Vi sinh vật phân tử

Chương 11:
ĐIỀU HÒA DỊCH MÃ Ở CẤP ĐỘ RNA
 
 

Điều hòa ở cấp độ RNA

Liên kết của Protein tới ARN điều khiển tỉ lệ suy thoái
Một số phân tử mRNA phải được tách ra trước khi dịch mã
Một số phân tử protein điều khiển có thể là nguyên nhân ức chế dịch
mã
Một số phân tử protein điều khiển có thể kích hoạt dịch mã
Quá trình dịch mã có thể được RNA đối nghĩa điều khiển
Điều khiển quá trình dịch mã bằng sự biến đổi Ribosome
RNA can thiệp ( RNAi)
Sự nhân bội và lan truyền của RNAi
PTGS (bất hoạt gen trong sau phiên mã) trong thực vật và sự chế ngự
trong nấm
Micro RNA – một lớp của RNA điều khiển nhỏ
Sự suy giảm là nguyên nhân gây kết thúc quá trình phiên mã sớm
RNA
Riboswitches - RNA tác động trực tiếp như một cơ chế điều khiển

1 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Điều hòa ở cấp độ RNA

Điều hòa sự biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã là hiệu quả nhất
trong bảo tồn nguyên vật liệu và năng lượng trong khi điều hòa hoạt động
của enzyme để cho hầu hết các phản ứng diễn ra một cách nhanh chóng. Vì
rằng điều hòa ở cấp độ dịch mã không phải là hiệu quả nhất và cũng không
phải nhanh chóng nhất, bởi thế nó thường xuyên xảy ra ít hơn các hình
thức điều hòa khác. Thông thường, một khi mRNA đã được tạo ra, nó
nhanh chóng chuyển đến ribosome nơi nó được dịch mã. Điều này đặc biệt
đúng trong sinh vật prokaryotic là sinh vật không có màng nhân để hạn chế
sự đến gần của bộ máy phiên mã và các ribosomes. Đã từng có ý kiến cho
rằng sự điều hòa dịch mã ở nó là rất hiếm. Phần nào điều này là do những
khó khăn lớn hơn của phạm vi dịch mã và liên quan đến hiện tượng như
mRNA ổn định hơn là ở cấp độ thử nghiệm phiên mã hay protein. Do đó,
gần đây công việc đã tiết lộ một số lượng ngày càng lớn các trường hợp
điều hòa ở mức độ dịch mã, đặc biệt là trong các sinh vật nhân thật. Trong
đó, thực vật dường như ưu tiên điều hòa dịch mã thông qua việc sử dụng
một số ít các phân tử RNA nhỏ điều khiển. Tuy nhiên, vẫn còn có những
người biết ít hơn các trường hợp điều hòa dịch mã so với điều hòa phiên
mã.
Ngoài việc kiểm soát quá trình dịch mã của mRNA ngay sau khi nó
tổng hợp, vẫn còn có khả năng xảy ra sự ngăn chặn quá trình tổng hợp các
RNA thông tin sau khi quá trình phiên mã đã được bắt đầu và chỉ một đoạn
ngắn RNA được tổng hợp. Một ít cơ chế còn chưa rõ ràng này được quy
vào như là cơ chế suy giảm quá trình phiên mã. Đôi khi nó được phân loại
như là một dạng của điều hòa quá trình phiên mã. Tuy nhiên, nó đã được
bao gồm trong chương này, vì nó liên quan chặt chẽ đến điều hòa dịch mã
mà các thay đổi cấu trúc RNA thông tin có liên quan trong cả hai trường
hợp.

2 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Nhiều trường hợp điều hòa quá trình dịch mã đã biết xảy ra như là các
bước ngoài trong bậc phức hệ điều hòa ở mức độ cao cũng bao gồm điều
hòa ở mức độ phiên mã và hoạt động của protein. Các ví dụ bao gồm các
phản ứng sốc nhiệt ở cả vi khuẩn và nhiều động vật và kiểm soát tốc độ
tăng trưởng của tế bào và khác biệt trong các động vật bậc cao. Trong
chương này, chúng tôi đã cố gắng để minh hoạ sự điều hòa ở cấp độ RNA
bằng cách sử dụng các ví dụ đưa ra các cơ chế điều hòa không quá phức
tạp.
Trước khi tổng hợp một phân tử mRNA, có một số con đường mà
trong đó sự dịch mã của thông tin có thể được điều khiển:
1. Kiểm soát đối với tỷ lệ suy thoái của mRNA
2. Sự biến đổi RNA không dịch mã thành dạng có thể được dịch mã
3. Các protein điều khiển kiểm soát sự dịch mã của mRNA
4. Sự liên kết của RNA đối nghĩa vào mRNA để ngăn cản quá trình
dịch mã
5. Kiểm soát sự dịch mã của mRNA bởi riboswitches.
6. Ưu tiên dịch mã của một số lớp mRNA nào đó do sự biến đổi của
ribosome.

Liên kết của protein vào mRNA điều khiển tỉ lệ của sự suy thoái

Không giống như các DNA cấu tạo nên gennom tế bào, thời gian tồn
tại của mRNA là tương đối ngắn. Tất cả các tế bào đều chứa một loạt các
ribonucleases có vai trò loại bỏ mRNA một khi nó đã phục vụ chức năng.
Thời gian bán hủy của một mRNA điển hình trong vi khuẩn như E. coli là
2-3 phút. Tính mẫn cảm với sự suy thoái của mRNA phụ thuộc vào cấu
trúc thứ cấp và vì vậy một số phân tử mRNA đã được ổn định hơn những
phân tử khác. Ở đây chúng tôi đang quan tâm đến trường hợp mẫn cảm với
sự suy thoái của mRNA được thay đổi để phản ứng lại tín hiệu điều hòa.
Sự suy thoái mRNA có thể được cản trở hoặc thúc đẩy do sự liên kết của
RNA đặc trưng với các protein điều khiển. Sự giải thích chính xác về cơ
chế thường khó khăn vì sự liên kết với ribosomes để bảo vệ mRNA tránh
sự suy thoái. Vì vậy mà mRNA không được dịch mã sẽ bị suy thoái nhanh

3 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

hơn. Có hai con đường chính trong đó liên kết của một protein có thể ảnh
hưởng đến sự ổn định mRNA. Thứ nhất, nó có thể thay đổi trực tiếp sự
mẫn cảm để ribonuclease tấn công. Thứ hai, các protein có thể giúp đỡ
hoặc cản trở liên kết vào ribosome, mà có thể thay đổi tốc độ dịch mã, và
gián tiếp ảnh hưởng đến sự ổn định mRNA.
Hệ thống điều khiển CsrAB của E. coli bao gồm một RNA liên kết
với protein, CsrA, và một phân tử RNA mã hóa, CsrB, hoạt động như là
một nơi đậu cho CsrA. Protein CsrA có thể liên kết với mỗi phân tử
mRNA đó mà nó điều hòa hoặc tới RNA CsrB. Mỗi RNA CsrB có thể
chứa khoảng 18 protein CsrA. Các hệ thống điều khiển CsrAB kiểm soát
cân bằng giữa các đường dự trữ như glycogen, được tích lũy trong vi
khuẩn, đặc biệt là trong pha tĩnh, và sự phân chia của đường bằng
glycolysis (CSR = carbohydrate storage regulator). Nói chung, CsrA kích
hoạt glycolysis và ngăn chặn tổng hợp glucose và tổng hợp glycogen.
Các hệ thống CsrAB kích hoạt các operon flhDC bằng sự ổn định
của mRNA. Những sự kiện chính có thể thảo luận. Liên kết của CsrA vào
mRNA có thể trực tiếp kích hoạt dịch mã. Ngoài ra bảo vệ các mRNA từ
sự suy thoái bởi ribonucleases sẽ gián tiếp tăng quá trình dịch mã. Protein
CsrA cũng liên kết vào mRNA mang các gene tham gia vào việc tổng hợp
glycogen (Hình. 11.01). Sự liên kết của CsrA đẩy nhanh sự phân hủy của
mRNA g/g của nó để ngăn cản sự dịch mã. Một lần nữa, có hai cách trong
đó có những liên kết của CsrA có thể ảnh hưởng đến sự ổn định mRNA.
Nó có thể thúc đẩy enzyme ribonuclease tấn công trực tiếp hoặc có thể
ngăn cản quá trình dịch mã đầu tiên, trong đó có trường hợp mRNA sẽ
không được bảo vệ bởi các ribosome và sẽ bị thoái hóa nhanh hơn. Quyết
định thí nghiệm giữa một trong hai cách không phải là dễ dàng.

