NORMA TCNICA

L5.227

Dez/2001
13 PGINAS













Teste de toxicidade com a bactria luminescente Vibrio fischeri:
mtodo de ensaio


















Companhia Ambiental do Estado de So Paulo
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Alto de Pinheiros CEP 05459-900 So Paulo SP
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http: // w w w . c e t e s b . s p . g o v . b r
TESTE DE TOXICIDADE COM A BACTRIA
LUMINESCENTE Vibrio fischeri
(MTODO DE ENSAIO)
L5.227
dez/2001
1/2
jul/03
ERRATA n 1
4.1. Equipamentos (pg. 3)
Onde se l:
a) ... emitida pela bactria 15 C 1C.
Leia-se:
a) ... emitida pela bactria a 15C 1C..
7
5.2. Sensibilidade (pg. 4)
8 Onde se l:
9 5.2.2 ... CE50 ...
10 Leia-se:
11 5.2.2 ... CE50
15min
....
5.4 Amostragem (pg. 4)
Onde se l:
As amostras devem ser coletadas conforme descrito na Norma ABNT 1:62.02-002.......... .
Leia-se:
As amostras devem ser coletadas conforme descrito na Norma NBR 9898/87 ....
5.7 Diluio da Amostra (pg. 5)
Onde se l:
Usualmente utilizam-se 5 diluies em srie ...
Leia-se:
Usualmente utilizam-se 4 diluies em srie....
5.8. Variante 1 5.8.2 (pg. 6)
Onde se l:
Transferir 10 L da suspenso-me (ver item 5.7) ...
Leia-se:
Transferir 10 L da suspenso-me (ver item 5.6) ....
5.9 Variante 2 - 5.9.1 (pg. 7)
Onde se l:
Adicionar 150 L da suspenso-me (ver item 5.7) ...
Leia-se:
Adicionar 150 L da suspenso-me (ver item 5.6) ...
2/2
jul/03
6.5. Critrios dos Resultados b) (pg. 9)
Onde se l:
6.5. b) ... CE50 ...
Leia-se:
6.5. b)... CE50
15min
....
Anexo A (pg 10)
Onde se l:
A-1 Inspeo visual da amostra
Leia-se:
A.1 Inspeo visual da amostra.
Onde se l:
O procedimento para execuo da correo da absorbncia descrito nos itens A2 a A13:
Leia-se:
... descrito nos itens A.2 a A.13, segundo Beckman Instruments Inc. Microtox System Operating
Manual, California, Beckman Instruments (1982):
A.2, A.3 e A.11 (pgs. 10 e 11)
Onde se l: ...15 1C ...
Leia-se: ...15C 1C ...
_____________________________________________________________________
TESTE DE TOXICIDADE COM A BACTRIA
LUMINESCENTE Vibrio fischeri
(MTODO DE ENSAIO)
L5.227
dez/2001
SUMRIO
1. Objetivo ............................................................................................................................................ 1
2. Normas Complementares.................................................................................................................. 1
3. Definies......................................................................................................................................... 2
4. Aparelhagem..................................................................................................................................... 3
5. Execuo do Ensaio.......................................................................................................................... 3
6. Resultados......................................................................................................................................... 7
6.4 Expresso dos Resultados...........................................................................................................9
6.5 Critrios de Validao ................................................................................................................9
6.6 Relatrios....................................................................................................................................9
1. Objetivo
1.1 Esta norma prescreve o ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri - Sistema Microtox
TM
,
utilizado como teste exploratrio da toxicidade aguda de amostras lquidas. Este mtodo aplicvel
para amostras de :
a)guas residurias (efluentes industriais e domsticos);
b)Extratos aquosos, solubilizados e guas intersticiais;
c)guas doces (superficiais e subterrneas), salobras e salinas.
1.2 Nesse ensaio a emisso de luz medida, em condies padronizadas, antes e depois da exposio
da bactria luminescente Vibrio fischeri a vrias concentraes da amostra, por um perodo de 15 a 30
minutos, sendo que a reduo da emisso de luz entre a primeira e a segunda medio proporcional
toxicidade da amostra testada.
2. Normas Complementares
Na aplicao desta Norma pode ser necessrio consultar as seguintes Normas:
NBR 9897/87 Planejamento de amostragem de efluentes lquidos e corpos receptores;
NBR 9898/87 Preservao e tcnicas de amostragem de efluentes lquidos e corpos receptores.
CETESB/L5.227/dez/2001
2
ISO - 11348-3 - Water Quality Determination of the inhibitory effect of water samples on the light
emission of Vibrio fischeri (luminescent Bacteria Test) Part3: Method using freeze-dried bacteria
(1998).
3. Definies
Para os efeitos desta Norma so adotadas as definies de 3.1 a 3.9.
3.1 Vibrio fischeri
Bactria marinha luminescente, anteriormente denominada Photobacterium phosphoreum, utilizada
como microrganismo-teste no ensaio de toxicidade aguda (linhagem NRRL-B-11177). Utilizam-se
usualmente bactrias liofilizadas. A utilizao de culturas recentes ou congeladas de bactrias
possvel, porm no est descrita nesta norma.
3.2 Agentes txicos
Substncias ou produtos qumicos que causam efeitos deletrios aos organismos-teste.
3.3 Toxicidade aguda
Propriedade do agente txico de causar efeitos deletrios a organismos vivos aps um curto perodo de
exposio dos mesmos a esse agente.
3.4 CE50

