Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu

Estudio de compuestos polifenlicos en cscaras de

Myrciaria dubia Camu camu y determinacin de su
actividad antioxidante in vitro.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:

La actividad antioxidante producida por la cantidad de los polifenoles presentes en la
cscara de Myrciaria dubia camu camu y la importancia que tiene en beneficio de la
salud.

ANTECEDENTES
El camu-camu (Myrciaria dubia (HBK) McVaugh), es una especie nativa de la regin
amaznica, es un rbol o arbusto pequeo, perteneciente a la familia Myrtaceae, que se
encuentra en estado silvestre en Per, Brasil, Venezuela y Colombia. En su ambiente
natural puede alcanzar hasta los cuatro a los ocho metros de altura
1, 2
.
La importancia de los antioxidantes es crucial para la salud, debido a su capacidad de
neutralizar radicales libres, que contienen uno o ms electrones desapareados; El
antioxidante al colisionar con el RL le cede un electrn oxidndose a su vez y
transformndose en un RL dbil no txico y que en algunos casos como la vitamina E,
puede regenerarse a su forma primitiva por la accin de otros antioxidantes
3
. Por tanto
son sustancias que permiten proteger a las molculas de las clulas del dao oxidativo
producido por las especies reactivas del oxgeno (ROS), como el radical hidroxilo (OH ),
superxido (O2), peroxilo (RO2 ) u xidos de nitrgeno (NO, NO2). Las clulas cuentan con
mecanismos de proteccin, pero cuando este sistema falla, se produce un desequilibrio y
se produce la generacin de especies oxidantes produciendo el estrs oxidativo, proceso
donde los ROS atacan los lpidos, inactivan protenas o daan el ADN
4, 5
.
Aunque los radicales libres son de vida muy corta (del orden de una milsima de segundo),
son tremendamente reactivos; por ejemplo un radical libre puede daar un milln de
molculas mediante ste proceso de auto-perpetuacin. Los principales antioxidantes
naturales son el cido ascrbico, el -tocoferol, los carotenoides y los compuestos
fenlicos, los cuales son encontrados en diferentes fuentes vegetales
6, 7
.
Los compuestos fenlicos constituyen un amplio grupo de sustancias (ms de 8.000)
presentes en el reino vegetal, aunque tambin existen compuestos de carcter sinttico,
que en su mayora son potentes antioxidantes. Todos ellos comparten una estructura
comn, un grupo fenol, al que pueden asociarse ncleos aromticos con diversos tipos de
sustituyentes, predominando los grupos hidroxilos.
Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu

Sus estructuras qumicas les permiten donar hidrgeno/electrones a los radicales libres, lo
que les confiere el carcter antioxidante. En estudios in vitro se ha demostrado que
muchos polifenoles son mejores antioxidantes que las vitaminas C y E. La eficacia de estos
antioxidantes depende en gran medida de la especie del radical libre generado, y de la
naturaleza del oxidante
8, 9
.
Teniendo en cuenta la presencia de compuestos fenlicos en alta concentracin, se
evaluar su contenido en polifenoles totales, en la cscara de camu-camu (Myrciaria dubia
(H.B.K) McVaugh) realizando la cuantificacin de los compuestos fenlicos totales por el
mtodo de Folin Ciocalteu
9
; evaluar la actividad antioxidante usando diferentes tipos de
radicales como DPPH en la cscara seca y relacionar el contenido de polifenoles totales
con la actividad antioxidante.
HIPTESIS

El fruto de camu camu presenta compuestos fenlicos en su estructura qumica, las cuales
poseen capacidad antioxidante.

OBJETIVOS

Objetivo General:
Determinar la actividad antioxidante in vitro de la cscara de Camu camu.

Objetivos especficos:
- Determinar la presencia de polifenoles en la cascara de Myrciaria dubia Camu camu
mediante el mtodo de Folin Ciocalteu y cuantificar estos.
- Determinar la actividad antioxidante del camu camu mediante el mtodo de inhibicin
del radical DPPH.

