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Mercedes Guerra, Grisel Ortega Separacin, caracterizacin estructural y cuantificacin de antocianinas mediante mtodos qumico-fsicos. Parte I ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, vol. XL, nm. 2, mayo-agosto, 2006, pp. 35-44, Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120664005

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, ISSN (Versin impresa): 0138-6204 revista@icidca.edu.cu Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar Cuba

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Mercedes Guerra, Grisel Ortega Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar (ICIDCA) e.mail: mercedes.guerra@icidca.edu.cu

RESUMEN Las antocianinas son compuestos fenlicos del grupo de los flavonoides y estn presentes en la naturaleza como pigmentos en las flores, frutos y hojas de algunas plantas. Se presenta una revisin bibliogrfica sobre separacin y caracterizacin estructural de las antocianinas. Se describen las propiedades qumico-fsicas y los mtodos utilizados para la separacin y purificacin de las mismas en materiales vegetales y en extractos comerciales. Se muestran diferentes adsorbentes y sistemas de fase mvil especficos en anlisis de mezclas de antocianinas utilizando los mtodos de cromatografa de placa delgada y HPLC. Palabras clave: Antocianinas, flavonoides, Cromatografa de Capa Delgada, Espectroscopa UV-VIS, adsorbente, fase mvil ABSTRACT Anthocyanins are phenolic compounds that belong to the flavonoid group and appear in nature as pigments in flowers, fruits and leaves of some plants. The present paper is a bibliographic description concerning to the separation and structural characterization of anthocyanins and describe its physico-chemical properties and the methods used in their separation and purification from plant materials and commercial extracts. Different adsorbents as well as specific movil-fhase systems in tests of anthocyanins mixtures, using methods of thin layer chromatography are shown. Key words: Anthocyanins, flavonoid, Thin Layer Chromatography, VIS-UV Spectroscopy, adsorbent, movil-phase

