PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS

1. INTRODUCCIN
Los microorganismos pueden ser aislados y propagados por diferentes
mtodos: su utilizacin vara segn el propsito y tipo de microorganismo que
se deseen aislar. Para su identificacin se utilizan diferentes mtodos como
son el estudio de su morfologa que tambin incluye sus reacciones frente a
diferentes colorantes y el tipo de estructura que pueden poseer como
endosporas, cpsula, etc.
La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo
que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una
esterilizacin deficiente o manipulacin incorrecta de materiales y medios de
cultivo conlleva a contaminaciones, resultados errneos o prdida del material
biolgico. Por ello, se requieren buenas prcticas de laboratorio para su
adecuado manejo. La esterilizacin por calor seco o hmedo son los mtodos
que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Microbiologa.
El calor seco destruye a los microorganismos por oxidacin, por ejemplo, al
exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180C
durante 2 horas. Estos mtodos se aplican en la esterilizacin de asas de
inoculacin y para todo tipo de material de vidrio y quirrgico.
Los procesos con calor hmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares
y protenas; se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones
termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan.
El equipo de uso comn es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presin
(15 lb/in2); con esta presin el material alcanza una temperatura de 121 C y si
se mantiene durante 15 minutos se asegurar la inactivacin de endosporas,
que son las estructuras bacterianas ms resistentes al calor.
Para cualquiera de los casos anteriores (morfologa, coloracin o reaccin
bioqumica) se necesitan medios de cultivo adecuadamente seleccionados,
preparados y almacenados.
Independientemente de los medios de cultivo y mtodos utilizados, el xito del
trabajo en el laboratorio de microbiologa depende de la adecuada eleccin y
buen uso de los mtodos de esterilizacin y tcnicas aspticas.

2. OBJETIVOS
Conocer los diferentes tipos de medios de cultivo existentes para
el crecimiento de microorganismos en el laboratorio.
Identificar los diferentes pasos a seguir en la elaboracin de un medio de
cultivo.
3. MARCO TEORICO
El estudio de los microorganismos lleva consigo la utilizacin de una amplia
gama de medios de cultivo tanto lquidos como slidos pero previamente es
necesario obtener cultivos puros de aquellos. Cualquier inoculo primario
contendr probablemente varios tipos distintos de microorganismos que darn
lugar a un cultivo mixto.
Efectuando una cuidadosa inoculacin en un medio slido en placa de cultivo
se obtienen colonias separadas de cada microorganismo presente, cada una
de las cuales procede en la mayora de los casos de la multiplicacin de un
solo microorganismo. Una sola clula da origen a una poblacin
genticamente homognea y es denominada clon, colonia o cultivo puro.
Entonces, un medio de cultivo es un sustrato natural o artificial o una solucin
de ciertos nutrientes que permiten cultivar los microorganismos de una manera
ms eficiente para su posterior uso en el laboratorio.
4. MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos
es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es
el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se
han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de
acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares
en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base
de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a
la que se aadirn otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de
medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias
y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente
solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
provocan su licuacin.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.
Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en
pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias
Grampositivas).

5. CONDICIONES PARA UN CULTIVO

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos
casos, son ajenos por completo al propio medio.
a. disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de
contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas.
En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias
inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias
adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las
reacciones qumicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones
de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la
preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo
provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles.
Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios
es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de
nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la
peptona.
b. consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo
productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en
estado semislido o slido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que
muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la
capacidad de licuarla.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est
ampliamente extendido en el laboratorio.
c. presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de
oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn
adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto
intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones
atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse
a cualquiera de las citadas condiciones.


d. condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas
en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas
en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de
agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y
evitar as que se deseque el medio.
e. Luz ambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que
en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de
los microorganismos fotosintticos.
f. pH
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de
los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con
un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No
se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no
impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar
sus procesos metablicos normales.
g. Temperatura
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre
15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o
incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los
patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos,
alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios.
h. Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la
aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir
el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en
dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el
autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante).



6. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
De acuerdo a la consistencia o estado fsico:
a. Medios lquidos: Son medios de cultivo que carecen de un
polisacrido denominado agar-agar extrado de algas marinas del gnero
Gellidium sp. un medio tpico es el caldo nutritivo o el caldo BHI. Al crecer en
un medio lquido un microorganismo utiliza los compuestos del mismo as como
excreta los productos metablicos bacterianos en l y puesto que en el medio
originalmente no contena estos productos sirven como una ayuda para la
identificacin del microorganismo en cuestin.
b. Medios slidos: Estos medios son usados frecuentemente para aislar
microorganismos, en los medios lquidos los microorganismos al encontrarse
libres pueden desplazarse en tanto que en los medios slidos se multiplican
localmente en el punto de la inoculacin y forman colonias cuya apariencia
frecuentemente es tpica de cada especie determinada. Para conseguir medios
slidos se agrega a un medio lquido agar en una proporcin del 1.5% al 2%.
Hoy en da se presenta en forma de polvo que incluye el agar, el punto de
fusin de estos medios oscila alrededor de los 98C y se solidifica al enfriarse
al 42-45C. La gelatina tambin puede emplearse como agente solidificante,
se trata de una protena obtenida a partir del colgeno de la piel, cuero,
tendones, y huesos y forma un gel de buenas caractersticas a concentraciones
de 12-15% en caldo nutritivo siendo su punto de fusin de 22C quedando
destruidas sus propiedades al alcanzar temperaturas por encima de 100C.
Una variante de los medio slidos son los medios condensados preparados a
partir de materias coagulables como el suelo o la albmina de huevo y
condensados en forma de pico de flauta a temperaturas cuidadosamente
controladas en la zona de los 75C.
c. Medio semislidos: son medios que usualmente contienen una
pequea cantidad de agar, esta cantidad promedio es de 0.5%, estos medios
son muy usados para determinar la movilidad de un microorganismo gracias a
su escaso poder retenedor, es decir, que no impiden que el microorganismo
mvil se desplace por el medio.
Segn las sustancias primarias los medios de cultivo se pueden clasificar
en:
a. Medios naturales: son aquellos medios empleados tal como se
encuentran en la naturaleza para cultivar microorganismos, como ejemplo de
estos medios encontramos la leche, los extractos vegetales o la sangre diluida.
b. Medios sintticos: como su nombre lo indica son medios que han sido
creados por el hombre y por lo tanto se conoce su formulacin completamente,
son utilizados para el cultivo de microorganismos coincidiendo de antemano los
requerimientos nutricionales que estos organismos necesitan. Como ejemplo
podemos mencionar todos los medios deshidratados que distribuyen las
casas comerciales.
c. Medios semisintticos: son medios de cultivo que llevan una mezcla
de medio naturales y medios artificiales, ya que algunos de los componentes
pueden ser susceptibles a los tratamientos empleados durante la elaboracin
de estos medios o tratamientos posteriores. Como ejemplo de estos medios
podemos encontrar el agar Baird Parker o el agar sangre.
d. Medio vivos: son aquellos medios que contienen clulas u organismos
vivos y que son ampliamente utilizados para demostrar reacciones susceptibles
de organismos superiores en presencia de microorganismos causantes de
alteraciones, tambin tienen importancia en el estudio y cultivo de los virus.
Ejemplos de estos medios pueden ser las clulas de rin de mono, huevos
embrionados o clulas de intestino de cobayos y conejos.
De acuerdo a los nutrientes en:
a. Medios simples: son medios que poseen los nutrientes mnimos para
permitir el desarrollo de microorganismos menos exigentes, como ejemplo
encontramos el caldo nutritivo o el agar nutritivo.
b. Medio enriquecidos: son aquellos medios a los cuales se les han
incorporado sustancias que proporcionan caractersticas complementarias
nutritivas para que el medio pueda servir como sustrato para los
microorganismos ms exigentes. Estos medios, tales como agar sangre, suero
o chocolate en caldo o en agar, se emplean para conseguir el crecimiento de
aquellos microorganismos sensibles que no crecen en medios corrientes.
c. Medios selectivos: son aquellos medios a los que se les incorporan
sustancias para inhibir al crecimiento de la mayor parte de los
microorganismos con excepcin de aquellos para los que fueron ideados, por
ejemplo, el medio telurito para el bacilo productor de la difteria y el agar citrato-
dexosicolato para los grupos de Salmonella sp y Shigella sp.
d. Medios diferenciales: son medios que contienen sustancias o
indicadores que permiten la diferenciacin de un microorganismo a otro. Por
ejemplo, el agar Mac- Conkey permite distinguir los microorganismos
fermentadores de la lactosa de los no fermentadores por la coloracin que
toman. Otro ejemplo claro de estos medios es el agar sangre que permite
distinguir los microorganismos que lisan o producen hemlisis de los eritrocitos
de aquellos que no son, es decir, que al mismo tiempo se pueden distinguir
microorganismos productores de hemlisis alfa, beta o gamma.