JUSTIFICACIN

Elegimos Myrciaria dubia (camu camu) porque es una fruta nativa que se encuentra en la
Amazonia Peruana y que en los ltimos aos ha ido tomando bastante importancia
alrededor del mundo.
La principal razn por la cual el camu camu cada vez toma ms importancia es debido a su
alto contenido de vitamina c o cido ascrbico que ninguna otra planta conocida a nivel
mundial, la cual es un importante antioxidante que ayuda beneficiando a la salud humana.
Con este proyecto esperamos demostrar que la cscara de camu camu es una buena
fuente de antioxidantes sobre todo de compuestos fenlicos.
Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu

APORTES:

Con este proyecto demostramos que la cscara de camu camu es una buena fuente de
antioxidantes sobre todo de compuestos fenlicos y cuyo uso podra ser adecuado en la
elaboracin de productos multivitamnicos, combinndole con otras frutas tropicales.
Tambin podra ingresar al mercado de bebidas nutracuticas y de productos biolgicos
como alternativa, sustentada en su excepcional capacidad antioxidativa y agradable sabor.
Demostrando la efectividad de Myrciaria dubia como antioxidante puede ser usada en
cremas elaboradas a base de extractos para evitar manchas propias del envejecimiento.
METODOLOGA:

Los frutos de camu-camu (maduro, pintn y verde) sern obtenidos del departamento de
Amazonas. Luego sern separados de su pulpa, cscara y semilla, en forma manual con la
ayuda de un tamiz. En la pulpa se realizaran medidas de pH, Brix, y acidez por titulacin
potenciomtrica
10
, se lograr establecer el ndice de madurez (Brix/%Acidez). El
tratamiento de la cscara ser inicialmente secado al vaci, (60 Kp.cm
-2
y 48 C 2; 72
horas), luego ser molido en molino de cuchillas, pasando por una malla de 1 mm,
seguidamente ser empacado al vaco (presin: 250 mbar) y almacenado a temperatura
de congelacin, para posteriormente realizar los anlisis respectivos.

Preparacin de extractos

Las muestras vegetales secas y molidas sern extradas con una mezcla de etanol y agua
destilada (7:3) por 4 das a temperatura ambiente. Luego de la filtracin, se proceder a
evaporar el solvente en un rotavaporador a temperatura menor de 40
o
C. Los extractos
hidroalcohlicos que se obtendrn, sern almacenados en la refrigeradora a temperatura
menor de 4
o
C hasta su uso.

Determinacin de compuestos polifenlicos

MTODO 1: Se utilizar el mtodo de Folin-Ciocalteu
11
. Se prepar una curva de
calibracin de cido glico. Los extractos hidroalcohlicos de las 2 muestras vegetales
sern evaluados a una concentracin de 0,1 mg/mL. A la muestra se le aadir solucin de
Folin-Ciocalteu (diluido 1 en 2 con agua milli-Q), luego se le aadir carbonato de sodio al
20% y 400 L de agua ultra pura. Se agitar vigorosamente, se cubrir de la luz y se le
llevar a reposo por 90 minutos a temperatura ambiente. Las absorbancias respectivas
sern medidas a 760 nm en un espectrofotmetro. Las muestras sern analizadas por
triplicado y el contenido de compuestos fenlicos totales ser expresado en mg de cido
glico/g de extracto hidroalcohlico.

Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu

MTODO 2: Esta prueba se basa en la reduccin de los iones Fe
3+
a Fe
2+
, por los
polifenoles mostrando una coloracin azul, formando el complejo ferrocianuro-ferroso,
registrndose una mxima absorbancia a 720 nm teniendo como ventaja: a) La rapidez y
simplicidad de la prueba debido a la formacin del color azul, lo que ofrece sensibilidad y
versatilidad para la determinacin espectrofotomtrica, b) Los resultados son
directamente medidos del contenido de polifenoles solubles
11
, obtenindose en el
extracto acuoso de la cscara seca pintn de camu-camu, mayor contenido de polifenoles.
Se realizar mediante el mtodo de Azul de Prussian, reportado por
11
.
Se tomar el extracto acuoso y se adicionar FeCl
3
0,1M en HCl 0,1N, y K
3
Fe(CN)
6
y 0,008
M la absorbancia ser registrada a 720 nm. Los resultados se expresarn en mg Ac.
Glico.g
-1
cscara seca.