e CE20
Concentraes efetivas do agente txico que causam 50% e 20% de reduo na quantidade de luz
emitida pelo microrganismo-teste (Vibrio fischeri), aps sua exposio a esse agente durante um
determinado perodo de tempo.
3.5 Efeito gama ()
Razo entre o decrscimo na quantidade de luz emitida pelo organismo-teste (Vibrio fischeri) e a
quantidade de luz remanescente em um determinado perodo de tempo.
3.6 Transmitncia
Razo entre a intensidade de luz transmitida e a intensidade de luz incidente na amostra.
3.7 Absorbncia
Logartmo na base dez do inverso da transmitncia.
3.8 Substncia de referncia
Substncia qumica utilizada para avaliao da sensibilidade do organismo teste.
3.9 Fator de Correo
Medida das alteraes naturais de intensidade de luz do organismo teste durante o tempo de exposio.
CETESB/L5.227/dez/2001
3
4. Aparelhagem
4.1. Equipamentos
a)Luminmetro com temperatura controlada: Consiste em um fotmetro de preciso, capaz de medir a
luz emitida pela bactria 15 C 1C.
b)Balana analtica
c)Destilador ou aparelho para desionizao de gua
d)Medidor de pH
e)Estufa para esterilizao e secagem de materiais
f)Refrigerador
g)Refratmetro ou salinmetro
4.2 Outros Materiais
a)Cubetas normais de borossilicato, atxicas, compatveis com o luminmetro utilizado.
b)Cubetas para correo da absorbncia de borossilicato, atxicas, contendo uma cmara interna,
sendo utilizadas para corrigir a absorbncia de amostras coloridas.
c)Micropipetadores de preciso e ponteiras atxicas compatveis com os pipetadores.
5. Execuo do Ensaio
5.1 Reagentes e Solues
5.1.1 Reagentes
Todos os reagentes utilizados na execuo do ensaio, exceto o reagente biolgico, devem ser de grau
analtico p.a. :
a) Reagente Biolgico (ampolas contendo culturas liofilizadas de Vibrio fischeri, mantidas entre
20C e 25C)
b) Cloreto de sdio (NaCl) p.a.
c) Sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO
4
.7H
2
O) p.a.
5.1.2 Solues