e. Medio auxanogrficos: son determinados medios a los que les faltan
ciertos factores nutritivos. El medio, generalmente slido se inocula con un
microorganismo, y luego se distribuye por la superficie discos con diferentes
compuestos nutritivos que puedan requerir los microorganismos en estudio y
de esta manera determinar que nutrientes favorecen o no al desarrollo por el
crecimiento del microorganismo alrededor del disco.
f. Medios para transporte o carriers: son medios slidos o
semislidos que pueden contener o no sustancias selectivas. Se
preparan para detener la viabilidad de los microorganismos durante varias
horas o das, permitiendo de esta manera el aislamiento de las especies menos
resistentes despus de transcurrido cierto tiempo entre la toma de la muestra y
la entrega al laboratorio.

7. MEDIOS DE CULTIVOS COMUNES
Son los ms corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos
todos, s son los ms conocidos en un laboratorio de Microbiologa.
Agar nutritivo
El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para
todo tipo de bacteria. Es muy util porque permanece solido incluso a relativas
altas temperaturas. Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en
la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y aparece como una
sustancia espesa, con colonias difcilmente observables. El agar nutritivo
contiene normalmente (w/v).
10gr Peptona
0.3 % extracto de carne
0.5% NaCl caldo
Leche 50 nutritivo
Suero 25 ml
Agua destilada 9.250 ml
13-15 gr agar agar en bacterias y 18-20 gr en hongos
pH casi neutro (6.8) a 25 C.

Agar C.L.E.D.
El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrlito Deficiente) est recomendado
para el recuento e identificacin presuntiva de los microorganismos de las
vas urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasin de los cultivos
por Proteus.
La presencia de lactosa en su composicin le confiere el carcter de medio
diferencial, aunque la interpretacin sea diferente al anterior medio por la
incorporacin de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias
lactosa positivas aparecern de color amarillo y las lactosa negativas lo
harn con un color verdoso, blanco o azulado.

Agar S.S.

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en
los cuales se sospeche su presencia.



Agar Hektoen
Es un medio ms diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para
facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres
azcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder
diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los grmenes
formadores de SH2, igual que el SS.

Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y
azcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto
a ciertos grmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).

C.P.S. ID3.
Medio cromognico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificacin
de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualizacin del cambio de
color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrn).
La identificacin solo requiere la adicin de un reactivo para confirmar o
descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren
los sistemas de identificacin habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New
GBS: Medios utilizados para deteccin de Streptococcus agalactiae, mediante
la utilizacin de un sustrato cromognico especfico de este microorganismo.


8. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Siempre es recomendable y se incluye como una regla bsica la de leer las
instrucciones de las etiquetas de los medios de cultivo, por ello no se
recomienda reenvasar los medios sino, mantenerlos en los recipientes
originales.
Para lograr una preparacin adecuada de los medios de cultivo es
recomendable seguir las siguientes instrucciones:

Preparacin de la solucin
Los medios de cultivo deben ser mezclados o hidratados en recipientes limpios,
libres de detergente y su volumen debe ser el doble de la cantidad que se vaya
a preparar.
El agua que se utiliza para su mezclado o reconstitucin debe ser destilada o
desmineralizada.
Para su preparacin primero debe calcularse la cantidad total y determinar la
cantidad de los componentes bsicos de los medios que deben ser preparados
con elementos individuales o en el caso de los medios deshidratados pesarse
la cantidad deseada del medio de cultivo, mezclar con aproximadamente la
cantidad del volumen total requerido de agua y agitar vigorosamente hasta
obtener un dilucin homognea, luego agregar el resto de agua para enjuagar
de las paredes del recipiente el material adherido.
Los medios de cultivo que no contienen agar ni gelatinas, (lquidos) pueden ser
disueltos en agua fra o ligeramente caliente. Pero si contienen alguna de las
dos sustancias deben ser calentados hasta ebullicin para solubilizar el agar.
Nunca sobre calentar porque se puede alterar su composicin.
Los medios que presentan turbidez debido a sus componentes insolubles,
deben ser agitados para homogeneizarlos adecuadamente.
Normalmente si se trabaja con agua neutra el pH debe coincidir con el rtulo
del medio comercial, pero si no es as debe corregirse adicionando NaOH
HCl0.1N, a una muestra de volumen conocido y calcular el pH para aadir
cido base en la proporcin correspondiente para lograr el pH adecuado.
Antes de distribuirlo en los recipientes definitivos, enfriar a 50C-60C, ya que el
agar hirviendo es peligroso de manejar, puede rajar el vidrio fro y dar lugar a
condensaciones excesivas. Adems, mezclar bien los componentes
insolubles que en algunos casos son parte integral de la formulacin y deben
ser suspendidos adecuadamente durante su distribucin.