Một Số Phân Tử mRNA Phải Được Tách Ra Trước Khi Dịch Mã

Ở Eukaryotic các phân tử mRNA là kết quả của sự xử lý và loại bỏ

các intron và gắn thêm đuôi và mũ so với sản phẩm phiên mã đầu tiên
(primary transcript) (xem Ch.12 để biết thêm chi tiết). Nói chung,
mRNA ở prokaryotic không được xử lý theo cách này. Sản phẩm phiên mã

4 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

đầu tiên được thực hiện bởi enzyme RNA polymerase, thường là RNA
thông tin trong prokaryotes. Tuy nhiên, trong một vài trường hợp hiếm hoi,
mRNA ở prokaryotic tiếp tục xử lý là cần thiết trước khi nó có thể dịch
mã.

Hình 11/1: Kiểm soát sự suy thoái của mRNA bằng CsrA
Ổn định của mRNA glg được điều hòa bằng protein CsrA. Trong khi
không dùng đến, các RNA liên kết với protein CsrA liên kết với RNA CsrB.
Khi protein CsrA liên kết với mRNA glg, cấu hình của mRNA glg, hình
dạng của mRNA glg thay đổi trở thành dạng dễ bị phân hủy

Trong Escherichia coli, ribonuclease III là một trong một số

ribonucleases chủ yếu tham gia vào việc xử lý trước các tRNA và rRNA.
Ngoài ra, một số phân tử mRNA phải được xử lý bằng RNase III trước khi

5 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

chúng có thể được dịch mã. Các mRNA từ gene speF mã hóa
decarboxylaza ornithin dịch mã tốt hơn gấp bốn lần nếu cắt bằng RNase
III. Tuy nhiên, mRNA từ gene adhE, mã hóa enzyme dehydrogenaza
alcohol, yêu cầu xử lý bằng RNase III là tuyệt đối. Trong những trường
hợp như vậy, phân tử mRNA ban đầu gấp lại đến mức vị trí liên kết của
ribosome và mã mở đầu không tới gần được. Tách mRNA ngược lên trên
của vị trí liên kết của bằng RNase III làm các trình tự này được giải phóng
để các ribosome nhận ra (Hình 11/02). Trong những thể đột biến rnc, mà
thiếu RNase III, các mRNA adhE không thể được dịch mã và các tế bào
không thể phát triển lớn mạnh trong lên men kị khí.

Hình 11/02: Sự tách ra của mRNA adhE bằng RNase III

Vị trí liên kết ribosome của mRNA adhE có thể không được liên kết
vào ribosome do tiền mRNA gấp lại. RNAase III tách các tiền mRNA
adhE vì vậy bộc lộ vị trí liên kết ribosome.

6 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Phá hủy thông tin adhE cũng được kiểm soát bằng sự hoạt động của
ribonuclease. mRNA adhE trưởng thành làm thoái hóa bằng ribonuclease
G, ribonuclease bình thường khác tham gia vào quá trình xử lý rRNA.
Trong thể đột biến rng, thiếu RNase G, chu kỳ bán hủy của mRNA adhE
sẽ tăng lên từ 4 đến 10 phút, mức độ tăng lên và protein adhE được sản
xuất quá mức.
RNA vô nghĩa (non-coding RNA): một vài phân tử RNA nào đó
không được dịch mã tạo protein
Sản phẩm phiên mã đầu tiên (primary transcript): phân tử RNA đầu
tiên thu được từ một mạch khuôn DNA phiên mã, trước khi xử lý hoặc sửa
đổi xảy ra
ribonuclease III: một ribonuclease của vi khuẩn có chức năng chính
là xử lý những rRNA và tRNA tiền thân

Một Số Protein Điều Khiển Có Thể Là Nguyên Nhân Kìm Hãm Quá
Trình Dịch Mã

Cũng như một số protein điều khiển có thể liên kết vào DNA và thúc
đẩy hoặc ngăn cản quá trình dịch mã, một số protein cũng có thể liên kết
vào những trình tự đặc biệt trên mRNA và điều khiển quá trình dịch mã.
Các ví dụ về cả hai quá trình điều hòa dịch mã tích cực và tiêu cực đã được
biết đến. Những phản ứng của mRNA với sắt được thường dùng dưới đây
như là một ví dụ về sự kìm hãm quá trình dịch mã.
Sắt là một dinh dưỡng cần thiết và là nhân tố đồng tác động (cofactor)
cho nhiều protein, chẳng hạn như cytochromes và hemoglobin. Tuy nhiên,
sắt tự do tạo ra các gốc tự do và độc hại do đó nguy hiểm. Do vậy, nguyên
tử sắt dư thừa được tích trữ vào ferritin còn ở prokaryotic là
bacterioferritin. Ferritin là một protein hình cầu lõm bao gồm 24 tiểu đơn
vị. Tính đến 5000 nguyên tử sắt có thể được lưu trữ như phức hệ
hydroxyphosphate bên trong hình cầu này.
Mức độ ferritin được điều tiết để đáp ứng lại nguồn dự trữ sắt. Trong
thực vật, mức độ ferritin được điều hòa ở mức độ phiên mã. Tuy nhiên,

7 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

trong cả động vật và vi khuẩn, mức độ ferritin phụ thuộc vào sự điều hòa
quá trình dịch mã. Khi thiếu sắt, quá trình dịch mã của mRNA ferritin được
cắt giảm. Khi sắt phong phú ferritin được tổng hợp nhiều. Trong động vật,
một RNA liên kết với protein chịu trách nhiệm, trong khi ở vi khuẩn được
kiểm soát bằng RNA đối nghĩa (antisense RNA) (xem dưới đây).

Bacterioferritin: Các vi khuẩn tương tự của ferritin, một protein có

dung lượng sắt
Ferritin: một protein tích lũy sắt
translational repression(sự kìm hãm quá trình dịch mã): hình thức
kiểm soát trong đó sự dịch mã của một RNA thông tin bị ngăn cản
Vùng 5’ không dịch mã (5’-UTR) của ferritin mRNA ở động vật chứa
một trình tự đặc biệt được biết đến như là một yếu tố đáp ứng sắt (iron-
responsive element (IRE)), một dạng có cấu trúc khung loop. Khi sắt
khan hiếm, một phân tử protein điều khiển sắt (iron regulatory protein
(IRP)) liên kết vào thân và loop IRE và ngăn cản dịch mã. Kết quả của
việc bổ sung thêm sắt dẫn đến sự tách ra của IRP từ ferritin mRNA, do đó
nó có thể được dịch mã (Hình 11/03).
Vùng 5’ không dịch mã (5’ -untranslated region (5’-UTR): Trình tự
không được dịch mã nằm ở giữa đầu tận cùng 5’ và mã mở đầu của một
mRNA
Protein điều khiển sắt (IRP): Nhân tố điều khiển sự dịch mã kiểm
soát sự biểu hiện của mRNA ở động vật để phản ứng lại mức độ sắt
Yếu tố đáp ứng sắt (IRE): vị trí trên mRNA để IRP liên kết

8 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/03: Điều hòa sự dịch mã của Ferritin mRNA bằng IRP
Các mRNA ferritin có một cấu trúc quai (loop) (các yếu tố đáp ứng
sắt hoặc IRE) trong vùng 5’ không dịch mã. Khi sắt khan hiếm, các protein
điều khiển sắt (IRP) liên kết với tiểu phần nhỏ của ribosome từ liên kết với
cấu trúc mũ của các mRNA để ngăn cản sự khởi đầu dịch mã. Khi sắt
phong phú không có IRP đến liên kết và sự dịch mã xảy ra.
Hình 11/04: Hoạt động Aconitase chống lại sự liên kết của RNA
với IRP1