Evaluacin de la actividad antioxidante en la cscara seca de camu-camu en tres estados
de madurez

Radical 2,2-diphenyl-1-picrilhydrayl (DPPH)
Se evaluar mediante el mtodo de inhibicin del radical DPPH
12
. Se har reaccionar la
muestra con el reactivo DPPH (100 M) en etanol al 96%, la absorbancia ser monitoreada
a 515 nm, a intervalos de 30 segundos durante 10 minutos. Para la determinacin de la
actividad antioxidante, los resultados sern expresados en trminos de IC
50
, K
2
y Poder
Antirradical
12
.

a) Coeficiente de inhibicin (IC
50
)
Se determinar mediante un anlisis de regresin del porcentaje de remanente versus la
concentracin necesaria de los extractos, para inhibir el 50% del radical DPPH
12
.
El porcentaje de remanente del radical DPPH ser calculado de la siguiente manera:
(Ecuacin 3)

%DPPH
REM
()
()
(3)

Donde (DPPH)
f
es la absorbancia del radical DPPH al final de la reaccin, (DPPH)
i
es la
absorbancia del radical al inicio de la reaccin. El valor de IC
50
, fue expresado en trminos
de cido Ascrbico Equivalente (AAE)
13
.


b) Constante de velocidad K
2

El valor de K
2
es un parmetro que diferencia a los compuestos de acuerdo a la reactividad
intrnseca.

Los valores de cintica de absorbancia que se obtendrn por la decoloracin del DPPH
para cada concentracin de las soluciones de trabajo de la cscara de camu-camu en tres
estados de madurez, en estudio, sern analizados mediante el programa STATISTICA/W
14
.

Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu

Para el clculo del parmetro "b" se usar el siguiente modelo matemtico: (Ecuacin 4)

A=(t + 1)
b
a (4)

Donde: A, es la absorbancia en cualquier tiempo t; a y b, son constantes; t, es el tiempo de
reaccin.

c) Poder antirradical
El poder antirradical, referido a la eficiencia de un antioxidante, ser evaluado de acuerdo
a la metodologa descrita
12
.
Para tener una mejor claridad sobre la capacidad que tiene un antioxidante para inhibir
radicales libres, se realizar utilizando el Software de Sistema de Modelamiento
Molecular - HyperChem (Vrsion 6,01)

determinando el Anlisis Conformacional de
Mnima Energa
15
.

Radical peroxilo
Se emple el mtodo de TRAP (Poder Total de Actividad Reductora). Se tomo 10 L de los
extractos acuosos a diferentes concentraciones de la cscara seca de camu-camu en
diferentes estados de madurez, se hizo reaccionar con 990 L de la solucin stock de
radical peroxilo. La disminucin de la absorbancia fue registrada a 414 nm a intervalos de
30 segundos durante 10 minutos. La actividad antioxidante fue expresada como IC
50
, y en
trminos de cido Ascrbico Equivalente (AAE)
13
.

ANLISIS ESTADSTICO
Los datos de absorbancia registrados para los modelos in vitro del radical DPPH, Catin
ABTS
+
, y radical Peroxilo sern evaluados mediante un Arnol para determinar el IC
50

12
. Los
datos de absorbancia registrados para los modelos in vitro del radical DPPH, catin
ABTS
+
y radical Peroxilo, sern sometidos a un anlisis de regresin lineal para determinar
el K
2
, asimismo los datos de absorbancia de polifenoles totales y cido ascrbico, para ser
expresados en trminos de Ac. Glico Equivalentes (AGE) y cido Ascrbico Equivalente
(AAE), respectivamente
13,15
.
Los valores calculados en las pruebas de actividad antioxidante, polifenoles totales, cido
ascrbico y antocianinas sern expresados como promedio desviacin estndar. Los
valores de IC
50
y cantidad de cido ascrbico, antocianinas y polifenoles totales, se
evaluarn estadsticamente mediante un Diseo Completamente al Azar (DCA), con tres
repeticiones, usando la prueba de t-student, p < 0,05
15
.








Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu

MATERIALES Y EQUIPOS:

Material biolgico:
Cscara de Myrciaria dubia camu camu
Material de laboratorio:
Pipetas
Beacker
Fiola
Embudos de decantacin
Tubos de ensayo
Frascos mbar
Reactivos:
Reactivo de Folin
cido glico
Etanol 96%
Agua destilada
Na
2
CO
3
20 %
DPPH
FeCl
3
0,1M
HCl 0,1N
K
3
Fe(CN)
6

Equipos:
Estufa
Refrigeradora
Balanza analtica
Molino de cuchillas
Rotavapor
Espectrofotmetro UV






Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu


CRONOGRAMA



















ACTIVIDAD MESES
En Fe Ma Ab Ma Ju Jul Ag Se Oc No
1. Bsqueda de informacin
bibliogrfica
X X
2. Recoleccin y
acondicionamiento de la
muestra
X
3. Preparacin de extractos X
4. Determinacin y
cuantificacin de compuestos
fenlicos
X X X
5. Evaluacin de la actividad
antioxidante
X X
6. Anlisis estadstico

X
7. Consolidacin de datos X
8. Preparacin del informe X
Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu


PRESUPUESTO

Descripcin Monto
(S/.)
Porcentaje
%
Bienes
Alimentos y bebidas para el consumo

Papelera en general, utiles, etc.
50 3.33
Aseo, limpieza y tocador.
50 3.33
Electricidad, iluminacin y electrnica.

Otros (USB,etc.)

Medicamentos

Insumos, intrumental y accesorios mdicos,
quirrgicos, odontolgicos y de laboratorio
400 26.67
Material biolgico

Animales para estudio

Productos farmacuticos de uso animal

Productos Qumicos
700 46.67
Otros bienes

Libros y textos para biblioteca

Servicios
Pasajes y gastos de transporte

Viticos y asignaciones por comisin de servicio
150 10
Otros gastos
100 6.67
Servicio de suministro de gas

Servicio de internet

Servicio de impresiones, encuadernacin y empastado
50 3.33
Servicios diversos

TOTAL
1500 100%




Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu


REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Moreira M, Ferreira S. Clonacin de arbustos arbustos de camu-camucamu-
camu y portainjertos arbreas. II. Rev. Bras. Frutic.2009; 31(4).

2. INPA - Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia. Camu-camu, una fuente
de vitamina C natural. Informativo INPA, Manaos; 1996.
3. Villanueva-tiburcio J, Condezo-hoyos L, Asquieri E. Antocianinas, cido
ascrbico, polifenoles totales y actividad antioxidante, en la cscara de camu-
camu (Myrciariadubia (H.B.K) McVaugh)..Cinc. Tecnol. Aliment., 2010;
30(1):151-160.
4. Rodrguez J, Menndez J, Trujillo Y. Radicales libres en la biomedicina y estrs
oxidativo. Rev. Cubana MedMilit 2001; 30(1):15-20
5. Sotero V, Silva L, Merino-Zegarra C, Maco M, Dvila E, Ramirez W, Garcia
D.Evaluacin de la actividad antioxidantede seis frutales amaznicos: anona,
castaa, chope, huasa, huito y uvilla. Revista Cientfica FOLIA AMAZNICA
2011; 20(1-2): 53 58.

6. Zamora J. ANTIOXIDANTES: MICRONUTRIENTES EN LUCHA POR LA
SALUD. Rev. ChilNutr, 2007; 34(1):89-129.

7. Halliwell B, Gutteridge JMC .Free Radicals in Biology and Medicine, Ed 4.
Clarendon Press, Oxford, 2006.

8. Snchez J. Efecto de la quercetina y la rutina frente al dao oxidativo inducido
en eritrocitos con distintos contenidos de colesterol.[Tesis doctoral].
Salamanca: Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Universidad de
Salamanca; 2009.

9. Zainol M, Abd Hamid A, Yusof S, Muse R. Antioxidative activity and total
phenolkic compounds of leaf, roods and petiole of four accesioprs of Centella
asiatica (L.) Rev. Urban. Food Chemistry.2003;81:575-581

10. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC. Vitamins and
other nutrients. Official methods of analysis. 15 ed. Gaithersburg, 1995.

Proyecto de investigacin Myrciaria dubia camu camu

11. Price M. L.; Butler, L. G. Rapid Visual Estimation Spectrophometric
Determination of Tannin Content of Sorghum Grain. Rev. Journal of
Agricultural and Food Chemistry,1977; 25(6):1268 -1273,

12. BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M. E.; BERSET, C. Use of a free radical
method to evaluate antioxidant activity. Rev. Food Science and Technology,
1995; 28(1):25 -30.

13. KIM, D. O. et al. Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity (VCEAC) of
Phenolic Phytochemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2002;50(13):3713-3717.

14. PROGRAMA INFORMTICO: STATSOFT. Statistica Software for Windows:
release 5.0. New York, 1993

15. PROGRAMA INFORMTICO: STATSOFT. HyperChem TM Program: release
6.01 for Windows. New York, 2000.