CONSERVACIN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS

Coleccin de Cultivo y servicio que ofrece

QusonlasColeccionesdeCultivo?
- Son organizaciones que principalmente se ocupan de guardar
convenientemente cepas de microorganismos, clulas superiores
o diversos materiales biolgicos y los suministran, previa
peticin, a laboratorios microbiolgicos o de biologa celular.
- Son por lo tanto servicios de apoyo a los trabajos de microbiologa.
Cundo aparecieron las primeras colecciones de cultivo?
-Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catlogo.
-La ms antigua Lobaina (Belgica) (Hongos)
-La ATCC, en 1925. No vinculos directos con la Universidad; es de
carcter comercial (Manassas, USA).
-La Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT), nace en el
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC)
(Villanueva)(1960).
A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional
denominada World Federation for Culture Collection (WFCC).
En Europa a su vez estn agrupadas en la European Culture Colletion
Organization (ECCO) que se fund en 1982.
Servicios que prestan las Colecciones de Cultivos
1.-Recoleccin,conservacin y suministro de cepas microbianas.
-Recoleccin: Es el servicio mas tpico de una CC. Las
colecciones renen cepas que les llegan a travs de distintos
conductos, las conservan convenientemente y las suministra
previa peticin.
-Conservacin:
-Suministro: Se hace por correo de superficie, areo o
mensajera,
pero siempre empaquetado correctamente; ya que siempre
hay que considerarlo como material potencialmente
patgeno
2.-Recopilacin de datos de las cepas microbianas y difusin de
los mismos
Fichas, ordenadores, redes electrnicas, public. de catlogos
3.-Servicio de resguardo de las cepas microbianas
Se pueden guardar por encargo cepas microbianas, cobrando
una tasa anual y manteniendo el secreto de este depsito.
4.-I dentificaciones microbianas.
5.-Depsito de cepas microbianas.
-Depsito pblico: Cualquier microbilogo puede depositar
una cepa, que considere interesante, en la coleccin. Esta cepa se
incorpora en el catlogo y puede suministrarse a cualquier otro
microbilogo que la solicite.
-Depsito no pblico: Algunas CC reciben el nombramiento
de Autoridad Internacional de Depsito para fines de patentes, de esta
manera se garantiza la descripcin total y reproduccin del proceso
patentado. Una vez conseguida la patente, la cepa puede suministrarse
previa autorizacin escrita del propietario, aunque no figure en el
catlogo.
6.-Organizacin de Cursos
7.-I nvestigacin.
8.-Asesoramiento en general
Normas generales para la conservacin de
cepas microbianas
Los tres objetivos para una correcta conservacin:
1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA)
2.-Que este viva.(VI ABI LI DAD)
3.-La cepa debe guardarse geneticamente estable (ESTABI LI DAD)
Lapage en 1977 deca que:
a) Un cultivo inicial de una especie es una poblacin
b) Un subcultivo es una poblacin diferente derivada de este
cultivo inicial.
c) Una cepa es una sucesin de subcultivos del cultivo inicial
El fenotipo del cultivo inicial sern los mismos en la cepa?
NO necesariamente porque se producen cambios en los subcultivos.
Los mtodos en la conservacin de las cepas microbianas tienen
como objeto fundamental minimizar estos cambios.
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin
Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica.
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar estril.
Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro
Desecacin en suelos, arena silicagel, etc
Desecacin en bolitas de alginato.
Desecacin en sal gorda para halobacterias
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin
Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar estril.
Conservacin de microorganismos por
congelacin
La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temperaturas inferiores a cero grados
centgrados.
Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por la
disminucin del agua disponible.
Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-Crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiolgico de la clula
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza
BACTERIA
H
2
O
H
2
O
H
2
O
H
2
O
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
AGENTES
CRI OPROTECTORES
OBJETIVOS
Minimizar daos
durante la congelacin.
Limitar la formacin
de hielo (tasa de
congelacin).
Vitrificacin del agua.
CARACTERISTICAS
No txico para la
clula.
Penetrar fcilmente en
la membrana celular.
Unirse a los electrolitos
o a las molculas de
agua.
Crioprotectores ms comunes
Glicerol
Dimetilfulfxido (DMSO)
cido glutmico
Glucosa
Sacarosa
Meso inositol
Lactosa
Leche Descremada
Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-Crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento (-70,-139)
-El estado fisiolgico de la clula (Final f.logartmica)
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza
Conservacin de microorganismos por
congelacin
Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-Crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiolgico de la clula
- Mantenimiento de la estabilidad (fenotpica y genotpica)
- Mantenimiento de la pureza (Hacer alcuotas)
Conservacin de microorganismos por
congelacin
Conclusiones
Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase
logartmica, a la temperatura ptima, en el medio ms adecuado.
Aadir los crioprotectores adecuados a una concentracin
ptima.
Repartir la suspensin en ampollas de congelacin, cerrarlas
hermticamente y mantenerlas 30 minutos a 30.
Disminuir la temperatura lo mas rpido posible.
A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar
rpidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado
en un bao a 37-40C.
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin
Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar estril
FUNDAMENTOS TERI COS DE LA
CONSERVACI N DE MI CROORGANI SMOS
POR LI OFI LI ZACI N
Liofilizacin
Es un mtodo de conservacin a largo plazo.
Se basa en la paralizacin del metabolismo
celular por falta de agua: congelacin y
sublimacin
PROCESO
Congelar el
agua libre de
las clulas
Eliminacin del agua
Agua congelada Vapor de agua
Sublimacin
Cundo aplicar la Liofilizacin?
Es un mtodo ampliamente utilizado para conservar distintos
Microorganismos.
SI NO
-Bacterias, levaduras,
Hongos, algunos virus, algas
-Dificultad de un crecimiento
Adecuado.
-Microorganismos delicados
que no resisten el paso de
congelacin.
-A tamaos de clulas mayores,
menos efectivo es el proceso
Protozoos,Clulas animales,
Clulas vegetales,Arqueobac-
terias y bacterias delicadas
Ejemplos:Rhodospirillum,
,Azospirillum,vibrio y dems
bacterias marinas.
-Levaduras miceladas con difi-
cultad en la esporulacin.
-Hongos con grandes conidios o
con dificultad en la esporulacin.
FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN
Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo
Depender del tipo de microorganismo y sus
requerimientos nutricionales.
Fase de crecimiento del cultivo.
F.exponencial. Suspensiones celulares de 10
8
-10
9
Clulas/ml en bacterias, algo inferiores en
hongos y levaduras.
Condiciones de incubacin.
T,aerobiosis, anaerobiosis, etc.
FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN
-Temperatura durante la sublimacin.
Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C.
-Grado de deshidratacin alcanzado.
Lo ms alto posible.
-Atmsfera de oxgeno en el tubo.
Las clulas liofilizadas se guardan en tubos al vaco para evitar
Rehidratacin o presencia de gases (como el oxgeno) que pueden
daar las clulas.
-Condiciones de almacenamiento.
La temperatura debe ser constante a 18 C y sin bajar de los 0 C
y, en oscuridad
LIOFILIZACIN
VENTAJ AS
-Reduccin de la variabilidad
del microorganismo.
-Largo tiempo de
conservacin.
-Aplicabilidad para la
produccin y distribucin
de los lotes
DESVENTAJ AS
-El alto coste inicial del
equipo.
-La preparacin de forma
incorrecta de los distintos
lotes puede desembocar en
un estancamiento de la
viabilidad y/o en prdidas
en la estabilidad de los
caracteres de los
microorganismos
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin
Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar esteril
Conservacin por transferencia
peridica
Es un mtodo en el que los organismos
permanecen activos durante el proceso. Consiste
en la inoculacin de microorganismos en un
medio de cultivo adecuado,la incubain a una T
adecuada para obtener crecimiento y finalmente el
almacenamiento bajo condiciones adecuadas. El
proceso es repetido a intervalos que garanticen la
obtencin de un cultivo fresco antes de la prdida
del viejo.
PARA UNA BUENA
RESI EMBRA PERI DI CA
Medio de cultivo.
Temperatura, tiempo y condiciones de incubacin.
Intervalo entre dos resiembras
Reduccin de la temperatura de almacenamiento.
Medios no enriquecidos, con limitacin de nutrientes.
Restriccin de la accesibilidad de aire del cultivo.
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin
Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar esteril
Conservacin por suspensin en agua
destilada o en agua de mar esteril
Es un mtodo alternativo muy usado y que da altos porcentajes
de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos
filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en
Suspender en agua estril unas cuantas clulas del cultivo que se
quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan,
se puede poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del
Hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se
hace en agua de mar diluida.
Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro
Desecacin en suelos, arena silicagel, etc
Desecacin en bolitas de alginato.
Desecacin en sal gorda para halobacterias
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodos de desecacin
Papel de filtro
Papel
Watman n4
15 minutos
121C
Paquete
cerrado
P
R
O
T
E
C
T
O
R
Cultivo Suspensin
celular
Gotas de
cultivo
Papel con
cultivo
Desecador
Paquetes
semicerrado
2-3 semanas
4C
Cerrado de
Los paquetes
Mtodos de desecacin
Suelo
P
R
O
T
E
C
T
O
R
Cultivo
esporulado
Suspensin de
esporas
20 minutos
121C
Tierra esteril
4C
G
E
R
M
I
N
A
C
I

N
4-5das
25C
Agotamiento
de
nutrientes
Microorganismos
en fase
durmiente
Almacenamiento
a 18C
Mtodos de desecacin
Bolas de Alginato
Alginato 3%
13 minutos
121C
Cultivo Suspensin
en agua esteril
Gotas
CaCl
2
0,03M
esteril
Gotas de alginato
con cultivo
30 minutos
Polimerizacin del
Alginato
Medio de Cultivo
0,75M Sacarosa
48horas
Placa petri con
Papel secante
Gotas de alginato
con cultivo
Corriente de aire estril
bomba de vaco a
Temperatura controlada
Prdida del 30% del peso
DESECACIN