Practica #03 04 05 - Factores Que Afectan La Actividad Enzimatica

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Per, DECANA DE AMERICA)

FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE OBSTETRICIA
CURSO DE BIOQUIMICA FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. COMPETENCIAS.Al finalizar la Prctica de Laboratorio el alumno ser capaz de: Explicar la actividad enzimtica de la pepsina sobre las protenas. Explicar el efecto de un factor enzimtico sobre la actividad de la pepsina. Determinar grficamente la Temperatura optima de la pepsina. Determinar grficamente el pH ptimo de la pepsina.
II. PRE-REQUISITOS PARA LA PRCTICA DE LABORATORIO.Conceptos Bsicos:
Enzima Sustrato - Producto. Complejo Enzima-Sustrato. Cintica Enzimtica. Constante de Michaelis-Menten (Km). Velocidad Mxima (Vmx). Cintica de Michaelis-Menten. Diagrama de Lineweaver-Burk. Peptidasa - Proteasa. Zimgeno. Pepsingeno - Pepsina.
Gua de Practicas del Curso de Bioqumica UNMSM Facultad de Medicina - Semestre 2011 0 Profesor Responsable Blgo. Marco Antonio Nez Fonseca
III. GENERALIDADES.-
Los biocatalizadores especficos sintetizados por el organismo, llamados enzimas, son protenas que intervienen en las reacciones biolgicas, acelerando la velocidad de reaccin hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente especficas en las reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados substratos) sobre los que actan. La cintica enzimtica es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cintica proporcionan una herramienta bioqumica muy til para calcular la
concentracin de una enzima en una muestra biolgica y comparar su actividad cataltica con la de otras enzimas. Adems, las mediciones cinticas permiten describir de manera cuantitativa el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima. La velocidad a la que procede una reaccin enzimtica est controlada en parte por las concentraciones de la enzima y el substrato. A medida que progresa la reaccin, aumenta la concentracin de los productos a expensas de la desaparicin de los correspondientes substratos, en tanto que la concentracin de la enzima no se altera. La actividad enzimtica puede expresarse: a) Por la desaparicin del Substrato (S) b) Por la aparicin de Productos (P) c) Por modificacin de Cofactores (C)
El mecanismo de reaccin enzima-sustrato puede simbolizarse as:
[E] + [S] C C
[E] + [P]
Diversos factores modifican la actividad enzimtica, tales como: 1) Concentracin de Substrato [S] 2) Concentracin de la Enzima [E] 3) pH del medio 4) Influencia de la temperatura 5) Efecto de inhibidores y activadores En las siguientes prcticas (Prcticas N 05, 06 y 07) estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad enzimtica de la pepsina en presencia de albmina La pepsina es un enzima proteoltico (proteasa cida) segregada por las clulas principales de las glndulas gstricas, tiene un peso molecular de 34 644 Da. Hidroliza los enlaces peptdicos, descomponiendo as las protenas en aminocidos. La pepsina solo realiza la protelisis en medio cido, acta a un pH bajo, por lo que es precisa la presencia de cido clorhdrico para la realizacin de la digestin gstrica de las protenas. Las clulas de las glndulas gstricas no producen directamente pepsina, sino que su producto es el pepsingeno, sustancia precursora sin capacidad digestiva que se convierte en pepsina en la luz de la glndula, al entrar en contacto con el cido clorhdrico y con la pepsina ya producida. La actividad enzimtica se medir por la desaparicin del substrato (disminucin de la turbidez en los tubos que contiene albmina), la cual se determinar en el Espectrofotmetro a 450 nm.

CURSO DE BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORIO N 03 EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO III. COMPETENCIA.Al finalizar la Prctica de Laboratorio el alumno ser capaz de: Determinar el Km y Vmx experimental de la pepsina para la albmina a partir de la grfica de vi contra [S]. Determinar el Km y Vmx experimental de la pepsina para la albmina a partir de la grfica de dobles reciprocas 1/v i contra 1/[S]. IV. PARTE EXPERIMENTAL.Preparar la siguiente batera de 8 tubos como se indica a continuacin: TUBOS N Agua Destilada HCl 1N Albmina 5% Pepsina 1% 1 2 3 4 5 6 7 8 ------5.0 ml
8.0 ml 7.0 ml 6.0 ml 5.0 ml 4.0 ml 3.0 ml 2.0 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 1.0 ml 2.0 ml 3.0 ml 4.0 ml 5.0 ml 6.0 ml 7.0 ml ---------------
Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 en el espectrofotmetro. Considerar las Absorbancias como Lectura Inicial. Luego, Incubar los ocho tubos a 37C por 5 min. Aadir 0.5 ml de pepsina a cada tubo (del tubo 8 a los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7). Incubar por 5 min a 37C. Detener la reaccin en un bao de hielo.
Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 en el espectrofotmetro. Considerar las Absorbancias como Lectura Final. Hacer la diferencia:
Actividad Enzimtica = Lectura Inicial - Lectura Final
El resultado de sta diferencia se considerar como Actividad Enzimtica.
Graficar en papel milimetrado:
Actividad Enzimtica en el eje Y versus [S] en el eje X.
1/Actividad Enzimtica en el eje Y versus 1/[S] en el eje X.
Calcular el Km y Vmx de la pepsina en cada una de las grficas