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INTRODUCCIN Las antocianinas son compuestos fenlicos del grupo de los flavonoides (1) y estn presentes en la naturaleza en forma de pigmentos en flores, frutos, bayas y hojas con grandes variedades de estructuras qumicas, concentraciones y siendo caracterstica de cada material y atributo especfico para la caracterizacin del mismo. Tambin se considera que son metabolitos secundarios de las plantas con actividad biolgica. En la actualidad en la industria alimentaria, cosmetolgica y farmacutica son utilizados una gran cantidad de compuestos obtenidos por va sinttica que ocasionan graves daos a la salud, entre los cuales se encuentran los colorantes. Por esto, la tendencia actual es sustituir este tipo de compuesto de amplio uso por pigmentos de origen natural, sobre todo de compuestos que imparten coloraciones rojos brillantes (2) que brindan un aspecto ms atractivo para la comercializacin de algunos productos. En estudios recientes, se ha reportado que las antocianinas inhiben el crecimiento de las clulas (3) cancergenas y ayudan a prevenir el cncer del coln e impiden enfermedades del corazn al inhibir la sntesis del colesterol, mejoran la circulacin y fragilidad de los vasos capilares (4), logrando beneficios antienvejecimiento. Por esta razn, se ha incrementado la demanda del producto, lo que conlleva a la bsqueda de nuevas tcnicas para la obtencin de antocianinas a grandes escalas y en particular la de origen natural, por lo que se ha encaminado la va biosinttica, lo cual ha conllevado a los estudios de separacin, caracterizacin estructural y al desarrollo de nuevas tcnicas analticas para cuantificar las antocianinas obtenidas. DESARROLLO DEL TRABAJO Mecanismo de biosntesis de los flavonoides Las variaciones en la estructura del esqueleto de los flavonoides se reportan que dependen de reacciones de hidroxilacin O- metilacin y formacin de glucsidos y oxidacin del anillo B. Algunas variaciones asociadas con el anillo B han sido encontradas para los isoflavonoides y rotenonas. (5)
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El paso principal en la biosntesis de todos los flavonoides est relacionado con la formacin de un intermediario chalcona. Se reporta que la formacin de la chalcona se produce por condensacin de la coenzima p- coumaril. En los primeros intermediarios de la formacin de chalcona se identifican tres unidades de malonil-CoA enzima (acetil -CoA. La chalcona y echinatina presentan un modelo de hidroxilacin inusual, ya que la funcin cetona insaturada en la molcula de chalcona normal sufre una transposicin. Los grupos hidroxilos se convierten en 5,7 dihidroxiflavonoides. La sntesis de flavona es altamente especfica slo para p-coumaril-CoA enzima y para grupos hidroxilos. Las Flavonas se forman a partir de mecanismos de oxidacin. Las dihidroflavonas son intermediarios importantes en la biosntesis de diferentes flavonoides. Por ejemplo, para la biosntesis de cianidina y quercitina, el dihidrokaempferol se reporta como un excelente precursor. En la biosntesis de taxifolina ocurre la incorporacin de chalcona con retencin de un protn en la posicin C-2. Esto excluye que para los intermediarios y la formacin de chalcona pueda ocurrir por la va de un epxido. La formacin de isoflavonoides puede ocurrir mediante una reestructuracin en el esqueleto de la chalcona involucrando un cambio en las posiciones de enlaces 1,2 -arlicos. Caracterstica qumico-fsica de las antocianinas Las antocianinas son compuestos fenlicos caracterizados por la presencia de un aglicn (antocianidina) del grupo de los flavonoides. Su frmula bsica est conformada por dos anillos aromticos unidos por una estructura de tres carbonos. En su forma natural, esta estructura corresponde a hetersidos formado por la combinacin de un aglicn (antocianidina) y de un azcar (generalmente glucosa). Si adems del azcar en la molcula existe un radical acilo, entonces son antocianinas aciladas (1) (5). Con pH cido las antocianinas son muy estables, pero esta estabilidad se reduce, cuando el pH se aproxima a la neutralidad, llegando a destruirse completamente con
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pH superior a 7. Sin embargo, las antocianinas de tipo aciladas, como la petanina [petunidina 3-(6``,4`` p-coumarilramnosido)-5glucsido] son ms estables y conservan su color caracterstico con pH alcalino. Las diferencias entre los antocianos individuales se encuentran en el nmero de grupos hidrxilos de la molcula y el grado de metilacin de estos grupos hidroxilos (que son los factores que caracterizan a las diferentes antocianidinas), de la naturaleza y el nmero de azcares ligados a la molcula y de la posicin del enlace y en la naturaleza y el nmero de cidos alifticos o aromticos unidos a los azcares en la molcula. Respecto a estos ltimos, son importantes los derivados acetilados y los pcumarilados. (6) Cuando en las antocianidinas se sustituye el grupo hidroxilo de la posicin 3 con una molcula de azcar se conoce como derivado sustituido 3- glucsido y con la sustitucin del hidroxilo en la posicin 3 y 5 se conoce como el derivado sustituido 3,5 diglucsido. Las estructuras ms comunes y sencillas son: Pelargonidina Estructura molecular

Soluble en agua, metanol, etanol, HCl 0.5-7 % y moderadamente soluble en HCl 10 %. Pelargonidina 3,5 diglucsido Frmula emprica: C27H31ClO15. Forma cristalina: Agujas rojas Se descompone 175-180 C Soluble: en agua, alcohol Peonidina

O C H3 OH Cl

Frmula emprica: C16H13ClO6 Peso molecular: 336.73 Forma cristalina: Agujas carmelita rojizo Soluble: En alcohol dando una solucin rojo oscuro y moderadamente soluble en agua dando una solucin carmelita rojizo. Derivados mono y disustituidos de la Peonidina Peonidina 3, 5 diglucsido Frmula emprica: C28H33ClO6 Soluble en HCl formando agujas prpura intenso Punto de fusin: 165-167 C Cianidina

