Apuntes de clases. 2012 Tcnicas para fibras colgenas y elsticas del Tejido Conjuntivo.

Prof. TM Patricia Toledo Rodrguez

En el tejido conjuntivo se identifican varios elementos: msculo liso, estriado, eritrocitos, fibras y otros tipos celulares .Las fibras colgenas estn constituidas por grupos fuertemente catinicos dependiente de los aminocidos que forman su cadena polipeptdica (glicoprotenas bsicas) con alta proporcin de glicina, hodroxiprolina y prolina, adems de pequeas cantidades de hidroxilisina de manera que se aprovecha esa caracterstica para ser identificados con colorantes aninicos. Se identifican cerca de 20 tipos diferentes de colgenas, reconocidas por su secuencia de aminocidos, y sus propiedades fsicas e inmunolgicas. En mamferos destacan cuatro: Tipo I : colgeno de tendones Tipo II: componente de cartlago hialino Tipo III: Piel y msculos, membranas basales Tipo IV.: principal colgeno de membranas basales (en asociacin con otras protenas) es no birrefringente. Dentro las metodologas de identificacin de las fibras colgenas, destacan las tcnicas Tricromicas (tres colores). Las tcnicas tricrmicas tienen siempre un colorante nuclear y al menos dos colorantes aninicos que se utilizan asociados a una molcula de heteropolicido (HPA). Se discuten tres teoras del mecanismo de tincin. 1.- Los HPA: los ms usados son el cido fosfomolibdico PMA y el cido Fosfotungstico PTA; stas molculas se usan en pasos sucesivos o en asociacin a los colorantes aninicos. Los HPA tienen la propiedad de unirse a protenas y aminocidos, pero no a hidratos de carbono, el efecto es la coloracin selectiva de las fibras de colgeno por uno de los colorantes aninicos, cartlago y algunas

mucosustancias muestran la misma afinidad tintorial pero ms leve. El cido fosfomolbdico no solamente produce una tincin intensa de las fibras de tejido conectivo por colorantes de grupos aninicos, sino que tambin reduce la tincin del citoplasma. Los HPA forman enlaces coordinados con molibdatos o tungstato o iones de cido fosfricos. Son colorantes aninicos: azul de anilina, fucsina cida, fast green y verde luz. El uso de los HPA adems favorece colorear en un medio fuertemente cido, el pH ptimo es cerca de 1,5 (a pH 2,5 hay prdida de un 50% de la afinidad). 2. Los HPA generaran una fuerte negatividad en la carga de las fibras de colgeno, similar a la funcin de un MORDIENTE. Esta teora tiene detractores, pues deja absolutamente de lado la conocida composicin de la fibras de colgeno, adems de generarse un conflicto con la hemoglobina de los eritrocitos, pues tiene una alta proporcin de aminocidos bsicos y no se tie igual que las fibras de colgeno. Se sugiere que los colorantes se uniran por fuerzas inicas a los HPA que ya estaran unidas a las fibra de colgeno. 3. Los HPA tendran dos maneras de unirse a los tejidos, primero por uniones ionicas de los HPA con protenas del citoplasma que inhibiran las uniones de los colorantes en el citoplasma, la unin de los HPA a las fibras de colgeno seran por uniones no inicas. Esta teora tiene detractores. En general, para stas tcnicas no se recomiendan alcoholicos; los mejores resultados se obtienen con mezclas en base de mercurio (recordar desenkerizar los cortes), Formalina logran buenos resultados. Se pueden mordentaciones de las muestras fijadas con formalina con fijadora de Bouin. fijadores fijadoras Bouin y realizar solucin

Se prefiere realizar tincin nuclear con Hematoxilina de Weiger, debido a que la laca formada es ms fuerte que las aluminicas, adems de no requerir proceso de diferenciacin. Se postula que el mecanismo de coloracin no es solo atribuible al efecto de los HPA, sino que adems intervendran factores como la malla molecular formada por el entrecruzamiento de las protenas durante la fijacin lo que genera grados de permeabilidad al paso de

los colorantes, motivo por el que muestras fijadas con dialdehdos (Glutaraldehdo, glioxal, etc) no son recomendables en stas tcnicas. Esto explicara que colorantes de peso molecular menor (cido pcrico, orange G, biebrich, azofloxina, etc) son capaces de penetrar algunas estructuras como citoplasma (poro fino) producindose una coloracin diferencial con aquellas estructuras con una red ms laxa. Segn J.A. Kiernan la selectividad de stas tcnicas es aun poco entendida. En resumen: los cortes primero se tien con un colorante nuclear (hematoxilinas frricas frecuentemente), luego al menos dos colorantes cidos junto a HPA, que sumado a diferencias de permeabilidad se genera la tincin selectiva de citoplasma y fibras de colgeno.

