Extrao e caracterizao espetroscpica

da mioglobina da carne
BIOQUMICA EXPERIMENTAL II 2013/2014
Docente: Lusa Serralheiro PL 23 | Grupo 1
Alunos: Alexandra Lana 43230 10 Maro 2014
Joana Gonalves 43681
Olena Mukan 44359
Patrcia Antunes 43149
Patrcia Sequeira 43242
RESUMO
Nesta atividade experimental, extraiu-se a mioglobina a partir de uma amostra de
aproximadamente 10g de carne e procedeu-se posteriormente identificao das
formas Fe
3+
-H2O-Mb (met-Mb, forma reduzida) e Fe
2+
-O2-Mb (oxi-Mb, forma oxidada)
desta protena.
A extrao da protena de interesse foi realizada atravs de uma centrifugao da
amostra em tampo de fosfato 20mM pH5,6 a 5000 rpm por 60 minutos, obtendo-se um
sobrenadante de volume final de 21mL, que contm as duas formas da protena que se
pde observar quando se traou o espectro de UV-Vis.
Para identificao das formas reduzida e oxidada da mesma, sujeitaram-se duas
amostras do sobrenadante submetido ao de, respetivamente, ditionito de sdio um
oxidante fortssimo e ferrocianeto de potssio um agente redutor forte. Para
separao das formas resultantes de mioglobina, cada soluo foi sujeita a uma
cromatografia de excluso molecular (SEC).
2

Por fim, realizou-se um doseamento proteico das solues A e B obtidas por
aplicao da SEC recorrendo a um ensaio espetrofotomtrico (com leitura dos seus
espetros para determinao do comprimento de onda a utilizar) e por aplicao do
mtodo de Lowry.
TRATAMENTO DE RESULTADOS
A mioglobina (Mb) dos mamferos uma protena monomrica que capaz de se
ligar ao oxignio at este ser requerido pelos tecidos cardacos e esquelticos. Esta
protena tem um nico grupo hmico (protoporfirina IX de ferro) que se liga protena
atravs de um resduo de histidina.
A protena foi purificada e estudada, neste trabalho laboratorial.
A mioglobina foi facilmente extrada de carne de bovino atravs de uma
centrifugao a 5000 rpm por 60 minutos, aps a homogeneizao em tampo de
fosfatos (20 mM pH 5,6). O sobrenadante resultante (21 mL, de cor vermelho intenso)
possui as duas formas comuns e estveis da protena: Fe
3+
H2OMb (Met-Mb) e Fe
2+

O2Mb (Oxy-Mb), com propriedades espectrais nicas (ver Quadro 1).

Amostra RegiodoVisvel RegiodeSoret
Met-Mb 635 504 409
Oxy-Met 580 542 417 348
Quadro 1-Picos de absoro das formas da mioglobina.
Retirou-se 1mL do sobrenadante, efetuou-se uma diluio 1:3 para se traar o
espectro e comprovar a existncia das duas formas da protena. O espectro obtido foi o
seguinte:

Figura 1-Espectro de absoro UV-Vis do
sobrenadante. Por observao do espetro obtido
possvel identificar trs picos: o primeiro encontra-
se nos 417nm o que corresponde regio de
Soret; Como o sobrenadante possui as duas
formas da protena: Met-Mb, com picos nos
comprimentos de onda (c.d.o) 504 e 635 nm e Oxy-
Met nos c.d.o 542 e 580 nm, verifica-se a presena
dos 3 picos.

3








Para a anlise de ambas as formas da protena, retiraram-se amostras de
sobrenadante para as reaes oxidao-reduo de interconverso:
Soluo A
O estado funcional da protena, Oxy-Mb, pode ser convertido na forma inativa,
Met-Mb, por oxidao numa reao em que um eletro do io ferro doado ao agente
oxidante.
A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,0549g de ferricianeto de potssio,
conduzindo produo de Met-Mb:
Fe
2+
-O2-Mb + K6[FeCN6] Fe
3+
-H2O-Mb (Equao1)

Soluo B
Alternativamente, Met-Mb pode ser convertida em Oxy-Mb por uma reao de
reduo em que o io do heme ganha um eletro do agente redutor.
A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,1135 g de ditionito de sdio, conduzindo
produo de Oxy-Mb:
Fe
3+
-H2O-Mb + Na2S2O4 Fe
2+
-O2-Mb (Equao2)
Estas solues foram ento submetidas a uma tcnica de cromatografia de
excluso molecular (SEC) de modo a purificar as duas formas para se poder traar o
espectro de UV-Vis e observar as diferenas espectrais das duas formas (ver Quadro 1).
A cromatografia foi realizada em colunas com cerca de 20mL de gel SephadexG-
25 (separa molculas com massa molecular entre 10005000 Da) sem o emprego de
bombas de presso.

Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Sobrenadante
1/3
635 0,172
542 0,523
505 0,395
580 0,488
409 3,152
417 3,222
Quadro 2-Registo das medidas de absorvncia do sobrenadante
nos comprimentos de onda 635, 542, 505, 580, 409 e 417 nm.
4

Soluo A (Met-Mb)
Aplicou-se cerca de 1mL da soluo A na coluna cromatogrfica e, aps algum
tempo, foi possvel observar duas fraes, uma amarela e outra castanha, onde a ltima
continha o composto de interesse, daqui se obteve um volume final de 1,2mL. A frao
obtida foi ento diluda numa diluio 1:5 e traou-se o espectro UV-Vis:











Com o traar do espetro, determinou-se a concentrao de Met-Mb recorrendo
Lei de Lamber-Beer. Para tal mediu-se a absorvncia a 409 nm.
Abs =lc
Onde:
Abs Absorvncia (A = 0,801)
- Coeficiente de absoro molar (=179mM
-1
.cm
-1
)
c Concentrao de Met-Mb
l percurso tico (l=1 cm)
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
SoluoA
1/5
635 -0,005
542 0,009
505 0,028
580 -0,002
409 0,801
417 0,533
Quadro 3-Medidas de absorvncia da Soluo A
(diluio 1:5) nos c.d.o 635,542,505,580,409 e 417
nm.
Figura 2- Espectro de absoro UV-Vis da soluo A
(Met-Mb) - diluio 1:5. Por observao do espetro
verifica-se a presena de um pico destacado dos
restantes que corresponde zona de Soret e ocorre
aos 409nm; existe, ainda, outro pico pouco visvel no
c.d.o dos 504 nm, que corresponde absoro da
forma Met-Mb. difcil avaliar o espectro pois a
amostra sofreu uma diluio de 1:5, o que pode ter
influenciado os resultados.

5

Aplicando a lei:
= [ ] [ ] =

[ ] =
0,801
179 1
[ ] = 4,47 10
3

A amostra foi diluda com uma proporo 1/5 ento tem que se multiplicar a
amostra pelo fator de diluio:
[ ]

= [ ] 5 [ ]

= 4,47 10
3
5
[ ]

= 2,235 10
2
= 2,235 10
5

Por recurso referncia 3
1
retira-se que a massa molecular da mioglobina
16949 g/mol, como a Met-Mb possui na sua constituio gua tem-se que a massa
molar da Met-Mb corresponde a 16949+2x1+15,999=16966,99gmol
-1
:
= = 16966,99/ 2,235 10
5
/ = 0,3792
1

= 0,3792 /
Como o volume de amostra retirado da coluna foi de 1,2mL tem-se que a massa
de Met-Mb de = 0,3792

1,2 = 0,4550.
Soluo B (Oxy-Mb)
Aplicou-se cerca de 1mL da soluo B e observou-se uma frao vermelha, que
foi recolhida, obtendo-se um volume final de 2,8mL. A frao foi diluda na razo 1:5 e
traou-se o espectro:








1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20374756 Consultado em 15/03/2014
Figura 3-Espectro de absoro UV-Vis da soluo B (Oxy-
Mb)-diluio 1:5. Por observao do espetro obtido
possvel identificar trs picos: o primeiro ocorre aos
417nm e corresponde regio de Soret; os restantes
ocorrem aos 542nm e 580nm e correspondem regio
do visvel.
6








Na determinao da concentrao de Oxy-Mb recorreu-se, tal como
anteriormente, Lei de Lambert-Beer descrita acima. Assim, aplicando a lei obtm-se
para Oxy-Mb:
Abs(417nm) = 0,499
oxy-Mb 417nm = 128 mM
-1
cm
-1
Percurso tico = 1cm
= [ ] [ ] =

[ ] =
0,499
128 1
[ ] = 3,898 10
3


A amostra foi diluda com uma proporo 1/5 ento tem que se multiplicar a
amostra pelo fator de diluio:

[ ]

= [ ] 5 [ ]

= 3,898 10
3
5
[ ]

= 1,949 10
2
= 1,949 10
5


Por recurso referncia 3
2
retira-se que a massa molecular da mioglobina 16949
g/mol como a Oxy-Mb apresenta oxignio na sua estrutura tem-se que massa molecular
da Oxy-Mb corresponde a 16949+15,99=16,964,99 gmol
-1
pelo que:
= = 16964,99 1,949 10
5
= 0,3306
1

