DR Sergio Martinez GLZ

UNIVERSI DAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSI TARIO DE I NVESTI GACI ONES
BI OMDI CAS

EL CERDO J OVEN COMO BI OINDICADOR DE
CONCENTRACIONES BAJ AS DE GENOTXICOS, MEDIANTE LA
PRUEBA DE MICRONCLEOS EN ERITROCI TOS DE SANGRE
PERIFRI CA.

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS MDI CAS
PRESENTA
M. en C. SERGI O MART NEZ GONZLEZ

ASESOR BSICO: Dr. en C. OLIVIA TORRES BUGAR N
ASESOR CLNICO: Dr. en C. BENJ AMN TRUJ I LLO HERNNDEZ
Colima, Col.; Enero de 2005.

2

A G R A D E C I M I E N T O S

3

A G R A D E C I M I E N T O

Gracias al apoyo para la realizacin de esta Tesis al consejo de ciencia
y tecnologa del estado de nayarit (COCYTEN), dado la temtica abordada
en el presente es importante para el Estado, ya que actualmente se distribuyen
y aplican grandes cantidades de productos qumicos, principalmente en la
agricultura. Muchos productos tienen efectos colaterales desconocidos, como
son los genotxicos (que daan al DNA) que probablemente ocasionarn
carcinogenesis y/o teratogenesis tanto en animales como en el hombre. Estos
efectos dainos son frecuentes en nuestra comunidad nayarita de causas
especficas hasta el momento desconocidas.

Estos agentes qumicos pueden ingresar directamente, por ejemplo los
plaguicidas, hormonales, medicamentos o sustancias manejadas en el trabajo o
el hogar; otros ingresan indirectamente con los alimentos (de origen animal o
vegetal), bebidas, plantas medicinales, que contienen tales sustancias dainas.
4

A G R A D E C I M I E N T O S

Gracias por el apoyo al Programa para el
Mejoramiento del Profesorado (PROMEP-
SEP), para realizar los Estudios del Doctorado.
Gracias por el apoyo a la Universidad
Autnoma de Nayarit (U.A.N.), as como a la
Unidad Acadmica de Medicina Veterinaria
Zootecnia para realizar los Estudios del
Doctorado.
Gracias por el apoyo al Centro de
Investigaciones Biomdicas de Occidente
(CIBO), en especial al Laboratorio de
Mutagnesis para la realizacin de esta
Tesis.

Gracias por el apoyo a la Universidad de
Colima, especialmente al Centro Universitario
de Investigaciones Biomdicas (CUIB), para
realizar los Estudios del Doctorado.
Gracias por las facilidades otorgadas a:

Dr. En C. Norberto Vivanco Prez
Universidad Autnoma de Nayarit

Dr. En C. Mara de Jess Durn Avelar
Universidad Autnoma de Nayarit
5

Mencin especial para:

DR. En C. BENJAMN TRUJILLO HERNNDEZ
Universidad de Colima

DR. En C. MIGUEL HUERTA VIERA

DR. En C. GUILLERMO ZIGA GONZLEZ
Centro de Investigaciones Biomdicas de Occidente

DR. En C. OLIVIA TORRES BUGARN
Universidad Autnoma de Guadalajara

6

Agradecimiento a:

DR. En C. SERGIO ADRIN MONTERO CRUZ

DR. En C. XCHITL ANGLICA R. TRUJILLO TRUJILLO

DR. En C. RAYMUNDO VELASCO RODRGUEZ

DR. En C. BELINDA GMEZ MEDA

DR. En C. ANA ZAMORA PREZ

M. En C. MARA LUISA RAMOS IBARRA
7

D E D I C A T O R I A S

A mi esposa FABIOLA, por haberme apoyado y
comprendido durante mis ausencias.

