DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA

I. INTRODUCCIN
Las enzimas son biocatalizadores especficos de naturaleza proteica que actan
acelerando las reacciones qumicas experimentando cambios fsicos durante ellas, pero
recuperando su estado original cuando dichas reacciones han culminado. De manera
general, una reaccin qumica catalizada por una enzima se representa de la siguiente
manera:
SUSTRATO + ENZIMA COMPLEJO ENZIMA - SUSTRATO ENZIMA + PRODUCTO
La ureasa, aislada y cristalizada en 1926 por el bioqumico estadounidense J. B.
Summer, se puede aislar de vegetales, mohos y bacterias, no encontrndose presente en
las clulas de mamferos. Esta enzima acta sobre enlaces carbono - nitrgeno (C-N)
diferente de los enlaces peptdicos y cataliza la siguiente reaccin:
UREA + H
2
O CO
2
+ 2NH
3

Pudiendo ser inhibida por iones plata, mercurio y otros metales pesados. Se seala que
un reductor suave como el sulfito produce su inactivacin reversible. Una unidad de
ureasa se define como aquella que libera un micromol de amonaco a partir de urea, por
minuto, bajo condiciones de ensayo especficos de pH y temperatura (pH 7.2 y 37C).
El objeto de la presente experiencia es demostrar la actividad enzimtica, determinando
para ello la actividad de la ureasa.
II. MATERIALES

1. Material Biolgico:
Enzima Ureasa (E.C.3.5.1.5. Urea amidohidrolasa)
2. Material y Equipo de Laboratorio:
Gradillas para tubos.
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm (07).
Pipetas de 1 mL (02; una al 1/100), 2 mL, 5 mL y 10 mL.
Bao Mara a 37C
Goteros o pipetas descartables de plstico.
Pizeta con agua destilada.
Espectrofotmetro SPECTRONIC-20.

3. Reactivos:
Buffer Tris-HCI 0.05 M, pH 7.2
Solucin de urea 0.075 M en buffer Tris-HCI 0.05M, pH 7.2
Solucin de ureasa 0.05%
Solucin de HgCl
2
1 %
Solucin de rojo de metilo 0.04%.

III. PROCEDIMIENTO
A. SISTEMA DE INCUBACIN:
COMPONENTES (mL) Y
PROCESO
TUBOS
1 2
Buffer Tris-HCI 0.05 M pH 7.2 0,5 0,5
Urea 0.075 M bufferada 3,0 3,0
Mezclar y pre-incubar a 37C por 5 minutos
Ureasa 0.05% --- 0,5
Mezclar suavemente e incubar a 37C por 15 minutos
HgCI21%, mezclar 2 gotas 2 gotas
Ureasa 0.05% 0,5 ---
Mezclar, preparar y seguir con los siguientes sistemas.
B. VALORACIN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR EL
MTODO DE LOS PRODUCTOS FORMADOS:
1) Cuantificacin de producto formado. Reaccin de neutralizacin:
Se pasa 2 mL de contenido del tubo 1 (Control o Blanco) a otro tubo marcado
(1B), se aade una gota del indicador rojo de metilo al 0.04% y se titula con
HCl 0.05N (usar una pipeta de 1 mi graduada al 1/100). El punto final es la
aparicin de un color rosa plido. Se anota el volumen del cido gastado, el
cual se restar del valor de titulacin a obtener en el tubo 2. Este blanco
representa el cido necesario para neutralizar los componentes del medio
inicial.
Luego se pasa 2 ml del contenido del tubo 2 (Problema) a otro tubo marcado
(2B) y se procede a titular como en el paso anterior. Como se produce una
base en esta reaccin, el tubo experimental problema (tubo 2) necesita ms
cido para lograr la neutralizacin.
CLCULOS: Se calculan los resultados en trminos de velocidad de
reaccin o actividad enzimtica expresados como micromoles de urea
desdoblados por minuto a 37C (unidades de ureasa).

(
()

()
)( )()()
( )()()

Expresar la actividad de ureasa en trminos de unidades enzimticas
(unidades de ureasa), considerando, adems de la temperatura y el tiempo, la
cantidad (en peso) de ureasa empleada y el pH.
2) Cuantificacin de producto formado. Mtodo Espectrofotomtrico,
Reaccin de Nessler:
COMPONENTES (mL) Y PROCESO
TUBOS
Blanco 1 2
Tubo 1 de sistema de incubacin --- 0,1 ---
Tubo 2 de sistema de incubacin --- --- 0,1
Agua destilada 4,5 4,4 4,4
Reactivo de Nessler 0,5 0,5 0,5
Dejar en reposo durante 10 minutos y leer en espectrofotmetro a 540 nm.
CLCULOS:
a) Correccin de lecturas: Restar lectura del tubo blanco ce reactivos de las
lecturas de los tubos 1 (control o blanco) y 2 (problema). Luego, restar la lectura
del tubo 1 de la lectura del tubo 2.
b) Velocidad de reaccin o actividad de ureasa: Se determina en trminos de mg
de NH
3
producido por mL, mediante la siguiente frmula:
( )( )

Factor de calibracin 37 mg NH
3
/mL para espectrofotmetro Spectronic-20.
IV. RESULTADOS
1) Reaccin de neutralizacin
Vol. HCl gastado (problema): 0.38 mL
Vol. HCl gastado (blanco): 0.05 mL
Velocidad: 1.1 unidades de ureasa
2) Reaccin de Nessler( espectrofotmetro)
Lectura tubo 1: 0.01
Lectura tubo 2: 0.19
Velocidad: 6.66 mg NH
3
/mL

V. DISCUSIN
Los resultados obtenidos en la reaccin de neutralizacin muestran la formacin
de NH
3
(base) en el tubo 2 del sistema de incubacin, que necesita ser
neutralizado por el HCl (acido).
En la reaccin de Nessler se puede observar la cantidad de NH
3
presente en el
sistema.
Si llevamos el resultado de la reaccin de Nessler a unidades de ureasa
notaremos que los datos coinciden. . Lo cual demuestra la actividad enzimtica
realizada por la ureasa.

VI. CONCLUCIONES
La ureasa lleva a cabo la transformacin de urea en NH
3
y CO
2
, demostrando as
su actividad enzimtica.

BIBLIOGRAFA
Stryer L., Mark Berg J., Tymoczko J.L. Bioqumica. Espaa. Editorial
REVERTE. 2008. Pg 205