LOS ANIMALES TRANSGNICOS. UN ANLISIS SOBRE LAS IMPLICACIONES TICAS DE SU CREACIN Y DE SU UTILIZACIN.

Proyecto de investigacin Transgnesis, clonacin animal y xenotransplantes: aspectos ticos y jurdicos (BIO2001-0044) Dra. Ana Aguirre Escobal, Profesora de Gentica del departamento de Gentica, Antropologa Fsica y Fisiologa Animal, de la Facultad de Ciencia y Tecnologa de la Universidad del Pas Vasco/ Euskalherriko Unibertsitatea

LA BIOTECNOLOGA Y SUS IMPLICACIONES TICAS Los temas ticos relacionados con la biotecnologa quedan dentro del mbito de lo que se denomina la Biotica, una rama de la filosofa que se centra en el anlisis de las implicaciones morales de la Medicina y de la investigacin cientfica. El trmino Biotica apareci por primera vez en 1970 para designar los problemas ticos planteados por los espectaculares avances que sucedieron esos aos en los campos de las Ciencias Biolgicas y Mdicas (Gracia, 1991). En ese momento comenz a extenderse la idea, que an contina en nuestros das, de que las nuevas tecnologas biolgicas y sanitarias podran comprometer gravemente la calidad de vida, e incluso, la permanencia de la vida misma en el planeta. Los recientes avances que se han producido en el campo de la Biotecnologa han generado un incesante debate biotico fundamentalmente debido a que las nuevas tecnologas ofrecen oportunidades sin precedentes de manipular los organismos vivos. Aunque estas oportunidades permiten la mejora potencial de la vida humana y contribuyen al crecimiento laboral y econmico, pueden implicar profundos dilemas ticos. Dos son las razones que subyacen en el conflicto que generan las nuevas tecnologas. Primero, que los aspectos ticos que rodean a la biotecnologa no siempre se pueden reducir a una nica eleccin o dilema moral sino que suelen estar acompaados de multitud de retos ticos. En muchas ocasiones estos retos no surgen exclusivamente por el avance biotecnolgico, pero ciertamente se produce una agudizacin de los mismos como consecuencia de las nuevas oportunidades que se consiguen. Segundo, porque las tcnicas biotecnolgicas son tan nuevas que no disponemos de precedentes histricos sobre su aceptacin y utilizacin tica. La moderna biotecnologa naci en un determinado contexto socio-poltico y estableci un precedente, ligado a la industria, que ha marcado su desarrollo posterior y que todava hoy mantiene su influencia. Entre 1973 y 1974 Herbert Boyer y Stanley Cohen, de la Universidad de California, San Francisco, desarrollaron un proceso tcnico mediante el cual era posible introducir DNA de un organismo en otro. En 1974 las Universidades de California y de Stanford solicitaron una patente sobre el proceso de recombinacin de DNA, la cual fue aprobada en 1980. Esta solicitud estuvo acompaada de una importante controversia en cuanto a la utilizacin de la tecnologa del DNA recombinante y en cuanto a que su aceptacin supona una comercializacin de la Biologa. Se produjeron graves tensiones en la comunidad cientfica, y en EEUU se alzaron voces solicitando que las autoridades gubernamentales regulasen la investigacin en ingeniera gentica. Una revisin de estos hechos histricos puede consultarse en Hughes (2001).

En 1973, poco despus de que se hiciese pblica la posibilidad de manipular el material gentico, un grupo destacado de investigadores en biologa molecular remiti una carta a la prestigiosa revista cientfica Science, en la que llamaban a una moratoria autoimpuesta sobre ciertos experimentos cientficos que utilizaban la tecnologa del DNA recombinante. En Febrero de 1975, 140 participantes, la mayora de ellos bilogos, se reunieron en Asilomar (California, USA) para debatir sobre la seguridad del DNA recombinante. En esta reunin, recordada en el futuro como la conferencia de Asilomar, se debatieron cuestiones que tenan que ver con los riesgos que podan comportar algunos experimentos y sobre la responsabilidad social de las investigaciones en biologa molecular. Como resultado de la conferencia se acord una moratoria en ciertos trabajos que utilizaban la tecnologa del DNA recombinante, sobre todo aquellos que tenan que ver con la manipulacin de genomas virales, a pesar de la ya entonces evidente potencialidad de esta tecnologa, de la enorme competitividad cientfica que caracterizaba a este campo cientfico y de no existir ninguna evidencia clara de ningn tipo de riesgo. En esta reunin se excluyeron del debate las cuestiones ticas y prevalecieron los temas de seguridad, lo cual permiti establecer unas guas de seguridad, que todava estn vigentes, y cuya puesta en prctica persuadi al Congreso de EEUU de que no eran necesarias medidas legislativas extraordinarias (los cientficos podan gobernarse a s mismos). Coincidiendo con el 25 aniversario de esta histrica conferencia, un grupo de investigadores volvi a reunirse en el Centro de Conferencias de Asilomar en Febrero del 2000 con la intencin de analizar la evolucin en la seguridad de esta tecnologa en los aos transcurridos, as como las previsiones para las aplicaciones y futuras evoluciones tcnicas. En esta ocasin no exista el sentido de la urgencia que domin la primera reunin ya que la mayor parte de los cientficos actualmente consideran que la tecnologa del DNA recombinante es segura. A pesar de ello, la sociedad actual est enormemente preocupada acerca de las aplicaciones de la manipulacin gentica y es mucho ms insistente a participar en el debate que en la dcada de los 70. Respecto a la primera reunin, la situacin actual de la comunidad cientfica es bien diferente. Los reunidos en la primera conferencia representaban a una comunidad cientfica con intereses puramente acadmicos. Hoy, debido a las numerosas aplicaciones comerciales de la ingeniera gentica, gran parte de los investigadores tienen lazos con compaas biotecnolgicas, lo cual complica enormemente cualquier intento de auto control por parte de la propia comunidad cientfica. Por estas y otras razones, los participantes concluyeron que ahora no resulta apropiado que los cientficos sean los encargados de analizar los riesgos de su trabajo y que tampoco parece adecuado dejar aparte el anlisis de las implicaciones ticas de esta tecnologa (Barinaga, 2000). Puesto que la creacin de animales transgnicos es una de las aplicaciones actuales de la tecnologa del DNA recombinante, el anlisis sobre su seguridad y sobre las implicaciones ticas de su utilizacin forma parte del debate social y traspasa las barreras del anlisis cientfico. Como ocurre con otras aplicaciones de esta tecnologa, nuestras sociedades se debaten entre dos visiones a priori contrapuestas. Por un lado, nunca antes haba existido una mayor sensibilidad tica por el respeto a la utilizacin de los animales. Por otro, las aplicaciones de esta tecnologa alcanzan campos que tienen un enorme inters social y econmico y su utilizacin puede derivar en considerables beneficios para la humanidad. Esta doble vertiente es responsable de que existan diferentes sensibilidades en cuanto a la utilizacin de los animales (transgnicos o no). As, algunas personas defienden la abolicin del uso de los animales en base a los derechos de estos organismos,

mientras que otras defienden que la sociedad est legitimada para utilizar los animales, independientemente de si se considera que los animales tienen derechos o no. Este debate, que no es exclusivo de los animales transgnicos, sirve sin embargo como marco para algunos argumentos contrarios a su utilizacin, sobre todo en lo que tiene que ver con su aplicacin a la experimentacin. Por ello, presentar en primer lugar el debate que tiene que ver con el uso de los animales, antes de analizar el hecho de que sean transgnicos, y posteriormente describir someramente las diferentes tcnicas implicadas en la creacin de animales transgnicos para posteriormente revisar los beneficios y los riesgos atribuibles a la aplicacin de esta tecnologa. DERECHOS DE LOS ANIMALES Y LA EXPERIMENTACIN ANIMAL Tal y como sugiere Lacadena (2003), lo primero que deberamos preguntarnos, en relacin a este enunciado, es si los animales pueden tener derechos. Desde el punto de vista jurdico parece claro que no es apropiado hablar de derechos de los animales ya que no se puede considerar que sean sujetos de responsabilidades ni de derechos (si acaso, podran ser objeto de derechos). Desde un punto de vista tico, la cuestin es compleja. Algunas personas consideran que los animales no son sujetos ticos puesto que no tienen capacidad de reclamar sus derechos, no pueden hacer juicios de valor sobre las consecuencias de sus actos y no tienen capacidad de decidir sobre sus acciones. Esta aproximacin, en la que se considera que los animales no son sujetos ticos y, por lo tanto, no tienen derechos, no excluye, sin embargo, el que los humanos, que s tenemos consideracin de seres morales y por lo tanto merecedores de derechos, tengamos la obligacin de velar por su bienestar, as como de mantener el medio ambiente, animales incluidos, en las mejores condiciones posibles. Frente a esta percepcin, segn algunas encuestas (Rollin, 2002), la mayor parte de los ciudadanos creen que lo animales s tienen derechos. En base a estos derechos, algunos reclaman la abolicin del uso de los animales en cualquier manifestacin social, incluso en la alimentacin, y proponen el vegetarianismo como sistema de alimentacin ticamente ms adecuado. Otros, en cambio admiten la legitimidad del uso de los animales por parte de la sociedad, independientemente de sus creencias sobre si tienen derechos o no. Como vemos, el panorama es realmente complejo. La creencia extendida sobre los derechos de los animales surge, probablemente, de los cambios radicales que se produjeron en el uso de los animales a mediados del siglo XX. Durante la mayor parte de la historia de la humanidad, la utilizacin de los animales mayoritariamente tena que ver con la agricultura (alimentacin, vestimenta, locomocin, fuerza). La clave del xito estuvo en el respeto a la naturaleza del animal, situndolos en ambientes para los que estaban biolgicamente adaptados y aumentando su capacidad natural de sobrevivir protegindolos de la depredacin, proveyndoles de comida, de agua, de atencin sanitaria, etc. Con el desarrollo de la tecnologa, la situacin ha cambiado y ahora es posible ubicar a los animales en ambientes y usos que no modifican su produccin pero s su bienestar. Se puede discutir sobre si los animales tienen derechos legales, derechos morales, derechos naturales, derechos intrnsecos, o derechos otorgados, pero atendiendo al acuerdo generalizado que considera que la especie humana debe contribuir al bienestar de los animales, el 15 de octubre de 1978 la Organizacin de las Naciones Unidas para la Educacin, la Ciencia y la Cultura (UNESCO), y posteriormente la Organizacin de las Naciones Unidas (ONU), aprob la Declaracin Universal de los

Derechos de los Animales. En esta declaracin se hace hincapi en que los animales tienen derecho a la vida y merecen respeto, y se incide en que no deben ser sometidos a malos tratos ni a actos crueles. Se recoge adems un artculo sobre experimentacin en el que se refleja la incompatibilidad de los derechos del animal con experimentaciones que impliquen sufrimiento fsico o psicolgico, independientemente de que su aplicacin sea mdica, cientfica, comercial o de cualquier otro tipo. Este tema, el de la experimentacin con animales, es probablemente uno de los ms difciles de abordar ya que en l se combinan potenciales beneficios cientficos, acadmicos, militares y mdicos con el sufrimiento y la muerte de un elevado nmero de animales. En el mbito de la experimentacin cientfica, los beneficios del uso de animales son realmente importantes. Probablemente los objetivos ms frecuentemente buscados por los investigadores que utilizan animales en la experimentacin cientfica tienen que ver con cuestiones como la de comprobar la eficacia y la toxicidad de nuevas sustancias, compuestos qumicos o potenciales medicamentos, y as evitar poner en riesgo la vida y la integridad de los seres humanos, o con el establecimiento de modelos de patologas humanas que ayuden a conocer los mecanismos moleculares y fisiolgicos de las mismas y que permitan el diseo futuro de nuevas terapias. Sobre el equilibrio existente entre estos potenciales beneficios y el sufrimiento y muerte generado a los animales de experimentacin cientfica, existen muy diversas posiciones. Algunos, como el conocido profesor de filosofa Peter Singer, ponen el acento en al sufrimiento que experimentan los animales, manteniendo que si su sistema nervioso es similar al nuestro, lo ser tambin el dolor que experimentan. Este autor defiende que los animales tienen derecho a que no se les haga sufrir. Su argumento ms controvertido es probablemente el de que si no resultase injusto matar a un animal (sin inflingirle dolor), porque se considerase que no tiene una concepcin de su propia realidad ni planes de futuro, tampoco resultara injusto matar (sin sufrimiento) a un nio pequeo o a un adulto mentalmente retrasado (Singer, 1989). Algunos grupos proteccionistas consideran que la experimentacin animal es una prctica cruel, innecesaria y poco seria desde una perspectiva cientfica. Apoyan estas afirmaciones con argumentos mdicos que inciden en las diferencias fisiolgicas y anatmicas entre humanos y otros animales: enfermedades que matan o daan a seres humanos, como la artritis, la esclerosis mltiple o la alta presin sangunea, no afectan a animales. Resaltan tambin que existen mltiples ejemplos de productos qumicos que se comportan de muy diferente manera en humanos y en otros animales: la penicilina y las aspirinas, beneficiosos en humanos, son letales para gatos; el arsnico es letal en humanos, pero no en ovejas y ratones; la morfina es un sedante en humanos, pero excita a gatos, cabras y caballos; etc. Apoyan sus afirmaciones con el ejemplo dramtico de la talidomida, un somnfero que fue prescrito para embarazadas en la dcada de los sesenta despus de que fuese administrada a perras, gatas, monas, ratas, hmsteres y gallinas, todas preadas, sin que se observase ningn efecto sobre las cras de estos animales. Sin embargo, su aplicacin a la especie humana provoc la muerte y graves malformaciones a cerca de 10.000 nios y nias. Para estos grupos proteccionistas, el ejemplo anterior y algunas otras discordancias en el efecto de medicamentos en especies animales distintas demuestran que un producto inofensivo en una especie puede ser mortal para otra, reduciendo as la importancia del uso de los animales en la experimentacin con frmacos.