A mis hijos: SERGIO ALEJANDRO y
RODRIGO, que son mis tesoros ms grandes y
mi mximo orgullo.
8

INDICE

9

INDICE

TABLA DE CUADROS Y FIGURAS 1
GLOSARI O 3
RESUMEN 5
SUMMARY 6
1.- INTRODUCCIN 7
1.1.- CONTAMINACIN AMBIENTAL Y SUS EFECTOS
GENOTOXI COS 8
1.1.2.- MUTACIONES INDUCIDAS Y ESPONTNEAS 9
1.2.-DETECCIN DE CONTAMINANTES GENOTXICOS 11
1.3.- PRUEBA DE MICRONCLEOS 12
1.4.- FORMACIN DE LOS MI CRONCLEOS 13
1.5.-BIOMONITORES UTILIZADOS 15
1.6. -ERITROPOYESIS EN MAMFEROS 16
1.7.- SELECCIN DE BIOMONITORES. INVESTIGACIONES
SOBRE MI CRONCLEOS. 19
1.8.- AGENTE INDUCTOR- CICLOFOSFAMIDA 23
2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 28
3.- J USTIFICACIN 31
4.- HIPTESIS 33
5.- OBJ ETIVOS 35
6.- MATERIALES Y MTODOS 37
6.1.- DISEO EXPERIMENTAL 38
6.1.2.- DEFINICIN DE VARIABLES 38
6.1.3.-CRITERIOS SELECCIN 38
6.1.4.- SELECCIN DE ANIMALES 39
6.2.- REALIZACI N 40
6.3.- TOMA DE MUESTRAS 40
6.4.- PREPARACIN DE LAS MUESTRAS 40

6.5.- ANLISIS DE LAMINILLAS 42
6.6.- MODELO EXPERIMENTAL 43
10
6.7.- TAMAO DE MUESTRA 44
6.8.- ANLISIS ESTADSTICO 45
6.9.- ASPECTOS TICOS 45
7.- RESULTADOS 46
8.- DISCUSIN 60
9.- CONCLUSIONES 66
10.- BIBLIOGRAFA 68

11

TABLA DE CUADROS Y FIGURAS
Pg.

Figura no. 1- Microncleos en diferentes tejidos. 12
Figura no. 2- Formacin de microncleos. 15
Figura no. 3- Eritropoyesis. 16
Figura no. 4- Eritrocitos 17
Figura no. 5- Funcin del Bazo. 18
Figura no. 6- Formacin de microncleos en eritrocitos. 19
Figura no.7- Eritrocitos de paciente esplenectomizado
con quimioterapia antineoplsica. 20
Figura no. 8- Mecanismo de alquilacin de la guanina de ADN 24
Figura no. 9- Accin de los alquilantes. 25
Figura no. 10- Metabolismo de la ciclofosfamida. 26
Figura no. 11- Realizacin de frotis. 41
Figura no. 12- Eritrocitos de cerdo con tincin con anaranjado
de acridina. 42
Cuadro no. I- Valor basal de Eritrocitos Micronucleados,
Eritrocitos Policromticos Micronucleados y Eritrocitos
policromticos en cerdos jvenes. 47
Figura no. 13- Eritrocitos micronucleados de cerdo. 47
Cuadro no. II- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto
a la ciclofosfamida en dosis nica. 48
Figura no. 14- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto
a la ciclofosfamida en dosis nica. 49
Cuadro no. III- Eritrocitos policromticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica. 50
Figura no. 15- Eritrocitos policromticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica. 51
Cuadro no. IV- Eritrocitos Policromticos en el cerdo expuesto 52
a la ciclofosfamida en dosis nica.
Figura no. 16- Eritrocitos Policromticos en el cerdo expuesto a la
ciclofosfamida en dosis nica. 53
Cuadro no. V- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto a la
ciclofosfamida en dosis continua. 54
12
Figura no. 17- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto a
la ciclofosfamida en dosis continua. 55
Cuadro no. VI- Eritrocitos policromticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua. 56
Figura no. 18- Eritrocitos policromticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua. 57
Cuadro no. VII- Eritrocitos Policromticos en el cerdo expuesto
a la ciclofosfamida en dosis continua. 58
Figura no. 19- Eritrocitos Policromticos en el cerdo expuesto a la
ciclofosfamida en dosis continua. 59

13
GLOSARI O

ADN: cido desoxirribonucleico.

ARN: cido ribonucleico.

