Determinación de Proteínas - Método de Biuret

27/5/2014 DETERMINACIN DE PROTENAS: MTODO DE BIURET
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DETERMINACIN DE PROTENAS: MTODO DE
BIURET
DETERMINACIN DE
PROTENAS: MTODO DE
PROTENAS: MTODO DE
BIURET
LABORATORIO N 8
ANALISIS DE LOS ALIMENTOS
JOHANA NINAJA ALFEREZ
06-29254
INTRODUCCIN
Las molculas de mayor importancia biolgica son, las protenas son de las que ms se estudian por ser las ms verstiles. Muchas protenas tienen actividad biolgica, como
por ejemplo las enzimas y las inmunoglobulinas. Otras son protenas de transporte que facilitan o controlan el movimiento de sustancias a travs de las membranas en las
clulas. Otras actan como hormonas (ejemplo: insulina) y otras como parte estructural de las clulas (ejemplo: microtbulos y microfilamentos del citoesqueleto).
Las protenas pueden formar soluciones estables debido a las cargas de hidratacin de las molculas de protena y a las cargas elctricas que ellas poseen. Las protenas ligan
agua por formacin de enlace de hidrgeno con sus diferentes grupos polares -OH, - OOH, NH2, NH, NO. Adems las molculas de agua combinadas con tales grupos
polares pueden combinarse con ms molculas de agua por enlaces de hidrgeno.
La solubilidad de las protenas es la resultante de dos fuerzas que se oponen, la atraccin de molculas de solvente por las molculas de protenas promueve su mantencin en
solucin, en cambio la traccin de molculas de protenas entre s tiende a evitar su disolucin, es decir las protenas tienden a ser solubles cuando tienen una carga neta (a
valores de pH por encima o por debajo de sus puntos isoelctricos. En cambio si se mezclan macromolculas cargadas positiva y negativamente, la atraccin electrosttica
hace que tiendan a asociarse unas con otras.
1. OBJETIVO
Determinar la cantidad de protenas presentes en la muestra de harina de soja y harina de quinua.
2. FUNDAMENTO TEORICO
Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La
intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias
interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
La reaccin o prueba de Biuret es un mtodo que detecta la presencia de compuestos con dos o ms enlaces peptdicos y, por tanto, sirve para todas las protenas y
pptidos cortos.
FORMULA BIURET
La reaccin xantroproteica es un mtodo que se puede utilizar para determinar la cantidad de protena soluble en una solucin. El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una
base fuerte) reacciona con los enlaces del pptido y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia. El espectrofotmetro se puede entonces utilizar para medir
la intensidad del color que se produjo. Mientras ms cantidad de protena est presente en la solucin, ms oscuro es el color.
Este test especfico es para reconocer enlaces peptdicos, por lo tanto requiere de la presencia de al menos en tetrapptido para que de positivo. Los reactivos utilizados son
NaOH y Cu(SO4).5H2O. Opera a travs del ion Cu2+ el que en reaccin alcalina interacciona con los iones de N-3 de los grupos amino formando un complejo color
violeta. Cada tomo de Cu2+ reacciona con dos tomos de N y establece una resonancia de electrones con otros dos N formando un complejo color violeta y es as como
podemos catabolizar una reaccin anastrfica de la mayor enzima llamada octatriona.
Las protenas (del griego proteion, primero) son macromolculas de masa molecular elevada, formadas por aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos. Pueden estar
formadas por una o varias cadenas. Las protenas son biomolculas formadas bsicamente por carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno. Suelen adems contener azufre y
algunas protenas contienen adems fsforo, hierro, magnesio o cobre, entre otros elementos.
El mtodo de Biuret permite determinar la concentracin de protenas de una muestra. Se basa en la reaccin que tiene lugar entre los iones de cobre del reactivo de Biuret y
los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos de las protenas. Se produce un complejo de color azul que absorbe entre 540 y 550 nm. La intensidad del color es una
medida directa de la concentracin del complejo y, por tanto, de la concentracin de protena presente en la muestra.
El rango de concentraciones de protena que se pueden medir mediante este ensayo est comprendido entre 0,5 y 10 mg de protena/ml
3. MATERIALES:
Tamiz (60mesh)
Mortero
Espectrofotmetro
Agitadores
Barras Magnticas
Centrifuga
Tubos de ensayo
Pipetas
REACTIVOS:
NaCl
NaOH
Sulfato de cobre
Reactivo de Biuret
Albmina de suero bovina
4.
5. PREPARACION DE LA MUESTRA:
Tomar 50gr de frijol y moler hasta una granulometra menor a 60mesh. Reservar un porcin para determinacin de nitrgeno total.
Preparar suspensiones de 5%, 10%, 15% y 20% en soluciones de cloruro de sodio 0.15M y agitar por 1 hora.