9 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Các protein IRP1 có tác động như một enzyme (aconitase) khi sắt
phong phú. Sau khi mất đi một nguyên tử sắt từ trung tâm nhóm Fe4S4,
trong hoàn cảnh sắt khan hiếm, hai vùng chính mở, cho phép liên kết với
RNA. Hậu quả của việc IRP1 liên kết vào mRNA là ngăn cản quá trình
tổng hợp transferrin.
Trong động vật, enzyme acid δ-aminolevulinic synthase xúc tác
từng bậc giới hạn tỷ lệ trong con đường tổng hợp các chất sắt có chứa đồng
nhân tố heme. Không đáng ngạc nhiên, các mRNA chứa một yếu tố đáp
ứng sắt và cũng điều khiển dịch mã dưới IRP. Các thụ thể cho protein vận
chuyển sắt transferrin, được tìm thấy trong máu, cũng được điều khiển bởi
IRP liên kết với một IRE trên mRNA, nhưng trong trường hợp này sự ổn
định mRNA bị ảnh hưởng.
Sự tập trung của sắt tự do trong cytoplasm được giám sát trực tiếp
bằng protein điều khiển sắt. Mặc dù có một số IRP, một IRP chính, IRP1
giống với với các enzyme cytoplasmic, aconitase. Enzyme này có một
nhóm Fe4S4 cần thiết cho enzyme hoạt động. Khi sắt khan hiếm, một
trong bốn nguyên tử sắt bị mất từ nhóm Fe4S4. Sau đó aconitase/IRP1 mất
enzyme hoạt động và thay hình dạng, bộc lộ vị trí liên kết với RNA. Vì
vậy, khi sắt phong phú, aconitase/IRP1 hoạt động như aconitase (một
enzyme trong chu trình Krebs để chuyển đổi isocitrate thành citrate) và
khi sắt hiếm, nó hoạt động như một RNA liên kết với chất kìm hãm quá
trình dịch mã (Hình 11/04).
Điều hoà bằng chất kìm hãm quá trình dịch mã cũng được sử dụng
để kiểm soát tổng hợp protein ribosome trong vi khuẩn chẳng hạn như vi
khuẩn E. coli. Các protein ribosome có trong một vài nhóm operon. Đối
với mỗi operon, một trong những protein ribosome mã hoá liên kết với
mRNA và tự điều hòa để tổng hợp tất cả các protein trong operon. Những
protein ribosome này được ưu tiên liên kết vào rRNA và chỉ được liên kết
vào mRNA của riêng mình khi không có mặt của rRNA. Cơ chế này đảm
bảo rằng tổng số của rRNA và ribosomal protein được cân bằng. Nếu có
một protein ribosome vượt quá rRNA khi đó quá trình dịch mã sẽ được
giảm xuống (Hình 11/05).

10 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/05: Điều Hòa Quá Trình Tổng Hợp

Protein Ribosome Trong Vi Khuẩn
Các mRNA được hiển thị ở phía trên cùng của hình có chứa một loop,
một vị trí liên kết ribosome (RBS) và gene cấu trúc mã hóa cho một số
protetin ribosome. Những protein này ưu tiên liên kết vào rRNA. Trong
những trường hợp không có đủ rRNA để liên kết với các protein ribosome,
một trong số chúng liên kết riêng với mRNA của mình và biến đổi các cấu
hình để chặn các vị trí liên kết với ribosome. Điều này ngăn cản quá trình
tổng hợp quá giới hạn của protein ribosome.

11 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Aconitase: Một enzyme của chu kỳ Krebs, trong động vật, cũng hoạt
động như một protein điều khiển sắt
Nhóm Fe4S4: một nhóm gồm nguyên tử vô cơ sắt và lưu huỳnh
được tìm thấy như là một cofactor trong vài protein
Chất kìm hãm dịch mã (translational repressor): Một protein liên
kết với mRNA và ngăn cản sự dịch mã

Một Số Protein Điều Khiển Có Thể Hoạt Hóa Quá Trình Dịch Mã

Điều khiển dịch mã tích cực được sử dụng để kiểm soát sự tổng hợp
protein trong lục lạp sau khi được ánh sáng kích thích. Tổng hợp của nhiều
protein lục lạp càng nhiều càng tốt gấp hàng trăm lần bởi ánh sáng. Các
mức độ của một số protein này được kiểm soát bằng sự phiên mã, một số
khác bằng dịch mã và một số khác nữa băng sự thoái biến protein.
Ví dụ, mRNA cho tiểu đơn vị lớn của Rubisco tích lũy trong quá trình
phát triển lạp thể ngay cả trong bóng tối. [Rubisco là ribulose bisphosphate
carboxylase, một enzyme quan trọng trong sự cố định của một lượng khí
carbon dioxide trong quá trình quang hợp. Đó là protein phong phú nhất
trên trái đất.] Một ví dụ khác là PsbA (= D1 protein) là thành phần của hệ
thống quang hợp II. Sự dịch mã của các mRNAs này được kiểm soát bằng
những protein mã hóa của nhân có hoạt động như chất hoạt hóa quá trình
dịch mã. Những protein này liên kết vào vào một vùng giàu adenine trong
vùng 5’-UTR của mRNA. Các chất hoạt hóa liên kết vào mRNA dưới ánh
sáng và cho phép dịch mã. Trong bóng tối, chúng không liên kết vào
mRNA không được dịch mã do cấu trúc cấu trúc thứ cấp bất lợi của nó
(Hình 11/06).
Các chất hoạt hóa quá trình dịch mã cPABP (chloroplast
polyadenylate binding protein) tồn tại ở hai hình dạng, chỉ một trong
trong số đó có thể liên kết với RNA. Sự chuyển đổi trong hai dạng cPABP
được kiểm soát bằng ánh sáng. Các điện tử được kích thích từ hệ thống
quang hợp I được đi qua một chuỗi vận chuyển điện tử ngắn tới cPABP.
Những điện tử này biến đổi dạng disulfide của cPABP thành dạng

12 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

sulfhydryl. Việc khử dạng sulfhydryl có thể liên kết vào RNA và kích hoạt
dịch mã, trong khi, dạng disulfide không thể dịch mã (Hình 11/07).
cPABP (chloroplast polyadenylate binding protein) một protein hoạt
hóa quá trình dịch mã điều khiển sự biểu hiện mRNA của lạp thể.
Rubisco (ribulose bisphosphate carboxylase) Một enzyme quan trọng
trong việc cố định khí carbon dioxide trong quá trình quang hợp
translational activator ( chất hoạt hóa quá trình dịch mã) Một
protein liên kết với mRNA và xúc tiến sự dịch mã

Hình 11/06: Sự hoạt hóa quá trình dịch mã mRNA lục lạp

Trong bóng tối, loop trung tâm trong mRNA ngăn cản các mRNA liên kết

13 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

vào ribosome. Khi có đầy đủ ánh sáng, một mRNA liên kết với protein làm
RNA duỗi thẳng ra để ribosome liên kết.

Quá Trình Dịch Mã Có Thể Được Điều Khiển Bằng RNA Đối Nghĩa
(RNA antinsense )

Chỉ có một mạch DNA được dùng làm khuôn để sao mã thành phân tử
RNA thông tin. Điều này có liên quan đến từng mạch khuôn riêng, mạch
không mã hóa hay mạch đối nghĩa. Do đó, các mRNA được sản xuất là
RNA có nghĩa. Mạch khác của DNA (mạch mã hóa hay mạch có nghĩa)
thường không được sử dụng như là khuôn cho quá trình dịch mã. Nếu
RNA phiên mã sử dụng mạch mã hóa làm khuôn như chúng tôi sẽ sản xuất
một phân tử RNA bổ sung trong trình tự mRNA. Điều này được gọi là
RNA đối nghĩa và có thể có bazơ kết cặp bổ sung với mRNA của nó, cũng
giống như hai mạch của DNA trong gene gốc có các bazơ kết cặp với
nhau (Hình 11/08). [Lưu ý rằng uracil kết cặp với adenine trong hai RNA].

14 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11.07: Hình dạng của chất kích hoạt dịch mã cPABP phản ứng lại
cường độ ánh sáng
Một chuỗi phản ứng ánh sáng trong hệ quang hợp II (PS II) và I(PS I)
của lục lạp thực vật nhờ đó một điện tử ở đó chuyển đi thông qua chuỗi
vận chuyển điện tử. Các điện tử khử cầu nối disulfide của cPABP vì vậy
hình dạng của nó thay đổi và cho phép nó liên kết với mRNA và kích hoạt
sự dịch mã.

15 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/08 : RNA đối nghĩa có thể có bazơ kết cặp với mRNA
mRNA thường được tạo ra từ mạch một mạch khuôn là mạch không
mã hóa của DNA. Như vậy mRNA đó được biết như là RNA có nghĩa. Nếu
RNA được tạo ra từ mạch khuôn là mạch mã hóa, nó sẽ bổ sung trong
trình tự mRNA và nó được biết như là RNA đối nghĩa. Mạch RNA có nghĩa
và đối nghĩa có thể kết cặp bazơ.
antisense RNA ( RNA đối nghĩa): Một phân tử RNA bổ sung cho
mRNA
sense RNA (RNA có nghĩa): RNA bình thường được sản xuất từ
mạch không mã hóa của DNA
RNA antisense (RNA đối nghĩa) đôi khi được sử dụng trong điều hòa
gen trong cả vi khuẩn và sinh vật nhân chuẩn. Nếu antisense RNA được
tạo ra, các bazơ của nó sẽ kết cặp với mRNA và ngăn cản nó liên kết với
ribosome và dịch mã được thực hiện. (Hình 11/09). Trong thực tế, RNA
antisense không được tạo ra bằng sợi không phải là khuôn của cùng một
gene tạo ra mRNA phiên mã. Khá khác biệt "kháng gene" được dùng để
tạo ra RNA antisense.
Bacterioferritin là protein của vi khuẩn được sử dụng để dự trữ bổ
sung thêm các nguyên tử sắt. Các gene bfr mã hóa bacterioferritin bản thân
và gene kháng bfr mã hóa các RNA đối nghĩa.