A pesar de los ejemplos anteriores y de otros parecidos, la mayor parte de la comunidad cientfica defiende el papel esencial de la investigacin con animales en el mbito de la Biomedicina. Actualmente, no puede haber nuevas medicinas o vacunas sin investigacin y desarrollo de las mismas en animales. En todo el mundo se requiere la investigacin en animales para procurar las mayores garantas de que el producto es seguro en humanos. Ahora bien, a fin de evitar la crueldad que en ocasiones implican algunos experimentos con animales, la comunidad cientfica y las reglamentaciones de muchos pases han desarrollado guas y legislaciones sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio que pretenden velar por el bienestar y el cuidado humanitario de los animales usados en la investigacin biomdica. En 1959, Russell y Burch hicieron pblica una propuesta que pretenda la eliminacin progresiva del uso de los animales en experimentacin, dando paso a la utilizacin de otros mtodos alternativos. Su propuesta, conocida como las tres erres (por reduccin, refinamiento y reemplazo) fue alcanzado un auge creciente. Se basaba en reducir el nmero de ejemplares animales utilizados en cada experimento en particular; refinar las tcnicas de investigacin de forma que se evite todo sufrimiento o dolor innecesario para los fines ltimos del ensayo cientfico; y reemplazar el uso de animales vertebrados vivos y conscientes por otros mtodos o modelos de experimentacin alternativos. Con estas metas, en la dcada de los 60 y 70 se establecieron diversos movimientos antiviviseccin y en defensa por los derechos de los animales. La puesta a punto en la dcada de los 80 de las tcnicas de cultivos celulares hicieron finalmente realidad la posibilidad de contar con modelos de experimentacin alternativos. Paralelamente, la sociedad tom conciencia de que gran parte de las vctimas eran utilizadas para testar cosmticos y nuevos armamentos. Todo ello confluy en que varios pases decidieran adoptar la propuesta de las tres erres en la dcada de los 90 y consiguieran reducir el nmero de animales utilizados en los laboratorios, gracias al desarrollo y diversificacin de mtodos de experimentacin alternativos, como los cultivos de tejidos o los modelos biolgicos computarizados que permiten realizar predicciones sobre los efectos que pueden tener nuevos frmacos sobre la salud humana, en base a datos previos de medicamentos similares. As, en 1988, el nmero de procedimientos realizados con animales por la industria cosmtica inglesa ascenda a 17.500, nmero que pudo ser reducido a 2.500 en el ao 1996. Un reciente artculo publicado por Carlsson et al. (2004), analiza 2.800 artculos cientficos publicados entre 1980 y 2000 en 14 revistas biomdicas destacadas. Durante este perodo la proporcin de estudios que utilizaban animales decreci un 30%. Considerando slo los artculos que utilizan animales, en este tiempo se ha producido un significativo incremento de trabajos, del 21-35%, en los que los animales no han sido tratados pero se les ha practicado la eutanasia para que sirvan como donantes de materiales biolgicos, un gradual descenso en el nmero de estudios crnicos y una disminucin del 50% en el nmero medio de animales utilizados por artculo publicado. El debate social y biotico que ha surgido en las ltimas dcadas respecto a la utilizacin de animales en la investigacin se ha materializado en muchos pases, principalmente europeos, en el desarrollo de marcos legales que regulan estos aspectos de la investigacin cientfica. Paralelamente se ha llegado al convencimiento social y cientfico de que la mejora en el trato de los animales de investigacin optimiza los resultados y permite disminuir a la dcima parte la cantidad de animales

que necesita un investigador. El motivo de esta reduccin es que la consideracin del bienestar animal permite reducir el estrs y, por consiguiente, evitar alteraciones de parmetros biolgicos, fisiolgicos y bioqumicos que, en otras circunstancias, obligan a realizar numerosas repeticiones de los ensayos. No obstante, actualmente siguen existiendo grupos contrarios a la utilizacin de animales en investigacin que preconizan la proteccin de los animales por encima de cualquier beneficio posible que resulte de su utilizacin cientfica. La mayor parte de ellos participan en el debate pblico sobre la utilizacin de animales en la investigacin y se mantienen alejados de actitudes delictivas como las que han protagonizado algunos grupos en los ltimos aos. En Gran Bretaa, personas con conexiones con firmas que ensayan con animales estn sufriendo acoso, dao a las propiedades, y violencia en manos de algunos grupos activistas. En respuesta a estos ataques, en abril de este ao se ha constituido el grupo de apoyo, denominado Vctimas del Extremismo de los Derechos Animales (VARE), para que los afectados puedan comentar cmo se han enfrentado al acoso de estos grupos extremistas. Recientemente se han emprendido acciones legales contra algunos activistas que haban cometido actuaciones vandlicas, establecindose penas de crcel para algunos de los acusados. Algunas de estas prcticas violentas se estn ahora extendiendo a otros pases, como EEUU, en donde las actividades de estos ncleos duros en defensa de los animales son consideradas como una seria amenaza interna (Notebook, The Scientist, 2004). LA TICA DEL USO DE LOS ANIMALES TRANSGNICOS. El trmino animal transgnico se refiere a un animal cuyo genoma ha sido deliberadamente modificado, mediante transferencia de un DNA exgeno, en todas sus clulas, incluidas las germinales. En 1981, Gordon y Ruddle acuaron la palabra transgnico como una variante animal originada tras la introduccin de un gen, o genes, en su genoma, y Palmiter y Brinster en 1986 describieron la introduccin de genes en clulas de la lnea germinal. Actualmente existen otros trminos para referirnos a un organismo transgnico, por ejemplo, el trmino OMG (organismo modificado genticamente), trmino que se aplica esencialmente a plantas transgnicas, aunque en sentido estricto podra incluir a todo tipo de organismos genticamente modificados (tambin microorganismos). Ms recientemente se tiende a utilizar el trmino AMG (animal modificado genticamente) para referirnos a animales transgnicos. En este momento, la utilizacin de animales transgnicos, o animales modificados genticamente, representa una de las herramientas de investigacin ms potentes y completas de las ciencias biolgicas. La transgnesis animal incluye la adicin, sustitucin o inactivacin de uno o varios genes y sus aplicaciones incluyen el terreno de la investigacin bsica (creacin de animales modelo para el anlisis de patologas animales y humanas, descubrimiento de nuevas terapias, etc), la alimentacin (mejora de caracteres productivos en ganadera, resistencia a enfermedades, etc), la industria (sntesis de nuevos compuestos textiles, protenas teraputicas, etc) y la Medicina (posibilidad de xenotransplantes, modelos para terapia gnica, etc), entre otros. Las enormes posibilidades de la utilizacin de los animales transgnicos en muy diversos campos de inters econmico y cientfico lleva a que algunos consideren que la investigacin con este tipo de animales es incompatible con el principio de reduccin anteriormente comentado. Como ejemplo de que los animales transgnicos no contribuyen a la reduccin en el uso de los animales de experimentacin, algunos

datos: se estima que en Canad, el nmero de animales utilizados para estudios que tienen que ver con la creacin y uso de transgnicos aument un 73% desde 1997 a 1998, y que este incremento fue del 29% en Gran Bretaa y del 20% en EEUU (Gauthier y Griffin, 2001). Los estudios que contemplan la evolucin del uso de animales en diferentes pases, detectan una situacin similar: desde 1996, en Gran Bretaa, Canad y EEUU se ha producido una paulatina disminucin de los experimentos que generan dolor severo en animales no anestesiados, llegndose a alcanzar cotas actuales realmente escasas en este tipo de aplicacin (Gauthier, 2002-03); sin embargo, aunque el uso de ratones fue paulatinamente decreciendo desde 1991 a 1997, a partir de esta fecha se detecta un progresivo incremento, coincidiendo con el aumento en el uso de los animales transgnicos. La relevancia de este incremento detectado en ratones resulta patente si tenemos en cuenta que los roedores (ratones y ratas) constituyen el grupo ms ampliamente utilizado como animales de experimentacin: en 1999, por ejemplo, los roedores constituan el 85% del total de animales utilizados en Europa (Tabla 1). Datos del 2003, publicados por el Gobierno de Gran Bretaa, indican que en el 2002, la proporcin de animales transgnicos alcanzaba el 25% de los animales utilizados en investigacin, con un incremento del 12% respecto al ao anterior (Animal Aid, 2003). Tabla 1: Datos sobre el uso de animales en investigacin Biomdica en Europa (1999). European Biomedical Research Association http://www.ebra.org/stats/index.html

As pues, los datos sobre el uso de animales parecen indicar que, hasta mediados de los 90, el esfuerzo realizado por los gobiernos para reducir el nmero de animales utilizados en la investigacin estaba resultando realmente efectivo, pero a partir de esta fecha, y coincidiendo con el desarrollo de la transgenia animal, se ha producido un cambio importante en esta tendencia reductora.

El incremento en el uso de animales en investigaciones que incluyen procedimientos de transgenia tiene que ver, en parte, con el hecho de que constituyen modelos para estudiar el mecanismo molecular detallado de patologas, pero tambin con que para la obtencin de los mutantes transgnicos se requieren un gran nmero de animales que son descartados por no presentar el fenotipo apropiado (no muestra las caractersticas especficas que se buscaban) o porque no son viables. En muchas ocasiones gran parte de los animales transgnicos no sobreviven mucho tiempo tras el nacimiento debido a que los defectos fisiolgicos y anatmicos directamente derivados de la introduccin del nuevo gen son demasiado importantes. As mismo, las propias tcnicas de transgnesis tienen una baja eficiencia y muchos de los animales utilizados para el proceso mueren tempranamente durante el desarrollo embrionario o fruto de anomalas anatmicas, fisiolgicas o de comportamiento. En ocasiones el proceso de transgnesis da lugar a la aparicin de fenotipos inesperados, bien por un control limitado de la tcnica de insercin de genes o bien por interacciones inesperadas del DNA introducido con otros genes propios del animal utilizado (background o fondo gentico). A modo de ejemplo, y dependiendo de la metodologa utilizada, la creacin de una cepa de ratn transgnico en el ao 2000 requera una media de 365 a 900 ratones (Monash University, 2000). Ciertamente las tcnicas han mejorando algo, pero la obtencin de un animal transgnico sigue requiriendo la prdida de un elevado nmero de animales. Una vez fundada una cepa de un animal transgnico, los animales posteriores son producidos mediante mtodos de cruzamiento convencionales, para as obtener los animales que se vayan a utilizar en posteriores experimentos. Mediante estos cruzamientos convencionales se obtienen adems, animales que no poseen el genotipo requerido. Frecuentemente estos animales, que no son genticamente equivalentes a los animales de cepas no transgnicas, no se utilizan en otros proyectos o experimentos, y son animales que se pierden durante el proceso. En relacin con la segunda erre, el refinamiento, la situacin es compleja. Las tcnicas de transgenia, como comprobaremos ms adelante, son cada vez ms precisas, en lo que a la insercin de genes se refiere. Por ello, los efectos indeseados del proceso de insercin, al menos en algunas especies, cada vez son ms fciles de evitar. Sin embargo, en algunas ocasiones, la utilizacin de la transgenia est asociada a la bsqueda de efectos fenotpicos fcilmente detectables por el investigador, efectos que suelen estar asociados a la presencia de importantes alteraciones anatmicas, histolgicas, fisiolgicas, etc. En este sentido, una de las aplicaciones ms frecuentes e interesantes, desde el punto de vista cientfico, es la creacin de los denominados transgnicos knockout, es decir, animales a los que se les sustituye un gen funcional por una versin no funcional, mediante recombinacin homloga. Este tipo de mutagnesis dirigida produce la ausencia de un determinado producto gnico funcional. Esta tcnica ha sido desarrollada y aplicada sobre todo en ratones con el objetivo de crear modelos de enfermedades humanas y animales. En estas situaciones en las que se crea la enfermedad, los animales indudablemente sufren en algn grado (Mempham et al. 1998). Se puede cuestionar si resulta adecuado aplicar la tecnologa de la transgenia para generar especficamente animales que presenten una enfermedad que, en muchos casos, ni siquiera se produce en esa especie en condiciones naturales. Pero lo que resulta evidente es que en esta aplicacin el refinamiento de la tcnica de la transgenia no se aplica con el objetivo de minimizar el dolor o el sufrimiento del animal

sino de procurar que el efecto sea debido especficamente al gen transferido. Ciertamente, podramos discutir si el sufrimiento generado por una patologa creada en un animal modelo es innecesario o no, o si se debe aliviar, pero lo que est claro es que no es evitable, a menos que se decida previamente no generar dicho animal modelo. En cuanto a la importancia de los animales genticamente modificados en la tercera erre, o de reemplazamiento, hay dos aspectos que deben ser considerados. Por un lado, la posibilidad de crear animales modelo en especies como el ratn, es una oportunidad para reducir el uso de primates no humanos en algunos tipos de ensayos, por ejemplo, en ensayos sobre la vacuna de la polio (Gordon, 1997), en investigaciones sobre enfermedades neurodegenativas (Chan 2004), sobre infecciones virales por hepatitis B, HIV, etc . Por otro lado, el desarrollo de nuevas tecnologas de inactivacin gnica, como el RNA de interferencia (RNAi), permite pensar en mtodos alternativos que en un futuro prximo sustituyan algunos experimentos que actualmente se realizan en animales mamferos knockout, por ensayos de silenciamiento gnico en cultivos de clulas troncales o diferenciadas (Hasuwa, 2002), o por ensayos realizados en animales no mamferos en los que la metodologa de recombinacin homloga no ha podido ser desarrollada hasta el momento (Roignant et al. 2003). As pues, y como resumen de lo comentado hasta ahora, parece que la tendencia durante la ltima dcada del siglo XX a aplicar en los pases occidentales los principios de las tres erres, si bien sigue considerndose adecuada por la mayor parte de la comunidad cientfica y de las legislaciones de los pases que regulan la investigacin, actualmente no est resultando tan efectiva como hace unos aos. Es posible que las enormes posibilidades cientficas y biotecnolgicas de la transgenia (estudios sobre la regulacin gnica, investigacin fisiolgica, produccin de protenas u hormonas especficas, ensayos sobre toxicidad de medicamentos, mejora del crecimiento y de la calidad en agricultura, etc) estn dando lugar a una explosin, quizs temporal, en su utilizacin. Es importante sealar que la justificacin a esta explosin en el uso de los animales transgnicos en base a los potenciales beneficios que se pueden derivar de su uso, es una visin que entra en el terreno de la denominada tica utilitarista que, sin embargo, no es compartida por toda nuestra sociedad. As, algunos argumentos en contra del uso de los animales transgnicos en investigacin tiene que ver con una cuestin previa a su aplicacin, como es que, en la creacin de un animal transgnico, no se respeta la integridad gentica de los animales ya que se produce la mezcla de material gentico entre diferentes especies e incluso entre diferentes reinos (entre animales y plantas, por ejemplo). Algunas personas consideran que esta mezcla de material gentico entre especies, o la creacin de quimeras, que en ocasiones es parte de la estrategia tcnica para la obtencin de un animal transgnico, altera el concepto de especie y es una intervencin antinatural que podra interferir en la concepcin de lo que hace que un animal sea tal. En este pensamiento se plantean dudas sobre qu hace, por ejemplo, que un cerdo sea tal, caso de que lleve genes humanos. En respuesta a estos problemas morales se argumenta que en la ingeniera gentica no hay mezcla de genomas, sino que nicamente se transfieren 1 2 genes, una pequea fraccin del genoma de la mayora de las especies receptoras. Por ello, no se puede hablar de humanizacin del cerdo, siguiendo el ejemplo anterior, cuando se transfieren genes humanos para conseguir un cerdo transgnico. Adems, no se debe

olvidar que muchos genes estn conservados entre diferentes especies, por lo que la presencia de determinadas secuencias no parece que sea lo determinante a la hora de definir la esencia de una especie. En cuanto a la trasgresin de la barrera de especie, la discusin, desde un punto de vista cientfico, es compleja ya que no siempre la barrera de especie es clara ni inmutable (las especies cambian naturalmente a travs de la evolucin, por ejemplo). Adems, desde la introduccin de la agricultura y la ganadera, ya en el neoltico, las caractersticas de algunos animales y plantas se han alterado artificialmente mediante cruzamientos selectivos. Se argumenta que la modificacin gentica directa es meramente una extensin de las tcnicas de cruzamiento tradicionales, de forma que si las modificaciones genticas de animales proporcionan argumentos para acusaciones como jugar a Dios, antinaturalidad o tratar a los animales como mercancas, los mismos argumentos seran aplicables a los cruzamientos selectivos que se utilizan rutinariamente (Boyd Group, 1999). LOS ANIMALES TRANSGNICOS Y LAS PATENTES Otro aspecto de los animales transgnicos que genera controversia tica es que su desarrollo colabora a la tendencia general de solicitar patentes respecto a la creacin de nuevas formas vivas. Esta tendencia no es nueva ni surge del desarrollo de la Biotecnologa, ya que hay una larga historia previa sobre patentes relacionadas con organismos vivos, y sus elementos o productos, cuya utilizacin pretende solucionar problemas relativos a la salud humana y animal. El criterio habitualmente aplicado para considerar una patente es que el objeto de la misma sea una invencin novedosa (no debera existir antes), para cuya obtencin debe haberse aplicado la inventiva (la invencin no debe ser obvia para un especialista en ese campo), y debe ser industrialmente aplicable (capacidad de ser desarrollado para un uso prctico). Las invenciones deben ser descritas con suficiente detalle como para que puedan ser desarrolladas por otros especialistas en el campo. La primera patente de un ser vivo data de 1843 y fue otorgada en Finlandia para una levadura utilizada en procesos de fermentacin. En general, las legislaciones contemplan la posibilidad de que un ser vivo, o su material gentico, sea objeto de patente. Sin embargo, tambin en general, excluyen la patentabilidad del ser humano o de las partes que lo componen, as como las patentes cuya explotacin sea contraria al orden pblico y a las buenas costumbres (moralidad). Diversos grupos cvicos, ambientalistas, cientficos, organizaciones de productores agrcolas, as como lderes religiosos, han organizado una campaa mundial en contra de la patentabilidad de seres vivos. Estos grupos consideran que los animales, plantas, seres humanos, microorganismos y sus partes -como genes y clulas-, no deben ser patentables ya que son creaciones de Dios y/o de la Naturaleza. Afirman que las formas de vida, aun las genticamente modificadas, no son invenciones y por ende no renen los criterios de "patentabilidad". Frecuentemente argumentan que las patentes de seres vivos o formas de vida carecen de tica y, adems, atentan contra los intereses sociales y econmicos de los pases en desarrollo (Kohr, 2000). Frente a esta visin, los defensores de patentar avances biotecnolgicos argumentan que las patentes no son una apropiacin de la vida sino la manera de garantizar unos derechos exclusivos de explotar temporalmente una innovacin de base biolgica. Tambin se oyen voces contrarias a las patentes de seres vivos por las implicaciones que, en el mbito de la investigacin bsica, podra tener la no publicacin, o la