a) Soluo de cloreto de sdio a 2%, denominada diluente
b) Soluo de cloreto de sdio a 22%, denominada soluo de ajuste osmtico
c) Soluo de sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO
4
.7H
2
O) 100mg/L, usada como controle positivo
5.2. Sensibilidade
5.2.1 A sensibilidade do organismo-teste deve ser avaliada por meio da determinao da CE50 do
sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO
4
.7H
2
O), utilizando o mtodo descrito nesta norma.
CETESB/L5.227/dez/2001
4
5.2.2 A faixa aceitvel de CE50 do sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO
4
.7H
2
O), nas condies
descritas nessa norma, 3,0 a 10,0mg/L.
5.3. Interferncias
a) Valores de pH inferiores a 6,0 ou superiores a 8,5 podero causar efeito txico. Dependendo do
objetivo do teste, o pH poder ser ajustado para a faixa adequada, adicionando-se cido clordrico ou
hidrxido de sdio, de forma que o volume adicionado no ultrapasse 5% do volume da amostra a ser
testada.
b) guas turvas ou fortemente coloridas: Perdas de luminescncia podem ser provocadas pela
absoro ou disperso da luz. Nesses casos essa interferncia pode ser compensada utilizando-se uma
cubeta de medida de compartimento duplo para a correo da absorbncia (vide anexo A).
c) Oxignio Dissolvido: Valores de oxignio dissolvido menores que 0,5mg/L podero causar efeito
txico.
d) Salinidade: No necessrio o ajuste osmtico em amostras que possuam concentraes de 20 a
50g/L de NaCl ou de outros compostos que produzam uma osmolaridade equivalente. Amostras com
salinidades inferiores a 20g/L devero ser testadas aps ajuste osmtico (item 6.2). Em amostras com
salinidades superiores a 50g/L poder ocorrer inibio da luminescncia.
e) Outros interferentes: A presena de substncias nutritivas de rpida biodegradao na amostra,
tais como uria, peptona, extrato de levedura, em concentraes maiores que 100mg/L, pode provocar
uma inibio da luminescncia independente dos contaminantes presentes na amostra.
5.4 Amostragem
As amostras devem ser coletadas conforme descrito na Norma ABNT 1:62.02-002 (Preservao e
tcnicas de amostragem de efluentes lquidos e corpos receptores). Devem-se utilizar recipientes limpos
e quimicamente inertes, enxaguados com a prpria amostra no momento da coleta. O prazo mximo
entre a amostragem e o incio do ensaio no deve exceder 48 horas e a amostra dever ser mantida sob
refrigerao (2 a 8C). Caso necessrio, a mesma poder ser armazenada congelada (20C) pelo prazo
mximo de duas semanas. Quando necessrio, realiza-se o ajuste de pH assim como o de salinidade,
imediatamente antes do incio do ensaio.
5.5. Procedimento Geral
5.5.1 O teste permite utilizar diferentes esquemas de diluio. Os testes devero ser realizados de forma
a se obter uma curva dose-resposta estatisticamente aceitvel, que permita a interpolao dos valores de
CE20 e CE50. Esta norma descreve o procedimento com dois diferentes esquemas, denominados aqui
variantes 1 e 2.
A diluio da amostra feita com diluente (soluo de NaCl 2%) em uma srie de cubetas aqui
denominadas srie A. Para uma segunda srie de cubetas B so transferidos volumes adequados de
diluente e reagente.
feita uma primeira medida da luminescncia das cubetas da srie B. Em seguida completa-se o
volume dessas cubetas com o contedo das cubetas da srie A. Aps perodos especficos de tempo so
realizadas novas medidas da luminescncia. O procedimento geral est resumido na Figura 1.
CETESB/L5.227/dez/2001
5
L
u
m
i
n
e
s
c

