BASES MOLECULARES DE LAS REACCIONES

IHQ CROMOGNICAS:
Inmunoperoxidasa e inmunofosfatasa
Prof. Laura ochoa Martnez.
Cmo se demuestra la reaccin Ag-Ac
Con la presencia de una enzima que est activa.
La enzima puede estar conjugada al anticuerpo
primario, al secundario o a la avidina, vale decir
al penltimo paso de la reaccin IHQ.
La actividad enzimtica se revela con un sustrato
y un cromgeno.
Marcador enzimtico: cromognica
Enzimas ms utilizadas en IHQ.
Peroxidasa de Rbano Picante (Horse Radish
Peroxidase)
Fosfatasa Alcalina intestinal (AP).
Mtodos de conjugacin de las enzimas
con los sistemas de marcacin en IHQ.
La conjugacin se lleva a cabo por una unin qumica covalente.
Se utiliza Glutaraldehido para unir la enzima con otras molculas.
Enzima--biotina
Enzima--IgG
Enzima--estreptavidina
Enzima--dextrano
Mtodos de conjugacin de enzimas en
los sistemas de marcacin en IHQ.
Unin no covalente.
Utiliza anticuerpos no marcados o molculas biolgicamente adhesivas
para formar complejos enzimaanticuerpo.
PAP
APAAP
ABC
Polmero marcado.
Peroxidasa(HRP, Horse Radish Peroxidase)
Enzima obtenida de la raz de rbano picante.
Glicoprotena de 40 KD
Acta a pH 7,6
Es una oxido-reductasa, que cataliza reacciones,
bisustrato de carcter de redox.
La cantidad de HRP presente influencia directamente la
cantidad de producto coloreado formado. Pero no es
estequiomtrica.
Tejidos problemticos
Clulas mieloides: mieloperoxidasa
Eritrocitos: seudoperoxidasa
Bloqueo:
H
2
O
2
3% acuoso o en metanol absoluto.
Cromgenos para HRP
3,3 diaminobenzidina (DAB), precipitado caf. (Tratar con
Hipoclorito de Sodio o Permanganato de Potasio: compuesto inerte)
3,5 tetrametilbenzidina (TMB), precipitado azul (uso
limitado, precipitado semisoluble en agua).
3 amino-9-etilcarbazol (AEC), produce un precipitado color
rojo, soluble en solventes orgnicos. Novared (VectorLabs.).
Sensible a la luz.
4-cloro-1-naftol, produce un precipitado azul negruzco.
Difunde (no recomendable para IHQ).
HRP
Ventajas
Gran estabilidad.
Fcil de conjugar con otras
molculas ((Ig, AV, etc.)
Facilidad para detectarla por
mtodos colorimtricos.
Rapidez de la reaccin.
Posee variados sustratos.
Preparaciones permanentes.
Gran utilidad en la IHQ
ultraestructural.
Desventajas
La actividad peroxidasa est
presente en muchas esta
clulas.
Requiere bloqueo de la
peroxidasa endgena.
Su actividad se mantiene
despus de la fijacin.
Fosfatasa Alcalina.
Enzima hidroltica, que cataliza la hidrlisis de steres de cido
fosfrico.
PM de 100 Kd.
Acta a un pH ptimo de 8.
La AP intestinal de origen bovino es la ms comnmente usada.
El principal sustrato de la AP es la sal de Sodio monobsica -
naftil fosfato.
Visualizacin de la Fosfatasa Alcalina.
Fosfatasa Alcalina.
Tejidos problemticos:
Hueso
Rin
Hgado
Es ms abundante en tejidos frescos.
Bloqueo:
Levamisol 1 a 5 mM
Bloqueo de fosfatasa alcalina intestinal: solucin de cido dbilcido
dbil
Procedimientos esenciales:
Bloqueos:
Boqueo de la peroxidasa endgena luego de la desparafinacin.
Bloqueo de receptores para Fc de Igs: 1% suero normal (antes del Ac
primario)
Bloqueo de receptores endgenos para Avidina y Biotina.
Recuperacin antignica:
Mediante uso de calor y buffer adecuado (antigen retrival).
Mtodos enzimticos.
Controles de la reaccin.
- Control anticuerpo primario de conejo:
Se reemplaza el anticuerpo primario por suero normal de conejo
diluido como el primario y se contina el procedimiento.
- Control anticuerpo secundario de cabra:
No se usa anticuerpo primario, se lo reemplaza por suero normal de
cabra diluido % y se contina el secundario y el resto del
procedimiento.
- Control del revelado:
Slo se incuba con PBS en reemplazo del suero primario y del
secundario, y se contina el procedimiento
- Controles de especificidad de la reaccin:
Usar tejidos controles positivos y negativos