+ OH Cl

Frmula emprica: C15H11ClO5 Peso molecular: 306.7 No funde a 350 C Forma de cristales: Prisma de color carmelita rojizo y soluble en alcohol, metanol, moderadamente soluble en agua y ligeramente soluble en cloroformo. Derivados mono y disusttuidos de la Pelargonidina Pelargonidina-3-monoglucsido Frmula emprica: C21H21ClO10 Forma cristalina: Agujas con color rojo castao y brillo bronceado.
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OH OH Cl

Frmula emprica: C15H11ClO6 (7) Soluble HCl alcohlico para dar agujas rojo castao monohidratado, muy soluble en alcohol y alcohol amlico dando una solucin violeta, soluble en carbonato de sodio con color azul. y poco soluble en HCl diluido o H2SO4.
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Cianidina 3-glucsido Frmula emprica: C21H21ClO11 Soluble en HCl diluido en medio alcohlico con formacin de lminas o prisma carmelita rojizo con brillo metlico. Soluble en alcohol con fuerte florescencia y en carbonato de sodio con azul-violeta. Se descompone a 205 C sin fundir Cianidina 3-ramnoglucsido Frmula emprica: C27H31ClO15 Agujas rojas en HCl o primas oscuros en HCl diluido metanlico. Soluble en agua caliente, alcohol. Cianidina 3-galactsido Frmula emprica: C21H21ClO11 Agujas rojas con brillo bronce metlico en HCl en medio metanol Descompone a 210-212 C Soluble en agua, etanol, metanol, HCl diluido. Prcticamente insoluble en HCl al 7 %. Cianidina 3,5 -diglucsido Frmula emprica: C27H31ClO6 Lminas con brillo metlico en HCl diluido Punto de fusin: 203-204 C. Cianidina 3-soforosida o mecocianina Frmula emprica: C27H31ClO16. Cristales rojos oscuros en HCl diluido y acetato de etilo o agujas rojo oscuro en HCl en medio alcohlico al 2 % Soluble en agua. Delfinidina Frmula emprica.C15H11ClO7 Prismas o agujas carmelita-chocolate con brillo metlico en HCl 5 % Soluble en metanol, etanol, acetato de etilo Derivados de la delfidina mono y disustituido Delfidina 3-glucsido Frmula emprica: C21H21ClO12 Cristales rojo oscuro en HCl diluido
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Delfidina 3,5 diglucsido Frmula emprica: C27H31ClO17 Cristales en forma de hoja con brillo bronceado en HCl diluido Insoluble en agua fra, alcohol, cido diluido. Soluble en HCl diluido y caliente. Delfina Con sustitucin de una molcula de glucosa y cido hidroxibenzoico. Frmula emprica: C41H39ClO21 Cinta o prisma de color rojo-carmelitoso oscuro en HCl al 3 % Descompone a 200-203 C. Soluble en agua con descomposicin, alcohol diluido, acetona, alcohol en ebullicin. Violana Con sustitucin de glucosa, ramnosa y cido p-hidroxicinamico Frmula emprica: C36H37ClO18 Lmina violeta azulado con brillo verde metlico en HCl metanlico y ter Soluble en alcohol amlico, HCl 0.15-0.5 %, menos soluble en HCl 1 %, ligeramente soluble en agua y prcticamente insoluble en HCl 5-12 %. Malvidina

