nefelometria (Behring Hoechst, Alemanha).

Aps medida do volume total do LBA, 20ml do lquido foram filtrados em gaze estril e o restante processado para pesquisa de bacilos lcool-acidorresistentes, fungos, clulas neoplsicas e pesquisa de cristais de slica. O filtrado, distribudo em tubos Falcon (Becton Dickinson Labware, Nova Jersei, EUA) de fundo cnico, foi centrifugado a 200xg, durante 10 minutos, em centrfuga refrigerada de bancada (spin VI, Incibrs, So Paulo, Brasil). O sobrenadante foi estocado a 80 C. O boto celular foi ressuspenso em PBS (tampo fosfato-salina), pH 7,2, contendo 2% de soro fetal bovino (Cultilab, So Paulo, Brasil), a celularidade total determinada em cmara de Neubauer e a viabilidade celular verificada pelo teste de excluso, com azul tripan. A concentrao final foi ajustada para 2 x 106 clulas/ml e a contagem diferencial realizada em preparaes de citocentrfuga (Shandon Cytospin 2, Japo) coradas pelo Wright-Giemsa. Foram contadas pelo menos 200 clulas, no sendo enumeradas clulas epiteliais e eritrcitos.

A NLISE

ESTATSTICA

Os resultados expressos como mdia aritmtica desvio padro (DP) foram analisados pelo teste t de Student; quando os dados apresentaram varincia no homognea, empregou-se o teste no paramtrico de Mann-Whitney para verificar diferena entre os grupos. Os resultados foram considerados significantes para o nvel de 5% de probabilidade (p < 0,05).

RESULTADOS
A lavagem broncoalveolar foi realizada no segmento medial do lobo mdio, em 25 pacientes que apresentavam leso difusa radiografia simples do trax e nos sete controles. Apenas no paciente com silicose aguda, foi lavado o segmento anterior do lobo inferior direito do pulmo, por ser o local onde as leses predominavam. A broncoscopia foi inteiramente normal nos pacientes e indivduos controles, no havendo nenhuma intercorrncia durante o exame. Somente dois pacientes apresentaram, aps a broncoscopia, febre acima de 37,5 C, que cedeu com uso de antitrmicos. Aps infuso de 100ml de soluo salina estril, no se observou diferena estatstica na mdia do volume de lquido recuperado entre grupo controle e pacientes silicticos. A viabilidade das clulas do LBA estava dentro dos limites aceitveis (86 a 100%) para estudos in vitro de funcionalidade celular. Os pacientes silicticos apresenta-

CARACTERIZAO

IMUNOFENOTPICA

POR CITOMETRIA DE FLUXO

Um milho (106) de clulas do LBA em PBS-2% FCS foram incubadas por 45min a 4 C, com a concentrao tima do anticorpo monoclonal conjugado a diferentes fluorocromos (Coulter, Miami, EUA ): T11-RD1 (rodamina)/ B1FITC (isotiacianato de fluorescena): marcador das populaes de linfcitos pan-T e linfcitos pan-B; T4-RD1/T8-FITC:
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ram, em relao ao grupo controle, um aumento significativo (p < 0,05) do nmero total de clulas no LBA (Tabela 1). No foi observada diferena entre as mdias apresentadas pelos pacientes com silicose simples e complicada. Tambm no se observou (Tabela 1) diferena significativa (p > 0,05) nos percentuais das clulas recuperadas, entre os indivduos do grupo controle e silicticos nem intergrupos (simples e complicada). O percentual de macrfagos no LBA do grupo controle foi superior, observando-se nos pacientes silicticos uma tendncia linfocitose. O paciente com silicose aguda apresentou acentuada pleocitose (125 x 106) com 27% de linfcitos no LBA.