Aducto: Los aductos en el ADN se forman cuando un agente qumico altamente reactivo
deficiente de electrones se une covalentemente a un sitio rico en electrones en el ADN
celular. Muchos carcinognicos ambientales ejercen sus efectos adversos a travs de sus
interacciones con el ADN. Los aductos que no son removidos del ADN por los mecanismos
de defensa pueden inducir mutaciones genticas que son transferidas a futuras
generaciones celulares. Si esas mutaciones ocurren en reas especficas del genoma,
como podra ser en genes tumor supresor u oncogenes, en subsecuentes eventos pueden
llevar a la transformacin celular y carcinognesis.

Anafase: Tercera etapa de la mitosis o de la meiosis (I o II) durante la cual los
cromosomas migran hacia los polos opuestos de la clula.

Aneuploidgeno: Agente capaz de producir en la clula que uno o ms cromosomas
completos de un conjunto normal falten o se presenten ms de una vez.

Carcingeno: Cualquier agente que produce cncer.

Centrmero: Pequea masa de cromatina situada en el interior de un cromosoma y a la
que se unen las dos cromtides. El centrmero ocupa una posicin caracterstica en todo
cromosoma. Es la ltima parte del cromosoma que se divide y por medio de la cual se fija
al huso.

Cinetocoro: Es el sitio de fijacin de los cromosomas a los microtbulos del huso durante
la mitosis y la meiosis.
14

Clastgeno: Agente capaz de inducir aberraciones cromosmicas

Cromosoma: Cuerpos constituidos por ADN incluido dentro de una trampa proteica; son
los portadores de la informacin gentica. Se hallan en el ncleo de la clula y pueden
observarse como estructuras intensamente teidas en forma de bastn, durante la
divisin celular.

Esplenectoma: Escisin o extirpacin del bazo

Genotxico: Agente que daa al ADN.

Microncleo: Fragmento o cromosoma completo que por no poseer huso mittico no
puede ser integrado al ncleo, por lo que queda en el citoplasma celular.

Micronucleognico: Agente formador de microncleos.

Mitgeno: Sustancia que estimula la mitosis de las clulas.

Mutacin: Cambio permanente y heredable del material gentico. Definido comnmente
como un cambio en un solo gen (mutacin en un punto), an cuando el trmino se usa
tambin para designar un cambio en el nmero o disposicin de los cromosomas.

Telofase: Perodo de la divisin celular cuando los cromosomas de las clulas hijas
alcanzan los polos de la clula.

15

RESUMEN

El objetivo de la presente tesis fue establecer la respuesta eritrocitaria micronucleada del
cerdo joven (10 a 13 semanas/edad) expuesto a la ciclofosfamida (0.5, 1.0 2.0 y 4.0
mg/Kg), para utilizarlo como un bioindicador de concentraciones bajas de genotxicos.

Utilizamos 50 cerdos de la cruza Landrace/Yorkshire. Estos fueron sometidos a
dos tipos de exposiciones: exposicin 1) ciclofosfamida va oral en dosis nica, y 2)
administracin de ciclofosfamida va oral en dosis continua. Los cerdos fueron divididos
en 5 grupos (n =10). El grupo 1) que fue considerado como grupo control. Y cuatro
grupos de tratamiento con ciclofosfamida; grupo 2) 0.5 mg/Kg, grupo 3) 1 mg/Kg,
grupo 4) 2 mg/Kg y grupo 5) 4 mg/kg. Todos los cerdos fueron sometidos y/o cruzados
a las dos exposiciones (dosis nica o dosis continua) con el mismo tratamiento de
ciclofosfamida. Los animales antes de usarse en la dosis continua tuvieron un tiempo de
lavado de 8 das.
As, en los cerdos inducidos con ciclofosfamida encontramos incrementos significativos en
el nmero de eritrocitos micronucleados (EMN) y eritrocitos policromticos
micronucleados (EPCMN) con la dosis nica en los tratamientos de 0.5 mg/Kg y 4 mg/Kg.
En la dosis continua del tratamiento de 4 mg/Kg de ciclofosfamida, los promedios de
EMN mostraron incremento, as mismo sucedi en el tratamiento de 1 mg/Kg en los
EPCMN.
Los cerdos jvenes (10 a 13 semanas/edad), muestran respuesta eritrocitaria
micronucleognica a la ciclofosfamida, an a dosis ms bajas de las recomendadas
para los roedores en pruebas de dao cromosmico. Por lo tanto, el cerdo puede ser
considerado, como una prueba confiable para detectar agentes genotxicos
micronucleognicos.