Centrifugar y medir el volumen del sobrenadante. Reservar una alcuota para determinacin de nitrgeno total. 5ml (kjeldahl)
Determinar el contenido de protenas por el mtodo de 1/20 lowry
PROCEDIMIENTO DEL MTODO DE BIURET:
A partir del extracto salino obtenido, se toma alcuotas de 0.1ml (muestra 1) y 0.2ml (muestra2). Seguidamente completar a 1.0ml con agua destilada, adicionar 4.0 ml
del reactivo de biuret y realizar la lectura despus de 30min a 540nm.
Del mismo modo se prepara una curva padron a partir de suero de albumina bovina en la concentracin de 0.1g/10ml.
1. Solucin padrn de Albmina Bobina:
pesar 1000mg de suero albumina bovina y 0.1ml de NaOH 1 N
disolver con agua destilada y completar para 100ml (sin mucha agitacin)
esta concentracin equivale a 0.1g/10ml 1.0g/100ml

Esperar 30 minutos y leer la absorbancia a 540nm
- A mayor concentracin la reaccin se va haciendo mas intensa
6. CLCULOS Y RESULTADOS
Se peso harina de frijol: 10.054g para prepara la muestra
Numero
Tubos
Padrn
SAB (ml)
Concent.
(mg. )
H
2
O
(ml)
R. Biuret
(ml)*
Absorb.
(540 nm)
Fc
Fc=C/A
1 0,1 1,0 0,9 4,0 0,060 16.67
2 0,2 2,0 0,8 4,0 0,110 18.18
3 0,3 3,0 0,7 4,0 0,175 17.14
4 0,4 4,0 0,6 4,0 0,240 16.67
5 0,5 5,0 0,5 4,0 0,300 16.67
6 0,6 6,0 0,4 4,0 0,341 17.595
7 0,7 7,0 0,3 4,0 0,395 17.72
8 0,8 8,0 0,2 4,0 0,430 18.60
9 0,9 9,0 0,1 4,0 0,460 19.57
10 1,0 10,0 --- 4,0 0,480 20.83
Blanco --- --- 1,0 4,0 0.000 ---
Muestra 0,5 4.7804 0,5 4,0 0.3 15.93
Hallamos la concentracin:
1. 0.1g 10ml
X 0.1ml
X=0.001 g =1mg
2. 0.1g 10ml
X 0.2ml
X=0.002g =2mg
3. 0.1g 100ml
X 0.3ml
X=0.003g = 3mg
4. 0.1g 100ml
X 0.4ml
X=0.004g = 3mg
Entonces armamos:
Concentracin Absorb.
( 540 nm)
1mg 0,060
2mg 0,110
3mg 0,175
4mg 0,240
5mg 0,300
6mg 0,341
7mg 0,395
8mg 0,430
9mg 0,460
1g 0,480
Hallando a y b:
a= 0.01639
b= 0.05360
r = 0.9953
Como: y = a + bx, reemplazamos con los datos obtenidos:
Absor. de la muestra A : 0.27
Absor. de la muestra B: 0.19
Para la muestra:
0.27=0.01639+0.05360 X
X=0.27-0.01270.05360=4,8004 mg
4.8004 mg -------------- 0.2 ml
X -------------- 87.5 ml
X = 1980.15 mg
1980.15 mg x 1g1000mg=1.98015 g
10.0540 g (muestra) ------- 100 %
1.98015g ------------------ X
X = 19.7% de protenas halladas.
7. DISCUSION
Es necesario hacer una buena preparacin de la muestra ante de enviarla a analizar, generalmente para obtener una buena muestra en este caso de frijol esta debe
remojarse en agua para que pueda salir la protena, debido a ello la muestra molida de estar por lo menos 3 4 horas, nosotros trabajamos con una agitador y la
muestra se expuso al agitador una hora, hubiera sido recomendable mas tiempo de reposo y agitacin para la muestra para obtener datos mas exactos.
8. CONCLUSIONES:
La experiencia del mtodo Biuret nos ayudo a determinar el porcentaje de protenas en el frijol de un modo sencillo, obteniendo as 19.7 % de protenas lo cual es bajo
pero cercano a lo ideal para el frijol que debera estar en 20 23 %
Las protenas son las molculas ms importantes en nuestra dieta alimenticia. As que debemos de saber que cantidad de protenas consumimos, para no presentar dficit,
por ello es necesario este tipo de pruebas de determinacin de protenas para saber la calidad del cereal que estamos consumiendo.
9. BIBLIOGRAFIA
Hart L., Fischer H. Anlisis Moderno de los Alimentos. Editorial Acribia. Zaragoza-Espaa.
Pearson D. Tcnicas de Laboratorio para el Anlisis de Alimentos. Editorial Acribia. Espaa.
Matissek. Shnepel Steiner. Anlisis de los alimentos/Fundamentos, mtodos, aplicaciones. Editorial Acribia. Zaragoza-Espaa. 1998
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