CURSO DE BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORO N 04 EFECTO DEL pH III. COMPETENCIA.Al finalizar la Prctica de Laboratorio el alumno ser capaz de: Determinar el pH ptimo en el cual la actividad enzimtica de la pepsina es mxima. IV. PARTE EXPERIMENTAL.Seguir el siguiente protocolo de trabajo: TUBOS N Agua Destilada HCl 1N Na2CO3 10% Albmina 5% Pepsina 1% pH 1 2.0 ml 5.0 ml 2 1.5 ml 0.5 ml 5.0 ml 3 2.0 ml 5.0 ml 4 1.5 ml 0.5 ml 5.0 ml 5 2.0 ml 5.0 ml 6 20.0 ml B 5.0 ml 5.0 ml -
Incubar los tubos (del 1 al 6) por 5 min. Aadir del tubo N 6, 3 ml de pepsina a los tubos N 1 al 5. Mezclar e incubar a 37C por 5 min.
Leer en el espectrofotmetro los tubos 1, 2, 3, 4, y 5 y el tubo blanco (B).
Restar la lectura del tubo blanco (B) menos la lectura de c/u de los 5 tubos. La diferencia ser asumida como actividad enzimtica.
Determinar: Los valores del pH final para cada uno de los tubos
Actividad Enzimtica versus pH

CURSO DE BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORIO N 05 EFECTO DE LA TEMPERATURA III. COMPETENCIA.Al finalizar la Prctica de Laboratorio el alumno ser capaz de: Determinar la temperatura ptima para la actividad de la pepsina.
IV. PARTE EXPERIMENTAL.Preparar dos series de tubos: SERIE N 1 TUBOS N Agua Destilada HCl 1N Albmina 5% SERIE N 2 TUBOS N Pepsina 1%
1S 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml
2S 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml
3S 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml
B 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml
1E 1.0 ml
2E 1.0 ml
3E 1.0 ml
Incubar los 6 tubos por 5 min segn el siguiente cuadro de temperaturas: TUBOS N Temperatura 1S y 1E 0C 2S y 2E 37C 3S 37C 3E 100C
Agregar el contenido de los tubos 1 E, 2 E, y 3 E a sus respectivos tubos 1 S, 2 S, y 3 S. Luego incubar cada tubo a las correspondientes temperaturas 0C, 37C y 37C respectivamente, por 5 min.
Posteriormente colocar los tubos en agua helada para detener la reaccin.
Leer las Absorbancias en el espectrofotmetro a 450 nm.
La actividad enzimtica se encontrar restando la lectura del tubo blanco (B) menos lectura de los otros tres tubos (correspondiente a cada temperatura).
Actividad Enzimtica versus Temperatura

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II. PRE-REQUISITOS PARA LA PRCTICA DE LABORATORIO.Conceptos Bsicos:

El mecanismo de reaccin enzima-sustrato puede simbolizarse as:

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMERICA)

Actividad Enzimtica = Lectura Inicial - Lectura Final

El resultado de sta diferencia se considerar como Actividad Enzimtica.

Graficar en papel milimetrado:

Actividad Enzimtica en el eje Y versus [S] en el eje X.

1/Actividad Enzimtica en el eje Y versus 1/[S] en el eje X.

Calcular el Km y Vmx de la pepsina en cada una de las grficas

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(Universidad del Per, DECANA DE AMERICA)

Leer en el espectrofotmetro los tubos 1, 2, 3, 4, y 5 y el tubo blanco (B).

Graficar en papel milimetrado:

Actividad Enzimtica versus pH

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(Universidad del Per, DECANA DE AMERICA)

1S 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml

2S 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml

3S 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml

B 3.5 ml 0.5 ml 5.0 ml

Posteriormente colocar los tubos en agua helada para detener la reaccin.

Leer las Absorbancias en el espectrofotmetro a 450 nm.

Graficar en papel milimetrado:

Actividad Enzimtica versus Temperatura

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