UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUMICOS
APOSTILA DE BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL



Isolamento e Identificao de
Micro-organismos do Solo




EDMAR DAS MERCS PENHA
MRCIA MONTEIRO MACHADO GONALVES





2010
2
PARTE 1 - Teoria

1- Introduo
O solo uma camada viva, que recobre a superfcie terrestre entre a litosfera e a
atmosfera. Os solos so constitudos de trs fases: slida (minerais e matria orgnica),
lquida (soluo do solo) e gasosa (ar). Essas fases podem ser encontradas em diferentes
propores, dependendo de fatores como tipo de solo e forma de utilizao. produto do
intemperismo sobre um material de origem, cuja transformao se desenvolve em um
determinado relevo, clima, bioma ao longo de um tempo e est em evoluo permanente.
O solo o resultado de algumas mudanas que ocorrem nas rochas. Estas mudanas
so bem lentas, sendo que as condies climticas e a presena de seres vivos so os
principais responsveis pelas transformaes que ocorrem na rocha at a formao do
solo.

2 - Microbiologia do Solo
O solo habitado por uma enorme variedade de micro-organismos vegetais
(microflora do solo) e animais (microfauna do solo) e ainda por organismos animais que
vo de dimenses submicrocspicas a dimenses mdias ou mesmo relativamente
grandes (macrofauna).
As comunidades de organismos micro e macroscpicos que habitam o solo realizam
atividades imprescindveis para a manuteno e sobrevivncia das comunidades vegetais
e animais. No solo as principais atividades dos organismos so a decomposio da
matria orgnica, produo de hmus, ciclagem de nutrientes e energia, fixao de
nitrognio atmosfrico, produo de compostos complexos que causam agregao do
solo, decomposio de xenobiticos e controle biolgico de pragas e doenas,
proporcionando assim, condies ideais para uma biodiversidade extremamente elevada.
A atividade biolgica do solo uma denominao genrica para a ao dos
organismos vivos do solo, tanto animais quanto vegetais. Esses organismos tm forte
3
influncia na gnese e manuteno da organizao dos constituintes do solo,
principalmente nos horizontes superficiais.
Praticamente todos os micro-organismos existentes na natureza possuem
representantes no solo. Quando um microbiologista procura um determinado organismo,
o solo a sua primeira consulta. Tendo em vista a composio do solo (rochas, minerais,
gua, gases e matria orgnica - hmus) oriunda de vegetais, animais e micro-
organismos, muitos grupos taxonmicos de micro-organismos esto presentes no solo
influindo na sua fertilidade, consequentemente tambm associada reciclagem dos
elementos qumicos.
O solo o maior reservatrio de micro-organismos do planeta, onde 1 hectare de
solo pode conter at 4 toneladas de micro-organismos, recebendo direta ou indiretamente
todos os dejetos dos seres vivos. um local de transformao da matria orgnica em
substncias nutritivas e tem grande abundncia e diversidade de micro-organismos.

3 - Fatores que afetam os micro-organismos do solo
Os principais fatores que afetam os microorganismos do solo so: substratos e
fontes de energia, fatores de crescimento, nutrientes minerais, composio do solo,
arejamento e condies de umidade, pH, presso atmosfrica, temperatura e radiao
solar, e da competio e antagonismos que se estabelecem entre os prprios grupos de
micro-organismos, dentre outros fatores.

4 - Principais grupos de micro-organismos do Solo
Um solo frtil apresenta bactrias, fungos, algas, protozorios e vrus, que podem
atingir um total de bilhes de organismos por grama. A proporo e a quantidade de
micro-organismos variam com a profundidade e a composio dos solos, conforme se
pode observar na Tabela 1.



4
Tabela 1 - Quantidade de Micro-organismos no Solo
Profundidade
(cm)
Umidade
(%)
Matria Orgnica
(%)
Bactrias (x 10
6
)/g
Fungos
(x 10
6
)/g
Aerbias Anaerbias
0-8 18,2 4,4 24 2,7 280
8-20 10,0 1,5 3,1 0,4 43
20-40 11,5 0,5 1,9 0,4 0
40-60 13,5 0,6 0,9 0,04 0
60-80 7,9 0,4 0,7 0,03 0
80-100 5,3 0,4 0,15 0,01 0
Fonte: Lindegreen & Jensen, 1973