1. Mtodo de Masson Se utiliza en general para diferenciar las fibras colgenas del msculo liso. Mecanismo: los colorantes utilizados en ste mtodo son Solucin acuosa de Biebrich Scarlet (CI 26905) + Fucsina cida (42685) ambos en solucin con cido actico. Solucin acuosa de cido fosfomolbdico-fosfotngstico (denominados colorantes sin colorear), tiendo citoplasma, queratina y fibras musculares de color rosado a rojo. Azul de anilina (CI 42755) en medio cido que tien las fibras colgenas. El azul de anilina puede ser reemplazado por verde luz al 2% (CI 42095) o fast green FCF (CI 42053) en medio cido. Tincin nuclear con Hematoxilina de Weigert, ncleos negros

2. Mtodo Picro-fuscina de Van Gieson Mecanismo: Se inicia con la tincin nuclear con Hematoxilina de Weigert. Luego es una solucin en medio cido se entrega a los aminocidos carga positiva (prolina, glicina e hidroxilisina), permitiendo la coloracin con la fucsina cida (CI 42685) o el ponceau que van junto a una solucin acuosa saturada de cido pcrico, Fibras colgenas rojas. Por otra parte al ser el cido pcrico una molcula de pequeo tamao logra teir el citoplasma clular de color amarillo ( un buen control son los glbulos rojos que estn presentes en el corte histolgico).

3. Mtodo de Mallory (1905) Metodo: los colorantes utilizados son Fucsina cida 0,1- 0,5 % en solucin acuosa (CI 42685), dando la tincin nuclear. Una solucin de azul de anilina (CI 42755, tener la precaucin de no usar el colorante soluble en alcohol) o azul de metileno (CI 42780) para fibras colgenas; con Orange G (CI 16230) el que es una partcula muy difusible (citoplasmas) y cido Fosfotungstico 2% o Fosfomolibdico (heteropolicido que forma una laca entre el colgeno y el colorante).

4. Coloracin diferencial de colgenas tipo I, II y III Rojo Sirius. Mtodo: Utiliza una solucin de picro sirius (rojo sirius F3BA CI 35780 0.1% - 1% en una solucin acuosa saturada de cido pcrico), los resultados son fibras de color rojo y citoplasma amarillo; las lminas al ser observadas en microscopio de polarizacin, la tincin lograda no es selectiva, pero ofrece una oportunidad de identificar especialmente las fibras de colgenas neo formadas, las colgenas tipo I amarillo brillante, naranja o rojo, las II (de acuerdo a orientacin) azules o amarillas claras, III verde. Las fibras colgenas y reticulares son anisotrpicas en cortes longitudinales (birrefringencia amarilla) e isotrpicas en cortes transversales.

5. Mtodo de Gomori:

Mtodo: es un mtodo en un paso. Utiliza una solucin de Hemalumbre de Gomori (hematoxilina + alcohol absoluto + alumbre de potasio + dixido de mercurio + agua destilada) y Colorante de Gomori (agua destilada + Chromotro 2R CI 16570+ Fast green FCF CI 42053 + cido fosfotngstico y cido actico); el pH de la solucin es de 2,5 a 2,7 levemente superior al ptimo para fibras colgenas, por lo que puede presentar una coloracin incompleta y difusa del componente fibrilar ms fino; resultando los ncleos y fibras musculares de color violeta, fibras colgenas verde y los citoplasmas rosados.

