UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

CENTRO DE CINCIAS QUMICAS, FARMACUTICAS E DE ALIMENTOS

CURSO DE FARMCIA
DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Professora Dr
a
. Gladis Aver


Sorologia: Reaes de Imunoprecipitao e Imunoaglutinao


Ana Laura Abduch
Christine Volz
Luisa Scapin





Pelotas, Janeiro de 2014.
1. Introduo
O avano no campo da biologia molecular moderna atualmente tem
trazido diversas facilidades no que tange tcnicas laboratoriais rotineiras em
ambientes clnicos e de pesquisa, baseando-se no uso de anticorpos. A
enorme especificidade dos anticorpos para com determinados antgenos os
torna valiosos para deteco, purificao e quantificao de antgenos levando
a tcnicas diagnsticas de alta sensibilidade e eficincia.
A produo de anticorpos, parte fundamental da resposta imune
adaptativa e que compem a resposta imune humoral, o tipo de resposta
especfica e direcionada. O antgeno que estimulou sua produo pode ser de
origem viral, bacteriana, fngica, tumoral entre outros.
Os teste imunes simulam in vitro os processos imunes in vivo,
fornecendo assim dados sobre o estado clnico do paciente e obre a infeco
que est sendo pesquisada.

2. Tcnicas
2.1. Imunoprecipitao
Est tcnica utiliza um anticorpo especfico para um antgeno protico
em um mistura de protenas para dessa forma isolar este antgeno da mistura.
O anticorpo preso a uma partcula de fase solida, por exemplo pedra de
agarose, por acoplamento qumico direto ou indireto. O acoplamento indireto
pode ser realizado pela ligao de um anti-anticorpo ou por meio de outra
protena com afinidade especfica pela poro Fc das molculas de
imunoglobulinas (Ig), como a protena A ou a protena G de bactrias
estafiloccicas.
Aps a incubao das partculas revestidas por anticorpos na soluo de
antgenos, ocorre a separao entre as molculas que no se ligaram no
complexo partcula-anticorpo-antgeno por lavagem das que se ligaram. Os
antgenos especficos so ento eludos do anticorpo por alterao do pH ou
de outras condies do solvente que promovam a reduo da afinidade de
ligao.
Os antgenos purificados podem ento ser analisados por tcnicas
qumicas convencionais, como a eletroforese em gel de poliacrilamida.

Vantagens e limitaes
Teste rpido;
Apresenta baixa sensibilidade;
Obtm-se frequentemente falsos negativos, especialmente quando a
concentrao de antgeno na amostra baixa.

Algumas tcnicas de imunopreciptao, as quais podem ser visualizadas
a olho nu proporcionam a formao de uma linha de precipitado em testes
realizados em meios gelificados. Estas tcnicas so caracterizadas como
imunodifuso.
Para realizar a tcnica de imunodifuso utilizase gel de agarose onde
as molculas (tanto antgenos como anticorpos) difundemse e encontramse,
formando ento os complexo Ag/Ac, que possuem alto peso molecular e ficam
imobilizados no gel. Formase ento o imunoprecipitado, que visvel.
A concentrao de antgenos e anticorpos deve ser bem definida neste
tipo de tcnica, para que no ocorra o fenmeno conhecido como pr-zona,
onde o numero de anticorpos estar maior que o dos antgenos, dessa forma
no precipitando todo o anticorpo presente.
Para obter-se a precipitao mxima tem que se atingir a zona de
equivalncia, quando o antgeno adicionado suficiente para se combinar com
todo o anticorpo presente.
A tcnica pode ser executa das seguintes formas:

Imunodifuso simples
Ocorre a imobilizao de um dos componentes (anticorpo ou antgeno)
no meio gel. Aps a gelificao, adicionase ou outro componente e aguardase
(por cerca de 1 semana) a formao da linha de precipitao na zona de
equivalncia. Permite determinar a presena de um antgeno ou anticorpo.

Imunodifusao radial
Ocorre a imobilizao de um dos componentes (anticorpo ou antgeno)
no meio gel. A mistura ento adicionada a uma lmina. Aps a gelificao,
orifcios so abertos no gel e adicionase o segundo componente aos orifcios.
Ocorrer e difuso simultnea atravs do gel e consequentemente a formao
de um halo (linha de precipitao) na zona de equivalncia.
Existe uma relao linear entre o quadrado do dimetro do halo e a
concentrao do antgeno.
Com o uso de antgeno de concentraes conhecidas pode-se fazer
uma curva padro, permitindo determinar a concentrao em amostras
desconhecidas.