I MUNOFENOTIPAGEM

DAS CLULAS DO LBA

Os indivduos sadios apresentaram perfil de imunomarcao das clulas do LBA, semelhante ao descrito na literatura(16,17). Na Tabela 2, so apresentados os valores percentuais obtidos na anlise por citometria de fluxo das subpopulaes de clulas no aderentes, presentes no LBA do grupo controle, dos pacientes com silicose simples, complicada e do paciente com silicose aguda. Os indivduos sadios apresentaram relao CD4/CD8 de 1,8, mostrando haver no LBA um predomnio de clulas CD4+ (48,9%) com percentual menor de clulas CD8+ (34,1%) e raros linfcitos B ( CD19 +). O valor percentual mdio das clulas NK
TABELA 1 Variveis do lavado broncoalveolar de pacientes silicticos Variveis Vrec (ml) Viab (%) Total cels x 106 Cels/ml x 103 Macrfagos % Linfcitos % Neutrfilos % Eosinfilos % Controle* (n = 7) 63,3 98,6 27,4 433,4 91,1 8,4 0,4 0 Simples* (n = 12) Complicada* (n = 13) 0.58,4 0.95,4 0.63,5 1.052,9 0.85,7 .11,0 0.2,3 0.0,2 10,3 3,40 41,9 660,6 10,9 4,1 5,1 0,4 Aguda (n = 1) 39 97 125 3.270 70 27 3 0

(CD56) com atividade citotxica natural foi de 7,3%, enquanto 16% eram linfcitos imaturos (DN) duplo-negativos para CD4 e CD8. O painel de anticorpos monoclonais utilizados permite inferir que a populao predominante de clulas no-aderentes no LBA de indivduos sadios apresenta o fentipo CD2 (87,3%), TCR, j que poucas clulas (2,9%) apresentaram marcao com anticorpo monoclonal anti-TCR. Em contraste, os pacientes silicticos apresentaram reduo significativa das subpopulaes de linfcitos CD2 (p < 0,01), CD4 + (p < 0,05) e CD8 + (p < 0,05), porm um aumento significativo (p < 0,01) das clulas duplo-negativas CD4CD8. No houve diferena significativa na imunofenotipagem das subpopulaes de linfcitos do LBA de pacientes com silicose simples e complicada. O paciente com silicose aguda apresentou um aumento acentuado de clulas imaturas duplo-negativas DN (CD4CD8), correspondendo subpopulao predominante no LBA deste paciente. No foi observada diferena significativa em relao s populaes de clulas NK e linfcitos TCR , quando se comparou o grupo de silicticos com o grupo controle.

A NLISE

DO CONTEDO PROTICO DO LBA

0.59,5 10,0 8,40 1,50 0.93,4 3,20 17,5 0.61,7 34,2 244,1 1.019,2 493,2 7,00 0.84,8 11,4 6,6 0.11,2 11,7 0.1,7 2,9 0,7 0.2,2 4,9

* Resultados expressos em mdia aritmtica desvio padro. Vrec. = Volume recuperado. Viab. = Viabilidade.

TABELA 2 Caracterizao imunofenotpica realizada por citometria de fluxo das populaes celulares do LBA dos pacientes silicticos Subpopulaes (%) T CD2 B CD19 CD4 CD8 DN CD4 CD8 NK CD56 TCR Controle* (n = 7) 87,3 1,1 48,9 34,1 16,0 7,3 2,9 6,30 0,6 13,7 12,1 4,70 2,2 2,3 Simples* (n = 12) 47,2 0,9 24,6 19,7 53,1 9,9 3,3 23,2 0,6 13,7 14,8 23,3 6,4 4,5 Complicada* Aguda (n = 13) (n = 1) 60,4 1,3 36,9 20,4 41,2 9,1 2,3 26,4 1,6 22,4 11,9 26,4 7,4 3,4 10,1 00,1 02,6 06,3 90,8 ND 02,1