= 0,3306 /

2
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20374756 Consultado em 15/03/2014
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Soluo B
1/5
635 -0,003
542 0,05
505 0,022
580 0,049
409 0,415
417 0,499
Quadro 4-Medidas de absorvncia da Soluo B (diluio
1:5) nos c.d.o 635,542,505,580,409 e 417 nm.
7

Como o volume de amostra retirado da coluna foi de 2,8mL tem-se que a massa
de Oxy-Mb de = 0,3306

2,8 = 0,9257.
DOSEAMENTO PROTEICO
Na determinao da quantidade total de protena presente no sobrenadante
recorreu-se ao mtodo de Lowry. O mtodo de Lowry uma tcnica que tem como
objetivo determinar a concentrao de protenas numa determinada soluo usufruindo
do reagente Folin Ciocalteau. Este reagente, em condies alcalinas, interage com as
protenas da amostra formando um complexo de cor azul que posteriormente pode ser
medido num espetrofotmetro a 750nm. Assim, inicialmente, prepararam-se sete tubos
de ensaio para a construo da curva de calibrao, seguindo o quadro 5.

Soluo(mL)

Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
BSA
(0,35mg/mL)
3

0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0 0 0

Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0,10 0,20 0,30 0,40
gua 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,40 0,30 0,20 0,10
ReagenteC 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
MISTRURAR TODOS OS TUBOS E AGUARDAR 10 MINUTOS.
ReagenteD 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
DEIXAR REPOUSAR TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 30 MINUTOS.
Volumefinal 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25
Quadro 5-Composio dos tubos para o doseamento proteico recorrendo ao mtodo de Lowry.
Concludos os tubos, registaram-se as absorvncias e registaram-se no Quadro 6.
Tubos Absorvncia
Registada
1 0,000
2 0,093
3 0,182
4 0,278
5 0,324
6 0,400
7 0,520
Quadro 6-Registo das absorvncias relativas aos tubos 1 a 7.

3
A concentrao de BSA indicada no protocolo seria de 0,3mg/mL, no entanto, como a soluo foi
preparada em aula para uso imediato, a massa de BSA pesada foi de 0,0035g pelo que, diluda em 10mL
de gua, origina uma concentrao de 0,35mg/mL.
8

Seguidamente, determinaram-se as concentraes de protena presentes em
cada tubo de ensaio da seguinte forma:
Exemplo: Tubo 2
[]
2
=
[] ()

[]
2
=
0,35 0,05
3,25
= 0,0054 /
Aplicando os mesmos clculos aos restantes tubos (3, 4, 5, 6 e 7) obteve-se o
Quadro 7.
Tubos Absorvncia [protena]
(mg/mL)
1 0,000 0,0000
2 0,093 0,0054
3 0,182 0,0108
4 0,278 0,0162
5 0,324 0,0215
6 0,400 0,0269
7 0,520 0,0323
Quadro 7-Registo das concentraes de protena padro nos tubos 2 a 7. Aplicao das absorvncias e
concentraes na construo da reta de calibrao do mtodo de Lowry.

Com base no Quadro 7 apresentado anteriormente, construiu-se a reta de
calibrao representada no Grfico 1.

Grfico 1-Curva de calibrao do mtodo de Lowry.
y = 15,361x + 0,0086
R = 0,992
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400
A
b
^
s

(
7
5
0
n
m
)
[protena]/tubo (mg/mL)
Curva de Calibrao - Mtodo de Lowry
9

Sobrenadante
Obtida a reta de calibrao foi possvel determinar as concentraes de protena
nos tubos 8, 9, 10 e 11 relativos ao sobrenadante recorrendo equao da reta. Como
esta do tipo = + , tem-se : = 15,361 + 0,0086 que corresponde a =
[]
8
+ . Assim, tem-se para o tubo 8:
Abs(750nm)tubo 8 = 0,480 nm
m=15,361
b=0,0086
Logo, 0,480 = 15,361 +0,0086 =
0,4800,0086
15,361

= []
8
= 0,031 /

No entanto, no inicio da preparao do sobrenadante efetuada uma diluio de
1:20 para que seja possvel a sua leitura espetrofotomtrica, assim, este valor de
concentrao de protena s real quando for multiplicado pelo fator de diluio.
Ento tem-se que um possvel real valor da concentrao de protena igual a:

[] = 0,031 20 = 0,6138 /

Posto isto, tem-se, ainda, que se considerar uma segunda diluio que ocorreu
aquando da adio da amostra aos tubos 8, 9, 10 e 11 que continha gua, reagente C e
reagente D pelo que haver uma segunda diluio da amostra assim, calculando o fator
de diluio, possvel determinar a real concentrao de protena presente nos tubos:
Volume de amostra: 0,1mL
Volume total do tubo: 3,25mL
=