n
c
i
a
L
u
m
i
n
e
s
c

n
c
i
a
L
u
m
i
n
e
s
c

n
c
i
a
Concentrao da amostra
Concentrao da amostra
Concentrao da amostra
a)
b)
a)
b)
Cubetas Srie A
Cubetas Srie A
Cubetas Srie A
Cubetas Srie B
Cubetas Srie B
Cubetas Srie B Cubetas Srie B
1) Diluio da amostra 2) Leitura I
o
3) Leitura I
5
4) Leitura I
15
Reagente
Diluente
Amostra
Figura 1 Esquema do procedimento geral do teste de toxicidade aguda com a bactria luminescente V.
fischeri.
5.5.2 Escolha da diluio inicial
Deve ser realizado um teste preliminar para amostras com toxicidade totalmente desconhecida ou
altamente txicas, com o objetivo de estabelecer o intervalo de concentraes a ser utilizado no teste
definitivo. O teste preliminar realizado de acordo com o procedimento descrito no item 5.9 desta
norma, utilizando-se diluies subseqentes 1:10.
Para o intervalo de concentraes a ser utilizado no teste definitivo considera-se como diluio inicial
adequada aquela que cause um efeito txico de 2 a 5 vezes maior do que a CE 50.
O teste definitivo deve ser realizado para estimar a CE50 ou CE20 da amostra, utilizando-se diluies
subseqentes 1:2 ou 1:3 da amostra.
5.6 Reconstituio do reagente Microtox
a) Adiciona-se 1mL de gua ultra-pura, a 3C3C, na ampola do reagente biolgico. Esse volume
de gua refrigerada vertido de uma s vez no recipiente que contm as bactrias liofilizadas. No
utilizar pipeta para essa operao. A suspenso das bactrias luminescentes serve como suspenso-me
e deve ser conservada a 3C3C durante a execuo do ensaio.
b) Deixar em repouso por 5 minutos.
5.7 Diluio da Amostra
Usualmente utilizam-se 5 diluies em srie 1:2 e a srie de cubetas utilizadas para essas diluies
sero denominadas A
1
a A
5
.
CETESB/L5.227/dez/2001
6
5.7.1 Adicionar 1mL da soluo de NaCl a 2% nas cubetas A
1
a A
4
, mantidas a 151C.
5.7.2 Pipetar 2mL da amostra na cubeta A
5
; se a amostra tiver salinidade inferior a 2% adicionar
em seguida 0,2mL da soluo de NaCl a 22%. Homogeneizar 5 vezes.
5.7.3 Transferir 1 mL da amostra da cubeta A
5
para A
4
. Homogeneizar 5 vezes.
5.7.4 Repetir a operao de A
4
para A
3
e de A
3
para A
2
.
5.7.5 Esperar pelo menos 15 minutos para que o equilbrio trmico seja atingido.
5.8 Variante 1
Utilizam-se doses mximas de 50% (amostras salinas) ou 45,45%, quando necessrio o ajuste osmtico
da amostra e srie de diluies 1:2. Usualmente aplicada para efluentes industriais ou quando se
suspeita de altos nveis de contaminao.
5.8.1 Pipetar 500L do diluente (soluo de NaCl 2%) para uma segunda srie de cubetas B
1
(cubeta
controle) a B
5
(cubetas de teste B
2
a B
5
), tambm mantidas a 151C.
5.8.2 Transferir 10L da suspenso-me (ver item 5.7) para cada uma das cubetas da srie B,
homogeneizando cada uma.
5.8.3 Aps um perodo de pelo menos 15 minutos de estabilizao, mede-se a intensidade da
luminescncia Io das cubetas B
1
a B
5
, a intervalos de 20s.
5.8.4 Imediatamente depois da medida da luminescncia, transferir 0,5mL do contedo da cubeta A
1
para a cubeta B
1
. Repete-se o processo para o restante das cubetas. Manter as cubetas a 151C nos
intervalos entre as medidas de luminescncia.
A Tabela I mostra os volumes utilizados em cada uma das cubetas para a variante 1
Tabela I Exemplo de preparo de diluies para a variante 1.
Cubetas da Srie A Cubetas da Srie B Diluio Final
(%) Diluente
( L)
Amostra
( L)
Diluente
( L)
Reagente
reconstitudo
( L)
Volume transferido
das cubetas A para B
( L)
Controle 1000 - 500 10 500
6,25 1750 250 500 10 500
12,5 1500 500 500 10 500
25 1000 1000 500 10 500
50 - 2000 500 10 500
CETESB/L5.227/dez/2001
7
5.9 Variante 2
Utilizam-se doses mximas de 90% (amostras salinas) ou 81,9%, quando necessrio o ajuste osmtico
da amostra e srie de diluies 1:2. Usualmente aplicada em amostras de corpos dgua ou quando se
suspeita de baixos nveis de contaminao.
5.9.1 Preparar uma suspenso especial diluente-reagente, pipetando 1500L de diluente (soluo de
NaCl 2%) para uma cubeta separada mantida a 151C. Adicionar 150L da suspenso- me (ver
item 5.7) e homogeneizar.
5.9.2 Transferir 100L da cubeta contendo a suspenso diluente-reagente, para as cubetas da srie B,
homogeneizando cada uma.
5.9.3 Aps um perodo de pelo menos 15 minutos de estabilizao, mede-se a intensidade da
luminescncia Io das cubetas B
1
a B
5
, a intervalos de 20s.
5.9.4 Imediatamente depois da medida da luminescncia, transferir 0,9mL do contedo da cubeta A
1
para a cubeta B
1
. Repete-se o processo para o restante das cubetas. Manter as cubetas a 151C
nos intervalos entre as medidas de luminescncia.
5.9.5. Determina-se e anota-se novamente a intensidade da luminescncia B
1
a B
5
aps 5 e 15 minutos
(I
5
e I
15
) e, opcionalmente, aos 30 minutos (I
30
).
A Tabela II mostra os volumes utilizados em cada uma das cubetas para a variante 2.
Tabela II Exemplo de preparo de diluies para a variante 2.
Cubetas da Srie A Cubetas da Srie B Diluio Final
(%) Diluente
( L)
Amostra
( L)
Diluente
( L)
Soluo especial
de Reagente
( L)
Volume transferido
das cubetas A para B
( L)
Controle 1000 - - 100 900
11,25 1750 250 - 100 900
22,5 1500 500 - 100 900
45 1000 1000 - 100 900
90 - 2000 - 100 900
6. Resultados
CETESB/L5.227/dez/2001
8
6.1 Clculo do Fator de Correo (f
t
)
Calcula-se o fator de correo (valor f
t
) a partir da intensidade de luminescncia medida, utilizando-se a
equao abaixo. Esse fator serve para corrigir os valores iniciais de I
o
de todas as cubetas do ensaio,
antes que possam ser utilizados como valores de referncia para a determinao da diminuio da
luminescncia provocada pela gua.
f
t
= I
t
/ I
0
onde:
f
t
fator de correo para o tempo de contato de 5, 15 ou 30 minutos;
I
t
intensidade da luminescncia para a cubeta de controle (B
1
) aps um tempo de contato de 5,
15 ou 30 minutos;
I
0
intensidade da luminescncia para a cubeta de controle (B
1
), imediatamente antes
da transferncia de soluo salina 2% da cubeta A
1
.
6.2 Clculo dos Valores de Gama ( )
Os valores de gama expressam a diminuio da emisso de luz do organismo teste para cada diluio da
amostra testada. Esses valores, utilizados para a determinao da CE50, so calculados de acordo com a
seguinte frmula:
(t,T) = = f
t
. I
0
- 1
It
onde:
(t,T) = efeito gama calculado para um perodo de tempo (t) a uma dada temperatura (T).
6.3 Determinaes das Concentraes Efetivas (CE)
As CE50 e/ou CE20 podem ser determinadas graficamente ou por meio de clculos matemticos.
6.3.1 Clculo das CEs
A determinao da CE50 e/ou CE20 feita por meio da reta de regresso linear obtida entre os
logartmos das concentraes testadas versus o logartmo dos valores de gama obtidos (item 6.1). A
reta obtida deve obedecer seguinte equao matemtica:
ln C = a + b ln (t,T)
onde:
CETESB/L5.227/dez/2001
9
C = Concentrao da amostra
a = Intercepo da reta
b = inclinao da reta
(t,T) = Valor do efeito gama
Os valores de gama iguais a 1 e 0,25 correspondem a 50% e 20% de reduo na quantidade de luz
emitida pelo organismo- teste.
6.3.2 Determinao grfica da CE