16
SUMMARY

The objective of the present thesis was to establish the micronucleated response
erytrocyte from the young pig (age 10 to 13 weeks) exposed to the cyclophosphamide
(0.5, 1.0 2.0 and 4.0 mg/Kg), to use it as a bioindicator of concentrations low of
genotoxic.

We used 50 pigs Landrace/Yorkshire crosses. These were subjected to two types
of expositions: exposition 1) cyclophosphamide oral way in an unique dose, and 2)
cyclophosphamide administration oral way in a continuous dose. The pigs were divided
in 5 groups (n =10). The group 1) was considered as control. And four treatment groups
with cyclophosphamide; group 2) 0.5 mg/Kg, group 3) 1 mg/Kg, group 4) 2 mg/Kg and
group 5) 4 mg/kg. All the pigs were subjected or cruzed to the two expositions (unique
dose or continuous dose) in the same cyclophosphamide dose. The animals before being
used in the continuous dose had a time of washed-out of the drug of 8 days.
This way, in the pigs induced with cyclophosphamide we found significant increments in
the number of micronucleated erytrocyte (EMN) and erytrocyte policromatics
micronucleated (EPCMN) with the unique dose in the treatments of 0.5 mg/Kg and 4
mg/Kg. In the continuous dose of the treatment of 4 cyclophosphamide mg/Kg, the
averages of EMN showed increment, likewise it happened in the treatment of 1 mg/Kg in
the EPCMN.
The young pigs (age 10 to 13 weeks), show response micronucleogenic in the
erytrocytes to the cyclophosphamide, still to lower dose of those recommended for the
rodents to test damage in the cromosomes. Therefore, the pig can be considered, like a
reliable test to detect micronucleogenic genotoxic agents.

17

INTRODUCCIN
18
1.1 CONTAMI NACI N AMBI ENTAL Y SUS EFECTOS
GENOTOXI COS

Diversas actividades realizadas por el hombre as como algunos eventos naturales
contaminan el medio ambiente y debido a la liberacin de agentes potencialmente txicos
y genotxicos, actualmente constituye una preocupacin mundial por los riesgos que
conlleva para la salud humana y los ecosistemas
1
.
As el medio ambiente se ve contaminado debido a que se vierten un sin nmero de
agentes fsicos y qumicos derivados de diversas actividades como es la generacin de
energa, industria, siderurgia, agricultura, qumica y por supuesto la farmacologa.
Aunado a esto, tambin son fuente de contaminacin algunos proceso naturales como
erupcin de volcanes, inundaciones, gases producidos por pantanos, entre otros
fenmenos
2, 3
.
Desafortunadamente, el desarrollo de la sociedad moderna se basa en la generacin
de una gran cantidad de sustancias qumicas, muchas de las cuales ocasionan dao a los
seres vivos, y entre ellos al hombre. Este dao puede incluir no slo los efectos a corto
plazo como quemaduras, intoxicaciones y alergias, sino tambin efectos de largo plazo
como el cncer y daos genticos en las generaciones futuras. Desgraciadamente la
rapidez con la que se generan estas sustancias supera con mucho la velocidad con la
que se diagnostican sus efectos sobre los seres vivos, por lo que resulta de suma
importancia conocer cules son estas sustancias y evaluar sus efectos sobre la salud, y
por ende es vital la implementacin de nuevos mtodos, modelos y biomonitores que
ayuden en esta difcil tarea
4,5
.