H3 CO

OH O C H3 Cl

Frmula emprica: C17H15ClO7 Peso molecular: 366.75 Prismas con forma rmbica con aparicin del color rojo por luz trasmitida y brillo verde cuando tiene contacto con el solvente toma un brillo azul acero. Usualmente se obtienen los cristales mono o dihidratado y las sales anhidra son muy higroscpica y no funde a 300 C Soluble en alcohol absoluto dando una solucin rojo-violeta, soluble alcohol amlico. Ligeramente soluble en agua. En metanol, el compuesto es soluble por formacin de una solucin color rojo, pero
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comienzan a separarse cristales de color rojo, los cuales se observan violeta por la luz transmitida. Derivados de la malvidina mono y disusttuidos Malvidina 3- glucsido tetrahidratado Frmula emprica: C23H25ClO12.4H2O En alcohol-HCl se obtienen unos prismas oscuros con brillo verde metlico. Ligeramente soluble en agua, alcohol, glicerol; prcticamente insoluble en benceno, cloroformo, ter. Malvidina 3,5 diglucsido Frmula emprica: C29H35ClO17 En HCl se obtienen prismas o agujas de color carmelita rojizo con brillo verde. Descompone a 165 C Malividina 3-galactsido hemihendecahidrato Frmula emprica: C23H25ClO12.5 H2O En HCl-metanol se obtienen cristales en forma de prisma o agujas de color bronce metlico y luz transmitida violeta-azulado. Muy soluble en metanol, alcohol, agua fra formando una solucin rojo oscuro. Ligeramente soluble en acetona y prcticamente insoluble en acetato de etilo. Petunidina

Punto de fusin: 178 C En HCl diluido se obtienen cristales en forma de lmina violeta con brillo cobrizo. Separacin y caracterizacin estructural de las antocianinas A continuacin se detallan las diferentes vas de tratamiento y purificacin de una muestra, la evaluacin de la estructura dependiendo del tipo de material de partida que presente diferentes tipos de antocianinas. Separacin y caracterizacin de antocianinas de la flor fistulosa de Monarda Se extraen las antocianinas y otros flavonoides de los ptalos de fistulosa de Monarda con metanol/cido actico/agua (10:1:9) y se purifica el extracto en una columna Sephadex LH20 (3 x 80 cm). Los flavonoides se separan por HPLC en una columna Spheri 10-RP18 10 (25 cm x 4.6 mm) con una elucin de gradiente, utilizando 5 % cido frmico/metanol y un detector de longitud de onda variable y un fotodiodo. En el cromatograma aparecen dieciseis picos, cinco corresponden a pigmentos de antocianinas, los cuales se identifican utilizando longitudes de onda a 280 y 510 nm. Los derivados de las antocianinas y la presencia de acilacin se pueden caracterizar por los tiempos de retencin y los espectros UV-Visibles. Los pigmentos hidrolizados en medio cido se separan mediante Cromatografa de papel, TLC y electroforesis.(10) Separacin y caracterizacin de las antocianinas en las frutas de edulis de Passiflora y P. de suberosa Las antocianinas en el edulis de Passiflora (la fruta de pasin) y P. de suberosa se extraen con metanol acidificado con TFA (trifloroactico) al 2 %. Los extractos filtrados se concentran a vaco y se purifica por particin en acetato de etilo y se aplica a una columna de Amberlite XAD-7 (Andersen, el Acta Chem Scand., 1988, 42, 462). Las antocianinas se separan en una columna Sephadex de LH-20 (100 x 2.6 cm i.d.) con metanol/TFA/agua (99:2:99). La Cromatografa de HPLC se realiza en una columna ODS (20 cm x 5 mm i.d.) 5 con un flujo de elusin de 1.2 ml/min con cido
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OH