No foi observada (Tabela 3) diferena significativa no contedo protico e na concentrao de albumina no LBA, entre os indivduos do grupo controle e pacientes silicticos nem intergrupos (simples e complicada). O paciente com silicose aguda apresentou aumento aproximadamente cinco vezes maior (510,0mg/L) que o grupo controle (110,0mg/L), na concentrao de protenas totais no LBA. Os pacientes com silicose complicada apresentaram valores de albumina superiores queles com silicose simples, sugerindo leso mais extensa da membrana alvolo-capilar. Essas alteraes foram ainda mais acentuadas no paciente com silicose aguda. Na Tabela 4, so apresentados os resultados da determinao, por nefelometria, das imunoglobulinas IgG e IgA presentes no microambiente pulmonar de indivduos sadios e pacientes com silicose simples, complicada e aguda. Os valores encontrados no grupo controle para IgG, IgA e os ndices da relao IgG/albumina e IgA/albumina esto dentro da faixa da normalidade. Pacientes com silicose apresentaram, em relao ao grupo controle, auTABELA 3 Determinao do contedo protico no LBA de pacientes com silicose Protena total mg/L Controle* Simples* Complicada* Aguda 110,0 44 140,0 60 140,0 50 510,0 Albumina mg/L 49,4 19,0 51,05 21,82 60,07 27,76 81,93

* Resultados expressos em mdia aritmtica desvio padro.

* Resultados expressos em mdia aritmtica desvio padro.

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TABELA 4 Determinao de IgG e IgA no LBA de pacientes com silicose Controle* IgG (mg/L) IgA (mg/L) IgG/Albumina IgA/Albumina 12,3 5,9 0,25 0,13 Simples* Complicada* Aguda 28,1 10,4 0,56 0,20 11,5 3,50 0,27 0,09 274,0 038,0 03,34 00,46

8,10 23,5 17,7 1,9 11,9 6,40 0,07 0,35 0,10 0,04 0,23 0,08

* Resultados expressos em mdia aritmtica desvio padro.

mento acentuado (p < 0,01) no contedo local de IgG e IgA, no LBA, no sendo, porm, observada diferena significativa entre os grupos de pacientes com silicose simples e complicada. O paciente com silicose aguda apresentou um aumento marcante de IgG (274,0mg/L) e IgA (38,0mg/L), no LBA , correspondendo, respectivamente, a vinte e duas e seis vezes o valor de referncia do grupo controle.

DISCUSSO
A lavagem broncoalveolar recolhe amostra da superfcie alveolar, possibilitando uma anlise dinmica do microambiente pulmonar. Em muitas doenas pulmonares, as alteraes decorrentes do processo patolgico no se refletem no sangue perifrico. A importncia do LBA inquestionvel nos estudos de pesquisa clnica, sendo, no entanto, importante a padronizao metodolgica para obteno de resultados consistentes e confiveis. As principais controvrsias referemse ao volume instilado, ao nmero de locais lavados, utilizao ou no da primeira amostra, determinao da celularidade e contagem diferencial das clulas no LBA(1820) . Os relatos contraditrios referentes s alteraes na celularidade do LBA em pacientes com silicose podem ser, em parte, atribudos: i) anlise em diferentes estgios da doena; ii) ao pequeno nmero de pacientes avaliados; e iii) falta de padronizao das tcnicas usadas no recolhimento e anlise das amostras(21,22). Nas pessoas cronicamente expostas slica, o LBA caracterizado pelo aumento de clulas inflamatrias eventualmente acompanhado de linfocitose(23-26). Nos pacientes silicticos includos no presente estudo, observou-se aumento significativo (p < 0,01) na celularidade total do LBA em relao ao grupo controle, com tendncia elevao do percentual de linfcitos, embora no tenha sido observada diferena na celularidade do LBA dos pacientes com silicose simples e complicada. Entretanto, o paciente com silicose aguda com extensa injria pulmonar apresentava pleocitose com linfocitose de 27%. De modo semelhante, Bgin et al.(27), em estudo realizado com trabalhadores da indstria de granito, tambm no observaram diferena significativa na celularidade do LBA, quando comJ Pneumol 26(3) mai-jun de 2000