=
0,1
3,25
= 0,030769
[] = 0,6138
1
0,030769

[]
8
= 19,95 /

Apresenta-se, de seguida, o quadro com o registo das restantes concentraes
determinadas para os tubos 9, 10 e 11.
Tubos Absorvncia Segunda Diluio por tubo [protena]
mg/mL
8
0,480 0,0308 19,95
9
0,789 0,0615 16,51
10
1,025 0,0923 14,34
11
1,231 0,1231 12,93
Quadro 8-Registo dos fatores da segunda diluio realizada a cada amostra e respetivas concentraes finais por tubo.
10

Apesar dos clculos terem sido realizados e apresentados, os valores de
concentrao proteica referentes aos tubos 9, 10 e 11 no podero ser utilizados no
estudo do grau de purificao da protena visto que as absorvncias relativas a cada tubo
tomam valores demasiado altos relativamente ao mximo estipulado pela reta de
calibrao, o que pode levar a concluses e determinaes proteicas erradas.

Soluo A (Met-Mb)
Para o doseamento proteico relativo Met-Mb procedeu-se do mesmo modo que
para o sobrenadante, ou seja, recorrendo reta de calibrao determinada pelo mtodo
de Lowry (Quadros 5 e 7 e Grfico 1).
Assim, como a reta de calibrao que dada por = +, com =
15,361 +0,0086 que corresponde a = []
8
+, tem-se como
exemplo para o tubo 8:
Abs(750nm)tubo 8 = 0,566 nm
m=15,361
b=0,0086
Logo, 0,566 = 15,361 +0,0086 =
0,5660,0086
15,361

= []
8
= 0,0363 /

No entanto, no incio da preparao da Met-Mb efetuada uma diluio de 1:5
para que seja possvel a sua leitura espetrofotomtrica, assim, este valor de concentrao
de protena s real quando for multiplicado pelo fator de diluio.
Ento tem-se que um possvel real valor da concentrao de protena igual a:

[] = 0,0363 5 = 0,1815 /

Posto isto, tem-se, ainda, que se considerar uma segunda diluio que ocorreu
aquando da adio da amostra aos tubos 8, 9, 10 e 11 que continha gua, reagente C e
reagente D pelo que haver uma segunda diluio da amostra assim, calculando o fator
de diluio, possvel determinar a real concentrao de protena presente nos tubos:
Volume de amostra: 0,1mL
Volume total do tubo: 3,25mL
=



=
0,1
3,25
= 0,030769
[] = 0,1815
1
0,030769

[]
8
= 5,899 /

11


Para os tubos 9, 10 e 11 foram realizados os mesmos clculos e apresentados
na tabela seguinte:
Tubos Abs [protena] mg/mL
8
0,566 5,897
9
0,940 4,926
10
0,186 0,625
11
1,425 3,746
Quadro 9-Registo dos fatores da segunda diluio realizada a cada amostra e respetivas concentraes finais por
tubo.
Por anlise das concentraes proteicas obtidas nos quatro tubos onde foram
colocadas amostras de Soluo A Met-Mb conclui-se que apenas o resultado
correspondente ao tubo 8 pode ser aceite. Os restantes tubos no podem ser
contabilizados j que tomam valores de absorvncia demasiado elevados levando a erros
na determinao da real concentrao.

Soluo B (Oxy-Mb)
No doseamento proteico relativo Oxy-Mb procedeu-se do mesmo modo que
para o sobrenadante e para a Met-Mb, ou seja, recorrendo reta de calibrao
determinada pelo mtodo de Lowry (Quadros 5 e 7 e Grfico 1).
Assim, como a reta de calibrao que dada por = +, com =
15,361 +0,0086 que corresponde a = []
8
+, tem-se como
exemplo para o tubo 8:
Abs(750nm)tubo 8 = 0,439 nm
m=15,361
b=0,0086
Logo, 0,439 = 15,361 +0,0086 =
0,4390,0086
15,361

= []
8
= 0,0280 /

No entanto, no incio da preparao da Oxy-Mb efetuada uma diluio de 1:5
para que seja possvel a sua leitura espetrofotomtrica, assim, este valor de concentrao
de protena s real quando for multiplicado pelo fator de diluio.
Ento tem-se que um possvel real valor da concentrao de protena igual a:

[] = 0,0280 5 = 0,140 /

Posto isto, tem-se, ainda, que se considerar uma segunda diluio que ocorreu
aquando da adio da amostra aos tubos 8, 9, 10 e 11 que continha gua, reagente C e
reagente D pelo que haver uma segunda diluio da amostra assim, calculando o fator
de diluio, possvel determinar a real concentrao de protena presente nos tubos:
12


Volume de amostra: 0,1mL
Volume total do tubo: 3,25mL


=



=
0,1
3,25
= 0,030769
[] = 0,140
1
0,030769

[]
8
= 4,55/


TUBOS ABS [PROTENA]
8 0,439 4,553
9 0,657 3,430
10 0,882 3,080
11 1,075 2,820
Quadro 10-Registo dos fatores da segunda diluio realizada a cada amostra e respetivas concentraes finais por
tubo.
Observando o quadro 10, verifica-se que a concentrao proteica de Oxy-Mb
dada pela mdia das concentraes dos tubos 8 e 9. Os tubos 10 e 11 apresentam
absorvncias demasiado elevadas e longnquas do extremo superior da reta de
calibrao o que induziria erros na determinao da concentrao proteica.

[]

=
4,553 +3,430
2
= 3,9915 /

QUADRO DE PURIFICAO



[Protena]
mgmL
-1

[Met-Mb]
mgmL
-1

[Oxi-Mb]
mgmL
-1

Mprotena
(mg)
(%) Graude
Purificao
Sobrenadante
19,95 - - 19,95 100 1
SoluoA
5,897 0,3792 - 7,0764 35,47 0,023
SoluoB
4,552 - 0,3306 12,7456 63,88 0,0464
Quadro 11-Quadro de Purificao.
13

Sobrenadante
O tubo mais apropriado a ser utilizado o tubo 8, pois a absorvncia est inserida no
intervalo abrangido pela recta de calibrao construda para o mtodo de Lowry.
A concentrao de protena calculada anteriormente para este tubo de 19,95mg/mL.
A massa de protena dada por mprotena = [Protena] x V, em que o volume o volume utilizado
na purificao, que no caso do sobrenadante 1 mL, logo :
mprot = 19,95 mg/mL x 1 mL = 19,95 mg

Soluo Met-Mb
Para a determinao das concentraes na soluo A, o tubo a ser utilizado ser
o tubo 8 com diluio de 1/5, pois o que se encontra dentro da recta de calibrao
construda para o mtodo de Lowry.
A concentrao de protena calculada anteriormente para este tubo de
5,897mg/mL.
As concentraes de Met-Mb e Oxi-Mb foram calculadas acima e colocadas no
quadro.
A massa de protena igual a : mprotena = 5,897 mg/mL x 1,2 mL = 7,0764 mg
O rendimento calcula-se atravs da seguinte expresso:

=


100 =
7,0764
19,95
100 = 35,47%

O grau de purificao -nos dado por:
=


=
0,3792
19,95
=
0,3792 1,2
19,95
= 0,023









14


CONCLUSO

Na parte inicial do trabalho, que corresponde leitura dos espetros de absoro
obtidos, verificam-se os picos previstos no Quadro 1 (retirado do protocolo). Isto indica
que, de um modo geral, os espetros obtidos em aula so semelhantes aos presentes na
literatura, nomeadamente no anexo fornecido para apoio ao trabalho prtico, o que
indica a ausncia de impurezas nas amostras analisadas.
Seguidamente, determinaram-se as massas de protena por aplicao da lei de
Lambert-Beer tendo-se obtido para a Met-Mb 0,4550mg e para a Oxy-Mb 0,9257mg.
Por fim, determinaram-se as quantidades de protena total no sobrenadante, na
soluo de Met-Mb e Oxy-Mb por aplicao do mtodo de Lowry. Neste ponto
obtiveram-se respetivamente: 19,95mg/mL, 5,897mg/mL e 3,9915mg/mL.
As medies de absorvncia mostraram valores elevados, apesar da diluio das
solues, pelo que no se pode comparar os valores de concentrao de protena nos
vrios tubos e foi usado o tubo 8 para as vrias amostras na avaliao da purificao da
protena, uma vez que possui valores de absorvncia dentro da reta de calibrao,
resultando em clculos de concentrao proteica sem desvios Lei de Lambert-Beer. Os
valores de rendimento so baixos, possivelmente devido a erros experimentais e ao facto
da diluio da amostra no ter sido suficiente para se avaliar considerando todos os
tubos. Em relao ao valores do grau de purificao, estes tambm se apresentam muito
baixos, o que pode ser explicado pela tcnica de separao usada e uma vez que s se
explora uma propriedade de protena (a massa).

BIBLIOGRAFIA
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