OH OH O C H3 Cl

Frmula emprica: C16H13ClO7 Peso molecular: 352,74 En HCl diluido se obtienen cristales en forma de prisma o agujas de color carmelita gris. Derivado de la petunidina 3,5 diglucsido Petunidina 3,5 diglucsido Frmula emprica: C28H33ClO17
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frmico/agua (1:9) y H2O/ metanol/frmico (5:1:4) como fase mvil y se caracterizan las estructuras mediante: Espectrofotometra UV-VIS de 210 a 600 nm., Espectrometra de masa FAB y RMN (11). Caracterizacin estructural de antocianinas de arndano Las antocianinas extradas de arndano se analizan por Espectrofotometra UV-VIS, Densitometra de TLC y HPLC con una evaluacin cuantitativa de antocianinas totales por Espectrofotometra a 535 nm. Las antocianinas se determinan por TLC en celulosa con espesor de capa de 300 F (0.1 mm espesor) con un sistema de solvente formado por cido frmico/agua/cido clorhdrico (6:5:1) y se detectan a 540 nm. La Cromatografa de HPLC se realiza utilizando una columna de C18 y aplicando un gradiente de elusin de cido frmico/acetonitrilo y deteccin a 280 nm. El anlisis de antocianinas de arndano result mejor empleando el mtodo de espectrofotometra directa o posterior a una separacin cromatogrfica (TLC/HPLC). Para la evaluacin cuantitativa, se recomienda el mtodo espectrofotomtrico directo. La densitometra de TLC slo se recomienda para extractos de alta pureza y la cromatografa HPLC resulta apropiada para la estandarizacin de extractos de arndano y la identificacin de impurezas como cidos del tipo fenlico y taninos (12). Caracterizacin de antocianinas extradas de arndano en muestras comerciales Los extractos secos de antocianinas se disuelven en HCl 0.1 M en metanol, posteriormente se miden sus espectros y el contenido de antocianinas se determina a 535 nm. Luego, se disuelven las muestras en 5 % cido frmico y se analizan por HPLC en una columna Partisil 10 ODS (25 cm x 4.6 mm) con una velocidad de elucin de 0.5 min/ml, utilizando gradiente de cido frmico/acetonitrilo (100:0 a 9:1 en 60 min sostenidos a 90 min) y la deteccin se realiza a 280 nm. (13) Separacin y caracterizacin estructural de antocianinas en el Sylvestris de Malva La extraccin de antocianinas se realiza con HCl-metanol, y las leucoantocianinas en el residuo se extraen similarmente des40

pus de un proceso de oxidacin en presencia de oxgeno del aire. Los extractos se analizan utilizando diferentes mtodos analticos para su caracterizacin y cuantificacin como: TLC en fase inversa, Cromatografa de HPLC y separacin en fase inversa para las antocianinas hidrolizadas y determinacin por espectrofotometra de antocianinas totales como cloruro de malvidina. (14) Composicin de los pigmentos de antocianinas en tomates rojos Las antocianinas presentes en tomates rojos se extraen previamente utilizando acetona y se realiza una segunda extraccin con 70 % de acetona seguido por agitacin con cloroformo/acetona (2:1). Se determina el contenido de antocianinas monmericas por el mtodo de pH diferencial en un rango de 2-40 mg/100 g. La composicin de antocianinas se caracteriza por HPLC, anlisis espectral y espectrometra de masa. En todas las muestras se detecta el pigmento pelargonidina-3-rutinosida-5-glucsido acetilada con cido p-coumrico (15). Complejidad de las antocianinas y su expresin de color Se presenta una resea que incluye los factores que afectan en la formacin del rango de colores de las antocianinas en las plantas (diversidad de cromforos, rango natural de valores de pH de 3-7, complejidad molecular incluyendo el origen de los compuestos complejos y efecto intermolecular a rango amplio). Los mtodos que se utilizan para estudiar estas propiedades son Espectroscopa UV-VIS, RMN, Dicroismo Circular y para lograr mayor selectividad Difraccin de Rayos X. (16) Antocianinas aciladas de los ptalos azules de Salvia uliginosa Los ptalos secos y congelados se extraen con cido frmico/metanol/agua 1:10:9); luego se filtra y se evapora hasta tener un volumen pequeo a presin reducida. Se realiza una Cromatografa de HPLC preparativa en columna ODS (10 mm d.i x 250 mm) con fase mvil cido frmico/metanol/agua (1:6:13) a (1:8:11) y se purifica por HPLC utilizando la misma columna con cido frmico/acetonitrilo/ agua (5:16:79). El producto se identifica utilizando tcnicas analticas de espectromeICIDCA No. 2, 2006