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publicacin tarda, de avances cuyo objeto pudiera ser patentable. Sorprendentemente, un reciente informe sobre esta cuestin concluye que proporcionar proteccin mediante patente para los resultados de la investigacin en ingeniera gentica suele facilitar su publicacin y evita la estrategia del secreto (COM, 2002, 2 final). La reglamentacin europea respecto a la patentabilidad de los animales (Directiva 98/44) determina que las razas no son patentables, pero s las invenciones que tengan por objeto animales, si su viabilidad tcnica no se limita a una raza animal. Entre el gran nmero de patentes concedidas en el mbito de la biotecnologa desde la adopcin de la Directiva en julio de 1998, algunas de las concedidas por la Oficina Europea de Patentes han provocado fuertes reacciones entre la opinin pblica. Este es el caso de la concesin de una patente a la empresa Seabright por la creacin de un pez transgnico, la cual dio lugar a una pregunta, dirigida a la Comisin de Patentes, referente a la compatibilidad de la concesin de una patente de este tipo con el criterio de no patentabilidad de las razas de animales. La Comisin respondi que en una disposicin del Reglamento de ejecucin del Convenio sobre la patente europea se establece que podr concederse una patente para una invencin relativa a un animal en la medida en que la contribucin tcnica que implique la invencin reivindicada no quede limitada a una raza de animales determinada (COM 545, 2002), corroborando as la patente concedida. De todas las aplicaciones posibles de los animales transgnicos, la obtencin de animales productores de protenas es probablemente la que est ms relacionada con la solicitud de patentes. La creacin de estos animales transgnicos no suele tener limitaciones legales en un entorno cientfico, pero esto suele ser diferente cuando se consideran aplicaciones comerciales. Por ejemplo, para expresar una protena particular en la glndula mamaria, se necesita un promotor funcional de ese tejido. La mayor parte de las secuencias reguladoras para este propsito estn actualmente bajo patente. Adems, si el producto que uno desea producir en la leche tiene una secuencia de DNA conocida, hay riesgo de que la protena y su uso teraputico estn tambin patentados. Igualmente, si el procedimiento que se ha utilizado es el de la transferencia nuclear o la clonacin, deber tenerse en cuenta que ambos procesos han sido objeto de multitud de patentes otorgadas (Dyck et al 2003). Sin embargo, no est todo dicho en el tema de las patentes de animales transgnicos y actualmente contina la discusin sobre el equilibrio que debe reinar entre incentivar la investigacin y sus aplicaciones, y la necesidad de evitar prcticas comerciales abusivas (Lenoir, 2003). Desde el punto de vista legal, la patentabilidad de organismos genticamente modificados tambin presenta problemas y lo ocurrido hasta el momento con la patente del denominado OncoMouse u oncorratn puede servir como ejemplo de las distintas formas en que los diferentes pases intentan aplicar sus correspondientes legislaciones sobre patentes para intentar mantener ese difcil equilibrio. Cientficos de la Universidad de Harvard (EEUU) consiguieron introducir en el genoma del ratn un gen humano implicado en el desarrollo del cncer, creando as ratones transgnicos especialmente susceptibles a desarrollar tumores. Tras varias vicisitudes, incluidas audiencias pblicas en el Congreso y peticin de moratoria sobre la patente de animales en ese pas, finalmente se concedi la patente n 4.736.866, el 12 de abril de 1988. Desde entonces, esa universidad y el consorcio qumico estadounidense DuPont mantienen la patente del oncorratn en Estados Unidos. La situacin de este oncorratn a nivel mundial es heterognea: la patente ha sido otorgada en al menos 17 pases, incluyendo, adems de EEUU, Francia, Alemania, Japn y Gran Bretaa.

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En otros pases, como Canad, la solicitud de patente ha sido rechazada. En este caso, el motivo del rechazo a la solicitud de patente ha sido la consideracin de que el oncorratn no ha sido realizado por las manos del hombre y que el mismo ratn podra haber existido sin la inyeccin del oncogn en la clula huevo fertilizada, si bien, en este caso, no habra estado predispuesto al cncer (Kondro, 2002). El oncorratn se convirti, en 1992, en el primer ser vivo patentado en Europa con fines cientficos, pero la patente ha tenido dos revisiones: antes de la primera, la patente inclua a todos los mamferos transgnicos no-humanos creados con este oncogn, y antes de la segunda a todos los roedores que contenan el oncogn incorporado y activado, y a sus descendientes. Recientemente, la Oficina Europea de Patentes ha confirmado la patente de este ratn, aunque la ha restringido a roedores modificados genticamente con genes adicionales que confieran susceptibilidad al cncer (EPO, 2-Julio-2004). Las asociaciones ecologistas consideran esta decisin un xito insuficiente ya que, a pesar de que se produce una limitacin en la patente, viola el Acuerdo Europeo sobre Patentes, que excluye a las que se refieren a especies, razas y variedades animales, y deja va libre a unas 2.000 solicitudes de patentes de animales transgnicos que estn a la espera en Europa.

CUESTIONES TCNICAS DE LA TRANSGENIA EN ANIMALES Un anlisis completo de los aspectos ticos relacionados con cualquier avance tecnolgico, requiere el examen del equilibrio existente entre los beneficios potenciales y los riesgos del mismo. Para este anlisis, previamente es necesario conocer el fundamento de las tcnicas que se utilizan. As pues, voy a comenzar realizando una breve descripcin de las tcnicas utilizadas para, a continuacin, presentar de forma resumida los aspectos beneficiosos y los riesgos asociados a la creacin y uso de los animales genticamente modificados. 1.- Cuestiones generales La transgnesis consiste en introducir una secuencia de DNA en el genoma de un organismo pluricelular, de forma que aparezca en todas las clulas de ese organismo y se transmita a la descendencia. Transgnesis es un trmino que suele aplicarse a plantas y a animales, mientras que la adicin de DNA a levaduras, bacterias o cultivos celulares se denomina DNA recombinante o clulas transformadas. En general, los fragmentos de DNA que se utilizan para producir un animal transgnico son secuencias gnicas precedidas de una secuencia promotora que permite su expresin a RNA. Este RNA ser posteriormente traducido en una secuencia polipeptdica (protena). La mayor parte de las veces, el DNA extrao que se utiliza para generar un animal transgnico termina integrado en su genoma, evitndose as que sea degradado y permitindose su replicacin y su transferencia a las clulas hijas. El objetivo de la transgnesis es aadir informacin gentica a un genoma o suprimir un gen endgeno, sustituyendo su secuencia por una no funcional. El gen exgeno puede ser una versin mutada del gen endgeno o un gen completamente diferente. Se sabe que la integracin de un DNA exgeno en un genoma est mediado por los sistemas de reparacin del DNA de la clula. Las protenas implicadas en este mecanismo reconocen estructuras de DNA anmalas, regiones de hebra sencilla o

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lugares en los que el DNA exgeno se ha asociado con el DNA hospedante (Houdebine, 2003). Cuando el DNA exgeno no tiene secuencias en comn con el genoma hospedante, el reconocimiento entre los dos DNAs implica slo a cortas secuencias que son ms o menos homlogas. Este reconocimiento puede ser suficiente para inducir los mecanismos de reparacin. El DNA exgeno entonces es integrado mediante un proceso de recombinacin no homloga, que es relativamente raro y que puede suceder en diferentes lugares del genoma de forma aleatoria. Cuando el DNA exgeno presenta largas secuencias homlogas a una regin del genoma hospedante, el mecanismo de reparacin induce una recombinacin homloga especfica, que genera la sustitucin de la secuencia endgena por la versin exgena. La recombinacin homloga es, al menos, 100 veces menos frecuente que la heterloga, por lo que, cuando ocurre, normalmente es un suceso nico en un genoma haploide. 2.- Tcnicas generales para la transgnesis Para transferir los genes exgenos al genoma hospedante de clulas animales se pueden utilizar diversas tcnicas que difieren en su adecuacin para diferentes clases de animales, en su eficiencia de transformacin y en sus riesgos. Una revisin exhaustiva de estas tcnicas se puede encontrar en Houdebine, 2003. Generalmente, el gen que se quiere transferir se incorpora en un vector de expresin que contiene adems los elementos genticos necesarios para el control de su expresin. Dependiendo de la clase animal en la que se quiera realizar la transgnesis, se eligen los vectores de expresin metodolgicamente ms apropiados, teniendo en cuenta cuestiones como la seguridad desde el punto de vista gentico e inmunolgico. En general, estos vectores son de tres tipos: 1. molculas de DNA, circulares o lineales, que combinan el gen codificante de un producto de inters con un elemento que regula su expresin en el hospedante (plsmidos, csmidos, fagos, BACs y YACs). Su frecuencia de integracin en el genoma de las clulas hospedantes es baja. 2. Transposones: elementos de DNA capaces de desplazarse o saltar de un lugar del cromosoma a otro, en el mismo o en otro cromosoma. Estos elementos naturales se modifican para introducir genes exgenos y para evitar que se expandan autnoma e incontroladamente por el genoma durante la transgenia. 3. Retrovirus: virus que tienen capacidad de integrar su genoma en el de la clula hospedante y as replicarse y expresar sus genes con las clulas hospedantes. Los retrovirus utilizados como vectores han sido modificados para que mantengan la capacidad de portar los genes exgenos pero resulten ms seguros. Muy frecuentemente, los vectores de expresin portan, adems del gen de inters y de sus elementos de regulacin, genes marcadores y/o genes reporter (chivatos) que sirven, en el primer caso, para seleccionar clulas en las que ha ocurrido la transgenia (genes de resistencia a antibiticos, por ejemplo) o, en el segundo caso, para comprobar la correcta expresin del transgn (GFP, protena fluorescente verde, por ejemplo).

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El DNA que se transfecta a clulas en cultivo, normalmente est en forma circular. La mayor parte del DNA circular que entra en una clula es destruido en el citoplasma. Slo una pequea parte del DNA exgeno llega al ncleo y se integra en el genoma. Durante el trnsito desde el citoplasma al ncleo, los fragmentos de DNA exgeno se asocian y forman concatmeros (segmentos de DNA compuestos de secuencias unidas por los extremos), al igual que cuando se introduce DNA directamente en el ncleo. Puesto que generalmente el DNA exgeno se integra en forma de concatmeros de unos 100 kb, normalmente contienen de 1 a 10 copias del gen original. As pues, salvo que se utilice la recombinacin homloga, el proceso de introduccin de un gen en el genoma hospedante es un proceso no controlado en cuanto al nmero de copias que se introducen y al lugar genmico en el que lo hacen. Existen diversas tcnicas que permiten obtener un animal transgnico, portador del gen de inters en todas sus clulas, incluidas las germinales. De todas ellas, las ms frecuentemente utilizadas son las siguientes:

a) Transferencia gnica del vector de expresin a vulos fertilizados.

Se pueden utilizar varias tcnicas para introducir un DNA en un vulo fertilizado: microinyeccin (inyeccin directa mediante pipeta), electroporacin (aplicacin de pulsos elctricos para introducir poros transitorios en las membranas de las clulas receptoras), bombardeo de partculas (bombardeo de las clulas hospedantes, por ejemplo con partculas de oro rodeadas de copias del vector de expresin), etc. Cualquiera de estas tcnicas nos permite introducir el DNA exgeno en el proncleo de embriones, si bien la ms frecuentemente utilizada es la microinyeccin. Para ello, es necesario extraer previamente oocitos de las hembras donadoras y llevar a cabo un proceso de fertilizacin in vitro. Cuando los proncleos son visibles, se lleva a cabo la introduccin del DNA exgeno de inters. El desarrollo inicial del embrin es controlado mediante microscopa y en el momento adecuado, por ejemplo en etapa de blastocisto, los embriones son transplantados a hembras receptoras, hormonalmente preparadas para llevar a trmino el desarrollo embrionario. La tcnica de microinyeccin se ha aplicado a diversos tipos de animales, tanto vertebrados como invertebrados, con resultados ms bien escasos. En vertebrados superiores se ha aplicado en ratones, ratas, conejos, ovejas, cabras y vacas, pero la eficiencia del proceso es baja y decrece del ratn a la vaca, en ese orden. En estas especies, y especialmente en vaca, el nmero de embriones conseguidos por superovulacin y la tasa de integracin de un gen extrao en el genoma embrionario es muy limitada (Houdebine, 2003). Todo ello hace que la transgenia por microinyeccin sea un proceso laborioso, poco efectivo y costoso en vertebrados superiores.

b) Transferencia gnica del vector de expresin al citoplasma.

En especies que no son mamferos, los proncleos no son visibles y la microinyeccin slo se puede llevar a cabo en el citoplasma del embrin. Esto ocurre especialmente en vertebrados inferiores e invertebrados, la mayora de ellos ovparos y con un desarrollo embrionario que ocurre fuera de la madre. Para proteger al embrin y permitir su desarrollo autnomo, normalmente hay una cscara protectora sobre la que se debe realizar una pequea abertura para llevar a cabo la microinyeccin. En embriones de salmones, se deben inyectar varios millones de copias del gen de inters para obtener una tasa de animales transgnicos ptima. La eficiencia de este mtodo es bastante variable, dependiendo de la especie.

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b) Transferencia gnica del vector de expresin a gametos. Consiste en introducir por microinyeccin el DNA de inters en los gametos, antes de la fertilizacin. Los embriones obtenidos a partir de esos gametos sern portadores del transgn. En el caso de los espermatozoides, stos se incuban en presencia del DNA, seguido de una fertilizacin dirigida in vivo o in vitro. Es decir, podemos introducir el DNA exgeno en uno de los gametos, producir la inseminacin in vitro y reimplantar el embrin en la etapa de blastocisto en las hembras receptoras, o podemos introducir el gen exgeno en el gameto, introducir los gametos modificados nuevamente en el animal e inducir la inseminacin in vivo. Esta tcnica ha permitido generar animales transgnicos en ratones, peces, gallinas, conejos, cerdos, ovejas y vacas. Los resultados obtenidos hasta el momento, en general, no han sido buenos y la tasa de transgnicos obtenibles es impredecible y baja.

c) Transferencia gnica del vector de expresin a clulas troncales embrionarias.