Imunodifuso radial dupla
Neste mtodo no h incorporao dos componentes ao gel. Ambos
difundem-se pelo gel atravs de orifcios, formando as linhas de precipitao
nas zonas de equivalncia.
O teste realizado colocando-se uma camada de agar em lminas de
vidro ou placas de Petri previamente recobertas com uma fina camada de agar.
Aps a gelificao, so feitos orifcios no agar, de acordo com o sistema a ser
analisado. As solues contendo o antgeno e o anticorpo so colocadas nos
orifcios do agar, as placas ou lminas so incubadas em cmara mida com
vedao a uma temperatura conveniente e constante por 18 a 24 horas.
Cada linha em um espectro de precipitao corresponde a um par de
antgeno-anticorpo. A ausncia do antgeno ou do anticorpo indicada pela
ausncia da linha.
A formao e localizao da banda de precipitao indicam a presena
de anticorpo bem como sua concentrao em relao ao antgeno, quanto mais
perto do antgeno maior a concentrao de anticorpo na amostra.

Aplicaes
Determinao do peso molecular e da quantidade de
protena imunoprecipitada por SDS-PAGE.
A imunoprecipitao permite a concentrao de protenas que so de
outra maneira difceis de detectar.
Diagnstico de doenas infecto-contagiosas (histoplasmose,
aspergilose), onde a deteco de imunoglobulinas e protenas sricas seja
significativa.
Quantificao de imunoglobulinas sricas.
Vantagens e limitaes
Teste mais demorado e mais especfico que a reao de precipitao
em meio lquido;
Detecta diferenas entre antgenos com alta sensibilidade;
Para se conseguir detectar antgenos ou anticorpos, estes tm de se
encontrar em altas concentraes



2.2. Imunoaglutinao
A reao de aglutinao caracteriza-se pela formao de agregados
visveis como resultado da interao de anticorpos especficos e partculas
insolveis que contm determinantes antignicos em sua superfcie.
A aglutinao pode ocorrer tanto com partculas que apresentam
determinantes antignicos naturais em sua superfcie (hemcias, bactrias,
protozorios, etc.) como com partculas inertes (partculas de ltex,
poliestireno, bentonita, etc.), ou mesmo com clulas antigenicamente no
relacionadas (hemcias, bactrias) s quais se adsorvem ou se fixam
antgenos solveis. No primeiro caso, a reao dita aglutinao direta, e no
segundo, aglutinao indireta ou passiva.
Os testes de aglutinao podem ser realizados em tubos ou placas. Se o
soro possuir um elevado ttulo de anticorpos aglutinantes, pode-se observar o
fenmeno de pro-zona, obtendo-se falsos resultados negativos. Esse efeito
eliminado empregando-se diluies seriadas do soro.

Aglutinao Direta
Nesta tcnica, o antgeno parte integrante da clula que teoricamente
est servindo de fase slida da reao. Um clssico exemplo da aglutinao
direta a tipagem sangunea, tambm conhecida como hemoaglutinao.

Vantagens e limitaes:
Um nico ttulo de uso limitado para se efetuar o diagnstico, pois
apesar deste valor indicar o nmero de anticorpos, no permite saber se estes
foram formados em resposta a uma infeco recente ou, anteriormente,
quando se entrou em contacto com a infeco pela primeira vez;
Efetuando vrios ttulos ao longo do tempo podemos observar a
evoluo da concentrao de anticorpos e, deste modo, conseguir estabelecer
um diagnstico mais preciso;
um mtodo sensvel e de fcil visualizao;
Existem vrios testes e, podem ser utilizados para efetuar um alargado
nmero de anlises/diagnstico.

Aglutinao Indireta
Nesta tcnica, o antgeno ou anticorpo adsorvido a uma partcula ou
clula que no interfere na reao Ag/Ac. As partculas mais utilizadas so as
de ltex e as clulas mais utilizadas so as hemcias formolizadas de aves e
carneiro.

Vantagens e limitaes
Os anticorpos aglutinam de forma mais intensa a antgenos adsorvidos do
que a antgenos solveis (mtodo direto);
Teste rpido (poucos minutos) e sensvel;
Resultados relativamente fceis de visualizar;
Existe uma grande variedade de testes.

Aplicaes
As reaes de aglutinao so muito empregadas para o diagnstico
laboratorial de doenas causadas por vrus, bactrias, protozorios e fungos,
doenas auto-imunes, na deteco de hormnios, na tipagem de grupos
sanguneos dos sistemas ABO e Rh, etc.







Referncias
FERREIRA, A. Watter; VILA, Sandra L.M. Diagnstico Laboratorial. 1996,
editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ.

ABBAS, A. K. Imunologia Celular e Molecular. 6 Ed. Rio de Janeiro:
Elsevier, 2008.

Novas Tecnologias de Diagnstico/Anlise. Disponvel em:
<http://pt.scribd.com/doc/16561222/14/Tecnicas-de-Imunofluorescencia>
Acesso em: 28/01/14.