4.1 - Bactrias
As bactrias so o grupo mais importante de organismos do solo, no qual, em
condies favorveis, atingem nmeros extraordinariamente elevados. H bactrias
aerbias obrigatrias, anaerbias obrigatrias e facultativas. As bactrias desempenham
papel importante na decomposio de resduos orgnicos e na formao do hmus.
Compostos extracelulares ajudam a se ligarem s partculas dos solos nos agregados.
Grupos especializados esto envolvidos em cada etapa do ciclo do Nitrognio.
So organismos unicelulares procariticos, constitudos por uma clula, sem ncleo
celular envolvido pela membrana nuclear. A estrutura da clula bacteriana a de uma
clula procaritica, sem organelas ligadas membrana celular, tais como mitocndrias ou
cloroplastos, sem um ncleo rodeado por uma cariomembrana e sem DNA organizado
em verdadeiros cromossomas, como os das clulas eucariticas. Na Figura 1 pode-se ver
uma representao da estrutura de uma bactria.


5

Figura 1 - Estrutura de uma bactria
Morfologicamente, as bactrias classificam-se de acordo com a forma da clula e
com o grau de agregao. Quanto a forma, podem ser: Coco (de forma esfrica ou
subesfrica, do gnero Coccus), Bacilo (em forma de bastonete ,do gnero Bacillus),
Vibrio (em forma de vrgula, do gnero Vibrio), Espirilo (de forma espiral/ondulada, do
gnero Spirillum) ou Espiroqueta (em forma acentuada de espiral). Na Figura 2, pode-se
ver as diferentes morfologias

Figura 2 - Morfologia de bactrias
6
As bactrias podem ser identificadas por meio da tcnica de colorao de Gram.
Durante o processo de colorao de Gram, as clulas so tratadas com cristal violeta
(corante primrio) e em seguida com uma soluo de iodo, o que resulta na formao de
um complexo cristal violeta-iodo (CVI) dentro das clulas. Quando uma bactria Gram-
negativa tratada com etanol, o lipdeo na membrana externa dissolvido e removido, o
que rompe a membrana externa e aumenta a sua permeabilidade. Assim, o complexo
corante pode ser removido, descorando a bactria Gram-negativa, que pode ento ser
tingida com o corante de fundo safranina. Em bactrias Gram-positivas, etanol faz com
que os poros no peptideoglicano se contraiam, e o complexo corante CVI permanece no
interior da clula.

4.2 - Actinomicetos
Actinobacteria um filo de bactrias Gram-positivas conhecidas como
actinomicetos ou actinobactrias. Estas bactrias tm organizao filamentosa, muitas
vezes ramificada. Dada sua semelhana com fungos e por produzirem, como estes,
cadeias de esporos semelhantes a condios, os Actinomicetos so com freqncia
erroneamente classificados como tais. Ao contrrio dos fungos, porm, so organismos
procariticos, em sua grande maioria aerbios e gram-positivos.
Os Actinomicetos ocorrem amplamente no solo, onde desempenham relevante
papel biolgico. Especialmente representantes do subgrupo dos estreptomicetos so
muito comuns na terra. Entre estes, contam-se o Streptomyces griseus e o Streptomyces
aureofaciens. Os representantes do gnero Streptomyces produzem importantes
antibiticos, como a estreptomicina, sintetizada por S. griseus, a clorotetraciclina,
sintetizada por S. aureofaciens, a terramicina, sintetizada por S. rimosus, entre muitos
outros.

4.3 - Fungos
Os fungos encontram-se mais na superfcie j que onde prevalecem as condies
de aerobiose. So muito ativos na decomposio de constituintes orgnicos complexos,
7
alm disso, os miclios melhoram a estrutura fsica do solo. Os gneros mais comuns so
Penicillium, Mucor, Rhizopus, Cladosporium, Aspergillus.
Os fungos apresentam um conjunto de caractersticas prprias que permitem sua
diferenciao das plantas: no sintetizam clorofila, no tem celulose na sua parede
celular, exceto alguns fungos aquticos e no armazena amido como substncia de
reserva. A presena de quitinas na parede da maior parte das espcies fngicas e a sua
capacidade de depositar glicognio os assemelham s clulas animais.
Os fungos so seres vivos eucariticos, sendo reconhecidos trs principais grupos:
as leveduras - apresentam um s ncleo, os fungos filamentosos ou bolores - so
multinucleados e os cogumelos - so macroscpicos. Seu citoplasma contm
mitocndrias e retculo endoplasmtico rugoso. So heterotrficos e nutrem-se de matria
orgnica morta - fungos saprofticos, ou viva - fungos parasitrios. Suas clulas possuem
vida independente e no se renem para formar tecidos verdadeiros.
Os componentes principais da parede celular so hexoses e hexoaminas, que
formam mananas, ducanas e galactanas. Alguns fungos tm parede rica em quitina (N-
acetil glicosamina), outros possuem complexos polissacardeos e protenas, com
predominncia de cistena.