16 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Vì chỉ một đoạn ngắn của RNA đối nghĩa là cần thiết để chặn mRNA,
các gene kháng tương tự như trong trình tự nhưng ngắn hơn gene nguyên
bản. Khi nuôi cấy lượng sắt tập trung thấp, không cần bacterioferritin,
nhưng nó tạo ra nếu mức độ sắt tăng lên. Gene bfr phiên mã của nó đã
phiên mã để tạo ra mRNA trong cả hai điều kiện. Tuy nhiên, gene kháng
bfr được kiểm soát bằng một protein điều khiển được gọi là Fur (Ferric
Uptake Regulator(yếu tố điều khiển sự hấp thu sắt III)), có khả năng nhận
biết được các cấp độ của sắt.
Khi lượng sắt có mặt phong phú, Fur hoạt động như là một chất kìm
hãm và làm tắt quá trình phiên mã của hàng tá hoặc hơn nữa các operon
cần thiết thích ứng cho các tế bào khan hiếm sắt. Bao gồm các gene một số
hệ thống hấp thu sắt được thiết kế để nắm bắt theo dõi mức độ dinh dưỡng
cần thiết này. Ngoài ra, Fur tắt gene kháng bfr, mà bật gen sản xuất của
bacterioferritin (Hình 11/09). Trong lượng sắt thấp gene kháng bfr được
phiên mã để tạo ra RNA đối nghĩa. Điều này ngăn cản tổng hợp protein
của bacterioferritin khi sắt là khan hiếm. Do đó, bằng cách sử dụng RNA
đối nghĩa, một trong những gene có thể được điều hòa để đối diện với một
nhóm khác mặc dù tất cả đều phản ứng lại với cùng một tác nhân kích
thích.

17 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/09: RNA đối nghĩa điều khiển tổng hợp Bacterioferritin
Các chromosome vi khuẩn có chứa gene cho cả mRNA bfr và RNA kháng
bfr. Nếu cả hai phân tử RNA được phiên mã, RNA kháng bfr kết cặp với
mRNA bfr và ngăn cản nó dịch mã. Khi sắt phong phú, gene kháng bfr
không được biểu hiện và chỉ mRNA bfr được sản xuất. Dưới các điều kiện
dịch mã của mRNA bfr để cho bacterioferritin có thể diễn ra

Tổng hợp RNA đối nghĩa nhân tạo sẽ can thiệp với sự biểu của gene
hay bất kỳ quá trình tế bào nào liên quan đến RNA. Ví dụ, RNA đối nghĩa
đang được kiểm tra qua thí nghiệm để ngăn chặn bệnh ung thư bằng dừng
lại quá trình phân chia nhiễm sắc thể.

Điều Hòa Quá Trình Dịch Mã Bằng Những Sự Biến Đổi Ribosome

Cũng giống như các ribosome phải dịch mã từ nhiều thông tin khác
nhau, được diễn tả dưới rất nhiều những điều kiện khác nhau. Không ngạc
nhiên, các ribosomes của chúng hiếm khi được sửa đổi, ngoại trừ trường
hợp chung là toàn bộ ribosomes vào dự phòng để giảm tổng tỷ lệ tổng hợp
toàn bộ protein trong các tế bào không phát triển, như được thảo luận trong
Chương 8.
Một trong những trường hợp ngoại lệ hiếm hoi là sự phosphoryl hóa
của protein S6 của tiểu phần nhỏ của ribosome trong tế bào của loài động
vật có vú. Các protein S6 có thể được phosphoryl hóa đến năm lần trên
một cụm của chất thừa serine gần với phần cuối C của nó. [Ở sinh vật nhân
chuẩn bậc thấp, chẳng hạn như nấm mem thiếu những vị trí phosphoryl
hóa này.] Sự phosphoryl hóa xảy ra sau khi các tế bào trong một mô đang
phát triển nhận được một tín hiệu để tăng nhanh. Việc ưu tiên ribosomes
sửa đổi dịch mã những phân tử mRNA đó có 5’-Terminal oligopyrimidine
(5’-TOP)
5/-Terminal oligopyrimidine tract (5’-TOP): Những bó giàu
pyrimidine kéo dài nằm giữa đầu tận cùng 5’ và mã mở đầu của mRNA.
Fur (ferric uptake regulator) ( điều khiển sự hấp thu sắt III) : protein
điều khiển chung với nhiều mức độ sắt trong vi khuẩn

18 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Việc sửa đổi ribosomes ưu tiên dịch mã các phân tử mRNA có 5’-
Terminal oligopyrimidine (đoạn kết thúc gồm đoạn ngắn pyrimidine) (5’-
TOP) (Hình 11/10). Đây là những trình tự giàu pyrimidine có vị trí tại đầu
tận cùng 5’ của mRNA, ngược lên mã mở đầu.
Nó sản xuất ra hầu hết các mRNAs ưu tiên mã hoá protein ribosome
và sự kéo dài các yếu tố. Nói cách khác, sự phosphoryl hóa protein S6 kích
thích ribosome để tạo ra nhiều hơn ribosomes tiến hóa mới để phản ứng
lại tỷ lệ tăng trưởng và phân chia tế bào.

RNA Can Thiệp (RNAi)

RNA can thiệp (RNAi) là một cơ chế để bất hoạt gene gây nên bởi
RNA mạch kép (dsRNA). Đó là trình tự đặc biệt và liên quan đến sự suy
thoái của cả hai loại phân tử RNA: RNA sợi kép (dsRNA) và RNA sợi đơn
thường mRNA là những sợi tương đồng trong trình tự dsRNA làm kích
hoạt phản ứng trả lời.
Đó là ý kiến cho rằng nguồn gốc của RNAi như là một cơ chế bảo vệ
chống lại vi rút. Trong suốt quá trình diễn biến của các sự kiện, những tế
bào chứa dsDNA và ssRNA nhưng RNA sợi kép lại không tìm thấy. Tuy
nhiên, trong khi nhiễm bệnh bởi hầu hết RNA của các loại vi-rút, các
genome của vi rút thông qua dạng trung gian là sợi kép RNA (những bản
sao trung gian). Điều này đúng cho cả hai loại virút rằng chúng mang theo
genomes như ssRNA trong các tiểu phần của virus và những loại sử dụng
dsRNA (xem Ch. 17 virus). Do vậy, dsRNA được xem là một tín hiệu cho
các nhiễm trùng và gây nên một trả lời chống lại vi rút.
RNA can thiệp được kích hoạt bởi dsRNA có đầy đủ các cặp bazơ và
có ít nhất 21-23 cặp bazơ. Còn những phân tử dsRNA dài sẽ được là cắt
thành những mảnh có độ dài khoảng 21-23 bp bởi một nuclease được gọi
là "Dicer" (Hình 11/11). Những mảnh RNA được gọi tắt là siRNA (RNA
ngắn can thiệp) và liên kết bởi protein của RNA-phức hệ gây nên sự im
lặng (RISC). Những phức hệ RISC nhận ra và làm suy biến RNA sợi đơn
tương ứng trong trình tự siRNA. Điều này bao gồm việc tháo ra và phân ly
của sợi siRNA trong phức hệ RISC và xảy ra sau cặp bazơ với RNA đích,

19 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

trong Hình. 11/11. Hoạt động của các nuclease trong phức hệ RISC, đôi
khi được gọi là "Slicer", sau đó làm thoái hóa RNA đích.

Hình 11/10: Sự phosphoryl hóa của S6 tạo cho mRNA có 5’-TOP

Các protein S6 của tiểu phần nhỏ ribosome có thể được phosphoryl
hóa bằng một protein kinase kích hoạt. Những mRNA này có một dải trên
đầu 5’ sau đó sẽ liên kết tốt hơn với ribosome và bắt đầu dịch mã.