Otros mtodos para fibras colgenas son: tricromicro Azan de Heidenhein, Mtodo rpido de Mallory- Heidenhein, Tricromico de Cason, Gallegos, Gabe, Mtodo de Ramon y Cajal para fibras reticulares, colgenas y elsticas., Mtodo de Arteta, Mtodo de Allchrome de Lillie Colorantes utilizados: Fucsina cida: es generada a partir de la F. bsica mediante la adicin de grupos sulfnicos (que le dan el carcter cido) Rojo Sirius: colorante poliazo, es una molcula de un PM ms alto que la Fucsina, pero planar. Puede ser reemplazada por el colorante benzo azul BB (CI 22610), la birrefringencia ahora obtenida es azul-violeta a amarillo.

Verde Luz:

Azul de anilina: hasta el da de hoy se dan dos frmulas diferentes de ste colorante, por lo que es posible que en las presentaciones comerciales se encuentran ambas. Acido Pcrico:

IDENTIFICACION DE LAS FIBRAS ELASTICAS. Las fibras elsticas estn constituidas en un 92% por elastina y un 8% por microfibrillas. La elastina es una protena hidrofbica que contiene muy pocos aminocidos con cadenas laterales ionizables, es rica en aminocidos no polares. Las microfibrillas son ricas en aminocidos polares, posee gran cantidad de cisternas (por lo tanto abundan los grupos SH) y un 5% de ellas corresponde a hexosas-hexosaminas (glicoprotenas). Los colorantes no sern atrados a la elastina con fuerzas inicas electrostaticas, si no que se postula sea por fuerzas de Van der Waals y puentes de Hidrgeno cuando la solucin colorante es alcohlica. Si se realiza un bloqueo de los grupos reactivos, se genera poco efecto en la coloracin y la prevencin de puentes de hidrgeno disminuye levemente la coloracin, el tipo de uniones que estara jugando un papel muy importante son las fuerzas de Van der Waals. Mecanismo de accin Hematoxilina de Verhoeff. HEMATOXILINA: colorante aninico ALCOHOL ABS.: solvente de la hematoxilina CLORURO FERRICO: accin de mordiente y oxidante SOLUCION DE YODO: estabilizador de la hematoxilina Las teoras que explican el mecanismo de tincin de la HV son empricas. La capacidad de tincin de la solucin de yodo disminuye en el tiempo (horas) y el efecto del yodo es aumentar la vida til de la H Frrica. El hecho que la capacidad de tincin disminuya en el tiempo se debe a que los iones fierro estn en exceso (cloruro frrico al 10%) forman un complejo metal-colorante, epro estas solucione no son indifenidamente estables. Por otro lado, el yodo puede cambiar la oxidacin de los grupos SH y las microfibrillas que componen la fibras elsticas; esto resulta importante pues la unin del colorante al tejido es por puentes de hidrgeno y fuerzas de Van der Waals.

El mtodo se realiza en dos pasos: 1. Se realiza una sobresaturacin de las fibras elsticas con la Hematoxilina ferrica. 2. Se realiza una diferenciacin con cloruro ferrico al 2%, el cual extrae el colorante unido inespecficamente. Es opcional una tincin de contraste

Mtodo de ORCEINA La Orcena es un colorante natural que se utiliza en solucin alcohlica puesto que no es muy soluble en agua. Mecanismo: complejo colorante, oxaxina y azino oxaxinas bsicas, se cree que une por puentes de hidrgeno, fuerzas de van der Waals o uniones no especficas con grupos aromticos. El colorante es insoluble en agua por lo que se disuelve en alcohol; es muy importante el pH cido se utiliza para aumentar las posibilidades de uniones por fuerzas de Vander Waals y puentes de H. Pues si se trabaja a pH neutro es un colorante cido y colorea ms fuertemente las fibras de colgeno, obtenindose coloraciones poco selectivas. La tincin se realiza por sobresaturacin y luego se diferencia con alcohol clorhdrico al 1%.

BIBLIOGRAFIA: Gua de Tcnicas de Histologa y Citologa, segunda edicin U de Chile. Manual de laboratorio clnico diagnstico. Raimundo Garca del Moral, 2001 Tcnicas en histologa y biologa celular. Luis Montuenga . 2009 Histological and histochemical Methods J.A. Kiernan 4 edicin Apuntes UC