4.4 - Algas
Desenvolvem-se principalmente na camada superficial de solos encharcados. Parece
que desempenharem papel importante no arejamento de solos pantanosos.
As algas compreendem vrios grupos de seres vivos aquticos e autotrficos, ou
seja, que produzem a energia necessria ao seu metabolismo atravs da fotossntese. A
maior parte das espcies de algas so unicelulares e, mesmo as mais complexas - algumas
com tecidos diferenciados - no possuem razes, caules ou folhas verdadeiras.
8
PARTE 2 - Prticas

1 - Objetivo do trabalho experimental
Promover o isolamento e identificao de micro-organismos de uma amostra de
solo.
Estudar as caractersticas dos principais micro-organismos do solo.
Proporcionar conhecimento prtico das tcnicas asspticas de manipulao de
micro-organimos.
Despertar os alunos para as normas de biossegurana.

2 - Principais etapas
1 Prtica Apresentao/Preparo de vidrarias para uso no laboratrio de
Microbiologia.
2 Prtica - Preparo de meios de cultivo/Esterilizao pelo calor.
3 Prtica - Isolamento de microrganismos do solo - plaqueamento.
4 Prtica - Descrio das colnias selecionadas/isoladas no plaqueamento.
Repique.
5 Prtica - Observao/descrio das culturas repicadas e de sua tolerncia ao
oxignio./Preparaes microscpias I: a fresco
6 Prtica - Preparaes microscpias II: fixadas e coradas
Discusso dos Resultados
9
1 Prtica Apresentao/Preparo de vidrarias para uso no laboratrio
de Microbiologia

1 - Materiais de uso no laboratrio de microbiologia
1.1 - Autoclave (calor mido) - Seu funcionamento baseia-se no vapor dgua sob
presso. utilizada para esterilizao de materiais usados em microbiologia e meios de
cultura.
1.2 - Estufa de incubao - Onde os micro-organismos so mantidos durante o seu
desenvolvimento em uma temperatura constante.
1.3 - Microscpio - Para a observao dos micro-organismos
1.4 - Placa de Petri - Recipiente redondo de vidro ou de poliestireno cristal, com tampa
rasa, destinada ao cultivo de microrganismos em meio slido.
1.5 - Tubo de cultura - Destinado ao cultivo de micro-organismos em pequeno volume de
meio (lquido ou slido).
1.6 - Pipeta graduada ou sorolgica - Utilizada para diluio, inoculao, etc. Deve conter
um tampo de algodo no bocal.
1.7 - Esptula de Drigalsky - Basto de vidro com formato de tringulo em uma das
extremidades. usado para distribuir de forma homognea uma cultura lquida sobre o
meio de cultura slido contido na placa de Petri.
1.8 - Cabo de Kolle - Cabo em cuja extremidade h um fio de platina ou outra liga
metlica (nquel-cromo) que pode ser reto (agulha) ou encurvado (ala). Serve para
semear micro-organismos em meio slido ou lquido.
1.9 - Lminas - So retngulos de vidro claro e transparente, de espessura mdia e bordos
polidos, que servem para o exame de micro-organismos ao microscpio.
1.10 - Lamnulas Pequenos quadrados de vidro, muito finos e transparentes, destinados
a cobrir a preparao contida na lmina, nos ensaios a fresco, evitando aberraes da
imagem e refrao dos raios luminosos;
10
1.11 - Pina para lmina - Servem para fixar uma lmina com material que vai sofrer
colorao, podendo ser de metal ou madeira;
1.12 - Algodo cardado Algodo cru no absorvente. Serve de tampo de frascos e
tubos contendo meio de cultura ou solues esterilizadas, pois funciona como um filtro
para micro-organismos.