20 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/11: Cơ chế của RNA can thiệp

RNA sợi kép xâm nhập (dsRNA) đã được thừa nhận(bởi RDE-4 và
các protein trong Caenorhabditis). Dicer tách các dsRNA vào phân đoạn
của 21 hay 22 nucleotides với một hoặc hai bazơ nhô ra- RNA can thiệp
ngắn (siRNA). Điều này được thừa nhận bởi RDE – 1 là các RNA-phức hệ
gây bất hoạt do RNA (RISC). Những mạch của siRNA được tách trong quá
trình hoạt hóa RISC. Cuối cùng, RISC tách RNA đích thành những đoạn
tương ứng với các siRNA.

RNA sợi kép thường được tiêu huỷ bởi các tế bào sống của tất cả các
sinh vật.
RNA can thiệp tiêu hủy RNA thong tin có trình tự giống như RNA sợi
kép được phát hiện trong các tế bào.
Dicer: Ribonuclease tách RNA sợi kép thành những phân đoạn 21-23
bp

21 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Phức hợp làm bất hoạt do RNA gây ra (RISC): phức hệ protein gây
nên bởi siRNA phân hủy RNA sợi đơn tương ứng trong trình tự siRNA
RNA can thiệp : có nghĩa là đáp ứng được kích hoạt bởi sự hiện diện
của RNA sợi kép và là kết quả trong suy thoái của mRNA hoặc những bản
sao RNA tương ứng khác.
short interfering RNA (siRNA): những phân tử RNA sợi kép gồm
21-22 nucleotides tham gia vào việc kích hoạt RNA can thiệp trong sinh
vật nhân chuẩn.
Slicer: Ribonuclease hoạt động của phức hệ RISC
RNA can thiệp của sinh vật nhân chuẩn hoạt động trong một phạm vi
rộng khắp, bao gồm cả động vật nguyên sinh, động vật không xương sống,
động vật có vú và thực vật. Nó không được tìm thấy trong sinh vật nhân
sơ. [Trong vi khuẩn, ribonuclease III nhanh chóng làm thoái hóa phân tử
dsRNA ngắn như 12 bp.] Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự phức tạp
của ý tưởng đơn giản, sự thoái hoá RNA chỉ duy nhất thông qua các hoạt
động RNAi. RNAi có liên quan đến các cơ chế có thể im lặng sự phiên mã
của gen đích do biến đổi cấu trúc chromatin và thúc đẩy sự methyl hóa
DNA.

Sự nhân bội và lan truyền của RNAi

RNAi có hiệu lực đặc biệt. Vì vậy, chỉ dưới 50 phân tử của siRNA có
thể làm bất hoạt RNA đích có mặt trong hàng ngàn bản sao của mỗi tế bào.
Đây là các kết quả từ sự nhân bội của siRNA qua một RNA polymerase
phụ thuộc RNA (RdRP) mà không cần phải có đoạn mồi (Hình 11/12). Cắt
các mRNA đích bởi Slicer gây ra hai phân tử RNA khác thường và không
ổn định, một phân tử được gắn mũ nhưng thiếu đuôi poly (A) và phân tử
khác có đuôi nhưng không được gắn mũ. Một hoặc cả hai phân tử RNA bất
thường hình như được sử dụng như làm khuôn để RdRP tạo ra dsRNA.
Sau đó dsRNA thực hiện vai trò như là chất nền cho Dicer, tạo ra nhiều
siRNA để nhân bội tác dụng các RNA can thiệp.

22 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

RNA can thiệp có thể được nhân bội và có thể lan truyền khắp một cơ
thể, sau khi được kích hoạt trong một vùng khu trú.
RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRP): RNA polymerase sử dụng
RNA như là một khuôn và tham gia vào sự nhân bội của RNAi phản ứng

Hình 11/12: Sự nhân bội của RNA can thiệp bằng RdRP
RNA dị thường được tạo ra bởi RISC - gián tiếp phân tách được sử
dụng như một khuôn của RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRP). Điều
này tạo ra nhiều hơn dsRNA rồi được quay lại chuyển thành nhiều hơn
siRNA bởi Dicer
Ngoài sự nhân bội, ảnh hưởng của RNAi có khả năng lan rộng từ các
tế bào đến tế bào, và có thể di chuyển trong khoảng cách lớn xuyên suốt
một cơ thể. Hiệu ứng đặc biệt này có thể thấy rõ trong những loài thực vật

23 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

(xem dưới đây). Sự lan truyền của tín hiệu siRNA trên toàn cơ thể cũng
được thấy trong động vật. Đáng chú ý là, trong C. elegans các RNAi có
hiệu lực trên là thông qua vài thế hệ (không có sửa đổi trong trình tự
genomic DNA của gene đích tìm thấy). Loài động vật có vú không có
những RdRP chịu trách nhiệm về sự nhân bội RNAi, vì vậy vẫn còn những
phế tích vùng khu trú RNAi. Đó là suy nghĩ rằng sự phát triển của hệ miễn
dịch đặc trưng của từng loài đã làm RNAi ít quan trọng trong những loài
động vật có vú.

Áp dụng Thí nghiệm của SiRNA

RNAi đang được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm nghiên cứu
để ngăn chặn sự biểu hiện của gene (như đối lập với thông tin di truyền của
vi rút). RNAi trong các động vật lần đầu tiên được tìm thấy với sâu hình
tròn Caenorhabditis elegans. Khi tiêm dsRNA vào C. elegans là nguyên
nhân phân hủy các mRNA của trình tự tương ứng và qua đó dừng sự biểu
hiện của gene tại cấp độ sau phiên mã. RNAi hiện đang được sử dụng để
nghiên cứu chức năng của gene trong C. elegans, từ khi trình tự genome
hoàn thành có hiệu lực bởi vậy có thể là tổng hợp siRNA tương ứng với
bất cứ gen nào cần quan tâm.
Việc sử dụng RNAi cho phép nghiên cứu về chức năng gene mà
không cần phải thực hiện những đột biến với sự thay đổi hoặc phiên bản
không hoạt động của một gene riêng biệt. Điều này đặc biệt hữu ích cho
những sinh vật nhân chuẩn, hầu hết đều ở thể lưỡng bội và nơi phân tích di
truyền kinh điển do đó đòi hỏi phải đưa đột biến vào cả hai bản sao.
RNA can thiệp hiện đang được được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu
chức năng gene trong nhiều động vật và thực vật.

24 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/13: Giới Thiệu Thử Nghiệm Của RNA Can Thiệp
RNA can thiệp xảy ra khi cả hai RNA có nghĩa và đối nghĩa của một
gene có mặt và dạng dsRNA. Hai sản phẩm thiết kế được hiển thị trực
tiếp cho sự tổng hợp của một phân tử dsRNA. Sản phẩm thiết kế thứ nhất
(A) có một vùng có nghĩa và một vùng đối nghĩa là cặp bazơ. Một phần
đệm riêng rẽ vùng có nghĩa và vùng đối nghĩa và một dạng cấu trúc loop
kẹp tóc. Một cặp Promoter (B) có một Promoter dịch mã trực tiếp cho
mạch có nghĩa, và Promoter khác cho mạch đối nghĩa. Kết quả là tạo hai
phân tử RNA bổ sung nhau và tạo dạng phân tử dsRNA.
Tuy nhiên, RNAi của nó rất nguyên thủy, ngăn chặn những biểu hiện
của tất cả các bản sao của gene đích. Thực vậy, RNAi có thể được sử dụng
trong những sinh vật nơi các bản sao của gene có mặt. Ví dụ, ở động vật
nguyên sinh như Paramecium chứa hai loại nuclei, một germline nhân sinh
sản và một nhân to hơn như thuộc thể đa bội (xem Ch. 19). Tình trạng này
gây cho chúng khó có tiêu chuẩn để phân tích di truyền.
Qua thực nghiệm, RNAi có thể được gây nên bằng cách cung cấp
những phân tử dài của dsRNA được cắt thành các siRNA bởi enzyme
Dicer (Hình 11/11). Sợi đơn RNA đối nghĩa chống lại gene thuộc tế bào
cũng có thể kích hoạt RNAi bởi cặp bazơ tương ứng thêm vào sợi RNA.