tra de masa FAB y RMN-H` a 500 y 600 Mhz en metanol conteniendo HCl al 0.1 % (17). Cianidina 3-(2``,3``digaloilglucosido) en hojas rojas Se pesan 400 g de hojas rojas de la flor "Crimson King"y se extraen con TFA (trifloroactico) al 1 % en metanol. Se filtra y se purifica por particin con acetato de etilo seguido por cromatografa usando columna Amberlita XAD-2. Las antocianinas diacetiladas (cianidinas) se separan en columna de Sephadex LH-20 utilizando una elucin paso a paso con metanol/TFA/agua de (19.8:0.2:80 a 59.4:0.6:40). Las estructuras se identifican empleando Espectrometra RMN homo y heteronuclear RMN-2D a 600.13 y 150.92 MHz para H`y C13 y los valores de los datos espectrales UV-VIS de la cianidinas separadas (18). Pigmentos de antocianinas de tulipanes La flor de tulipn "Queen Wilhelmina" se extrae con metanol conteniendo TFA al 1% y se realiza una particin con acetato de etilo. Las antocianinas se separan por cromatografa de columna Amberlite XAD-7 y se purifican usando una columna Sephadex LH20 y un sistema de solvente agua/metanol/TFA(80:19.6:0.4). La Cromatografa de HPLC se lleva a cabo en columna Hipersil ODS. La identificacin de estructuras se realiza mediante espectroscopa UV-VIS utilizando como solvente metanol/cido clorhdrico al 0.01 % en un rango de longitud de onda entre 240-600 nm, espectroscopa RMN y masa con ionizacin a presin atmosfrica e inyeccin de flujo y como resultado se obtienen estructuras moleculares del tipo de dos pelargonidinas y dos cianidinas con grupos acilos enlazados a la posicin axial del azcar (19). Purificacin e identificacin de antocianina de capulina (Prunus serotina ERC) Las antocianinas se extraen en acetona, se somete a un proceso de particin con cloroformo y se purifica en un cartucho de fase slida C18 . Los mtodos de bisulfito y pH diferencial se utilizan para determinar el contenido de antocianinas monomricas y color polimrico. Las antocianinas se identifican por anlisis espectral, HPLC, Espectrometra de
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Masa-electrospray. La Cromatografa HPLC se realiza (despus de hidrlisis alcalina y cida) en columna C-18 (25 cm x 4.6 mm d.i) 5 con gradiente de elucin (1ml/min) usando sistema de solvente acetonitrilo/ cido fosfrico/cido actico (el programa se detalla en el trabajo) y deteccin a 280, 310 y 520 nm. Como resultado del estudio estructural se obtienen dos tipos de cianidina: cianidina-3-glucsido y cianidina -3rutinosida y un tercer pigmento amarillo naranja detectado por Espectrometra de Masa (20) Enlace convalente entre pigmentos de antocianinas-flovonol de la flor Agarparthus azul Se separan dos antocianinas de la flor de Agaparthus azul. La purificacin involucra varios pasos cromatogrficos, el primero con Diaion Hp-20, una comatografa de columna con Sephadex G25, celulosa, Rp y Toyopearl HW-40 y los productos separados se caracterizan por RMN-H`, RMN-C13, Espectrometra de Masa-Cromatografa Gaseosa, HPLC acoplado a un espectroftometro UV-VIS seguida de una hidrlisis cida o bsica. La estructura encontrada es una delfidina diglucsido p-coumarilada unido a flavonol triglucsido. (21) Petunidina 3-O- ramnopiranosida-5-O- glucopiranosa y otras antocianinas de la flor Vicia villosa Las antocianinas se extraen toda la noche de la flor Vicia Villosa con 1 L de metanol/ cido actico (19:1; Solvente A) y luego se filtra y se concentra el solvente A filtrado. Este concentrado se extrae con acetato de etilo 3 x 300 ml y se aplica a una columna Amberlite XAD-7. Las antocianinas se eluyen con 1 L del solvente A y se separan en columna de Sephadex LH-20 (10 cm x 1 cm d.i) con metanol /agua/TFA (39.9:60:0.1). El TLC se realiza con slica microcristalina F5565 Merck con 1-butanol/cido actico/ agua (4:1:5) como fase superior y cido frmico/cido clorhdrico/agua (1:1:2). Se toma una alcuota de 15 l y se inyecta en una columna de HPLC Hypersil ODS 5 m (20 cm x 5 mm d.i) con cido frmico y cido frmico/agua/metanol (1:4:5) por elusin isocrtica y gradiente. Se separan tres antocianinas que se identifican por:
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Espectrofotometra UV-VIS con registro del espectro de 240 a 600 nm, RMN homo y heteronuclear, RMN 2D y como estructuras se propone el 3-O- ramnopiranosida-5-O glucopiranosidas de petunidina (71 %), delfidina (12 %) y malvidina (9 %). (22) Antocianinas de flores y Lirio (Liliaceae) Se pesa 1 g de segmentos secos y congelados de 10 cultivos de flores, incluyendo adems una especie de Lirio y se extraen con 13 ml de acetonitrilo al 50 % conteniendo 3 % de TFA. Se filtra y el extracto se pasa por una columna Develosil ODS-Hg-5 (25 cm x 4.6 mm d.i) a 40 C con gradiente de elusin (1ml/min) con acetonitrilo acuoso de 0-30 % conteniendo 0.5 % de TFA durante 30 min y deteccin de diodo en un rango de 260 - 530 nm. Una segunda elusin con 1.5 ml/min con agua/TFA (99:1, solvente A) y acetonitrilo/agua/TFA (3:7:0.05, solvente B, abarcando 16,38, 44, 50, 67 y 100 % de B a 0,3,10,20,25 y 40-50 min respectiva-