Desde 1969 en respuesta al gran inters por investigar la mutagnesis ambiental, los
objetivos fueron claramente enfocados en tres reas: la definicin del rango de efectos
producidos en el humano por los mutgenos, el desarrollo de mtodos confiables para la
deteccin de los mismos y la elucidacin de mecanismos de dao cromosmico y
mutaciones gnicas
6.
19
Dentro de los mltiples efectos de los contaminantes se encuentra el efecto
genotxico expresado en sus diversas formas, como por ejemplo teratognesis,
mutagnesis y por supuesto la cancerognesis.
Por lo tanto un agente genotxico es todo aquel ente capaz de lesionar la integridad
del material gentico y/o sus componentes asociados, entonces, bajo este trmino se
incluyen los agentes que interaccionan directa o indirectamente con el ADN provocando
el aumento de mutaciones (mutagnesis), tambin los que interfieren en algunos
procesos enzimticos as como en la reparacin o en la gnesis del material proteico
involucrado en la segregacin cromosmica
7
. Es importante sealar que los compuestos
genotxicos afectan con mayor frecuencia a las clulas normales que proliferan
rpidamente como son las clulas epiteliales y de mdula sea, por lo tanto, existe un
gran nmero de clulas susceptibles a estos efectos dainos
8
.

1.1.2. Mutaciones Inducidas y Espontneas

Se reconoce que el ADN es portador de la informacin gentica y tienen la capacidad
de sufrir alteraciones ocasionales, las cuales, pueden ser heredadas en forma estable y
predecible, estos cambios explican las variaciones hereditarias y la diversidad que se
encuentran en el mundo biolgico
9-10
.
Sin embargo, muchos contaminantes son capaces de inducir cambios permanentes y
heredables en el ADN (mutacin) con una frecuencia superior a la que ocurre de manera
espontnea (mutagnesis), si bien es cierto que las mutaciones pueden tener lugar por
agentes endgenos
10
.
Las mutaciones espontneas son producidas en ausencia de un mutgeno conocido,
estas se generan por situaciones o agentes propios del ambiente intracelular. Estas
mutaciones pueden originarse por errores en la replicacin o bien por reacciones que
ocurren de forma espontnea como consecuencia de la inestabilidad qumica de la
molcula de ADN o de la accin de subproductos del metabolismo celular, denominados
mutgenos endgenos
7, 10-12
.
20
Las mutaciones inducidas o exgenas son producidas por agentes fsicos, qumicos o
biolgicos ajenos a la clula, y estos son denominados mutgenos exgenos
7, 10-12
.
La lista de estos agentes mutgenos es muy grande, y los mecanismos y efectos
producidos son muy diversos; algunos actan como mutgenos directos y otros requieren
ser activados a carcingenos activos por la accin de ciertas enzimas, por ejemplo
7, 10-12
:
1) Agentes alquilantes transfieren grupos, generalmente metilo o etilo, a un tomo
nucleoflico de las bases nitrogenadas,
2) Anlogos de base, los que al insertarse entre los pares de bases del ADN,
distorsionan su estructura helicoidal lo que provoca el desplazamiento del marco de
lectura.
3) Agentes bifuncionales establecen enlaces cruzados entre bases de la misma hebra o
de hebras opuestas. Tales alteraciones afectan la integridad y/o configuracin
bioqumica del ADN y que al no ser corregidas antes de la replicacin, por el sistema
de reparacin, conducen a una mutacin potencialmente cancergena.

Las mutaciones pueden ocurrir en las clulas somticas o gamticas; cuando el dao
se produce durante la gestacin, el agente se convierte en un teratgeno
7
, y cuando se
presentan en las primeras, se relacionan con la aparicin de cncer ya que dichas clulas
adquieren el estado transformado debido al aumento de la frecuencia de mutaciones,
caracterstica principal de un proceso cancrigeno
4
.
Es evidente que un efecto mutagnico podra llevar a un evento cancrigeno, aunque
no es imperativo, o bien a un deterioro progresivo de la salud. De tal suerte, la
correlacin entre mutagenicidad y carcinogenicidad cada da es ms aceptada porque se
demostr que de 175 carcingenos conocidos, 157 (90 % aproximadamente) son
mutgenos, lo que permite identificar con claridad la relevancia de saber con precisin el
posible dao que un compuesto puede tener sobre un organismo
13
.
Por lo anterior, es importante detectar las sustancias mutgenas, pues como ya se
mencion tienen la capacidad de alterar el material gentico de los organismos
incluyendo al hombre, provocando mutaciones en clulas somticas con el desarrollo
subsiguiente de cncer, o teratognesis
10
.
21
Una maniobra primaria para evitar el incremento de la contaminacin ambiental, sera
conocer el tipo y efecto de los contaminantes sobre los seres vivos, para posteriormente
formar leyes que regulen el manejo, tratamiento y liberacin de estas sustancias.