25 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Điều này tạo ra dsRNA bên trong các tế bào. Ngoài ra những phân tử
dsRNA ngắn có chiều dài khoảng 21.-23 nucleotides có thể được quản lý
trực tiếp và sẽ hoạt động như siRNA.
Mặc dù dsRNA có thể được căn cứ như vậy, thông thường sẽ rất là
thuận tiện hơn để cung cấp xây dựng một DNA tạo ra dsRNA in vivo. Điều
này có thể được thực hiện bởi ba biến dị chính (Hình 11/13):
i. Một đoạn DNA đơn được phiên mã từ một Promoter đơn để tạo
ra một cấu trúc thân quai. Tại đây các mạch được thêm vào và bớt đi liên
tiếp nhưng bị phân ly bởi một đoạn ngắn căng của DNA còn lại những
đoạn không có cặp đôi và dạng quai.
ii. Một đoạn DNA của hai promoter đối diện. Do đó từ cùng một
đoạn dsDNA, một promoter phiên mã từ mạch dương và promoter khác
phiên mã từ mạch âm.
iii. Hai phân đoạn DNA, hai đoạn này ngược nhau và cả hai đều có
promoter riêng biệt. Do đó một trong những promoter phiên mã mạch
dương từ mạch có nghĩa của DNA và một promoter khác phiên mã từ
mạch âm, ngược chiều, đối nghĩa của phân đoạn DNA.
Các dsRNA được tạo ra từ các DNA có thể dài (dựa vào Dicer để tạo
siRNA) hoặc ngắn, trực tiếp cho siRNA.
Trong trường hợp của Caenorhabditis elegans, dsRNA có thể được
tiêm vào trong sâu. Hoặc sâu có thể được làm thức ăn cho vi khuẩn, chẳng
hạn như E. coli, mang những plasmid với DNA, như được diễn tả ở trên là
tạo ra dsRNA in vivo. [Khá tiện lợi, dạng vi khuẩn là chế độ ăn uống tự
nhiên của C. elegans.]

26 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Micro RNA (miRNA) được tạo ra bằng quá trình một phân tử tiền
thân gập lại tạo cấu trúc thân quai. Dicer, giống như nuclease tạo ra
siRNA, phản ứng lại quá trình này. Sau đó phân ly hai mạch., một mạch
của miRNA liên kết với mRNA đích và ngăn cản quá trình dịch mã.

27 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

PTGS trong thực vật và sự chế ngự ở nấm

Mặc dù được phát hiện độc lập, nó giống như là bất hoạt gen sau
quá trình phiên mã (PTGS) trong cây trồng, chế ngự trong Neurospora
và RNAi trong động vật góp một cơ chế bảo tồn. Hệ thống này cũng được
tìm thấy trong động vật nguyên sinh như Paramecium và nhóm trùng mũi
khoan. Trong cả PTGS và RNAi sự hiện diện của dsRNA kích hoạt hệ
thống Dicer/RISC để tạo ra sự thoái hóa RNA. PTSG trong thực vật có thể
được truyền đi nguyên vẹn trong toàn bộ sinh vât từ một vùng khởi đầu.
Điều này đã được minh họa trong thử nghiệm cấy ghép, trong đó sự bất
hoạt được truyền từ mô ghép vào thân chính nhận được phần ghép. Các tín
hiệu siRNA khuếch đại bởi RdRP (xem ở trên) và sau đó truyền từ tế bào
đến tế bào qua plasmodesmata cho đến khi chúng đến với được hệ thống
mạch, phân phối các siRNA trong toàn bộ thực vật.
PTGS đã được quan sát thực sự trong thực vật một vài năm trước khi
RNAi được phát hiện ở động vật. PTGS đã được nhận thấy khi bổ sung các
bản sao các gene của thực vật đã được đưa vào các tế bào thực vật lạ bằng
kĩ kỹ thuật di truyền. Thay vì tăng mức độ biểu hiện của gene, như chờ
đợi, đôi khi là một kết quả giảm lớn mức độ biểu hiện của gene. Điều này
được minh chứng do phân hủy của mRNA tương ứng với các trình tự đưa
vào và xảy ra bởi một cơ chế chặt chẽ liên quan đến RNAi, như được mô
tả ở trên cho các động vật. Quelling là một hiện tượng tương tự thấy trong
nấm như Neurospora. Đột biến cây Arabidopsis có khiếm khuyết trong
PTGS biểu hiển tăng sự nhạy cảm của một số thực vật bị nhiễm bệnh RNA
virus. Điều này một lần nữa cho thấy rằng vai trò tự nhiên của
PTGS/RNAi trong việc bảo vệ chống lại sự lây nhiễm của vi rút.
Một loạt các kỹ thuật, thủ thuật được sử dụng để tạo ra RNA sợi kép
bên trong các cơ thể thực nghiệm.
RNA can thiệp hoạt động tốt trong thực vật và phản ứng được phân
phối xung quanh thực vật đầy đủ thông qua hệ thống mạch.
Bất hoạt gen sau phiên mã (PTGS): kiểu thực vật của RNA can thiệp
để phản ứng lại RNA sợi kép là kết quả trong sự thoái hóa của mRNA
hoặc các các bản sao RNA tương ứng khác gây ra dsRNA

28 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/15: Hai Dạng Cấu Trúc Thứ Cấp Luân Phiên Của Vùng
Dẫn Đầu Của mRNA
Những trình tự trong vùng dẫn đầu của RNA thông tin được kí hiệu
là 1, 2, 3 và 4 có thể cặp bazơ ghép đôi theo một trong hai cách sau: A).
Cấu trúc kết thúc sớm của mRNA là do các cặp bazơ ghép đôi tạo hai
dạng cấu trúc ghép cặp bổ sung và cấu trúc loop trong mRNA. Ở loop thứ
hai, trình tự 3 kết hợp với 4, là nguyên nhân của kết thúc. B) Sự kết thúc
có thể được ngăn cản nếu một protein liên kết vào mRNA tại vị trí 1, cho
phép vị trí 2 và 3 kết cặp với nhau. Điều này tạo ra những "pre-emptor" và
ngăn cản sự hình thành yếu tố kết thúc.

Giống như RNAi, PTGS đòi hỏi sự hình thành các dsRNA. Thực vậy,
PTGS có thể gây cảm ứng trong thực vật bằng sự điều hành các phân đoạn
nhỏ của dsRNA làm sẵn, đúng như RNAi gây cảm ứng trong động vật.
Tuy nhiên, có sự khác biệt chính giữa PTGS và RNAi là dsRNA có thể
tích lũy trong cây sau quá trình phiên mã của một gen chuyển. Các cơ chế
này chưa được hiểu rõ hoàn toàn. Trong một số trường hợp quá trình phiên
mã của cả hai mạch DNA được đưa vào bởi promoter đối lập có thể dẫn
đến sự hình thành RNA kép. Trong các trường hợp khác, sự ghép cặp ba
zơ có thể xảy ra trong nội tại giữa các vùng được bổ sung trong chuỗi. Tuy
nhiên, PTGS cũng có thể gây cảm ứng bằng những gen chuyển đơn lẻ
phiên mã cao. Đó là ý kiến cho rằng mRNAs khác thường đôi khi có được
thực hiện và hoạt động như các khuôn cho một RNA-phụ thuộc RNA
polymerase (RdRP). Điều này sau đó tạo ra các dsRNA.

29 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Micro RNA– Một lớp của RNA điều khiển nhỏ

Phân tử RNA rất nhỏ (miRNA) là những phân tử RNA ngắn có một
vài tính chất chung với siRNA. Tuy nhiên, những phân tử miRNA quy
định sự biểu hiện của gene bằng ngăn chặn sự dịch mã của mRNA chứ
không thúc đẩy sự thoái hóa của mRNA. Chúng ngăn cản quá trình dịch
mã bằng cách liên kết vào mRNA, thường liên kết vào vùng 3’ không dịch
mã, ít phổ biến trong các vùng mã hóa .
micro RNA (miRNA) phân tử RNA điều khiển nhỏ của tế bào nhân
chuẩn
Những phân tử miRNA được sản xuất từ những RNA tiền thân dài
hơn với khoảng 70 nucleotide được phiên mã từ gen trong nhiễm sắc thể.
Những phân tử RNA tiền thân cuộn gấp tạo thành cấu trúc thân quai (Hình
11/14). Vùng thẳng sợi kép sau đó sẽ được cắt bởi Dicer, với cùng một
nuclease tạo ra siRNA. Những phân tử miRNA có 1-3 bazơ không ghép
đôi ở giữa và vì thế đây là sự khác với siRNA, là loại có đầy đủ các cặp ba
zơ ghép đôi . Thay vì Rde1 nhận ra được siRNA, các miRNA được liên kết
bởi các protein có liên quan, Alg1 và Alg2 (trong C. elegans). Cũng chưa
chắc chắn phức hệ RISC sau đó liên kết vào miRNA và các mạch riêng rẽ
hay không (như siRNA). Một cách khác là các mạch riêng rẽ tự phát từ
miRNA các cặp ba zơ thiếu sót. Trong bất kỳ trường hợp nào, một trong
những sợi của miRNA sau đó liên kết vào mRNA đích. Tuy nhiên, sự ghép
cặp ba zơ thường không phải là hoàn hảo (như với siRNA). Kết quả là, quá
trình dịch mã của các mRNA bị ngăn chặn, nhưng mRNA không bị thoái
hóa. Cơ chế chính xác của sự ức chế quá trình dịch mã hiện nay là không
rõ ràng.
Micro RNA được tìm thấy ở giun, côn trùng, loài động vật có vú và ở
cả thực vật là như nhau giữa các sinh vật mà RNA can thiệp biểu lộ.
MiRNAs đầu tiên được tìm thấy trong C. elegans, nơi chúng được gọi là
RNA thời gian nhỏ (stRNA) vì chúng quy định thời gian phát triển của sâu
trong quá trình chuyển dạng của các con sâu non tới sâu trưởng thành.
Nhiều miRNAs xuất hiện để được tham gia vào việc điều tiết sự phát triển
và có rất nhiều đích cho miRNA như mRNAs là những yếu tố mã hoá cho