Las clulas troncales embrionarias (Embrionic Stem cells, o clulas ES) son pluripotenciales ya que tienen la capacidad de generar todos los tejidos y rganos de un organismo, pero no son capaces de desarrollar un embrin (no son capaces de producir los tejidos extraembrionarios que lo rodean y procuran su correcto desarrollo). La introduccin de clulas ES en otro embrin genera una quimera, es decir, un organismo en el que habr clulas con distinta informacin gentica debido a su origen diferente. Cada clula de un organismo quimera, incluyendo los gametos, se originar a partir de las clulas ES del donante o a partir de las clulas del embrin receptor. Las clulas ES tienen alta capacidad de multiplicarse in vitro pero tienden a diferenciarse espontneamente, transformndose entonces en clulas multipotentes, (clulas que tienen la capacidad de producir varios tipos celulares, pero no todos). Para generar una quimera capaz de transmitir su genoma a la progenie, las clulas ES pluripotenciales deben mantenerse en ese estado durante todo el cultivo, lo cual se consigue mediante la adicin de determinados factores al medio de cultivo. Durante el cultivo, las clulas ES pueden ser transfectadas con una construccin gentica de inters y seleccionadas utilizando los genes de seleccin. La introduccin de estas clulas ES transgnicas en un blastocisto dar lugar a animales mosaico para el transgn de inters. Si las clulas ES transgnicas donantes estuviesen implicadas en la generacin, entre otros, del tejido germinal del animal quimera, sus descendientes podran portar el transgn en todas sus clulas y habramos conseguido un animal transgnico. El mtodo es muy laborioso y menos eficiente que la adicin de genes por microinyeccin. Normalmente se utiliza para sustituir genes por recombinacin homloga y ha sido la tcnica habitualmente utilizada para la obtencin de ratones knockout.

d) Transferencia gnica del vector de expresin a clulas diferenciadas y posterior

transferencia nuclear o clonacin. Es posible transferir un DNA exgeno a un cultivo de clulas ya diferenciadas y escoger las portadoras de ese DNA exgeno de forma estable mediante genes de seleccin y cultivos apropiados. Las clulas seleccionadas, portadoras de una nueva informacin gentica, pueden ser utilizadas entonces como donadoras del ncleo en un proceso de transferencia nuclear que permitir generar un nuevo individuo que portar la misma informacin gentica que el ncleo donante utilizado (en este caso el

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portador del transgn). Para ello, se obtienen vulos a los que mecnica e individualmente se les extrae el ncleo, con la ayuda de la microscopa. Las clulas seleccionadas portadoras del transgn se utilizan entonces como donadoras de ncleo, generalmente mediante fusin con estos vulos enucleados. El resultado de la fusin es una clula que contiene una dotacin cromosmica diploide (equivalente al ncleo de la primera clula obtenida tras un proceso de fecundacin) y un citoplasma en el que, aparentemente, se encuentran los factores necesarios para iniciar el desarrollo embrionario, de forma equivalente a lo que ocurre en una clula cigtica obtenida por fecundacin. El desarrollo embrionario de esta clula dar lugar a un animal que ser genticamente idntico al donador de las clulas diferenciadas, salvo en el hecho de que portar el gen de inters en todas sus clulas, incluidas las germinales. El primer animal transgnico generado mediante la tecnologa de transferencia nuclear, tecnologa utilizada en su momento para crear a la oveja Dolly, fue tambin una oveja, llamada Polly, portadora de un gen de inters teraputico para humanos, el gen humano del factor IX de coagulacin (Schnieke et al, 1997). Desde entonces se han conseguido numerosos animales transgnicos mediante esta tcnica, y en diferentes especies, gracias a las importantes ventajas que presenta esta metodologa: se necesitan muchos menos intentos que en la microinyeccin para obtener resultados favorables; la integracin del gen puede ser analizada en las clulas en cultivo antes de proceder a la transferencia nuclear; se pueden descartar las lneas celulares en las que el DNA exgeno se haya reordenado o est en demasiadas copias; se puede elegir el sexo y el genotipo del donador; etc. A pesar de ello, la eficiencia de la tcnica es muy baja y siguen siendo desconocidos los mecanismos moleculares que aparentemente producen la desdiferenciacin de los genomas de las clulas diferenciadas utilizadas como donadoras de informacin gentica. La posibilidad de llevar a cabo procesos de recombinacin homloga para la sustitucin de genes endgenos o para la utilizacin de sistemas de control de la expresin del transgn (ver ms adelante) han contribuido tambin a que esta metodologa haya ganado espacio entre las de aplicacin para la creacin de animales transgnicos. 3.- Recombinacin homloga o sustitucin dirigida La sustitucin de genes mediante recombinacin homloga es una tcnica prcticamente rutinaria en bacterias y levaduras. En ratones se viene utilizando desde hace ms de 10 aos, pero su aplicacin a otros mamferos tiene una menor eficiencia. No obstante, la creacin de animales transgnicos mediante recombinacin homloga en clulas somticas y posterior transferencia nuclear se ha logrado en ovejas (McCreath et al., 2000), en ratones (Rideout et al., 2000), en cerdos (Lai et al., 2002) y recientemente en ganado bovino (Kuroiwa et al., 2004). Para aplicar la recombinacin homloga a la generacin de animales transgnicos, es necesario construir un vector de expresin que incluya varios miles de nucletidos homlogos a alguna regin del DNA hospedante. Las regiones con homologa eventualmente recombinarn. Si las regiones de homologa flanquean una secuencia de inters, la recombinacin en las regiones homlogas producir la sustitucin de la regin existente en el genoma hospedador por el transgn, consiguindose que la secuencia exgena se integre en un lugar especfico del genoma. La secuencia exgena puede interrumpir un gen determinado, el cual entonces quedara inactivo (knock-out o KO) o ser un gen activo, relacionado o no con el gen diana (en este caso hablamos de la integracin dirigida de un gen exgeno: knock-in o KI).

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Como ya hemos comentado, la recombinacin homloga en clulas animales es un proceso mucho menos frecuente que la integracin al azar. Por ello, las clulas en las que sucede la recombinacin homloga deben ser seleccionadas mediante la utilizacin de apropiados genes de seleccin. Las pocas clulas en las que se haya producido el proceso de recombinacin homloga, se dejan proliferar para obtener clones de clulas idnticas a partir de cada clula recombinante. Puesto que el proceso de recombinacin homloga es muy poco frecuente, lo habitual es que las clulas seleccionadas contengan una nica insercin del transgn, siendo, por tanto, heterocigotas en relacin a la presencia de DNA recombinante. Cada clon puede ser exhaustivamente analizado para comprobar que la sustitucin ha ocurrido y en qu condiciones. Si la sustitucin gnica mediante recombinacin homloga se realiza en clulas ES, se puede generar un ratn quimera mediante la metodologa anteriormente comentada. La transmisin del genoma de las clulas ES a la progenie generar animales que sern heterocigotos para la mutacin. Se pueden obtener animales homocigotos mediante reproduccin convencional (se espera que 1/4 de los descendientes entre heterocigotos sern homocigotos para la mutacin generada). Si la sustitucin gnica se realiza en clulas somticas, se requiere un procedimiento de clonacin mediante transferencia nuclear para poder obtener un animal con la sustitucin gnica en todas sus clulas (Houdebine, 2003). 4.-Control de la expresin en la transgnesis De todos los genes estimados en el genoma humano, nicamente una fraccin pequea se expresa en un tipo celular concreto. Algunos productos gnicos tienen funciones que requieren su presencia en grandes cantidades y otros en menor cantidad. Adems, la necesidad de un determinado producto gnico tambin vara a lo largo del tiempo, como sucede con algunas protenas que modulan la diferenciacin celular y que estn presentes slo durante un breve periodo de tiempo. Por tanto, en condiciones biolgicas, la expresin de algunos genes es variable en el espacio (tipos celulares) y en el tiempo, gracias a estrictos sistemas de control de la expresin, no siempre bien conocidos. Un proceso de transgnesis tcnicamente adecuado debera, por tanto, ser capaz de proveer las herramientas adecuadas para que el control de la expresin del transgn pudiese ser el apropiado. En animales, la regulacin de la expresin gnica sucede principalmente en dos niveles: a nivel de la estructura del DNA y mediante el control de la expresin transcripcional. En el nivel estructural influyen fundamentalmente modificaciones qumicas en las histonas, va acetilacin , fosforilacin y metilacin. El control de la transcripcin es probablemente el mecanismo de control de expresin gnica ms importante en animales. Para que la transcripcin de un gen tenga lugar, no slo es necesario que est presente una RNA polimerasa que transcriba el DNA, sino que adems se necesitan factores de transcripcin, secuencias promotoras, elementos distales y elementos proximales. En la figura 1 se muestra la estructura de un gen eucariota en la que se incluyen algunos elementos clave para el control de la expresin de un gen, entre los que destacan los promotores, los silenciadores (insulators) y los amplificadores (enhancers). Adems, debemos tener en cuenta que un gen transcripcionalmente activo puede estar sujeto a la accin de activadores o de represores. Todo ello complica enormemente el uso de la transgenia en animales ya que todas estas consideraciones deberan tenerse en cuenta a la hora de expresar un gen en un animal transgnico.

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Figura 1: Estructura de un gen eucariota. La expresin gnica est controlada por secuencias localizadas aguas arriba de la regin transcrita. Los promotores participan directamente en la formacin del complejo de preiniciacin de la transcripcin. Los intensificadores (enhancers) incrementan la frecuencia de la accin del promotor. Las regiones distales , MAR (regin de unin a la matriz), abridores (openers) de la cromatina y aisladores (insulator) mantienen una configuracin de cromatina abierta y evitan el silenciamiento del gen por la cromatina de alrededor. (Houdebine, 2003)

Para conseguir la expresin del gen de inters en un animal transgnico, al menos, deberan tenerse en cuenta dos aspectos a la hora de preparar vectores de expresin adecuados. El primero es la capacidad intrnseca del transgn para transcribir eficientemente: eleccin de adecuadas seales de inicio y de final de la transcripcin, presencia o no de intrones (aunque los intrones son regiones que no tienen informacin codificante, en ocasiones, son necesarios para un correcto nivel de expresin), etc. El segundo aspecto es el correcto funcionamiento de la construccin cuando es introducida en un sistema biolgico complejo. La primera caracterstica se puede evaluar en clulas transfectadas in vitro, mientras que la segunda slo podr ser estimada en el animal transgnico. De entre todas las secuencias actualmente conocidas implicadas en el control de la expresin de genes, destaca especialmente las conocidas como secuencias promotoras. Estas secuencias son las encargadas de regular cundo y dnde debe ser expresado un gen, por lo que su correcta eleccin es una parte importante del diseo de una construccin molecular que vaya a ser utilizada para la transgenia. En muchas ocasiones lo que se busca es que la expresin del transgn nicamente suceda en un tejido determinado, para lo cual se coloca el gen de inters bajo el control de una secuencia promotora especfica de dicho tejido. A pesar de ello, frecuentemente las construcciones se expresan, en mayor o menor grado, en tejidos en los que el promotor no se espera que trabaje. Esta expresin ectpica parece ser debida a un efecto posicional (dependiente del lugar de insercin del transgn en el genoma) y puede provocar un efecto no esperado en el animal transgnico. 5- Expresin condicional de los transgenes Aunque la tecnologa de transgenia nos permite alterar genes endgenos en algunas especies, no siempre es posible llevar a cabo esta opcin ya que algunos genes tienen importantes papeles en el desarrollo embrionario y su modificacin puede generar la muerte embrionaria. En otras ocasiones, la expresin del gen introducido puede tener un efecto letal a nivel embrionario, por lo que su utilidad es nula. A fin de evitar estas limitaciones, se han desarrollado algunos sistemas, sobre todo de aplicacin experimental en ratones, con los que se pretende activar o silenciar la expresin de un gen en el momento elegido por el investigador. En principio, en los vectores podemos introducir toda la informacin necesaria para que nuestro transgn se exprese como deseamos y en el tejido apropiado. Mediante la adicin de secuencias, podramos incluso condicionar la expresin, o llegar a inhibirla, dependiendo de la presencia o no de una molcula de control. As, podramos

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conseguir reducir o anular la expresin del transgn, en ausencia de la molcula control, o aumentar su nivel expresin, cuando aadimos esa molcula. Lo ideal sera conseguir que este tipo de control de la expresin sucediese de modo reversible, en el gen diana especfico que nos interesa, y que el mecanismo de control no interfiriese con otros componentes celulares o con el metabolismo general. Los primeros intentos para controlar la expresin de los transgenes se desarrollaron colocando los genes de inters bajo el control de promotores inducibles por metales pesados, choque trmico, interferones o esteroides. Estas construcciones, sin embargo, frecuentemente producan efectos pleiotrpicos en el animal transgnico o mostraban una actividad basal elevada en ausencia del inductor. Para evitar estos problemas y conseguir un control ms adecuado de la expresin de un transgn se han desarrollado los denominados sistemas binarios, en los que la expresin del gen est controlada por la interaccin de dos componentes: un efector, cuyo producto acta sobre el transgn diana y el propio transgn diana. Los sistemas binarios se dividen en dos categoras. En la primera, el efector es una recombinasa de DNA de lugar especfico que dirige la activacin o el silenciamiento del gen diana mediante una recombinacin especfica. En la segunda categora, el efector transactiva la transcripcin del transgn diana, en presencia de una molcula inductora. Una revisin completa de los sistemas de expresin condicional actualmente aplicables a ratones puede encontrarse en Lewandoski, 2001. 6.- RNA de interferencia El RNA de interferencia (RNAi) es un mtodo eficaz para conseguir la rpida prdida de funcin de un gen, a travs de la destruccin dirigida de su RNA mensajero. Actualmente se considera que la tecnologa del RNAi es una poderosa herramienta tanto para el estudio del control de la expresin gnica, como para el anlisis de la funcin de los genes y, potencialmente, para la terapia gnica. La posibilidad de bloquear especficamente un gen mediante la utilizacin del RNAi fue descrita por primera vez en 1998 por Fire y colaboradores en el nematodo Caenorhabditis elegans. La idea bsica sobre este sistema de silenciamiento, conseguida a partir de este trabajo y de otros posteriores, consiste en sintetizar un RNA de doble hebra (dsRNA) con una secuencia gnica complementaria a la secuencia del RNA diana que se quiere inactivar. En C. elegans, y en otros organismos como Drosophila, planaria, plantas, etc , una vez en el interior de las clulas, el dsRNA es roto en pequeos fragmentos, llamados RNAs interferentes cortos (siRNA), con la ayuda de un complejo enzimtico celular. El siRNA es el que desencadena la degradacin del RNA mensajero del que incluye la secuencia, consiguindose as la degradacin especfica del RNA diana. En mamferos la introduccin de dsRNA en las clulas genera la activacin de la respuesta del interfern, una actividad que bloquea el proceso de traduccin celular, pero de manera inespecfica. Sin embargo, la introduccin de pequeos siRNAs con homologa respecto a los genes diana, no activa dicha respuesta y permite mantener la utilidad de esta tecnologa en la degradacin especfica de RNAs. Esta degradacin dirigida conlleva, a menudo, consecuencias adversas para el organismo, evidencindose en fenotipos aberrantes que permiten la identificacin de la funcin de ese gen.

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Aunque inicialmente esta tecnologa se ha aplicado a estudios en cultivos celulares, recientemente se han desarrollado algunos modelos de ratones transgnicos KO para genes determinados, mediante la expresin de un siRNA especfico. El primer ejemplo de la utilizacin de esta nueva tecnologa en la produccin de ratones transgnicos es el trabajo de Kunath y colaboradores, en abril del 2003. Este equipo consigui embriones de ratones transgnicos con expresin reducida del gen Rasa 1 (o RasGAP) mediante la utilizacin de clulas ES transgnicas que producen establemente un siRNA especfico para ese gen. Las clulas ES transgnicas seleccionadas se agregaron a un embrin tetraploide para obtener ratones no quimricos derivados nicamente de las clulas ES transfectadas (las clulas embrionarias hospedantes, por ser tetraploides, no forman tejidos del embrin, si bien contribuyen al trofoblasto y al componente endodrmico extraembrionario del saco vitelino; las clulas ES transgnicas agregadas generan el embrin completo, as como el compartimento mesodermal del saco vitelino) y dieron lugar a animales transgnicos que expresan el siRNA y bloquean la expresin especfica del gen RasGap. APLICACIONES DE LA TRANSGENIA EN ANIMALES Y SUS BENEFICIOS POTENCIALES Actualmente existen un elevado nmero de aplicaciones descritas para los animales transgnicos. Las ms relevantes tienen que ver con la investigacin cientfica o con la industria. En el primer grupo deberamos incluir todas aquellas investigaciones que buscan, mediante el uso de animales transgnicos, un mayor conocimiento sobre el funcionamiento de los organismos vivos y sobre las enfermedades humanas. Entre las aplicaciones industriales podramos considerar aqullas que tienen que ver con la salud humana (obtencin de protenas teraputicas, clulas y rganos) y las que pretenden una mejora de la produccin animal (mejora de caracteres productivos, resistencia a enfermedades, etc). Aunque no es un objetivo de este trabajo presentar una revisin exhaustiva de las aplicaciones de la transgenia animal, es necesario revisar al menos aquellas que puedan ser ms relevantes y que nos permitan obtener algunas claves sobre los potenciales beneficios de su utilizacin. 1.- INVESTIGACIN BSICA La mayor parte de los animales transgnicos que actualmente se generan, se utilizan para aumentar nuestro conocimiento sobre la funcin gnica, las interacciones moleculares o los mecanismos de actuacin de genes diversos. As, gran parte de los avances del conocimiento celular, molecular y fisiolgico actual se han llevado a cabo gracias a la utilizacin de animales a los que se les ha aadido un gen cuya funcin, interacciones moleculares, etc, se quieren conocer o corroborar, o gracias a la utilizacin de animales a los que se les ha sustituido un gen por una versin defectuosa mediante recombinacin homloga. El estudio sobre los genes de las inmunoglobulinas, genes del desarrollo embrionario, control hormonal, determinacin y diferenciacin sexual, control de la proliferacin y muerte celulares, son tan slo algunos ejemplos de los campos en los que la utilizacin de animales transgnicos ha contribuido notablemente (Wheeler et al. 2003). Actualmente existen por todo el mundo bancos de animales genticamente modificados, generados por compaas pblicas y privadas, que estn disponibles para los investigadores. A este nivel, los ratones son, sin duda alguna, los animales