1.2.-DETECCIN DE CONTAMI NANTES GENOTXI COS

En toxicologa gentica se acepta que una sola prueba no puede detectar con
exactitud o predecir en forma confiable los efectos genotxicos de una sustancia en el
humano
14
. Por eso es importante disponer de diversas alternativas de estudios tanto in
vivo como in vitro para probar genotxicos. Dado que el anlisis de los contaminantes de
manera directa requiere de gran precisin y de un conocimiento amplio de agente
qumico que se va verificar y de que su evaluacin es limitada por su sensibilidad y
especificidad del mtodo utilizado
15
es que actualmente se conoce un gran nmero de
pruebas con las que se puede determinar el dao gentico.
Estas se pueden realizar in vivo o in vitro, con micro o macro organismos
16-17
. Entre
estas se encuentran una variedad de pruebas entre las que existen algunas muy
econmicas y rpidas, pero tambin las hay sumamente costosas: Entre ellas tenemos el
cariotipo, el intercambio de cromtides hermanas, el ndice mittico, la prueba realizada
en Salmonella typhimurium o prueba de Ames y la prueba de microncleos
11,17-20
.

1.3 PRUEBA DE MICRONCLEOS

La prueba de microncleos, es un mtodo ampliamente utilizado para la deteccin del
dao genotxico producido por diferentes sustancias qumicas y agentes fsicos. Esta
indica el dao de agentes mutagnicos sobre los cromosomas mediante la identificacin
de fragmentos acntricos y/o cromosomas rezagados
21-23
. Los microncleos son
22
fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que espontneamente o por causa
de agentes genotxicos, quedan fuera del ncleo durante la divisin celular
24
. En
hematologa los microncleos se conocen como cuerpos de Howell-J olly, su forma es
generalmente redonda o almendrada y alcanza un dimetro entre 0.4 a 1.6 micras
(Figura 1)
21-24
.

La prueba de microncleos permite detectar agentes clastognicos y aneuploidognicos. Los ag

aneuploidognicos (como colchicina, vincristina y vinblastina), se caracterizan por
bloquear la polimerizacin de microtbulos durante la formacin del huso mittico,
originando de esta manera el rezago de cromosomas completos, que no se incluyen en
los ncleos hijos. Mientras que los agentes clastognicos como son las radiaciones y
algunos medicamentos antineoplsicos (como la ciclofosfamida, la arabinosa-c, el
busulfan y el metotrexate), actan como anlogos de base, por lo tanto se intercalan en
a
c
d
b
Figura 1 a) MN en mdula sea de ratn b) MN en eritrocito de aves
c) MN en queratinocitos de ambystoma d) MN en mucosa bucal humana

a
A
b
c d
23
el ADN, e inhiben su sntesis y ocasionan posteriormente un debilitamiento de enlace
entre las bases, lo que termina por producir una fractura cromosmica. Los compuestos
aneuploidognicos causan microncleos ms grandes que los causados por los agentes
clastognicos
25
. Se pueden diferenciar unos de otros por la presencia del centrmero y/o
cinetocoro mediante la tcnica de FISH (hibridacin in situ fluorescente), ya que si los
microncleos presentan centrmero generalmente estar formado por un cromosoma
completo (microncleo centrmero positivo) de lo contrario estar formado por un
fragmento cromosmico acntrico (microncleo centrmero negativo)
26-27
.

1.4. FORMACIN DE LOS MICRONCLEOS

Los cambios ms frecuentes en el ADN son la sustitucin de una base por otra y las
deleciones o prdidas de secuencias, si bien las deleciones pueden ser bien de una o dos
pares de bases hasta deleciones de cientos de kilobases
11-12, 28
.