9. ESTERILIZACIN DE MATERIALES
Antes de comenzar desinfectar la mesada de trabajo con etanol 70.
Encender el mechero.
Realizar todos los procedimientos dentro del cono de esterilidad
generado por la llama del mechero.
Evitar toda corriente de aire que pueda distorsionar el rea de esterilidad
cercana al mechero (movimientos bruscos, hablar, toser, puertas o
ventanas abiertas, etc.).
El ansa se esteriliza en forma vertical sobre la llama del mechero antes y
despus de usarla. Recordar dejar enfriar el ansa estril cerca del
mechero antes de usarla.
Rotular siempre las placas y tubos de forma clara.
Al finalizar el trabajo dejar el lugar de trabajo limpio y ordenado.
Se esteriliza por autoclave o por ebullicin de acuerdo a las instrucciones para
cada preparacin. Los tiempos y temperaturas recomendados estn
relacionados con las temperaturas alcanzadas en el medio y el tiempo en el
que se mantengan a la temperatura especificada.
Cuando se esterilizan volmenes grandes de medio se debe aumentar el
tiempo de esterilizacin para permitir la penetracin del calor al interior del
recipiente. Los autoclaves varan en su feribilidad de calor y por
consiguiente, se debe comprobar colocando pares trmicos en los recipientes
del medio o cintas indicadoras de esterilidad.
La capacidad de los recipientes debe ser lo suficiente para permitir un amplio
espacio cuando se sube la espuma.Los cierres de rosca deben estar media
vuelta flojos para permitir el flujo de vapor durante el calentamiento por calor.
Estos cierres se aprietan firmemente cuando se haya completado su
esterilizacin. Lo mismo tapones de algodn y gasa deben estar flojos antes y
apretarse generalmente luego de la esterilizacin.
Los recipientes deben estar libres de lcalis para impedir la alteracin del pH
del producto. No se deben retirar del esterilizador mientras an estn
calientes, puesto que un cambio brusco en la presin de vapor interna de los
recipientes puede dar lugar a ebulliciones explosivas. Todas las instrucciones
que indiquen adicionar un reactivo compuesto estril en el medio despus de
autoclavado, se deben realizar teniendo en cuenta las precauciones aspticas.
Cuando va a adicionar una cantidad importante de enriquecimiento o de inculo
lquido, la cantidad se debe resta al volumen inicial de agua destilada requerido
para la reconstitucin del medio. De esta manera no se altera la concentracin
de los ingredientes de la frmula original, ni tampoco la resistencia del gel de
agar en las preparaciones. Cuando un medio de cultivo con un pH de 5
contiene agar, debe ser manejado con mucho cuidado para evitar la hidrlisis
del agar ya que la mezcla del calor y la acidez disminuyen la esterilidad del gel.
Servido de los medios de cultivo
Una vez estril los medios de cultivo debe ser enfriados a temperatura
promedio de 45 - 55C para ser adicionados en los recipientes finales teniendo
en cuenta nuevamente las tcnicas aspticas.
10. PRUEBA DE ESTERILIDAD DE MATERIALES
Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA
durante 1 minuto en zonas no aspticas (patio, aulas, comedor) y
etiquetarlas.
Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA
durante 1 minuto en zona asptica (cerca del mechero) y etiquetarlas.
Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30C
durante 24-48 horas. Las cajas Petri se colocarn con la tapa hacia
abajo.
Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de
contaminantes, por la aparicin de turbidez, nata superficial y/o depsito
de material en el fondo de los tubos con medio lquido, as como la
formacin de colonias microbianas en la superficie de los medios
slidos.
11. BIBLIOGRAFA

Brook Th. 1999. Biologa de los Microorganismos. 8. Mac Graw Hill.
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Agar_nutritivo
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/salmoshigagar.htm
http://www.panreac.es/pdf/ManualCultimed_completo.pdf
http://www.scharlab.com/docs/ebooks/descargarpdf.php?id=6
http://www.condalab.com/
Negroni, Martha. microbiologa estomatologa 2ed. 2009. Pg. 551 a
560
Seminarios de Microbiologa 1er Bloque Medios de cultivo