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genticamente modificados que ms se utilizan para esta aplicacin, tanto por la disponibilidad de la tcnica para conseguir KO y KI como por su relativa similitud molecular con la especie humana. 2.- ESTUDIO DE ENFERMEDADES HUMANAS Y TERAPIAS APLICABLES La utilizacin de animales modelo para el estudio de enfermedades humanas y para el ensayo de compuestos potencialmente teraputicos ha sido extensa durante las ltimas dcadas. Este uso, sin embargo, quedaba limitado a aquellas patologas humanas para las que se hubiese descrito un modelo patolgico equivalente en alguna especie animal. La posibilidad de generar en animales patologas similares a las humanas mediante la modificacin de sus genomas, ha abierto nuevas posibilidades para analizar los detalles moleculares derivados de un incorrecto funcionamiento de los genes implicados en enfermedades genticas heredables (como fibrosis qustica, distrofia muscular, etc), en enfermedades infecciosas (como hepatitis C, SIDA, priones, etc), en patologas degenerativas (como Alzheimer, ateroesclerosis, etc), en enfermedades autoinmunes (como diabetes, lupus, etc), en patologas relacionadas con la proliferacin celular (funcionamiento de proto-oncogenes, genes supresores de tumores, control de la apoptosis, etc), en el envejecimiento celular, en el rechazo al transplante de rganos entre diferentes especies, etc. Hoy en da nadie pone en duda la importante contribucin que los trabajos con animales transgnicos han aportado al avance del conocimiento molecular de los procesos implicados en las patologas humanas o de los mecanismos de control que se pueden promover mediante el desarrollo de compuesto teraputicos de nueva creacin. Tambin es destacable la contribucin de estos animales al desarrollo y aplicacin en humanos de tcnicas que permiten la adicin de genes a clulas somticas (terapia gnica). Segn los datos del gobierno de EEUU, cerca del 90% de los ensayos de este tipo se realizan en ratones. Desde el desarrollo de las tcnicas para la obtencin de ratones KO y de ratones transgnicos por adicin, se han generado ms de 7.500 lneas de ratones modelos de enfermedades humanas. Aunque se estima que evolutivamente ratones y humanos se separaron hace entre 70 y 100 millones de aos, ambos comparten el 85% de su genoma. Sin embargo, y a pesar de estas similitudes, como ya hemos comentado anteriormente, sabemos que los ratones no siempre son buenos modelos para las patologas humanas. (Wilson 2003). El desarrollo de las tecnologas de transgenia en otras especies permite ahora disponer de ratas transgnicas que replican alta presin sangunea y ateroesclerosis, peces cebra para el estudio de problemas de anemia, conejos para enfermedades fisiolgicas, gusanos (C. elegans) como modelo de la enfermedad de Huntington, moscas (D. melanogaster) como modelo de la enfermedad de Alzheimer, etc. Es posible que los beneficios de estos avances en el conocimiento y control de las patologas humanas sea uno de los motivos por los que la percepcin social del uso de los animales transgnicos es ms positiva en el mbito de la salud y de la investigacin que en campo de las aplicaciones industriales. 3.- SUMINISTRO DE RGANOS Y TEJIDOS EN TRANSPLANTES

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La escasez de donantes humanos para el transplante de corazones, riones y otros rganos, ha incentivado la bsqueda de otras fuentes no humanas para el suministro de rganos (xenotransplante). Las investigaciones actuales en este campo van desde la creacin in vitro de rganos, hasta la modificacin de animales para evitar la respuesta inmune a tejidos extraos que se produce en los transplantes a humanos de rganos procedentes de animales. En general, las especies pertenecientes a un mismo orden zoolgico no presentan anticuerpos preformados o naturales entre s, y por lo tanto no hay rechazo hiperagudo al trasplantar rganos entre las mismas. Los humanos y los primates no humanos pertenecen al mismo orden zoolgico, por lo que el trasplante de rganos entre ambas especies no comporta el rechazo hiperagudo de los mismos. Adems, las similitudes anatmicas y funcionales entre estas especies, hacen que los primates no humanos sean, a priori, la fuente de rganos ms lgica para los humanos. Sin embargo, el uso de primates no humanos comporta muchas dificultades: son animales que se reproducen lenta e ineficazmente en cautividad; algunos estn en peligro de extincin, pueden ser el origen de graves infecciones para los humanos, y su proximidad a estos hace que para muchas personas sea ticamente inaceptable su utilizacin como fuente de rganos para trasplante (Maez Mendiluce, 2003). El cerdo, en cambio, cumple muchos de los requisitos que seran deseables en un animal como potencial fuente de rganos: es un animal domesticado, se reproduce en camadas numerosas, es fcil de alimentar, crece rpidamente, y comparte numerosas similitudes anatmicas y fisiolgicas con los humanos, habindose utilizado ya con fines teraputicos clulas, tejidos y hormonas de cerdo (a modo de ejemplo, actualmente el transplante de vlvulas de corazn de cerdo a humanos es una prctica clnicamente rutinaria). Sin embargo, para que el cerdo pueda ser una fuente de rganos slidos para el trasplante a humanos hay que controlar, en primer lugar, la potente respuesta inmunolgica que el receptor desarrolla contra el xenoinjerto. Los obstculos inmunolgicos en el xenotransplante porcino-humano son la respuesta de rechazo hiperaguda, el rechazo vascular agudo, el rechazo celular y, potencialmente, el rechazo crnico. El rechazo hiperagudo ocurre en segundos o minutos: los anticuerpos existentes naturalmente reaccionan con estructuras antignicas presentes en la superficie de los rganos porcinos e inducen el rechazo hiperagudo, activando la cascada del complemento. Los genes reguladores de la cascada del complemento son el gen del factor de aceleracin del decaimiento (DAF) y el gen de la protena cofactor de membrana (MCP). Cerca del 80% de los anticuerpos humanos capaces de producir un rechazo hiperagudo, identifican una sola estructura: el disacrido 1-3 Galactosa (-Gal), producido por el enzima 1,3-galactosiltransferasa. Este disacrido se encuentra presente en las clulas de todos los mamferos inferiores y monos del Nuevo Mundo, en los que sustituye a los azcares responsables de los grupos sanguneos ABO. Se han desarrollado varios mtodos para intentar reducir el rechazo hiperagudo (la sobrexpresin en las clulas del cerdo del enzima 2,3- sialiltransferasa, o de 1,2fucosiltranferasa, para que compitan con 1,3GT; el tratamiento de los rganos de cerdo con -galactosidasa para eliminar de la superficie los epitopos 1,3Gal; la inhibicin de la activacin del complemento; y la deplecin temporal del anticuerpo anti-1,3Gal de receptores antes del transplante), pero todas estas opciones slo evitan temporalmente el rechazo y las molculas 1,3Gal residuales son todava suficientes para activar la cascada del complemento y para, como consecuencia de esta activacin, provocar la destruccin del rgano.

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Dai y colaboradores (2002) y Phelps y colaboradores (2003), han presentado la creacin de cerdos transgnicos KO, con produccin deficiente del gen de la 1,3galactosiltransferasa, mediante recombinacin homloga y posterior transferencia nuclear, aparentemente aptos para xenotransplantes. Tambin se han creado, mediante microinyeccin en el proncleo de embriones, cerdos portadores del gen humano DAF (Murakami et al. 2002), del gen humano MCP y de ambos (Zhou et al. 2002), para intentar controlar la activacin del complemento y evitar as el rechazo hiperagudo. Las pruebas del efecto de estos transplantes en primates no humanos (normalmente babuinos) han comenzado ya y los resultados muestran una perspectiva esperanzadora (Schuurman et al. 2002). A pesar de ello, algunos investigadores han mostrado su escepticismo respecto a que el transplante de rganos slidos de estos cerdos transgnicos a humanos vaya realmente a conseguir evitar el rechazo agudo del xenotransplante (Miyata 2003; Chen et al. 2004). 4.-PRODUCCIN DE PROTENAS La obtencin de protenas teraputicas humanas raras a partir de extractos de tejidos, de sangre, etc, ha sido una prctica habitual en las ltimas dcadas del siglo XX. Sin embargo, el coste del proceso, su laboriosidad, su baja eficiencia y los riesgos de contaminacin con patgenos humanos, han obligado a considerar otras alternativas. La produccin de protenas teraputicas humanas mediante bacterias recombinantes o mediante cultivos celulares ha aliviado considerablemente el problema y ha permitido que actualmente estn disponibles para su uso teraputico un buen nmero de protenas generadas mediante ingeniera gentica. Sin embargo estos sistemas de produccin tienen sus limitaciones: slo se pueden utilizar para sintetizar protenas simples, la cantidad de protena conseguida es limitada, a menudo las modificaciones postraduccionales de las protenas sintetizadas son inexistentes o incorrectas, por lo que, o no tienen valor teraputico, o si lo tienen, pueden producir reacciones alrgicas contra estas protenas sintetizadas en cultivos. Adems, en muchos casos los costes de produccin son muy elevados. La produccin de protenas recombinantes en animales de granja como vacas, cabras, conejos, ovejas o cerdos, tiene algunas ventajas sobre otros sistemas de produccin que se deben considerar: la posibilidad de produccin a gran escala, el bajo coste de produccin, la facilidad de la propagacin de los animales fundadores transgnicos, la obtencin de modificaciones post-traduccionales correctas y la estabilidad en la expresin proteica. Estas atractivas perspectivas han generado el desarrollo del concepto de granjas gnicas o de animales biorreactores. El concepto tiene que ver con la posibilidad de obtener protenas de inters a partir de diferentes tejidos animales, como la glndula mamaria, sangre, esperma, orina, (Kues y Niemann, 2004) o a partir de la clara de los huevos de gallina (Harvey et al. 2002). De todas las alternativas, el lugar preferido para la produccin de protenas en animales transgnicos es la glndula mamaria, fundamentalmente por las cantidades que se pueden obtener y por la facilidad de extraccin y de purificacin de la protena. As, mediante la utilizacin de promotores especficos de la glndula mamaria, se han conseguido producir grandes cantidades de numerosas protenas recombinantes heterlogas, purificadas a partir de la leche de conejos, cerdos, ovejas, cabras y vacas transgnicas. Se ha ensayado la actividad biolgica y los efectos teraputicos de

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muchas de esas protenas, y algunos compuestos se encuentran muy avanzados en los ensayos clnicos correspondientes (Tabla 2). Tabla 2.- Situacin de algunas protenas teraputicas producidas en la glndula mamaria de animales transgnicos (-AT: antitripsina, tPA: activador del plasmingeno tisular; AT III: antitrombina III) (Nieman y Kues, 2003)
Especie Producto Ensayo clnico Fase II/III Fase II/III Fase III Fase II/III Tratamiento para Esperado en el mercado -AT deficiencia; >2007 fibrosis qustica Embolia >2006 coronaria Resistencia a 2005 heparina Enfermedad de 2004 Pompe Compaa PPL/GTC GTC GTC Pharming

Oveja/cabra -AT Cabra Cabra Conejo tPA AT III -Glucosidasa

La produccin de protenas en la leche no slo se aplica a compuestos de inters teraputico sino que incluye la posibilidad de producir otras sustancias con indicaciones distintas a la salud. As, otra aplicacin tecnolgica que se espera tenga gran implicacin comercial es la produccin de seda de araa en la leche de cabras. Cientficos de la empresa Nexia han conseguido cabras transgnicas que expresan el gen de la fibrona de araa (la protena de la seda de araa) en la leche. La fibra de la seda es un material muy preciado por su resistencia y su elasticidad. Aunque hasta el momento se han realizado diversos intentos para conseguir una sustancia equivalente, el compuesto artificial ms parecido, el Kevlar, que se utiliza para la fabricacin de los chalecos antibalas, es tres veces menos resistente y mucho menos estable que la seda de araa. Adems, tiene un elevado coste de produccin y su fabricacin requiere el uso de altas temperaturas y presin, as como disolventes orgnicos cidos, altamente contaminantes. Se espera que en los prximos aos se desarrollen importantes aplicaciones mdicas e industriales (civiles, militares y en el campo de la microelectrnica) a partir de la seda obtenida en las cabras transgnicas de Nexia. 5.- MODIFICACIONES DIETTICAS DE PRODUCTOS ANIMALES Los alimentos funcionales son aquellos que se han diseado para producir un beneficio fisiolgico especfico sobre la salud y el bienestar humanos y para evitar enfermedades relacionadas con la dieta. Aunque la alternativa de utilizar la transgenia para conseguir alimentos funcionales en animales tiene mucho menos desarrollo que en plantas, se estn ensayando algunas aplicaciones interesantes. Algunas de estas aplicaciones tienen que ver con la produccin de leche: leche con menos grasa, e incluso sin grasa; leche con una composicin lipdica modificada; leche con una proporcin aumentada de casenas para la produccin de queso y requesn; leche hipoalergnica, mediante la interrupcin del gen -lactoglobulina; leche libre de lactosa mediante la interrupcin del locus de la -lactoalbumina, una molcula clave en la sntesis del azcar de la leche, azcar que produce problemas digestivos en una elevada proporcin de la poblacin mundial que no posee el enzima lactasa activo en su sistema digestivo; leche con abundante lactoferrina (leche para nios); o leche con abundante lisozima u otras sustancias antimicrobianas, para

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mejorar las condiciones higinicas de las ubres (Kues y Niemann, 2004). Queda pendiente conocer la aplicabilidad real de estas posibilidades que todava se encuentran en proceso de ensayo. 6.- MEJORA PRODUCTIVA EN ESPECIES GANADERAS Y ACUCOLAS Esta es una de las aplicaciones de la transgenia que a priori presenta ventajas econmicas claras. Consiste en modificar genticamente una especie de inters comercial para mejorarla respecto a parmetros productivos: resistencia a enfermedades, tasa de crecimiento, mayor eficiencia en la conversin de alimentos, control de la reproduccin, composicin de los huevos, proporcin msculo-grasa, produccin de lana, tolerancia a variables ambientales como temperatura, etc. En este contexto, una de las aplicaciones importantes es la introduccin de transgenes para conseguir un mayor o ms rpido crecimiento de la especie de inters. Esta aplicacin ha sido ampliamente ensayada en especies acuticas, generalmente introduciendo el trangn de la hormona de crecimiento (GH) bajo el control de un promotor de alta expresin. Los resultados de los ensayos son prometedores desde el punto de vista econmico, ya que en salmnidos, por ejemplo, el incremento medio del crecimiento en un tiempo dado es de 3-5 veces superior en transgnicos que en controles, y la eficiencia en la conversin del alimento es de 10-20% superior respecto a los no transgnicos (Hallerman, 2003a). Ensayos similares se estn llevando a cabo en trucha, tilapia, medaka, carpa, etc, especies cuyas variedades no transgnicas son objeto de cultivo desde hace aos. Aparentemente, la aplicacin comercial de los peces transgnicos para alimentacin puede estar ya teniendo lugar en algunos pases, como Cuba, con la tilapia de rpido crecimiento, o China, con carpas transgnicas para alimentacin (la carpa es un pez muy apreciado en esta cultura). En otros lugares como Europa y Japn, la poltica sobre el desarrollo de peces transgnicos es ms conservativa y su aprobacin, caso de que se produzca, tardar unos aos. En EEUU, se espera que la aprobacin, por parte de la FDA, para la comercializacin de peces transgnicos de crecimiento mejorado, aptos para el consumo humano, suceda en los prximos meses (Dunham, 2004). 7.- CONTROL DE PLAGAS La posibilidad de controlar daos graves en la agricultura y en la selvicultura o de evitar la transmisin de enfermedades mortales para animales o humanos mediante el control de algunos insectos, se ha venido desarrollando mediante una aproximacin gentica denominada tcnica de esterilizacin de insectos. Su aplicacin causa cruzamientos no frtiles y reduce el tamao de la poblacin del insecto-plaga. Esta tcnica es cara y requiere la esterilizacin de grandes cantidades de insectos para que se muestre realmente efectiva. La posibilidad de desarrollar insectos transgnicos que mejoren la efectividad de la esterilizacin, ha sido puesta en prctica, de forma experimental, en varios proyectos. En la mayora de los casos, cuando los insectos causan una enfermedad humana, como la fiebre amarilla, el dengue o la malaria, no es el insecto en s mismo el que produce la enfermedad sino los virus o protozoos que transmite. As, en estas aplicaciones de la transgenia se busca impedir que el insecto pueda funcionar como vehculo transmisor de la patologa.