mente. El lmite deteccin de la cianidina 3O- rutinosida y cianidina 3-O- rutinosida-7-O--Dglucosido fue de 1.2 mol. Las estructuras se confirman por Espectrometra UV-VIS, RMN y masa-FAB. Estos compuestos son los responsables del color rojo de la flor de lirio.(23) Antocianinas en plasma humano despus de una administracin oral de un extracto de baya de saco Un mililitro de plasma se disuelve en 200 l de una solucin acuosa de 0.44 M de TFA y la mezcla se aplica en un cartucho de extraccin en fase slida Sep-Pak C18. Las antocianinas se eluyen con TFA a 0.44 M en metanol y posteriormente, la fase se evapora a sequedad y se redisuelve en solucin de TFA a 0.44M. Una porcin de la solucin se analiza por HPLC con una columna Zorbax SB-C18 (25 cm x 4.6 mm d.i) con un gradiente de elusin (1ml/min) con solucin acuosa de acetato de sodio 25

Tabla 1 . Valores de Rf x100 de antocianinas y ant ocianidinas en varios sistema s de solventes Poliacrilonitrilo -Poliamida (7:2) mezclada con 40 ml de 0.05 M fosfato de potasio primario A 46 42 36 36 35 57 54 38 31 21 37 39 41 27 95 94 83 92 47 41 62 55 51 54 53 34 61 65 71 46 70 50 87 90 95 70 75 60 84 86 92 75 57 50 84 83 69 72 75 72 91 85 78 79 60 44 56 26 61 33 37 52

Adsorbente

Silica Gel D-O

Celulosa MN 300

Celulosa

Poliamida

Antocianid inas Cianidina 3 glucsido Cianidina 3 triglucsido Cianidina 3,5 glucsido Delfinidina 3 glucsido Delfidina 3,5 glucsido Malvidina 3 glucsido Malvidina 3,5 glucsido Peonidina 3,5 glucsido Petunidina 3 glucsido Antocianinas Cianidina Delfidina Malvidina Paeonidina Pelargonidina Petunidina