A determinao das CEs pode tambm ser feita graficamente, plotando-se em papel dilog, a
concentrao da amostra e o valor do efeito gama (Figura 2). Os valores de gama iguais a 1 e 0,25
correspondem a 50% e 20% de reduo na quantidade de luz emitida pelo microrganismo teste.
6.4 Expresso dos Resultados
A expresso dos resultados pode ser feita em CE50 e/ou CE20, sempre que possvel incluindo os
respectivos limites de confiana em nvel de 95%, nos diferentes tempos de exposio (5, 15 ou 30
minutos).
6.5 Critrios de validao
a) O valor de f
t
deve ser maior ou igual a 0,7.
b) A CE50 do sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO
4
.7H
2
O) deve estar dentro da faixa de 3,0 a
10,0mg/L.
6.6 Relatrios
Os relatrios de teste devem conter obrigatoriamente, alm dos resultados da CE50 ou CE20 da
amostra, as seguintes informaes:
a) Mtodo utilizado;
b) Identificao da amostra, incluindo informaes sobre amostragem e condies de conservao;
c) Data da realizao do teste;
d) Resultado do ensaio expresso em CE50 ou CE20;
e) Concentrao mxima da amostra testada;
f) Pr- tratamento da amostra, se realizado;
g) Qualquer modificao do mtodo, ou qualquer circunstncia que possa interferir nos resultados.
....// Anexo
CETESB/L5.227/dez/2001
10
ANEXO A
CORREO DA ABSORBNCIA PARA AMOSTRAS COLORIDAS
A-1 Inspeo visual da amostra
Amostras com colorao, principalmente vermelha ou marrom, podem causar uma reduo no
especfica no nvel de luz que no se diferencia da reduo causada por um agente txico.
A amostra deve ser observada dentro de uma cubeta (j com a salinidade ajustada) para avaliao
inicial e determinao do uso do procedimento de correo de absorbncia. Se houver precipitao em
30 minutos (muitas vezes causada pelo ajuste osmtico), pode-se testar somente o sobrenadante.
Se no houver precipitao, utiliza-se uma cubeta de correo de cor (Figura 2) para medir a
interferncia da cor na amostra. As medidas obtidas so utilizadas para corrigir matematicamente os
resultados iniciais.
CMARA INTERNA
CMARA EXTERNA
FIGURA 2 - Cubeta para correo da absorbncia.
O procedimento para execuo da correo da absorbncia descrito nos itens A2 a A13:
A.2 Pipetar 1,5 mL do diluente na cmara externa de uma cubeta de correo de absorbncia limpa
(Fig. 2) e coloc-la sob temperatura de 151C.
A.3 Pipetar 1,0 mL do diluente em uma cubeta normal e coloc-la na cmara de incubao A
1
.
A.4 Pipetar 2,0 mL da amostra (ou da mais alta concentrao testada da mesma) em uma cubeta normal e
coloc-la na cmara de incubao sob temperatura de 15 1C.
A.5 Colocar cubetas limpas em todas as outras cmaras incubadoras.
A.6 Esperar 15 minutos para que o equilbrio trmico seja atingido.
A.7 Pipetar 50L da suspenso bacteriana reconstituda na cubeta A1., homogeneizando bem.
A.8 Transferir uma quantidade suficiente da suspenso bacteriana da cubeta A1 para a cmara interna
da cubeta
de correo, para que seja obtido um nvel aproximadamente igual ao do diluente na cmara externa.
Essa transferncia feita com o auxlio de um aspirador plstico, colocando-se a ponta do aspirador
no fundo da cmara externa. Evitar a formao de bolhas.