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Este es el caso, por ejemplo, del desarrollo de mosquitos transgnicos que experimentalmente reducen la capacidad de transmitir el parsito de la malaria. Los mosquitos modificados genticamente portan el gen sinttico SM1 (Ito et al, 2002), cuya expresin interfiere en el ciclo de vida del parsito dentro del mosquito. Como consecuencia de la interferencia, el parsito no llega a la glndula salivar del mosquito, por lo que ste no lo transmitir a los humanos que sean picados por estos mosquitos transgnicos. La utilizacin de insectos transgnicos como alternativa para el control de plagas es una aplicacin que actualmente se encuentra en fase de experimentacin. Algunos investigadores muestran sus dudas sobre su eficacia real (Catteruccia et al 2003). Adems, los posibles efectos ambientales que se pueden derivar de su utilizacin generan una gran polmica. 8.- ANIMALES DE GRANJA MENOS CONTAMINANTES En la agricultura, la polucin por fsforo animal es un serio y creciente problema. Los cerdos y los pollos son ejemplos de animales naturalmente incapaces de digerir el phytate (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogenphosphate) de las plantas, el cual constituye el 80% del fsforo que poseen los cereales. Debido a esta incapacidad de absorcin del fosfato de origen vegetal, se requieren suplementos dietticos de fosfato bio-disponible para un crecimiento ptimo de estos animales, suplementos que se han venido aplicando durante las ltimas dcadas. Sin embargo, las heces de estos animales contienen un exceso de fosfato, lo que genera importantes problemas medioambientales derivados de la eutrofizacin de los ecosistemas. La creciente preocupacin social por los problemas de contaminacin ambiental han potenciado el desarrollo de diferentes estrategias para intentar disminuir la cantidad de fsforo en las heces de estos animales. Una de ellas es la de reducir o eliminar la necesidad de suplementos de fsforo en la dieta de los cerdos sustituyendo la dieta vegetal por piensos o harinas de carne las cuales, al presentar ms de un 87% del fsforo digerible, hacen innecesarios los suplementos. Sin embargo, los graves problemas originados en el pasado reciente por la propagacin de enfermedades animales a partir del consumo de este tipo de piensos ha forzado la vuelta a la alimentacin vegetal. Otra prctica que busca la disminucin en la contaminacin por fsforo, es el uso de un maz con bajo nivel en phytate, cuya utilizacin reduce hasta un 56% el nivel de fsforo en las heces. La creacin de cerdos transgnicos que producen phytase en la saliva y que, por tanto, son capaces de digerir esta fuente vegetal de fsforo, es una nueva alternativa. Estos cerdos transgnicos experimentalmente requieren menos suplemento de fsforo inorgnico para un crecimiento normal y excretan un 75% menos de fsforo fecal que los no transgnicos (Golovan et al. 2001). La utilizacin en un futuro cercano de estos animales transgnicos menos contaminantes se observa con gran inters desde entornos preocupados por la eutrofizacin de los ecosistemas. 9.- ANIMALES ORNAMENTALES E INDICADORES DE CONTAMINACIN Uno de los genes que tradicionalmente se ha utilizado como gen informador o reporter en la creacin de animales transgnicos ha sido el de la protena fluorescente verde, originalmente aislado a partir de la medusa Aequorea vixtoria. Esta protena es intrnsecamente fluorescente, lo cual permite su visualizacin sin necesidad de un sustrato para una reaccin qumica. El cDNA de este gen ha sido modificado para que emita en diferentes espectros de emisin y hoy se encuentran disponibles genes productores de protenas fluorescentes de varios colores (amarilla, azul, cian, etc).

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Tambin se han clonado genes de protenas fluorescentes a partir de anmonas, corales, etc. Una aplicacin para estos genes productores de protenas de colores ha sido la de obtener peces ornamentales transgnicos que sinteticen protenas fluorescentes en el msculo. El primer pez transgnico comercial en EEUU ha sido precisamente un pez cebra que expresa fluorescencia amarilla, denominado GloFish y comercializado por la empresa Yorktwon Technologies con fines ornamentales. En este momento se estn desarrollando nuevas alternativas de peces cebra que expresan protenas fluorescentes rojas, verdes y amarillas (Gong et al. 2003). Segn indican los propios impulsores del proyecto, el objetivo de desarrollar estos peces fluorescentes, no es nicamente su utilizacin ornamental, sino que su objetivo a largo plazo es la utilizacin de estos peces transgnicos como bioindicadores de contaminacin: la presencia de determinados contaminantes activara los genes productores de fluorescencia y producira un cambio de color en los mismos. La presencia de contaminantes qumicos tipo estrgenos (mediante la utilizacin de un promotor estrognico) o metales pesados y toxinas (mediante promotores que responden al estrs) activaran la expresin del transgn cuyo producto sera la obtencin de una protena fluorescente determinada. El cambio a un color especfico en el pez cebra bioindicador y transgnico sera indicativo de la presencia de un determinado elemento contaminante (Carvan et al. 2000). RIESGOS DE LA TRANSGENIA EN ANIMALES De la misma manera que he presentado de forma sucinta las aplicaciones de la transgenia en animales y los beneficios presentes y futuros ms destacables, presentar los riesgos o peligros ms importantes, tanto de la tecnologa de transgnesis en s misma como de las aplicaciones comentadas. Ambas cuestiones, beneficios y riesgos, deben ser tenidas en cuenta en el debate social e individual sobre la transgnesis animal. 1.- Cuestiones tcnicas asociadas al proceso de transgenia La valoracin sobre los riesgos que entraa la utilizacin de cualquier procedimiento tecnolgico es una forma habitual de establecer el balance riesgos/beneficios. En el caso de los animales genticamente modificados este balance permite adems determinar los aspectos tcnicos que deben ser mejorados en funcin de criterios como la salud de los animales o como la seguridad de los procedimientos. 1.1.- Produccin de animales modificados genticamente y eficiencia de la transgenia. Las tcnicas utilizadas en la transgnesis animal incluyen la obtencin de vulos mediante la administracin de medicamentos a las hembras donantes a fin de estimular la superovulacin. Estos vulos se recogen mediante la muerte de los animales donadores (en el caso de ratones) o mediante laparotoma (en animales superiores) y posteriormente son utilizados para la fertilizacin y/o para la modificacin gentica. Los embriones modificados genticamente in vitro son posteriormente implantados en madres sustitutas, mediante laparotoma. Tanto la induccin de la superovulacin como la laparotoma son tcnicas establecidas, aplicadas rutinariamente en los cruzamientos selectivos de animales de granja y de laboratorio. La laparotoma debe ser aplicada con anestesia general; y tanto sta como la superovulacin son procedimientos que generan malestar, por lo

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que se deben aplicar procedimientos analgsicos. La preparacin de las madres sustitutas implica cruzarlas con machos estriles (vasectomizados) para producir un pseudoembarazo (Boyd Group, 1999). Adems de los efectos directos de las tcnicas comentadas, el proceso de transgenia tiene una importante repercusin sobre la mortalidad durante el desarrollo embrionario y durante la etapa perinatal. La tasa de mortalidad suele depender del procedimiento aplicado en la transgnesis, de la especie en la que se haya llevado a cabo, de la cepa utilizada e incluso del propio experimento. A pesar de la importante variabilidad existente entre las escasas cifras que se publican sobre este particular, cabe destacar que la eficiencia de la transgnesis se ha incrementado ligeramente en los ltimos aos, como consecuencia de una mayor experiencia de la comunidad cientfica en este proceso y de la depuracin de las tcnicas de aplicacin. Los datos recopilados por Auerbach en el 2004 sobre la eficiencia de la transgenia en ratones, puede servir como ejemplo de la tasa general de eficiencia en la transgenia por microinyeccin, tcnica que hoy por hoy sigue siendo la de mayor aplicacin. Segn esta autora, la proporcin de vulos fertilizados microinyectados, adecuados para la transferencia, es del 60-90%, dependiendo de la cepa donadora. La proporcin de los vulos que finalmente producen ratones nacidos es del 10 al 20%, pero slo entre el 2 y el 4% de los vulos inyectados terminan siendo fundadores transgnicos. De acuerdo con los datos del Roslin Institut (Paterson et al, 2003), la tcnica de transferencia nuclear tiene todava una eficiencia excesivamente baja como para que pueda ser aplicada a amplia escala para la produccin de animales de granja transgnicos (menos del 4% de los embriones consiguen ser viables). Estos valores de eficiencia tan reducidos han conducido al ensayo de mtodos de transgenia ms eficientes, como la transferencia gnica mediada por esperma, de aplicacin actual menos generalizada pero con buenas perspectivas futuras (Chang et al, 2003). 1.2.- Efectos de los transgenes sobre la salud de los animales En algunos casos, las modificaciones genticas realizadas en animales parecen no tener efectos negativos sobre la salud de los animales que se obtienen; en algunos casos incluso se obtienen beneficios sobre la salud de estos animales; sin embargo, en otros casos se obtienen severos efectos adversos. Como ya se ha comentado, en el mbito de la investigacin en ocasiones se generan animales transgnicos mediante la interrupcin de un gen o mediante la introduccin de genes, funcionales o no, con intencin de generar o estimular la aparicin deliberada de un amplio rango de enfermedades genticas o de anomalas en el desarrollo o en el funcionamiento gnico. Sin embargo, en cualquier caso de manipulacin gentica pueden producirse efectos colaterales no esperados. Tales efectos colaterales pueden ser causados cuando el nuevo material gentico se expresa en ciertas condiciones fisiolgicas no predichas o cuando el DNA introducido interrumpe o interfiere en la funcin o en la expresin de uno o ms de los genes propios del animal (Boyd Group, 1999). Un fallo en el control de la expresin del nuevo gen puede producir una expresin ectpica del mismo y generar asimismo problemas en el animal transgnico(Van Reenen et al, 2001). Los problemas que se generan por la introduccin del transgn son consecuencia de la aleatoriedad de la integracin del nuevo material gentico en el genoma del animal

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receptor, en particular cuando se utiliza la tcnica de la microinyeccin. Algunas estimaciones indican que en ratones y animales de granja, entre el 5 y el 10% de las lneas transgnicas generadas por microinyeccin portan tales lesiones genticas (Hallerman, 2003b) las cuales producen severos defectos orgnicos, como debilidad muscular, ausencia de riones, temblores, cambios de comportamiento, esterilidad, interrupciones de la estructura cerebral, degeneracin neuronal, deformidades en los odos, etc. Los problemas orgnicos generados por un nivel de expresin inapropiado del transgn son asimismo importantes y en cerdos que expresan un transgn para la hormona de crecimiento humana se han descrito problemas fisiolgicos como diarreas, desarrollo mamario en machos, letargia, artritis, problemas en la piel y en los ojos, prdida de lvido, etc (Hallerman, 2003b). Por otro lado, se han descrito numerosos problemas de salud relacionados con la obtencin de ganado bovino y ovino transgnico mediante tcnicas de transferencia nuclear: adems de las altas tasas de mortalidad fetal, se produce una alta mortalidad neonatal y perinatal asociada con problemas respiratorios, tamao excesivo en el nacimiento, anomalas cardiovasculares, etc (Hare 2003). 1.3.- Genes marcadores Como ya hemos visto anteriormente, los vectores que se utilizan para la transgenia, en ocasiones contienen genes marcadores, obtenidos a partir de bacterias, que confieren resistencia a antibiticos, o compuestos similares, tambin a las clulas eucariotas. En la mayora de los casos, los genes marcadores del vector permanecen en las clulas del animal, especialmente en los knockouts. Generalmente se considera que estos marcadores son relativamente seguros, aunque existe la posibilidad de que causen efectos no deseados en la especie hospedante, como contribuir a la generacin de nuevos patgenos resistentes a antibiticos, o en el consumidor final, como actuar como nuevos alrgenos. Aunque no se conoce ningn ejemplo de adquisicin de genes resistentes a antibiticos por la flora bacteriana de los animales transgnicos, por ejemplo, la expansin de los genes marcadores, aunque remota, sigue siendo una posibilidad. Debido a que estos genes marcadores no son esenciales para el producto en s mismo, actualmente se buscan alternativas tcnicas que permitan su eliminacin una vez hayan dejado de ser necesarios en el proceso de generacin de un animal transgnico. 1.4.- Potencialidad de creacin de nuevos patgenos Los retrovirus son vectores muy eficientes para insertar transgenes en muchas especies animales. La posibilidad de que se generen virus potencialmente patgenos mediante recombinacin entre secuencias del vector de expresin y virus relacionados no patognicos presentes en el genoma receptor es especialmente destacada en algunas especies, como cerdos y gallinas, donde existen provirus endgenos no patognicos. Los provirus endgenos normalmente son versiones mutadas, no infecciosas, de retrovirus que mantienen cierta homologa con las secuencias existentes en retrovirus activos y en vectores retrovirales. Esta homologa provee la posibilidad de que se generen virus recombinantes patognicos. Un ejemplo bien conocido es la generacin inadvertida de virus de leucemia murina (MLVs) obtenidos mediante recombinacin entre provirus endgenos benignos y un vector para la transgenia portador del gen de la globina. Estos virus produjeron alta incidencia de linfomas en ratones (del 100% en algunas cepas) y resultaron altamente patognicos en monos rhesus, produciendo linfomas fatales similares a la enfermedad inducida por MLV en ratn (Purcell et al, 1996). As pues, es razonable pensar que

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pueden originarse virus muy patognicos en un animal cuando existe la posibilidad de recombinacin entre las secuencias del vector y de virus endgenos (Hallerman, 2003b). 1.5.- Potencialidad para la movilizacin Cuando se utilizan vectores virales para la introduccin de transgenes en la lnea germinal de animales, existe la posibilidad de que ocurra una transmisin inadvertida del transgn a otros individuos que pueden ser incluso de especies distintas. Esto podra ocurrir si un animal fuese infectado con un virus suficientemente similar como para que el vector pudiese ser empaquetado en el virin (Hallerman, 2003b) La transmisin de una secuencia a individuos de otras especies (transferencia horizontal) podra tambin ocurrir cuando se utilizan como vectores de expresin la secuencia mariner, u otros transposones relacionados. Se han encontrado secuencias relacionadas con este transposn en el genoma humano, y en otros animales, como planaria, nematodos, insectos, etc, lo cual sugiere la posibilidad de transferencia horizontal, va transposicin, entre hospedantes filogenticamente muy diversos. Estos elementos transponibles podran ser potencialmente movilizados por vectores de expresin en los que utilicen elementos tipo-mariner para insertar un transgn, y su insercin en genes hospedantes podra dar lugar a un defecto gentico inesperado (Hallerman, 2003b). Hay que decir, sin embargo, que la importancia posible de la transferencia horizontal en eucariotas es un tema muy controvertido y que actualmente no se conocen completamente ni su implicacin evolutiva ni sus mecanismos moleculares. Por el contrario, cada vez tenemos una mayor informacin sobre los importantes efectos de la movilizacin de los elementos transponibles en los genomas hospedantes, a la vez que se produce un incremento en el uso de estos elementos mviles como vectores para la transgenia. 1.6.- Expresin ectpica de genes Numerosos experimentos han demostrado que el nivel y la especificidad de la expresin de un transgn en un animal genticamente modificado son regulables slo de forma limitada, probablemente porque no conocemos, o porque no dominamos, todos los factores implicados en el control de la expresin gnica. As, los transgenes en ocasiones se expresan en bajos niveles en algunos tejidos en los que no se espera que el promotor est activo. Tal expresin ectpica puede ser debida al efecto de elementos intensificadores que se encuentren en las cercanas o a la transcripcin basal del transgn (Hallerman, 2003b). Hay varios ejemplos en los que se ha detectado en sangre protena recombinante cuya expresin estaba controlada por elementos reguladores para dirigir su expresin slo a la glndula mamaria. En ocasiones la presencia de protena recombinante en el torrente sanguneo, o en otros tejidos, se debe a su difusin desde la glndula mamaria. Sea como sea, su presencia puede generar patologas y otros defectos sistmicos en el animal transgnico. La existencia de expresin ectpica o la posibilidad de difusin de la protena recombinante a otros tejidos deben ser consideradas, junto a la bioactividad, alergenicidad o toxicidad del compuesto expresado, en la evaluacin sobre la seguridad de los productos alimentarios derivados de animales transgnicos. 2.- Consideraciones ambientales

