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Microscopia e tcnicas de

colorao colorao
Observao de microrganismos: o Microscpio
Instrumento utilizado para observar os microrganismos
Existem duas categorias de microscpios:
a) Microscpio tico: feixes de luz / sistema lentes
b) Microscpio eletrnico: feixes de eltrons
Microscpio tico composto: Microscpio tico composto:
sistema composto : oculares + objetivas
Campo claro, campo escuro, contraste de fase, fluorescncia
imagem duas dimenses
mais comum no laboratrio de microbiologia
ampliao at 1.000 - 2.000 x
Poder de resoluo:
capacidade do sistema em distinguir dois pontos muito prximos
Resoluo:
depende comprimento de onda da luz e abertura numrica (A.N.) da
objetiva
Abertura numrica : capacidade de concentrar a luz
Lentes de maior aumento: maior AN
poder de resoluo mximo em microscpio tico: 0,2 m
Olho ~ 0.1 mm; MEV ~ 1-3 nm; MET ~ 0.20.4nm
Principais caractersticas das objetivas do microscpio ptico :
Ampliao
linear da
objetiva
Dimetro
aprox. do
campo(mm)
Abertura
'Nmerica
Dist. de trabalho
aprox.(mm)
Poder de
resoluo
(m)
Mxima
ampliao
aprox. (ocular
10x)
10x (o de
pequeno
aumento)
1.5 0.25 4.50 2.0 100 vezes
40-45x
(objetiva (objetiva
seco de
grande
aumento)
0.34 0.65 0.65 0.7 450 vezes
90-100x
(objetiva de
imerso)
0.15 1.25 0.13 0.4 1000 vezes
Poder de ampliao (magnificao): aumento da ocular X aumento objetiva
Objetiva imerso: meio (leo de imerso) com o mesmo ndice de
refrao do vidro da lmina, para evitar refrao dos raios de luz
seguindo diretamente para a objetiva, aumentando o poder de resoluo
Informaes encontradas nas objetivas do microscpio
1. Microscopia campo claro
Pouco contraste
permite observao de clulas absorvem e dispersam luz grau varivel
clulas pigmentadas, leveduras
maioria das bactrias no podem ser vistas em campo claro
Para resolver este problema colorao das clulas Para resolver este problema colorao das clulas
colorao facilita a visualizao dos m.o. no microscpio tico
Tipos de corantes usados em microbiologia:
1) Corantes bsicos (catinicos): cromforo carga +
2) Corantes cidos (aninicos) : cromforo carga -
Corantes bsicos
azul de metileno
cristal violeta
safranina
verde malaquita
fucsina bsica
Corantes cidos
eosina
vermelho congo
sudan black
fucsina bsica
Mais usados: superfcies celulares apresentam
em geral cargas negativas
Colorao de fundo
Tipos de colorao :
a) Colorao simples: 1 corante
Ex: azul de metileno, iodo (grnulos amido)
Tcnica de colorao de microrganismos
b) Colorao diferencial: mais de um corante. Permite diferenciar clulas
Ex: colorao de Gram, colorao Ziehl - Neelsen
Tcnica de colorao de Gram
Desenvolvida por Christian Gram em 1884
Colorao de Gram uma das mais usadas em bacteriologia
Gram + ou Gram : diferenas na composio da parede celular
Essencial na identificao de bactrias
varivel se clulas esto mortas ou velhas: cultura jovem (24 h)
Colorao de Gram
http://www.microbelibrary.org/images/keen/gramstainkeen.htm
2. Microscopia da contraste de fase
Grande contraste entre as clulas e o meio
clulas apresentam IR diferente do meio
luz atravessa o m.o. IR diferente: sofre retardo amplificao efeito
formao imagem escura do m.o. em fundo claro
permite visualizar clulas no coradas ou seja, vivas
clulas coradas esto mortas e muitas vezes apresentam distores clulas coradas esto mortas e muitas vezes apresentam distores
3. Microscopia de campo escuro
Espcime atingido lateralmente pela luz
nica luz que atinge a lente a dispersa pelo espcime
m.o. aparece claro sob fundo escuro
permite observar m.o. vivos e no corados : espiroquetas
possui maior resoluo que campo claro ou contraste de fase
4. Microscopia de fluorescncia:
Utilizado para observao de m.o. que apresentam fluorescncia
fluorescncia natural ou marcadores fluorescentes
luz UV ( curto) atinge m.o. e molcula fluorescente emite luz ( longo)
muito til na deteco de m.o. patognicos: imunofluorescncia
IMPORTNCIA DA MICROSCOPIA:
Morfologia e colorao : IDENTIFICAO
cocos Gram +
Arranjo em
cachos
Staphylococcus
bastonetes Gram +
Presena de
endosporos
Bacillus
Clostridium
Outros tipos de microscopia: imagens tridimensionais
- Contraste por interferncia diferencial (CID) : luz polarizada permite
visualizar estruturas internas em clulas no coradas (ncleo, esporos,
grnulos)
- Fora atmica: observao superfcies e morfologia celular (varredura)
- Laser varredura confocal: laser acoplado ao sistema tico. Permite
visualizar diferentes camadas de m.o. em uma superfcie. til em ecologia
microbiana. Utiliza corantes fluorescentes.
Microscpio tico simples (estereoscpico ou lupa)
- Ampliao entre 10 a 125x
- no possui objetivas apenas oculares
- imagem tridimensional e direta
- campo amplo de visualizao
- ampla profundidade de foco (zoom)
- observao de colnias
- macro estruturas de fungos filamentosos
- baixa resoluo
Microscopia eletrnica : feixe de eltrons
permite estudo detalhado das estruturas celulares
vantagem diante do tico: poder de resoluo 100 X maior, em virtude
do comprimento de onda muito curto dos raios eletrnicos
Produz aumentos teis de 200.000 a 400.000
Principais tipos de microscpio eletrnico:
1) Transmisso (MET) : estruturas internas PR: 0.20.4nm
2) Varredura (MEV): estruturas externas PR : 1-3 nm
MEV
MET
Imagem do mesmo m.o. visto por trs tipos de microscpio
a) Campo claro
b) MET
c) MEV
Desvantagens da microscopia eletrnica:
alto custo aquisio, manuteno e preparo de amostras
baixo poder de penetrao
amostra deve ser cortada em fatias muito finas (MET)
recobrimento com ouro (MEV)

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