2 - Preparo de vidrarias para uso no laboratrio de microbiologia
2.1 - Pipetas - so lavadas com gua corrente, deixadas em soluo detergente e
novamente passadas em gua. Depois de secas, coloca-se algodo no bocal e em seguida,
so esterilizadas em estojos especiais ou embrulhadas em papel Kraft. No esquecer de
anotar o volume.
2.2 - Tubos de cultura - se estiverem com culturas, devem ser inicialmente autoclavados
(120C, 20min), o meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com gua e sabo e
deixadas por algumas horas em soluo detergente. Depois disso so passadas em gua
corrente e secas. Aps a lavagem, e antes da esterilizao, os tubos so arrolhados
firmemente com algodo, de modo que ao ser pego somente pela rolha o tubo no se
solte. A esterilizao deve ser feita em autoclave, quando j possuem meio de cultura em
seu interior.
2.3 - Placas de Petri - se estiverem usadas devem ser autoclavadas (121C, 20min), o
meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com gua e sabo e deixadas por algumas
horas em soluo detergente. Depois disso so passadas em gua corrente e secas. Juntar
tampa e fundo adequadamente e acondicionar para esterilizao em portas-placa ou
embrulhar em grupos de cinco com papel Kraft. Identificar o material e datar. Esterilizar
em autoclave a 121C por 30 minutos. Secando em seguida em estufa a 100C.
11
2 Prtica - Preparo de meios de cultivo/Esterilizao pelo calor.

1 - Definio
Meio de cultura o nome que se d associao, qualitativamente e
quantitativamente equilibrada, de substncias que, por sua natureza, permitem o cultivo
dos microrganismos fora do seu habitat ou meio natural.
O cultivo artificial em condies previamente definidas e reprodutveis integra,
junto com a esterilizao e a prtica assptica, o fundamento cientfico da tcnica
microbiolgica.

2 - Exigncias Nutritivas
O meio de cultura deve conter os elementos necessrios para o crescimento ideal do
microrganismo a ser cultivado. Sabemos que h diferentes grupos microbianos que
exigem determinados compostos que so utilizados no preparo dos meios tais como:
-gua
-sais minerais
-fontes de carbono
-fontes de nitrognio (orgnica ou inorgnica)
-fontes de enxofre (orgnica ou inorgnica)
-extrato de leveduras
-extrato de carne
-agar-agar (meios slidos ou semi-slidos)
Outros requisitos: pH, tenso de oxignio e esterilidade.

3 - Classificao dos Meios de Cultura
Podem ser classificados de acordo com diferentes critrios, desde a forma em que
se apresentam at sua finalidade.
Quanto apresentao: lquidos, slidos ou semi-slidos.
12
Quanto origem dos constituintes: naturais ou sintticos.
Quanto natureza dos constituintes: meios minerais, meios orgnicos, meios mistos
e meios complexos (adio de fatores de crescimento).
Quanto finalidade: meios de cultivo, meios de enriquecimento, meios de
identificao, meios diferenciais, meios especiais e meios para conservao.

4 - Normas de Preparao
Embora cada meio de cultura tenha sua composio prpria ou detalhes tcnicos
especiais para o preparo, todos os meios devem ser preparados obedecendo algumas
regras bsicas. Em geral, todas as substncias devem ser solubilizadas. No caso de meios
slidos, primeiramente deve-se solubilizar o agar em gua aquecida numa temperatura
em torno de 60
o
C, em seguida adicionar os demais componentes do meio aps solubiliz-
los individualmente em gua. Os sais, a peptona e os acares tambm devem ser
solubilizados em gua fria, enquanto que o extrato de carne e de levedura em gua
ligeiramente aquecida. Finalizada a solubilizao o pH do meio deve ser ajustado para o
valor desejado com soda ou cido, distribudo em recipientes adequados e esterilizado.

5 - Composio dos Meios de Cultura/Solues Utilizadas
Gelose Simples isolamento de bactrias
Composio: extrato de carne - 3g
peptona - 10g
Na
2
HPO
4
- 1g
NaCl - 5g
agar-agar - 18g
gua destilada - 1 litro
pH - 7,4 a 7,6
Distribuir: 250 mL de meio slido/erlenmeyer 500 mL
Esterilizar a 121
o
C/15 min.