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Cuando se analizan los riesgos de la mayor parte de las aplicaciones biotecnolgicas, uno de los apartados a los que, en general, es necesario prestar especial atencin es al relacionado con los riesgos para el medio ambiente. La sociedad actual est ms sensibilizada que nunca respecto al impacto que la biotecnologa puede producir en los ecosistemas. Los movimientos sociales del mundo occidental han contribuido a que estos peligros ambientales potenciales sean analizados detenidamente y a que los pases legislen sobre estas cuestiones bajo el prisma de lo que ha venido en denominarse el principio de precaucin. Ello es debido a que es difcil prever efectos que pueden producirse a muy largo plazo y que son dependientes de factores tan variables como la movilidad de los animales, la posibilidad de transferencia gentica vertical u horizontal, la posibilidad de que posean ventajas reproductivas o ventajas de adaptacin al medio, la perturbacin que produzcan sobre los ecosistemas, la reduccin o incluso eliminacin de poblaciones salvajes,... Por todo ello, documentos internacionales como el Protocolo de Cartagena, de acuerdo con los principios de la Declaracin de Ro sobre Ambiente y Desarrollo, contempla la necesidad de controlar el desarrollo, manejo, transporte, uso, transferencia y eliminacin de cualquier organismo vivo modificado genticamente para prevenir o reducir el riesgo para la diversidad biolgica, teniendo tambin en cuenta el riesgo para la salud humana. 2.1.- Confinamiento Resulta evidente que el impacto sobre el medio ambiente estar directamente relacionado con la posibilidad de que los animales modificados o sus transgenes se dispersen por el ambiente. En este sentido, los grupos taxonmicos que presentan el mayor riesgo ambiental son los organismos acuticos y los insectos debido a que su movilidad impone serios problemas de contencin y debido a que, a diferencia de los mamferos y aves de granja, pueden competir y sustituir a las poblaciones indgenas. La minimizacin del efecto sobre el ambiente requiere la aplicacin de medidas de confinamiento para evitar o reducir el escape al medio de animales modificados genticamente o de sus gametos viables. Para peces y crustceos producidos mediante tcnicas de acuicultura se han desarrollado diferentes medidas de contencin (biolgicas, mecnicas y fsicoqumicas) que pueden tambin aplicarse en el caso de la transgenia. Las medidas biolgicas de confinamiento generalmente implican la eliminacin de la capacidad reproductiva de los animales. Medidas habituales para evitar la procreacin de los peces en granjas acucolas incluyen la utilizacin de individuos triploides de un nico sexo. La induccin de la triploida es una medida de esterilizacin biolgica ya que en estos organismos las meiosis generan frecuentes desequilibrios cromosmicos y, consecuentemente, incapacidad de conseguir gametos viables. Sin embargo, la experiencia previa en acuicultura nos indica que esta tcnica no es efectiva al 100%. El confinamiento mecnico implica la aplicacin de medidas que reduzcan o eviten el escape de los animales de los sistemas acuticos (mediante tanques estancos, etc) y el confinamiento fsico implica la aplicacin de medidas letales a las vas de escape cambiando las propiedades fsicas del agua (por ejemplo, calentar el agua de salida a temperaturas letales y luego enfriarla nuevamente, etc). En muchas ocasiones es necesario aplicar mltiples medidas de contencin porque ninguna de ellas es completamente efectiva.

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El caso de la diseminacin incontrolada de salmones de granja (no modificados genticamente, pero s seleccionados mediante tcnicas de mejora tradicional), puede servir como ejemplo de lo complicado que puede resultar en ocasiones el control del confinamiento. Se tiene constancia de los efectos devastadores que ha originado la diseminacin de salmones de granja en el medio natural, por accidentes en el control del estancamiento de algunas piscifactoras. Los salmones de granja son competidores con los silvestres y en algunos lugares de vertidos conocidos, han conseguido desplazarlos completamente. Al igual que los salmones de granja, los salmones genticamente modificados mediante la introduccin de genes productores de hormona de crecimiento son mucho mayores que los salvajes. Desconocemos exactamente el impacto que podra tener su liberacin al medio, pero despus de lo observado con los salmones de granja se sospecha que podra generar un impacto muy importante en las poblaciones naturales de salmnidos. Este y otros ejemplos de los efectos del escape de peces de granjas pisccolas, as como el desconocimiento de las consecuencias ambientales que podran derivarse de la liberacin, voluntaria o no, de peces y crustceos, y de insectos transgnicos utilizables para el control de plagas, obligan a que en este momento se considere prioritario el desarrollo y la validacin de mejores mtodos para inducir la esterilidad reproductiva de los animales modificados genticamente, en particular peces y crustceos, y a robustecer los protocolos de medidas de contencin (Report FAO/WHO, 2003). El control de la diseminacin de animales manipulados genticamente plantea menos problemas en el caso de animales de granja (como cerdos, vacas, ovejas, gallinas, conejos, etc) los cuales presentan menor capacidad de dispersin y de posibilidad de desplazar a variedades silvestres. En estos casos, las medidas de confinamiento son ms sencillas de aplicar y los cruzamientos suelen estar bien controlados mediante la aplicacin de simples medidas de esterilizacin o de limitacin de la reproduccin. Adems, el nmero de estos animales modificados suele ser relativamente reducido, lo cual facilita su vigilancia. Quizs el mayor problema de dispersin que pueda suceder en estos animales de granja es su entrada en la cadena de produccin de alimentos para otros animales o para los humanos, aspecto del que nos ocuparemos ms adelante. 2.2.- Biodiversidad Aunque no existe una definicin consensuada sobre la biodiversidad ni en cmo apreciar sus cambios desde la perspectiva cientfica, poltica y/o normativa, la sociedad occidental actual est bastante concienciada respecto a la importancia de mantener las variedades silvestres de plantas, animales y microorganismos utilizados por todo el mundo en la agricultura y en otras actividades humanas, como fuente gentica para la produccin sanitaria, agrcola y alimenticia, as como para propuestas estticas y recreativas. En este sentido existe cierta preocupacin sobre la implicacin que puede tener la aplicacin de la tcnica de transgenia en el mantenimiento de la biodiversidad. En los ltimos aos se han descrito potenciales eventos de contaminacin gentica entre plantas transgnicas y variedades silvestres. La posibilidad de que efectivamente pueda suceder una contaminacin de los acervos gnicos silvestres por parte de secuencias utilizadas durante el procedimiento de transgenia ha desencadenado una

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preocupacin general sobre la posible implicacin del proceso de transgenia en los intentos actuales de conservacin de las variedades naturales. Respecto a la transgenia animal conviene decir que actualmente es una tecnologa de aplicacin limitada y mucho menos extendida que la transgenia vegetal. A pesar de ello, preocupa la posibilidad de que algunas variedades genticamente modificadas compitan con las variedades nativas, problema especialmente destacable en el caso de peces, crustceos e insectos en los que, como ya hemos visto, existen mayores dificultades para el control de su confinamiento gentico. Es destacable, sin embargo, que la tcnica de transferencia nuclear, una de las que puede utilizarse para la creacin de animales transgnicos, puede ser utilizada como mtodo para evitar la desaparicin de especies o de variedades en peligro de extincin y, por lo tanto, en favor el mantenimiento de la biodiversidad. La tcnica de transferencia nuclear o clonacin pretende, en estos casos, la obtencin de nuevos individuos, genticamente idnticos a los donantes de las clulas procedentes de organismos de especies o de variedades ya extintas, o en peligro de extincin. Las clulas donantes se pueden obtener a partir de individuos vivos o de tejido congelado; como vulos receptores se pueden utilizar los de la misma especie, aunque tambin hay algunos ejemplos en los que se han empleado vulos de especies afines. Aunque la contribucin real de esta tcnica a la recuperacin de especies o de variedades extintas, o en peligro de extincin, es cientficamente discutible, su aplicabilidad tcnica a la recuperacin de animales con fines recreativos parece no cuestionarse. Existen sin embargo interesantes debates sobre las implicaciones econmicas, sociales, polticas, e incluso evolutivas, de la aplicacin de la tcnica de clonacin con fines de conservacin animal. 3.- Proteccin de la salud humana La seguridad de un producto transgnico que quiera ser utilizado para alimentacin animal o humana, o que vaya a ser utilizado como producto teraputico, debe ser evaluada caso por caso. Dependiendo del conocimiento previo que se tenga sobre el producto(s) expresado(s) a partir del transgn, el establecimiento del riesgo puede requerir desde una evaluacin limitada al proceso de transgenia, en el caso de protenas bien documentadas (evaluacin en la que debe ser corroborada la secuencia aminoacdica del producto, se deben analizar las tasas de expresin en diferentes tejidos, etc) hasta, en el caso de protenas menos conocidas, llevar a cabo amplios ensayos de seguridad, en los que se incluyan estudios sobre su toxicidad y alergenicidad con animales. 3.1.- Biogranjas Los animales transgnicos que reportan beneficios econmicos (animales para produccin de alimentos, animales de lite clonados, animales productores de compuestos teraputicos, animales donantes de rganos, etc) generalmente gozan de mejor calidad de vida y condiciones de cuidado que los animales que se utilizan en investigacin, ya sean transgnicos o no, e incluso disfrutan de mejores condiciones que otros animales no transgnicos generados con objetivos semejantes. En esta aplicacin, los que nacen con alguna deficiencia orgnica suelen ser sacrificados ya que su mantenimiento resulta negativo en el balance econmico. Los productos de inters farmacolgico que se obtienen a partir de la leche, orina, sangre, etc, de animales modificados genticamente se someten a los mismos

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controles que cualquier compuesto de inters teraputico sintetizado o purificado a partir de tcnicas convencionales. Los ensayos clnicos a los que se someten todos los compuestos con objetivo teraputico, sea cual sea su forma de obtencin, permiten evaluar la seguridad y la efectividad teraputica de los mismos. Es importante aadir para algunas protenas de inters mdico, la posibilidad de conseguirlas a partir de tejidos de animales transgnicos, a priori reduce sus riesgos. Este es el caso de algunos compuestos cuyo mtodo de obtencin convencional era su purificacin a partir de tejidos humanos, vivos o de restos cadavricos. En los ltimos aos hemos asistido a diversos procesos de transmisiones virales y prinicas (SIDA, Hepatitis C, Creutzfeldt-Jakob, etc) como consecuencia de la utilizacin de materiales y/o de productos teraputicos contaminados, riesgo que podra ser evitable con la utilizacin de frmacos derivados de animales transgnicos. No debemos sin embargo olvidar la necesidad de controlar apropiadamente la posibilidad de transmisin a humanos de virus infecciosos hasta ahora especficos de la especie ganadera utilizada para la transgenia, transmisin que, en caso de producirse, podra tener efectos importantes sobre la especie humana, aunque difciles de evaluar adecuadamente a la luz de los conocimientos actuales. 3.2.- Xenotransplantes Un peligro indirecto del uso de animales transgnicos para xenotransplantes tiene que ver con la posibilidad de que estos animales modificados produzcan nuevas infecciones en seres humanos. Las posibles nuevas infecciones porcinas podran estar causadas por virus exgenos, por retrovirus endgenos, por bacterias y por parsitos. Los dos ltimos pueden ser eliminados de una manera relativamente sencilla. Algunos virus pueden ser eliminados mediante medidas estrictas durante su manejo (vacunacin, aislamiento, parto mediante cesrea, etc) pero la eliminacin total es prcticamente imposible. Esta imposibilidad, unida a mtodos de deteccin de virus inadecuados, al conocimiento de que en el genoma porcino existen retrovirus endgenos que podran afectar a las clulas humanas relacionadas con el transplante y a la experiencia previa en transmisiones de virus humanos patgenos durante el alotransplante, generan un riesgo potencial, nada despreciable, de introduccin de agentes infecciosos exgenos en los organismos receptores. Hasta el momento, no se ha observado transferencia de enfermedades o diseminacin de virus en humanos receptores de transplantes. Tampoco se tiene constancia de que retrovirus endgenos porcinos hayan causado enfermedades en especies implicadas en ensayos de laboratorio. Sin embargo, aunque la posibilidad de que virus no patgenos se conviertan en virulentos es una cuestin que cientficamente est discutida (Report FAO/WHO, 2003), se considera que estos virus representan un alto riesgo debido a su adaptabilidad, variabilidad y semejanza con virus patgenos humanos conocidos. Por otro lado, se cree que la presencia de la estructura galactosil-galactosa en la superficie de las clulas no humanas, responsable del rechazo hiperagudo cuando se transplantan a humanos clulas, tejidos u rganos de animales no humanos, confiere cierto nivel de proteccin contra la infeccin zoontica por virus encapsulados (Hallerman, 2003b). Los cerdos modificados mediante interrupcin del gen galactosyl transferasa podran tener la potencialidad de transmitir a humanos virus, tales como influenza, mucho ms rpidamente. Debido a estos peligros potenciales de transmisin de virus, un aspecto importante en relacin con la seguridad de los xenotransplantes es el relacionado con el manejo y

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mantenimiento de los cerdos que se utilizan como donantes de rganos. Los cerdos se mantienen en esterilidad, a menudo en ambientes aislados, para minimizar la transmisin de enfermedades a receptores humanos, pero estos ambientes pueden llevar al desarrollo de comportamientos anormales (NRC, 2002) Adems de por los problemas de rechazo no resueltos, la tcnica del xenotransplante sigue en fase de experimentacin debido al riesgo potencial de transmisin de enfermedades virales porcinas a seres humanos receptores del transplante y debido a que, si esto sucediese, el receptor del transplante sera una fuente de virus altamente infectivos para otros seres humanos. La dificultad para evitar estos problemas infecciosos potenciales y el desarrollo de otras alternativas tcnicas de gran aplicabilidad y menores riesgos, como la utilizacin de clulas troncales, estn dirigiendo el xenotransplante a una etapa de transicin en la que probablemente se tomarn decisiones importantes sobre su futura aplicacin. 3.3.- Riesgos por ingestin Parece inevitable que la transgenia animal tenga alguna implicacin en el consumo de alimentos, tanto porque la tcnica se aplique al desarrollo de animales modificados genticamente para la mejora de sus caractersticas agronmicas, como porque se introduzcan en la dieta, de forma controlada o no, productos alimentarios derivados de animales genticamente modificados desarrollados para propuestas veterinarias, farmacuticas o industriales. Normalmente, todas las protenas y polipptidos que ingerimos se rompen en el tracto digestivo, perdiendo as su bio-reactividad; slo unos pocos pptidos atraviesan la barrera del epitelio digestivo. Esto es diferente, sin embargo, en el caso de personas con alguna patologa en el epitelio digestivo o en personas jvenes, en las que el epitelio digestivo es permeable y por tanto las protenas pueden pasar al torrente sanguneo (Report FAO/WHO, 2003). Como ya hemos visto, la introduccin de genes en un genoma animal es generalmente no dirigida, por lo que el DNA exgeno puede inactivar o activar genes endgenos. Por otro lado, el producto del gen exgeno puede ser txico o alergnico. Estas posibilidades de riesgo son las mismas que se consideran en el caso de plantas modificadas genticamente dedicadas al consumo humano, por lo que su valoracin es muy similar a la de las plantas transgnicas. La evaluacin de la toxicidad es bastante fcil de realizar y para ello se utilizan los mismos mtodos que permiten la evaluacin txica de varios productos, incluidos los frmacos. La valoracin toxicolgica de la nueva protena suele estar basada en el conocimiento actual de las sustancias txicas, incluyendo la bsqueda de secuencias homlogas a las de toxinas alimentarias conocidas, y en el establecimiento de la funcin de las protenas nuevas. En el caso de protenas desconocidas, la evaluacin debe incluir una valoracin toxicolgica clsica completa, mediante la utilizacin de animales de experimentacin. Hay que destacar que normalmente una sustancia txica afecta tambin a los animales por lo que si tenemos animales genticamente modificados vivos y con buena salud no esperamos que la expresin del transgn resulte txica en humanos. Esto es distinto en el caso de los alrgenos. Se sabe que los animales genticamente modificados no desarrollan reacciones inmunes contra los productos de sus transgenes ya que ellos son parte integral del organismo desde el nacimiento (Houdebine, 2003). En general, la alergenicidad de un compuesto es ms difcil de