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mM (fase mvil B) (de 0-24 % de B en A durante 50 min, 38 % de B en A durante 110 min hasta 100 % de B en A durante 120 min) y deteccin a 520 nm. Dos picos de antocianinas se pueden separar si se modifica la programacin de fase mvil de 0-26 % de B en A durante 20 min hasta 33 % de B en A durante 80 min (24). Caractersticas de las antocianinas en Cromatografa de Capa Delgada En la tabla 1 se observan los Rf de algunas antocianinas y antocianidina en varios sistemas de solventes. Sistema de solvente A= Pentanol-1-propanol-1- cido acticoagua (3:2:2:1) se puede aadir dos partes de heptanol-1 y un desarrollo a 12 cm para mejorar la placa. B= n-butanol- cido actico-agua (4:1:2). C= formato de etilo-metil-etil acetona-cido formico-agua (3:4:1:2). D= cido formico - cido clorhdrico-agua (10:1:3). E= alcohol amlico - cido actico - agua (2: 1: 1). F= cido actico - cido clorhdrico - agua (10:1:3), distancia de desarrollo de 12 cm. G= cido actico- agua (3:2), distancia de desarrollo. La manchas de antocianinas y antocianidinas se pueden ver a luz ultravioleta, pero se puede incrementar su intensidad rociando con una solucin de cido oxlico al 10 % en acetona.agua (1:1). (25) CONCLUSIONES En esta revisin se muestran las diferentes estructuras moleculares de las antocianinas presentes en diversos materiales de origen vegetal, lo cual implica una gran cantidad de variantes de tcnicas analticas para el tratamiento de muestra, de mtodos de purificacin por Cromatografa de particin y extraccin; caracterizacin estructural mediante tcnicas de TLC, Cromatografa HPLC, Espectrofotometra UV-VIS, Espectrometra de RMN H` y C13, Espectrometra de Masa-FAB y MasaElectrospray, lo cual constituye una herramienta importante para el desarrollo del traICIDCA No. 2, 2006

bajo de investigacin en el tema de separacin, identificacin y cuantificacin de estas molculas a partir de plantas superiores o por cultivo de clulas inferiores. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Salinas, Y.; Martnez, F.; Soto, M. Efectos de la mixtamalizacin sobre las antocianinas del grano de maces pigmentados Agrociencia .37 (6) pp. 617-628, Nov-Dic 2003. 2. Harbone, J.; Grayer, R. The anthocyanins in: The flavonoids. Advances in research since 1980. Londres: Chapman and Hall, 1988. p 1-20. 3. Kame, H.; Kojima, S.; Hasegawa, M.; Yukawa, K. Suppressive effect of flavonoid extracts from flower petals on cultered human malignant cells. J Clin Exp Med 164 : p. 829, 1993. 4. Miniati, E.; Coli, R. Anthocyanins not only for colour for foods in: Papers presented at the 1st International Symposium on natural colorants for foods. Nutraceuticals, Beverages and Confectionary. The Herald Organization, 1993. 5. Harbone, J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. Ed. Chapman and Hall. UK. 1984, pp:61-68. 6. Valls, J; Mateos, S; Lampreave, M; Nadal, M; Arola, L. Contenido y evolucin de los antocianos en la maduracin de variedades antctonas y forneas. Revista Tcnica de Inters permanente No 3.056 5 de marzo de 2005. pp. 726-730. 7. Valls, J.; Lampreave, M.; Nadal, N.; y Arola, L. Importancia de los compuestos fenlicos en la calidad de los vinos tintos Enologa: pp 119-121, marzo 2000. 8. Indice de MERCK Eleventh Edition, USA: Merck Co, 1989 9. Rao, C. Espectroscopa ultravioleta y visible,. madrid: Alambra, S.A., 1970. p. 258. 10. Davies,-AJ; Mazza,-G. Separation and characterization of anthocyanins of Nonarda fistulosa by high performance liquid chromatography, J-Agric-FoodChem. 40(8): p.1341-1345, 1992. 11. Kidoy, L.; Nygard, A.M.; Andersen, O.M.; Pedersen, A.; Aksnes, D.W.; Anthocyanins in fruits of Passiflora edulis
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