Gelose Sabouraud isolamento de fungos (leveduras)
Composio: peptona - 10g
glicose - 20g
extrato de levedura- 0,01g
agar-agar - 18g
13
gua destilada - 1 litro
pH - 5,6
Distribuir: 250 mL de meio slido/erlenmeyer 500 mL
Esterilizar a 121
o
C/15 min.

Gelose Czapeck isolamento de fungos (bolores)
Composio: sacarose - 30g
NaNO
3
- 3g
MgSO
4
- 0,5
KCl - 0,5
K
2
HPO
4
- 1g
agar-agar - 18g
gua destilada - 1 litro
pH - 7,3
Distribuir: 250 mL de meio slido/erlenmeyer 500 mL
Esterilizar a 121
o
C/15 min.

Obs.: Para cada um dos meios acima, preparar 250 mL de meio lquido.

Soluo Salina diluio
Composio: NaCl - 8,5g
gua destilada - 1 litro
Distribuir: 9 mL/tubo e 90 mL/erlenmeyer 250 mL
Esterilizar a 121
o
C/15 min.
14
3 Prtica - Isolamento de micro-organismos do solo - plaqueamento.

1 - Definio
Em microbiologia, isolamento a operao que consiste em separar uma espcie
microbiana de outra, a partir de certo material contaminado. Imagine, se for preciso obter
um microrganismo existente no solo, uma bactria por exemplo, sabendo que no solo,
encontram-se bactrias, leveduras e bolores. Como ser possvel obter essa bactria
isolada dos outros microrganismos?
Tomando uma poro representativa desse material, faz-se uma suspenso em
soluo fisiolgica de maneira a se obter um extrato do solo. Esse extrato vai ser diludo
e a diluio plaqueada. A finalidade da diluio diminuir o nmero de microrganismos
para que na placa de Petri as colnias apaream bem separadas a fim de permitir um bom
isolamento. Os microrganismos vo se desenvolver custa dos nutrientes presentes no
meio adicionado placa. A composio dos nutrientes varia de acordo com grupo
microbiano que se deseja isolar.

2 - Tcnicas de Plaqueamento
2.1- Superfcie
a) Espalhamento o meio de cultura fundido colocado na placa de Petri, deixado
solidificar at que se tenha uma superfcie bem rgida e sobre ela colocamos a amostra
convenientemente diluda. Espalha-se o material por toda a superfcie da placa com
esptula de Drigalsky e incubamos por tempo determinado na temperatura adequada,
aps marcar as placas com as diluies e o nome do operador.
b) Esgotamento de ala so preparadas 3 a 4 placas com o meio de cultura
solidificado e sobre o mesmo faz-se a semeadura com uma ala carregada no material a
ser analisado. Esta ala ir passar por 3 a 4 placas em movimentos zig-zag e incubada na
temperatura e tempo adequados, aps marcar as placas com o nome do operador.

15



2.2 - Mistura (incorporao ou pour-plate)
indicada para os casos em que o microrganismo mvel e tende a invadir toda a
placa ou quando h suspeita de anaerbios. O material, devidamente diludo, ser
colocado na placa e o meio de cultura fundido ( 50
o
C) deve ser adicionado e misturado
ao mesmo com movimentos giratrios. Incubar na temperatura e tempo adequados, aps
marcar as placas com as diluies e o nome do operador.

3 - Tcnica de diluio sucessiva
Em um erlenmeyer contendo 90 mL de soluo salina adicionar de forma assptica
10 g de solo, homogeneizar e prosseguir de acordo com o esquema apresentado na figura
a seguir:


1
16

Figura 2 Tcnica da diluio sucessiva para o plaqueamento de amostra de solo.

Em cada uma dessas tcnicas o objetivo diminuir a populao microbiana, assim
as clulas individuais estaro localizadas a certa distncia umas das outras. E tambm
para facilitar a contagem das placas selecionadas contendo entre 30 e 300 colnias. Cada
clula se estiver distante o suficiente das demais, produzir uma colnia que, por estar
afastada das demais pode ser considerada pura. Todas as clulas em uma colnia tm o
mesmo parentesco. Para isolar uma cultura pura, uma colnia individual deve-se
transferir uma amostra da colnia para um tubo de ensaio contendo meio estril, seguindo
as prticas asspticas para evitar recontaminao.
4 - Quantificao do n
o
de micro-organismos presentes numa amostra de solo
Selecionar a placa contendo entre 30 e 300 colnias. Contar o nmero de colnias e,
de acordo com a diluio utilizada no material de origem, expressar o nmero de
unidades formadoras de colnia (UFC) presentes na amostra, nas condies de teste.
Exemplo de clculo:
n de colnias = 54
diluio = 10
-5

Total: 54 10
-5
= 54 x 10
5
= 5,4 x 10
6
UFC/g de amostra
17
4 Prtica - Descrio das colnias selecionadas/isoladas no
plaqueamento. Repique.