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analizar ya que no siempre afecta a los animales y ni tan siquiera afecta a todos los humanos. La mayora de los alrgenos alimentarios estn identificados y son conocidos. Por ello las primeras etapas para la evaluacin de la alergenicidad de un compuesto cualquiera se basan en el estudio de las homologas con alrgenos conocidos. Pruebas clsicas sobre su resistencia a pepsina, tamao, conformacin y efectos en animales permiten establecer una cierta probabilidad de alergenicidad del compuesto. Aunque no resulta sencillo llevarlas a la prctica, las pruebas de alergenicidad in vivo, mediante el seguimiento de consumidores, seran una prctica deseable y efectiva. Quizs por ello, las legislaciones europeas han decidido desarrollar el principio de precaucin, y pretenden garantizar la trazabilidad y el etiquetado de los alimentos que contengan o hayan sido obtenidos a partir de microorganismos, animales o vegetales genticamente modificados. El consumo de animales modificados genticamente que expresan compuestos bioactivos merece una mencin aparte. Como acabamos de comentar, aunque normalmente el sistema digestivo rompe las protenas, algunas personas pueden ser permeables a los pptidos ingeridos. La ingestin de protenas bioactivas producidas en animales genticamente manipulados puede ser un problema real para estas personas. Por ejemplo, la produccin en la leche de protenas bactericidas para reducir la susceptibilidad a la mastitis por Staphylococcus aureus o para el control de enfermedades bacterianas en peces puede alterar el equilibrio bacteriolgico de la flora intestinal de los consumidores y puede incrementar la proporcin de los patgenos resistentes. La ingestin de peces que expresan un gen de hormona del crecimiento no humana plantea interrogantes en cuanto a su efecto en el caso de consumidores que por problemas digestivos (lcera u otras alteraciones) o edad absorben protenas que no han sido rotas y las incorporan en su organismo. As pues, el riesgo para algunos individuos puede ser alto, aunque para el conjunto medio de personas sanas de cualquier edad el riesgo sea entre bajo y moderado (Report FAO/WHO, 2003). Para terminar, un comentario respecto al denominado principio de equivalencia sustancial que se ha aplicado en ocasiones para defender la seguridad de los alimentos obtenidos a partir de organismos transgnicos. La base de este principio es que algunos productos alimenticios que hoy ingerimos derivan de organismos que no podemos considerar inherentemente seguros. Una historia de dcadas del consumo de estos productos, sin efectos deletreos obvios, nos lleva a la aceptacin de que los alimentos tradicionales son seguros. La comparacin de los productos tradicionales con los nuevos productos alimentarios derivados de los organismos genticamente modificados y su equivalencia en cuanto a los productos obtenidos permite, segn este principio, admitir que los nuevos son al menos tan seguros como los productos tradicionales a los que han desplazado en la dieta. El principio ha generado mucho debate en los ltimos aos y diferentes interpretaciones en pases distintos. En este momento se considera que la idea bsica de comparar los nuevos productos derivados de organismos modificados genticamente con sus contrapartidas tradicionales es un punto de partida en el establecimiento de la seguridad de estos nuevos compuestos, pero la equivalencia sustancial no debe ser aplicada como punto final para establecer la seguridad de un compuesto alimenticio derivado de un organismo transgnico.

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CONCLUSIN Al margen de la valoracin individual respecto a la utilizacin de animales para la alimentacin o para otros usos relacionados con la investigacin o con la produccin industrial, e independientemente de la consideracin moral que cada uno tengamos sobre la manipulacin de los genomas animales, desde un punto de vista global es importante sealar que la utilizacin de animales modificados genticamente est generando importantes beneficios cientficos y sanitarios, y que en el futuro puede producir significativas aplicaciones de inters industrial. Se debe indicar asimismo que, desde el punto de vista tcnico, los procedimientos actuales de transgenia en animales no estn completamente controlados. La utilizacin de procesos de recombinacin no homloga y la expresin del transgn de forma no completamente controlada obligan a analizar detalladamente el resultado de cada proceso de modificacin gentica animal. Los riesgos sobre la seguridad ambiental y sobre la salud de los seres humanos o de otras especies animales, unidos a los problemas actuales de las tcnicas de transgenia, obligan a una valoracin detallada de la relacin beneficios/riesgos caso por caso, valoracin que debe asumir la imposibilidad de establecer a priori todos los riesgos potenciales de un proceso de transgenia, especialmente los que pueden tener un efecto sobre el ambiente o sobre la salud de los humanos a medio y largo plazo.

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ANEXOS 1.- Declaracin Universal de los Derechos del Animal

PREAMBULO Considerando que todo animal posee derechos Considerando que el desconocimiento de dichos derechos ha conducido y sigue conduciendo al hombre a cometer crmenes contra la naturaleza y contra los animales Considerando que el reconocimiento por parte de la especie humana de los derechos a la existencia de las otras especies animales, constituye el fundamento de la coexistencia de las especies en el mundo Considerando que el hombre comete genocidio y existe la amenaza de que siga cometindolo Considerando que el respeto hacia los animales por el hombre est ligado al respeto de los hombres entre ellos mismos Considerando que la educacin debe ensear, desde la infancia, a observar, comprender, respetar y amar a los animales SE PROCLAMA LO SIGUIENTE: Artculo 1 Todos los animales nacen iguales ante la vida y tienen los mismos derechos a la existencia. Artculo 2 Todo animal tiene derecho al respeto. El hombre, en tanto que especie animal, no puede atribuirse el derecho de exterminar a otros animales o de explotarlos violando ese derecho. Tiene la obligacin de poner sus conocimientos al servicio de los animales c) Todos los animales tienen derecho a la atencin, a los cuidados y a la proteccin del hombre. Artculo 3 Ningn animal ser sometido a malos tratos ni a actos crueles. Si es necesaria la muerte de un animal, sta debe ser instantnea, indolora y no generadora de angustia. Artculo 4 Todo animal perteneciente a una especie salvaje, tiene derecho a vivir libre en su propio ambiente natural, terrestre, areo o acutico y a reproducirse. Toda privacin de libertad, incluso aquella que tenga fines educativos, es contraria a este derecho.

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Artculo 5 Todo animal perteneciente a una especie que viva tradicionalmente en el entorno del hombre, tiene derecho a vivir y crecer al ritmo y en las condiciones de vida y de libertad que sean propias de su especie. Toda modificacin de dicho ritmo o dichas condiciones que fuera impuesta por el hombre con fines mercantiles, es contraria a dicho derecho. Artculo 6 Todo animal que el hombre ha escogido como compaero, tiene derecho a que la duracin de su vida sea conforme a su longevidad natural. El abandono de un animal es un acto cruel y degradante. Artculo 7 Todo animal de trabajo tiene derecho a una limitacin razonable del tiempo e intensidad del trabajo, a una alimentacin reparadora y al reposo. Artculo 8 La experimentacin animal que implique un sufrimiento fsico o psicolgico es incompatible con los derechos del animal, tanto si se trata de experimentos mdicos, cientficos, comerciales, como toda otra forma de experimentacin. Las tcnicas alternativas deben ser utilizadas y desarrolladas. Artculo 9 Cuando un animal es criado para la alimentacin debe ser nutrido, instalado y transportado, as como sacrificado, sin que de ello resulte para l motivo de ansiedad o dolor. Artculo 10 Ningn animal debe ser explotado para esparcimiento del hombre. Las exhibiciones de animales y los espectculos que se sirvan de animales son incompatibles con la dignidad del animal. Artculo 11 Todo acto que implique la muerte de un animal sin necesidad es un biocidio, es decir, un crimen contra la vida. Artculo 12 Todo acto que implique la muerte de un gran nmero de animales salvajes es un genocidio, es decir, un crimen contra la especie. La contaminacin y la destruccin del ambiente natural conducen al genocidio. Artculo 13 Un animal muerto debe ser tratado con respeto.

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Las escenas de violencia en las cuales los animales son vctimas, deben ser prohibidas en el cine y en la televisin, salvo si ellas tienen como fin el dar muestra de los atentados contra los derechos del animal. Artculo 14 Los organismos de proteccin y salvaguarda de los animales, deben ser representados a nivel gubernamental. Los derechos del animal deben ser defendidos por la Ley, como lo son los derechos del hombre. Este texto definitivo de la Declaracin Universal de los Derechos del Animal ha sido adoptado por la Liga Internacional de los Derechos del Animal y las Ligas Nacionales afiliadas tras la 3. reunin sobre los derechos del animal, celebradas en Londres del 21 al 23 de septiembre de 1977. La declaracin proclamada el 15 de octubre de 1978 por la Liga Internacional, las Ligas Nacionales y las personas fsicas que se asocien a ellas, fue aprobada por la Organizacin de las Naciones Unidas para la Educacin la Ciencia y la Cultura (UNESCO), y posteriormente por la Organizacin de las Naciones Unidas (ONU).

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2.- PRINCIPIOS TICOS DE LA INVESTIGACIN CON ANIMALES

Canadian Council on Animal Care (CCAC) El uso de animales en la investigacin, enseanza y pruebas, es aceptable solamente si contribuye en forma efectiva a la mejor comprensin de principios biolgicos fundamentales, o al desarrollo de conocimientos que, razonablemente, podemos esperar que beneficien a los seres humanos o a los animales. Los animales deberan usarse nicamente cuando el investigador haya buscado sin xito encontrar una alternativa aceptable. El intercambio continuo de conocimientos, la revisin de literatura, y la adhesin a los principios de los "Tres R" de Russell-Burch (Reemplazo, Reduccin Refinamiento), son otras condiciones necesarias. Los investigadores que usan animales deberan emplear con ellos los mtodos ms humanitarios posibles, hacer que el nmero usado sea el menor posible y que slo sea requerida la especie apropiada para poder obtener una informacin vlida. Los principios siguientes incluyen las sugerencias de miembros de las comunidades que trabajan en las reas de las ciencias y del bienestar animal, adems de las organizaciones representadas en el Consejo. Dichos principios se deberan aplicarse conjuntamente con los expuestos en el Manual sobre el Cuidado y Uso de Animales de Experimentacin del Consejo Canadiense de Proteccin de los Animales (CCPA). 1. Si se deben utilizar animales, ellos deberan ser mantenidos en condiciones que aseguren su bienestar fsico y psicolgico, segn la poltica del CCPA sobre Las necesidades sociales y comportamentales de los animales de experimentacin. 2. Los animales no se deben someter a angustia o dolor innecesarios. La tcnica experimental debe asegurarles toda la proteccin posible, ya sea para investigacin, enseanza o para pruebas; el costo y la conveniencia no deben tener precedencia sobre el bienestar fsico y mental del animal. 3. Se debe buscar la opinin de expertos sobre el valor potencial de estudios con animales. Los procedimientos siguientes, que no son todos sino solo un ejemplo, requieren una evaluacin externa e independiente que justifique su uso: investigaciones sobre quemaduras, congelamiento, fracturas, y otros tipos de lesiones en animales anestesiados, se debern realizar con prcticas veterinarias aceptables para lograr el alivio del dolor, incluyendo la analgesia adecuada durante el perodo de recuperacin; peleas organizadas entre predadores y presas o entre animales de una misma especie, cuando son probables las heridas. 4. Si el dolor o la angustia son necesariamente parte del estudio, se deben minimizar tanto en intensidad como en su duracin. Los investigadores, los Comits de proteccin de los animales, los comits de revisin de subsidios y los jueces deben ser especialmente cuidadosos en su evaluacin de los proyectos de uso animal en los siguientes procedimientos: a) experimentos que involucren la privacin de medicamentos que alivian el dolor pre o postoperatorio; b) experimentos donde el animal est paralizado o inmovilizado sin reduccin en la sensacin de dolor; c) impulsos elctricos utilizados como refuerzo negativo;

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d) condiciones ambientales extremas tales como temperaturas bajas o altas, humedad alta, atmsfera modificada, etc., o cambios bruscos de estas condiciones; e) experimentos sobre la angustia y el dolor; f) experimentos que requieran la privacin de alimentos y agua por perodos incompatibles con las necesidades fisiolgicas especficas de las especies; tales experimentos no deberan ser perjudiciales para la salud de los animales; g) inyeccin del adyuvante completo de Freund (ACF). Esto debe efectuarse en conformidad con las Directrices sobre los procedimientos inmunolgicos aceptables por el CCPA. 5. Un animal en estado de dolor severo que no puede ser aliviado debera ser inmediatamente destruido, usando un mtodo que produzca una inconsciencia rpida. 6. Mientras que los procedimientos sin recuperacin que involucren animales anestesiados, y los estudios que no causan dolor o angustia se consideran aceptables, los procedimientos experimentales siguientes infligen un dolor excesivo y por lo tanto son inaceptables: a) utilizacin de relajantes musculares o de paralizantes (curare y similares) solos, sin anestesia, durante los procedimientos quirrgicos; b) procedimientos traumatizantes que involucren aplastar, quemar, herir o golpear animales no anestesiados.

7. En el pasado, se realizaron estudios tales como pruebas toxicolgicas y biolgicas, investigaciones sobre el cncer y sobre enfermedades infecciosas requiriendo la continuacin de la experiencia hasta la muerte del animal. Sin embargo, cuando hay seales evidentes que dichos procesos ocasionan angustia o dolor irreversibles, se deberan buscar mtodos alternativos que satisfagan tanto los requerimientos del estudio como las necesidades del animal.
8. La restriccin fsica debera ser utilizada solamente despus de que se hayan examinado cuidadosamente los procedimientos alternativos y que se hayan considerado inadecuados. Los animales as sujetos deben recibir una atencin y cuidado excepcional, en conformidad con los requerimientos especficos y generales de las diferentes especies, tal como est indicado en el Manual. 9. Los experimentos dolorosos o la repeticin de operaciones traumatizantes sobre un animal, realizadas nicamente con fines de enseanza o para la demostracin de conocimientos cientficos establecidos, no puede justificarse. Los medios audiovisuales u otras tcnicas alternativas deberan ser empleados para transmitir este tipo de informacin.

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3.- COMIT NACIONAL DE ESPAA PERTENECIENTE AL INTERNATIONAL COUNCIL FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE (ICLAS). (Normas elaboradas en colaboracin con los consejos generales de colegios oficiales de farmacuticos, mdicos y veterinarios) Principios bsicos Artculo 1. Los progresos del conocimiento humano son necesarios y sobre todo los de la Biologa, de la Medicina del hombre y de los animales. Artculo 2. El hombre tiene necesidad de utilizar el animal en la bsqueda del conocimiento humano igual que para alimentarse, vestirse y trabajar. De ah el deber de respetar al animal, ente auxiliar y ser viviente comn a l. Artculo 3. Toda persona que emplee animales con fines experimentales debe tener presente que estn dotados de sensibilidad y memoria y son susceptibles al dolor y al sufrimiento. Responsabilidades del experimentador Artculo 4 El experimentador es nombrado responsable de sus actos en el marco de la experimentacin animal. Artculo 5 Las experiencias concernientes a los seres vivos y las extracciones de tejidos a sujetos vivos con fines de investigacin deben ser realizados por un cientfico cualificado o bajo su control directo. Las condiciones de conservacin de los animales en experimentacin deben ser definidas por un cientfico competente. Artculo 6 En los estudios sobre la utilizacin de animales debe existir una probabilidad razonable para que estos estudios contribuyan de manera importante a la adquisicin de conocimientos que desembocarn eventualmente en la mejora de la salud y del bienestar del hombre y de los animales. Artculo 7 Los mtodos estadsticos, los modelos matemticos y los sistemas biolgicos in vitro deben ser utilizados cuando sean apropiados para completar la experimentacin animal y para reducir el nmero de los sujetos utilizados. Artculo 8 El experimentador debe utilizar el animal adaptado a su investigacin y tener en cuenta tambin los grados sensoriales y psquicos propios de cada especie. Los animales en peligro de extincin no debern ser utilizados ms que en circunstancias excepcionales muy definidas.

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Mientras sea posible, los animales utilizados en el laboratorio provendrn de cras especializadas para asegurar las mejores condiciones de equilibrio biolgico. Artculo 9 El experimentador debe velar porque las condiciones de conservacin del animal de laboratorio sean las mejores posibles, y aportar los cuidados necesarios antes, durante y despus de las intervenciones. Artculo 10 El experimentador tiene el deber de ahorrar al animal todo sufrimiento fsico o psquico intil. Debe poner en marcha los mtodos que permitan limitar el sufrimiento y los dolores en el caso o casos que sean inevitables.

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