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Biologa Molecular Daz, H. Las Heras, M. Pinto, F. Reyes, M. Rivera, C. Romero, R.

24 05 -2011 REPLICACIN II MODELOS DE REPLICACIN Daniela Seelenfreund

Modelo de replicacin de E. coli Esto es bsicamente lo que habamos visto, el modelo de E. coli, en el cual hay un origen y a partir de ste se replica el DNA en forma bidireccional. Sin embargo, existen tambin otras estrategias de replicacin.

Estructuras de distintos intermediarios de replicacin Una forma de tratar de estudiar estos sistemas de replicacin es mirar cules son los intermediarios del proceso, es decir, qu estructuras se forman en el camino.

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Cuando uno pone esto en un gel se ve en forma absolutamente anmala (esos geles se ven sper feos, as que no hay que asustarse en caso de que se vea esto en un paper). En lugar de bandas que migran perfectamente bien, todas estas estructuras generan alteraciones electroforticas. Factoras en E. coli La replicacin, como habamos mencionado, no ocurre en cualquier parte de la bacteria, sino que en focos especficos, que se llaman factoras de replicacin (aqu es donde se estn formando las horquillas de replicacin). En ellas estn ensambladas las DNA polimerasas y otras protenas. En el proceso de replicacin lo que en realidad se mueve es el DNA y lo que est fijo es la protena (no es la imagen que uno tiene de una locomotora corriendo a travs de un riel que sera el DNA, sino que es al revs).

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Esto se puede ver en la imagen siguiente. Aqu se tiene una marcacin para la protena SeqA. Como vemos, ellas estn concentradas en ciertos puntos que coinciden con los sitios donde se ve incorporacin de BrU (bromouridina, recordemos que es un anlogo de nucletido). Si se sobreponen ambas imgenes se ve que en realidad son los mismos puntos, lo que nos dice que hay algn tipo de organizacin incluso en coli.

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Esto de las factoras se vio inicialmente en eucariontes. Debemos pensar que hay mltiples orgenes de replicacin (recordemos que puede haber ms de un origen de replicacin o replicn) y stos estn organizados en factoras. Nuevamente es el DNA el que va a los lugares especializados, dentro del ncleo en este caso, y ah se asocian todas las protenas que participan.

Otras estrategias replicativas

Crculo rotatorio Esta fotografa corresponde a un plasmidio o a un DNA genmico viral que se est replicando con un sistema totalmente distinto a lo que habamos visto (un origen y replicacin bidireccional). Esto es DNA de doble hebra, aqu hay una replicacin perfectamente asimtrica y este tipo de replicacin existe en muchos sistemas. Es un sistema de replicacin muy verstil llamada crculo rotatorio.

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El sistema de crculo rotatorio puede generar mltiples productos diferentes. Este DNA circular (ver imagen) va a ser el molde para la replicacin. El producto de esa replicacin es un DNA inicialmente de una hebra. Este sistema de crculo rotatorio se utiliza en plasmidios, por ejemplo (conjugacin).

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En este nuevo sistema se va a replicar slo una de las dos hebras. Aqu se parte con un DNA de doble hebra. Lo primero que ocurre es un nick, un corte en un punto especfico producido por una endonucleasa, lo que genera un extremo 3` OH libre, gracias a lo cual nos saltamos el problema del partidor, debido a que es el mismo sustrato el que est ofreciendo el extremo 3` OH (esto es anlogo a lo que habamos visto sobre cmo se transfiere el TDNA o a lo del proceso de conjugacin). Esto podra ser equivalente al OriT, el origen de transferencia. Entonces aqu empieza a replicarse. Para que esto comience esa hebra debe desplazarse y al hacerlo queda disponible el molde para esta nueva hebra que se empieza a sintetizar como siempre en el sentido 5`3` a partir de un 3` OH libre.

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Replicacin del fago lambda mediante crculo rotatorio

ste se replica por el sistema de crculo rotatorio. En este caso el DNA es lineal y el producto de esta replicacin va a ser cortado al trmino de cada unidad de genoma. Entonces, despus de que se sintetiza, se forma un DNA de doble hebra que se corta en el largo equivalente a un genoma y eso se empaqueta dentro del fago. Esto es asimtrico (a partir de un DNA de doble hebra se replica una hebra). Qu otros sistemas usan esto? Bacterifago X-174 Es un fago chiquitito que tiene DNA circular de una hebra (el sistema entonces sirve tanto para DNA lineal como para DNA circular de doble hebra o de hebra simple). Normalmente el punto de corte, en el caso de fagos, es siempre el mismo lugar y se produce por una nucleasa propia del fago (no es un corte al azar en cualquier zona del DNA).

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Fago M13 M13 es un fago filamentoso, pequeo y su DNA tambin es de una hebra y circular. Este fue uno de los primeros fagos que se utiliz para secuenciar. Cuando M13 infecta a E. coli lo primero que hace es sintetizar una forma intermediaria replicativa que es de doble hebra (a partir de la hebra genmica simple y con la ayuda de varias enzimas) para producir un sustrato de doble hebra que pueda ser replicado mediante crculo rotatorio.