1 - Leitura da Placa
Examina-se a placa contra a luz, por ambos os lados, procurando colnias isoladas
que sero marcadas (Figura 1). Em seguida, com auxlio da lupa, observa-se
cuidadosamente estas colnias marcadas e numera-se aquelas que, pelo aspecto, parecem
provir de espcies diferentes.


Figura 1 - Cultura selecionada

18
2 - Caractersticas Morfolgicas das Colnias
Anotar cuidadosamente as seguintes caractersticas:
a) Tamanho:

b) Forma:

c) Elevao:

d) Bordos:


e) Estrutura da superfcie:

19

3 - Repique
a operao que consiste no transporte de certa poro de uma cultura para um
meio esterilizado. A poro transportada denomina-se inculo ou semente. Podemos ter
dois casos:
Repique da placa ao tubo as colnias selecionadas sero transferidas, ou seja,
repicadas uma a uma, para tubos contendo meio lquido e tubos contendo agar inclinado
com emprego de uma ala de platina. Primeiramente semeado o agar e a seguir o meio
lquido, sem carregar novamente a ala, uma vez que para o meio lquido um pequeno
inculo suficiente. Os tubos so identificados com o nome do material, nmero da
colnia e a data, e incubados na temperatura e tempo adequados. A placa conservada
fora da estufa, de preferncia na geladeira, at que o repique tenha crescido e a seguir
descarregada.
Repique de um tubo ao outro se a cultura primitiva lquida usa-se pipeta
Pasteur, se provm de meio slido usa-se ala ou agulha, conforme o caso. Quando o
repique feito visando isolamento ou conservao, a superfcie da gelose aproveitada
ao mximo, semeando-se com um movimento de zig-zag numa linha sinuosa e fina sem
ferir o meio. Entretanto, se o objetivo verificar o tipo de crescimento (para identificao
das espcies), a semeadura feita numa linha reta do fundo at em cima.
20
5 Prtica - Observao/descrio das culturas repicadas e de sua
tolerncia ao oxignio./Preparaes microscpias I: a fresco

1 - Descrio das Culturas Repicadas e de sua Tolerncia ao Oxignio
1.1 - Tubos de Gelose Inclinada: Examinar os tubos contendo as culturas repicadas
com objetivo de verificar se estes se apresentam homogneos em toda sua extenso.
1.2 - Tubos de Meio Lquido: Examinar a tolerncia das culturas repicadas ao
oxignio, de acordo com a classificao abaixo.

Figura 1 Esquema representativo das formas de crescimento de micro-organismos em
meio lquido dependendo de sua relao com o oxignio atmosfrico.
(a) Aerbios como o O
2
penetra pouco no tubo, os aerbios obrigatrios crescem na
superfcie.
(b) Anaerbios estritos so sensveis ao O
2
, crescem somente no fundo.
(c) Aerbios facultativos so capazes de crescer tanto na presena como na ausncia de
O
2
, por toda a extenso do tubo.
(d) Microaerfilos se afastam da zona com maior quantidade de O
2
.
(e) Anaerbios aerotolerantes crescem por toda a extenso do tubo. Entretanto,
crescem pouco na superfcie - so fermentadores.
21