pararam grupos de pacientes com silicose simples e complicada. Em indivduos normais, as subpopulaes celulares de linfcitos encontradas nas estruturas alveolares so semelhantes quelas do sangue perifrico(16,17). A maioria dos linfcitos T recuperados no LBA ou de bipsias brnquicas expressa TCR (28) . No presente estudo, o percentual (2,86%) de clulas TCR encontradas no LBA dos indivduos sadios est de acordo (1-5%) com o descrito na literatura(29,30). Os pacientes silicticos apresentaram valores semelhantes, sendo encontrado, independentemente do tipo de silicose, percentual mdio 2,51% de linfcitos TCR , no LBA . As clulas TCR parecem desempenhar, na mucosa, um papel importante na resposta imune contra patgenos microbianos intracelulares e na induo da tolerncia a antgenos inalados e/ou ingeridos(31,32). A realizao de dupla marcao permitiu evidenciar, no LBA do grupo controle e de pacientes com silicose, as populaes de linfcitos T imaturos: duplo-positivas (CD4+CD8+) e duplo-negativas (CD4CD8). Os pacientes silicticos apresentaram, em relao ao grupo controle de indivduos sadios, uma reduo significativa das subpopulaes de linfcitos T maduros com fentipo CD2 +CD4 +, CD2 +CD8 + e aumento do percentual das clulas imaturas duplo-negativas CD4 CD8 . Estas alteraes foram mais acentuadas no paciente com silicose aguda. Estes resultados sugerem que o microambiente pulmonar alterado pela doena seja um stio de linfopoese extratmica, possivelmente com formao local de repertrio de clulas T. Existem evidncias de que, durante o processo inflamatrio, a reteno de antgenos e a produo local de mediadores (e.g.: citocinas, quimiocinas) determinam a formao de tecido linfide tercirio(33,34). Estudos posteriores em citometria de fluxo, utilizando tripla marcao, so fundamentais para caracterizar o estgio de diferenciao das subpopulaes celulares presentes no LBA. A anlise do repertrio (TCR) dos linfcitos da periferia e do microambiente pulmonar poder esclarecer se realmente o microambiente pulmonar dos pacientes com silicose um stio extratmico de gerao de linfcitos. O aumento acentuado de imunoglobulinas no lavado broncoalveolar dos pacientes com silicose, bem como seu aumento percentual em relao albumina, indicam uma produo local de imunoglobulinas, no microambiente pulmonar. Como no foi observado aumento percentual de plasmcitos e linfcitos B (CD19+), no LBA desses pacientes, esses resultados sugerem que as clulas produtoras de imunoglobulinas esto localizadas no interstcio pulmonar. Esta hiptese advm do fato da existncia de centros germinativos no BALT (sistema linfide associado ao brnquio), inclusive de humanos, aps exposio das vias areas estimulao antignica(35). Os pacientes silicticos com formas mais avanadas (complicadas) da doena apre-

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sentaram, em relao ao grupo de pacientes com silicose simples, valores superiores de IgG, mas no de IgA. O aumento de albumina no LBA, neste grupo, sugere tambm haver comprometimento da membrana alvolo-capilar, com a progresso da doena e passagem de protenas atravs dessa barreira. De modo semelhante ao presente estudo, outros pesquisadores(36) tambm observaram haver aumento discreto na concentrao de albumina, no LBA dos pacientes com silicose complicada. O paciente com silicose aguda apresentou valores acentuadamente mais elevados de albumina, IgG e IgA, indicativos de leso mais extensa da membrana alvolo-capilar. A utilizao de anticorpos monoclonais e imunofenotipagem, por meio de citometria de fluxo, permitiu mostrar a existncia de alteraes imunolgicas no microambiente pulmonar, nas diferentes formas da silicose. Importante ressaltar que um aumento nas subpopulaes de linfcitos T imaturos (CD4CD8) e da produo local de imunoglobulinas acompanhava a gravidade da doena. Estudos posteriores do LBA, mediante tcnicas avanadas de biologia celular e molecular, devero fornecer melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na injria pulmonar, inflamao, reparo e fibrose, que ocorrem na silicose. A compreenso desses mecanismos permitir vislumbrar novas perspectivas teraputicas para esta doena que, ainda hoje, incapacita e ceifa tantas vidas, no auge da sua produtividade.

REFERNCIAS
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J Pneumol 26(3) mai-jun de 2000

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