CETESB/L5.227/dez/2001
11
A.9 Aps um perodo de pelo menos 15 minutos de estabilizao, mede-se a intensidade da
luminescncia da cubeta de correo.
A.10. Usar um aspirador para remover o diluente da cmara externa.
A.11 Com a cubeta de correo ainda na cmara sob temperatura de 151C, transferir 0,5 a 1,5mL da
amostra testada da cubeta C
1
para a cmara externa da cubeta de correo (com o auxlio do aspirador
de plstico).
Essa transferncia deve ser feita cuidadosamente para que no haja contaminao da suspenso bacteriana
contida na cmara interna com a amostra.
A.12 Efetuar nova leitura.
A.13 Efetuar os clculos requeridos de acordo com item 6 (valores corrigidos de gama para
cada concentrao da amostra testada no ensaio inicial), da seguinte forma:
a) Determinar os nveis de luz inicial (Lo) e final (Lf), correspondente a:
- cubeta com diluente na cmara externa
- cubeta com amostra na parte externa
b) Calcular a absorbncia devido cor (Ac) para a concentrao da amostra usada no ensaio (Co):
Ac = 3,1 x ln Lo
Lf
c) Calcular a contribuio absorbncia de cor (Ax) para cada concentrao de interesse (concentraes
testadas da amostra).
Ax = C x Ac
Co
onde:
C = concentrao de interesse
Co = concentrao para qual foi determinado o valor de Ac
d) Calcular a transmitncia para cada concentrao testada
Tx = 1 - e
-Ax
Ax
e) Calcular o gama corrigido (c) para cada concentrao:
c = Tx ( 1 + ) - 1
f) Calcular a CE50 ou a CE20 com os valores corrigidos de (item 6.2).
_______________________________________________________________