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Una vez que se produce el nick empieza la replicacin de crculo rotatorio y a partir de un producto del crculo rotatorio obtenemos nuevas copias del DNA genmico (esto ocurre dentro de la bacteria que infect).

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Etapa 1: Sntesis de la forma replicativa

RFIIrelajado RFIsobreenrollado

Esto se ha estudiado en tres fagos distintos como modelo que se replican por crculo rotatorio (M13, G4 y X174). Todos ellos poseen un genoma de DNA circular de una hebra. Para formar el intermediario de doble hebra (RFI), el DNA de una hebra se tapiza por protenas ssb (protenas ssb de la clula que infect). Quedar tapizada toda la hebra, excepto la zona que va a funcionar como partidor para la sntesis de la segunda hebra, debido a que sta va a formar estructura secundaria (ssb no se va a unir al DNA que no est como hebra simple). Una vez que se uni ssb, se forman estas horquillitas que van a ser el punto de partida para sintetizar el partidor (aqu s necesitamos un partidor). Estos partidores sern sintetizados por distintos conjuntos de enzimas en cada fago. En M13 ser por la RNA polimerasa. En G4 por una primasa y en x174 por un sistema de primasas complejo formado por muchas protenas, llamado primosoma. Entonces en todos ellos, lo primero que se sintetiza en la segunda hebra es la zona complementaria con esta mini horquilla.

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Sntesis de partidor en fagos DNAss Cuando se sintetiza el partidor (por la primasa), se desplaza a ssb. A partir de ese partidor se va a completar la segunda hebra.

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Formacin de RF en fago G4

Zona de horquilla en fago G4

Protenas que participan en la formacin de DNA ds (RF) de M13 (se utiliza la maquinaria de la clula)

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Una vez que se tiene la forma intermediaria, se puede proceder a la segunda etapa que va a ser la replicacin va crculo rotatorio. Etapa 2: Replicacin mediante crculo rotatorio M13 En el caso de M13 se produce en un punto especfico en el origen un corte (Nick) por una endonucleasa llamada protena A (ProtA) y que es propia del fago (no es de la clula). Esta protena adems se queda unida al DNA, entonces va a estar marcando el extremo parental.

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Fago X Aqu empieza la sntesis igual a lo que vimos en el caso anterior, la diferencia es que la protena queda unida y al completarse un crculo se une al punto de inicio y se sella este crculo y la protena vuelve a quedar unida en el punto donde se inici la replicacin. En este caso se obtiene DNA circular de una hebra (es verstil el sistema).

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Genoma mitocondrial humano Tambin funciona distinto y no es un crculo rotatorio. El DNA mitocondrial humano es un DNA sper estudiado (el genoma mitocondrial es pequeo y compacto, contiene genesque codifican para protenas mitocondriales). En azulgenes que codifican para tRNA (estn intercalados). Hay genes en todas partes, excepto en una zona conocida como D-loop (se llama as por desplazamiento, que es lo que ocurre al inicio de la replicacin del DNA mitocondrial). Esta zona que no contiene genes se estudia para identificacin de individuos (al no contener genes puede variar mucho ms). En esta regin est el origen para una hebra (el DNA mitocondrial es de doble hebra). Aqu cada hebra tiene su propio origen de replicacin (esta replicacin no ocurre por el sistema del crculo rotatorio pero en este caso tambin tenemos una asimetra, en el sentido que cada hebra tiene su propio origen de replicacin).

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Las hebras se denominan como hebra H y hebra L (replicacin no sincronizada de cada hebra). En la zona del D-loop est la zona para la hebra H, entonces esa inicia su replicacin desplazndose en la hebra parental. sta se sigue replicando hasta que llega a la zona del otro origen de replicacin, el origen OL. Es como si se destapara esa zona del origen para que pueda comenzar la sntesis de la segunda hebra en el sentido opuesto (as es como se replica el DNA mitocondrial).

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En cloroplastos pasa algo muy similar al caso de la mitocondria con la replicacin del DNA, ya que tambin usa el sistema D-loop, pero en lugar de tener un origen para cada hebra tiene varios orgenes (2 o 3) para cada hebra, por tanto es la misma idea pero ms complejo.

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Adenovirus (replicacin DNA lineal) Tiene DNA lineal de doble hebra, un genoma no segmentado y es ms grande que un fago (38-40Kb, 30-40 genes). Este DNA se puede encontrar como DNA lineal o circularizarse gracias a que los extremos de las secuencias son complementarios entre s (estructura de mango de sartn).

Los adenovirus tienen una protena asociada que se une al genoma viral en el extremo 5` de cada hebra (protena terminal, propia del virus). Esta protena tiene unida covalentemente una citosina, que aporta un primer (mnima expresin de un primer, una sola base). Esta citosina ofrece entonces el extremo 3`OH libre, lo que permite que de ah pueda partir la DNA polimerasa.

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Protenas que participan en la replicacin de DNA de adenovirus

Replicacin de adenovirus

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