2 - Preparaes microscpias I: a fresco
o mtodo de observao mais simples e o mais antigo. Permite que se observem
as clulas ou microrganismos sem nenhum artifcio. possvel observar a forma, cor e o
movimento das clulas, que so conservadas vivas. No permitem inspees prolongadas,
pois h sempre o perigo de ressecar o lquido dispergente.
2.1 - A partir de cultivo em meio slido
- Secar a lmina
- Colocar uma pequena gota do lquido dispergente (soluo fisiolgica) no centro
da lmina com auxilio de uma pipeta Pasteur.
- Retirar com auxilio da ala de platina, previamente esterilizada (aquecida ao rubro
e resfriada), uma pequena quantidade do crescimento do microrganismo da gelose e
ressuspender na gota do lquido sem espalhar pela lmina.
- Colocar sobre a suspenso de clulas a lamnula de modo a no formar bolhas de
ar.
2.2 - A partir de culturas em meio lquido
- Secar a lmina
- Retirar com a pipeta Pasteur um pouco do cultivo previamente agitado e colocar
uma gota no centro da lmina.
- Colocar sobre a suspenso a lamnula de modo a no formar bolhas de ar.
Essas preparaes podem ser coradas ou no. Neste caso, os corantes empregados
so os corantes vitais, ou seja, no comprometem a vida da clula. H difuso do corante
no lquido celular. Ex: azul de metileno usado para pesquisa de clulas vivas.
Nestas preparaes as clulas so observadas por refrao. Entretanto, como as
clulas tm ndice de refrao prximo ao meio dispergente, o feixe luminoso deve ser
estreito (diafragma aberto apenas para iluminar o campo).
22

3 - Observaes das Preparaes
Deve-se sempre anotar todos os dados relativos s observaes, tais como:
- material em exame e suas condies (no caso de culturas de microrganismos: o
meio de cultivo, data da cultura, temperatura de incubao);
- tipo de preparao e a tcnica usada;
- tipo de observao feita e jogo tico usado.

Deve-se procurar sempre desenhar o material em observao, anotando a forma, a
estrutura e quaisquer outros detalhes presentes.

Figura 2 - Diferentes tipos de esporos fngicos

23
6 Prtica - Preparaes microscpias II: fixadas e coradas

1 - Preparaes Fixadas e Coradas: Consiste em fixar o esfregao sobre a lmina, o qual
sofrer o mtodo de colorao.
1.1 - Preparo do esfregao
A partir de cultivo em meio slido
- Secar a lmina
- Com auxilio de urna pipeta Pasteur colocar no centro da lmina uma gota de soluo
fisiolgica.
- Com a ala de platina, previamente esterilizada (aquecida ao rubro e resfriada), retirar
urna pequena quantidade do crescimento do microrganismo da gelose e ressuspender na
gota de soluo fisiolgica, espalhando bem, de modo a formar uma camada homognea
e fina.
- Esperar secar e fixar.
A partir de cu1turas em meio lquido
- Secar a lmina
- Retirar com a pipeta Pasteur um pouco do cu1tivo previamente agitado e espalhar bem,
de modo a formar uma camada homognea e fina.
- Esperar secar e fixar.

1.2 - Fixao
A Marchoux
- Mtodo qumico
- Mecanismo: precipitao das protenas celulares pelo etanol
- Execuo: cobrir o esfregao com etanol, escorrer e flambar.
Calor
- Mtodo fsico
- Mecanismo: coagulao das protenas celulares.
- Execuo: passar o esfregao pela chama do bico de Bunsen de duas a trs vezes.

24
1.3 - Colorao: As clulas fixadas podem sofrer diversos processos de colorao, sendo
o mais importante a colorao de Gram.
Colorao de Gram - Tcnica segundo Hucker
- Cobrir a preparao com Gram I (soluo de cristal violeta). Deixar 60 segundos.
Escorrer e lavar com gua corrente.
- Recobrir com gotas de Gram II (soluo de Lugol). Deixar 30 seg. Escorrer e lavar.
- Tratar com Gram III (etanol) at descorar. Escorrer e lavar.
- Recobrir com Gram IV (soluo de safranina). Deixar 5-7 seg. Escorrer, lavar e secar.
Neste caso as clulas so observadas com a objetiva de imerso. Para tal, colocar
diretamente sobre a preparao uma gota de leo e levar ao microscpio para focalizar.
As preparaes deste tipo so observadas com bastante luz (condensador elevado e
diafragma bem aberto).
Diagnstico: clulas roxas Gram positivas
clulas vermelhas - Gram negativas


Figura 1 Preparo de lminas para observao microscpica.
25
2 - Observaes das Preparaes

Deve-se sempre anotar todos os dados relativos s observaes, tais como:
- material em exame e suas condies (no caso de culturas de microrganismos: o meio de
cultivo, data da cultura, temperatura de incubao);
- tipo de preparao e a tcnica usada;
- tipo de observao feita e jogo tico usado.

Deve-se procurar sempre desenhar o material em observao, anotando a forma, a
estrutura e quaisquer outros detalhes presentes.


Figura 2 Principais formas de bactrias.