30 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

quá trình phiên mã, trong đó lần lượt điều khiển sự biểu hiện của các gen
khác.

Kết Thúc Sớm Nguyên Nhân Suy Giảm Sự Phiên Mã Của RNA

Sự suy giảm quá trình phiên mã là một cơ chế điều khiển liên quan
đến sự kết thúc sớm quá trình tổng hợp mRNA. Những nguyên lý cơ bản
của sự suy giảm lần đầu tiên một phần của mRNA sẽ được thực hiện, vùng
dẫn đầu, có thể gấp lên tạo thành hai cấu trúc thứ cấp xen kẽ. Một trong
những cấu trúc cho phép tiếp tục sự phiên mã nhưng cấu trúc thứ cấp khác
là nguyên nhân kết thúc sớm quá trình phiên mã. Tình trạng của sự suy
giảm còn chút không rõ ràng. Nó thường được xem như là điều hòa ở mức
độ phiên mã. Tuy nhiên,nó lại có liên quan đến việc mRNA đã được phiên
mã một phần. Do vậy đôi khi nó được xem như là điều hòa "sau quá trình
phiên mã". Từ khi sự suy giảm có liên quan chặt chẽ với các cơ chế khác
xen kẽ giữa cấu trúc kết cặp bổ sung và cấu trúc loop của RNA, tôi đã chọn
để cho nó cùng với các hình thức điều hòa khác của RNA.
Thông thường, vùng dẫn đầu chứa bốn tiểu vùng (trình tự từ 1 đến 4)
có thể kết cặp bazơ theo hai cách khác nhau. Khi không có các yếu tố khác
can thiệp, trình tự 1 kết cặp với trình tự 2 và trình tự 3 kết cặp với trình tự
4, do đó tạo thành hai cấu trúc kết cặp bổ sung và cấu trúc loop (Hình
11/15). Cấu trúc thứ hai của cấu trúc kết cặp bổ sung và cấu trúc loop,
chứa trình tự ghép cặp 3 và 4, hoạt động như là một nhân tố kết thúc. Tuy
nhiên, thay vì trình tự 2 có thể kết cặp với trình tự 3. Để điều này xảy ra,
một protein phải liên kết vào trình tự 1 và gỡ bỏ nó khỏi phạm vi hoạt
động. Các kết quả tiếp nối là tạo loop kết thúc, thường bao gồm trình tự 3
và 4, dạng này không tồn tại lâu và quá trình dịch mã của mRNA có thể
tiếp tục.
Điều hòa bằng sự suy giảm stem bao gồm sự luân phiên giữa cấu trúc
kết cặp bổ sung cấu trúc loop trong mRNA.
Sự suy giảm (attenuation): một dạng của điều hòa quá trình phiên
mã tác động bằng cách tạo sự kết thúc phiên mã sớm và phụ thuộc vào sự

31 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

luân phiên giữa cấu trúc ghép cặp bổ sung và cấu trúc loop trong vùng
dẫn đầu của mRNA
Vùng dẫn đầu( leader region ): vùng phía trước của một phân tử
mRNA của các gen cấu trúc, đặc biệt là khi tham gia vào sự điều hòa bằng
cơ chế suy giảm.
Sự suy giảm được sử dụng để điều khiển các gene cho sinh tổng hợp
các axit amin trong cả hai loại vi khuẩn gram âm, chẳng hạn như E. coli,
và vi khuẩn gram dương, ví dụ như Bacillus. Nếu nguồn dự trữ acid amin
dồi dào thì các gene sinh tổng hợp nên nó phải được được tắt. Ngược lại,
nếu mức độ của các acid amin thấp, các gene sinh tổng hơp nên nó sẽ được
phiên mã.
Trong E. coli, sự suy giảm có sự phức tạp và thường liên quan đến sự
liên kết của các ribosome vào vùng dẫn đầu của mRNA , nơi mà chúng
dịch mã ra một peptide dẫn đầu. Peptide dẫn đầu được mã hoá bằng một
khung đọc mở ngắn và chỉ bao gồm 14 hoặc 15 axit amin. Nó nằm sát với
đầu tận cùng 5’ của mRNA, ngược dòng của các gen cấu trúc cho các
enzymes của con đường sinh tổng hợp (Hình 11.16A).
Peptide dẫn đầu chứa một số đơn vị mã liên tiếp cho các acid amin
nghiên cứu. Ví dụ, trong peptide dẫn đầu của operon his của E. coli có bảy
đơn vị mã cho histidine trong một hàng. Trong peptide dẫn đầu operon thr,
có 11 nhóm đơn vị mã cho threonine và isoleucine. Từ khi threonine là tiền
chất cho isoleucine, kiểm soát sự suy giảm bao gồm cho đơn vị mã cho cả
hai axit amin này. Khi nguồn dự trữ một acid amin trong trạng thái thiếu
hụt, sẽ khó khăn cho ribosome trong việc tìm một tRNA mang acid amin
cụ thể và nó chậm dần lại. Khi một số đơn vị mã cho một acid amin hiếm
theo sau lẫn nhau, các ribosome sẽ tạm thời dừng lại. Các ribosome bao
phủ trình tự 1, loop 2 / 3 và loop kết thúc sẽ không được tạo ra
(Fig.11.16B). Các RNA polymerase đến phiên mã phần còn lại của
mRNA.

32 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/16: Ribosome Ngăn Cản Sự Hình Thành Của Loop Kết
Thúc
Sự suy giảm kiểm soát việc tổng hợp các mRNA được hoàn thành
hoặc không phát triển. [ RNA polymerase không hiển thị trong hình này,
thật đúng cơ chế suy giảm.] (A) Vùng dẫn đầu của mRNA chứa các trình
tự mã hóa cho peptide dẫn đầu và bốn trình tự cụ thể (1, 2, 3 và 4) mà có
thể có cặp bazơ để hình thành cấu trúc kết cặp bổ sung và cấu trúc loop.
(B) Khi thiếu các acid amin tương ứng, các ribosome trì hoãn tại vùng 1,
cho phép cấu trúc pre-emptor hình thành và sự phiên mã của mRNA bằng
RNA polymerase tiếp tục. Lưu ý rằng peptide dẫn đầu không được hoàn
thành. (C) Khi có một lượng giàu có của các acid amin tương ứng, peptide
dẫn đầu được thực hiện và ribosome di chuyển đến vùng 2 một cách nhanh
chóng, cho phép các vùng 3 và 4 để tạo thành loop kết thúc. Điều này
ngăn cản sự kéo dài của mRNA.
Trong Bacillus, ribosomes không phức tạp và không có peptide dẫn
đầu. Dù sao, vúng dẫn đầu của các mRNA có bốn trình tự có thể kết cặp
để tạo ra hai cấu trúc xen kẽ. Protein suy giảm liên kết với acid amin đang
nghiên cứu. Trong sự hiện diện của các acid amin, các protein suy giảm
liên kết vào vùng dẫn đầu mRNA và thúc đẩy sự kết thúc. Trong Bacillus,

33 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

vùng dẫn đầu 5’ của mRNA của trp chứa một hoạt động của mười một bộ
ba UAG hoặc GAG tách ra khỏi nhau của hai hoặc ba bazơ khác. Mười
một tiểu đơn vị của protein suy giảm tryptophan (tryptophan attenuation
protein (TRAP)) với những liên kết, tạo thành một vòng mười một thành
viên (Fig.11.17). Điều này cho phép hình thành thân quai kết thúc và do đó
gây ra sự kết thúc sớm quá trình phiên mã.

Riboswitches - RNA Tác Động Trực Tiếp Như Là Một Cơ Chế Điều
Khiển

Một trong những câu chuyện hấp dẫn gần đây trong sinh học phân tử đã
được khám phá rằng RNA có thể thực hiện nhiều chức năng mà trước đó
người ta đã tin rằng cần phải có nhiều protein. Như ta đã biết, Ribozymes
là phân tử RNA có khả năng xúc tác, tham gia vào phản ứng cắt nối RNA,
tổng hợp protein và sao chép trong virut. RNA đối nghĩa và một loạt các
phân tử RNA điều khiển nhỏ, chẳng hạn như siRNA được tham gia vào
điều hòa gen. Gần đây nhất, đã tìm thấy những phạm vi của RNA ở phía
trước RNA thông tin, gọi tắt là riboswitches, có thể trực tiếp tương tác với
những phân tử nhỏ
và có thể kiểm soát
sự biểu hiện của
gene. Đại đa số các
riboswitches đã
được tìm thấy trong
vi khuẩn và cho đến
nay nó chỉ là thử
nghiệm trong vi
khuẩn và là bằng
chứng cho sự tồn
tại hoạt động
riboswitch.

34 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Hình 11/17: Sự suy giảm bằng protein liên kết RNA

Khi tryptophan là có mặt, nó say sưa liên kết vào protein suy giảm
tryptophan. Những liên kết này làm cho cấu trúc RNA thay đổi. Thay đổi
cấu trúc RNA tạo nên cấu trúc thân quai là nguyên nhân kết thúc sớm.

Một số phân tử RNA thông tin có thể kiểm soát quá trình dịch mã của
mình thông qua các vùng riboswitch có liên kết với các phân tử nhỏ .
Protein suy giảm: protein điều khiển tham gia vào việc làm giảm và
liên kết với vùng khởi đầu của mRNA
Riboswitch: vùng của RNA thông tin trực tiếp nhận biết một tín hiệu
và kiểm soát quá trình dịch mã bằng một trong hai cấu trúc
Tuy nhiên, phân tích trong trình tự đã cho thấy genomes của một số
nấm và thực vật có chứa những trình tự tương đương, hàm ý trong chúng
chác chắn cũng có riboswitches.
Quá trình sinh tổng hợp tạo ra sản phẩm chuyển hóa như axit amin và
vitamin thường gây cảm ứng khi nguồn cung cấp sản phẩm chuyển hóa
ngắn nhưng được tắt khi nguồn dự trữ sản phẩm chuyển hóa phong phú.
Các gene cho quá trình sinh tổng hợp như vậy thường được kiểm soát bởi
các chất ức chế hoặc bởi sự suy giảm và được kìm nén để phản ứng lại sự
tập trung cao các sản phẩm chuyển hóa nghiên cứu. Trong những trường
hợp này, các sản phẩm chuyển hóa liên kết với một protein điều khiển như
đã mô tả, chẳng hạn như ArgR repressor của E. coli có liên kết với
arginine, hoặc sự làm giảm protein (tryptophan tryptophan attenuation
protein (TRAP)) của Bacillus có liên kết với tryptophan.
Trong riboswitches, các sản phẩm chuyển hóa liên kết trực tiếp một
trình tự RNA tại đầu tận cùng 5’ của RNA thông tin. Ví dụ, riboswitch
thiamine của E. coli có chứa một trình tự liên kết với vitamin/đồng yếu tố
thiamine pyrophosphate với tính đặc thù cao và được biết đến như là hộp
THI. Tương tự như các hộp RFN của riboflavin trong riboswitch Bacillus
subtilis liên kết với mononucleotide flavin. Khi các vitamin này được cung
cấp ngắn những gen sinh tổng hợp được bật mà không có sự can thiệp của
bất kỳ protein điều khiển nào. Ngược lại, khi vitamin xuất hiện ở mức độ
cao, các gene được tắt. Hiện nay Riboswitches đang được biết đến cho một

35 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

số vitamin, một số axit amin (methio chín và Lysine) và bazơ purine các
adenine và guanine.

Hình 11/18: Cơ chế của Riboswitch

Riboswitches luân phiên giữa hai cấu trúc: cấu trúc kết cặp bổ sung
và cấu trúc loop phụ thuộc vào sự có mặt hoặc vắng mặt của tín hiệu
chất chuyển hóa.
(A) Trong cơ chế suy giảm, kết quả của sự có mặt của tín hiệu chất
chuyển hóa hình thành cấu trúc kết thúc và quá trình phiên mã không thể
tiếp tục được. (B) Trong cơ chế ức chế quá trình dịch mã, kết quả của sự
có mặt của chất chuyển hóa dẫn đến sự cách ly trình tự Shine-Dalgarno,
do đó ngăn cản sự dịch mã của mRNA.

Liên kết của của các sản phẩm chuyển hóa tới những hộp RNA để
thay đổi hình dáng của toàn bộ vùng riboswitch. Riboswitches tồn tại trong
hai hình dạng luân phiên khác nhau cấu trúc kết cặp bổ sung và cấu trúc
loop. Điều này lần lượt kiểm soát sự biểu hiện của gen bởi một trong hai

36 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

cơ chế liên quan, kết thúc sớm quá trình phiên mã (tức là làm giảm) hoặc
ức chế quá trình dịch mã:
Trong cơ chế suy giảm (Hình 11.18A), việc riboswitch kiểm soát
không biết có hay không các mRNA cho các gen sinh tổng hợp sẽ kết thúc
sớm. Tại đây các riboswitch tách các trình tự kết thúc ra để tín hiệu của nó
không có mặt trong sản phẩm chuyển hóa và quá trình phiên mã tiếp tục.
Khi các sản phẩm chuyển hóa liên kết, các riboswitch thay đổi hình dáng
cho phù cho phép một sự hình thành một thân quai kết thúc, đó là nguyên
nhân kết thúc sớm của mRNA. Do vậy, các gene không được biểu hiện.
Trong cơ chế ức chế quá trình dịch mã (Hình 11.18B), việc riboswitch
kiểm soát có hay không có các mRNA sẽ được dịch mã. Khi không có tín
hiệu bám giữ sản phẩm chuyển hóa trình tự Shine-Dalgarno liên kết tự do
với RNA ribosome (rRNA) và quá trình dịch mã được tiến hành. Khi có
tín hiệu bám giữ sản phẩm chuyển hóa, các riboswitch tách trình tự Shine-
Dalgarno ra và sự dịch mã bị ngăn cản.
Riboswitches cũng có thể đáp ứng các điều kiện vật lý như trái ngược
với các phân tử nhỏ. Các RNA thermosoensor là một loại đặc trưng của
riboswitch để đáp ứng nhiệt độ và kiểm soát mRNA dịch mã bằng việc
tách trình tự Shine-Dalgarno ra. Với nguyên lý tương tự như trên, nhưng
hình thành một trong hai cấu trúc kết cặp bổ sung hoặc cấu trúc loop phụ
thuộc trực tiếp vào nhiệt độ. Ở nhiệt độ cao, một trong những cấu trúc kết
cặp bổ sung không ổn định và riboswitch chuyển đổi đến các dạng nhiệt độ
cao. Các gen rpoH của E. coli tham gia vào các phản ứng sốc nhiệt, như
được mô tả trong Chương 9. Ngoài những mô tả quá trình điều hòa đó, quá
trình dịch mã rpoH mRNA được ngăn cản bởi một RNA thermosoensor ở
nhiệt độ thấp, nhưng khi nhiệt độ tăng lên quá trình dịch mã được tiếp tục.
Các gene khác của quá trình dịch mã được kiểm soát bởi RNA
thermosoensors bao gồm một số gen hoạt hóa tham gia vào tính độc của vi
khuẩn gây bệnh chẳng hạn như Yersinia và Listeria. Bên ngoài vật chủ, các
gene được tắt bằng ức chế quá trình dịch mã. Bên trong vật chủ là động vật
có vú máu nóng khi nhiệt độ ấm áp các protein hoạt hóa được biểu hiện.
Các protein hoạt hóa sau đó tiến hành để kích hoạt một số gene khác liên
quan đến tính độc của vi khuẩn.

37 Điều hòa ở cấp độ RNA

 Vi sinh vật phân tử

Riboswitches có thể đáp ứng với tốt nhiệt độ như sự tập trung các
chất chuyển hóa.

38 Điều hòa ở cấp độ RNA