Normalmente, tras la ruptura de la cadena de ADN los extremos resultantes se suelen
unir rpidamente por la accin de enzimas de reparacin. La rotura puede ocurrir en un
solo punto o en dos puntos y si no se repara el fragmento o fragmentos que no contienen
el centrmero se perder en la siguiente divisin celular. El centrmero se puede
considerar el centro cintico del cromosoma, pues sobre l se sitan las estructuras
llamadas cinetocoros, a las cuales se unen las fibras que constituyen el huso acromtico o
huso mittico. Estas fibras o filamentos formados por microtbulos son de naturaleza
proteica, que sirven como rieles en el huso mittico durante la separacin de las dos
cromtides en la divisin celular. De esta forma se produce la segregacin ordenada de
los cromosomas y cada clula hija recibe una cromtide de cada cromosoma, es
decir, idntica dotacin gentica
11-12, 28
. La ausencia de centrmero (cromosoma
acntrico) impide que el cromosoma se una al huso mittico y, por lo tanto, que se
incluya en el ncleo de las clulas hijas
11-12, 28
.

24
De acuerdo a lo anterior, los microncleos pueden ser formados durante la transicin
de metafase/anafase de la mitosis, durante la divisin celular etapas en las cuales ocurre
la separacin de cromtides .

Son reconocidos dos mecanismos por los cuales se pueden formar los microncleos
(Figura 2)
23
:

1).-Prdida mittica de fragmentos acntricos.

Es considerado el mecanismo clsico, donde cualquier fragmento cromosmico que
no posea centrmero no podr integrarse a un ncleo, pues carece del elemento
indispensable para orientarse en el huso acromtico. Despus de la telofase los
cromosomas normales, as como los fragmentos que posean centrmero, darn origen a
los ncleos de las clulas hijas regulares. Los elementos rezagados quedarn incluidos en
el citoplasma de las clulas hijas y una considerable proporcin es transformada en uno o
varios ncleos secundarios que son como regla mucho ms pequeos que el ncleo
principal y de ah su nombre de microncleo.

25
2).- Prdida mittica de cromosomas completos.

Esto sucede cuando se daa el funcionamiento del aparato mittico, por ejemplo:
bajo la influencia de la colchicina, el ncleo principal es algunas veces reemplazado por
un grupo de pequeos ncleos, los cuales son en general considerablemente ms
grandes que el tpico microncleo; esto es debido a que cromosomas completos son los
que constituyen a estos microncleos.

1.5.-BIOMONITORES UTILIZADOS

La prueba de microncleos es ampliamente aceptada y es posible utilizarla in vivo e
in vitro en diversas
11
, as como en especies de laboratorio
24, 29-30
y silvestres
31-34
entre
ellos se encuentra al humano
35-38
, rata
23
, ratn
24,39
, hmster
24
, primates
39
, anfibio
40-41
,
aves
42
, peces
43
, moluscos
15
, y en gran variedad de tejidos como: sangre perifrica
31-34, 44-
46
, reticulocitos de la mdula sea
17,35
linfocitos
46
, hepatocitos
24
y en clulas de mucosa
bucal
37-38,47
.
Clastgeno
Aneuploidgeno
Telofase
Figura 2.- Formacin de Microncleos.
26
Por otra parte tambin es posible aplicar esta tcnica en plantas, ya que tambin
pueden ser biomonitores de agentes genotxicos micronucleogenicos, este es el del haba
y la cebolla (Vicia faba, Allium cepa) en la que se utilizan los meristemos de la raz para la
observacin de los microncleos, o Tradescantia en la que se utiliza el polen
48-56
.

1.6. ERITROPOYESIS EN MAMFEROS

La produccin de eritrocitos (eritropoyesis), se inicia con la clula tronco-eritroctica
que se origina a partir de una clula tronco pluripotencial. La clula de la serie roja ms
joven, identificable por sus caractersticas morfolgicas, en la mdula sea es el
prenormoblasto, que madura a normoblasto, el cual pasa por tres estadios de
maduracin, el normoblasto bsofilo, el policromtico y el ortocromtico (Figura 3).

Eritroblasto
con microncleo
Figura 3. Eritropoyesis
27
El normoblasto ortocromtico, 5 horas despus de la ltima mitosis expulsa su ncleo,
proceso que incluye aproximacin a la periferia y finalmente aislamiento y liberacin del
mismo. Los normoblastos pierden su ncleo al pasar de la mdula sea al torrente
circulatorio, debido a que los poros entre las clulas endoteliales de los sinusoides
medulares tienen un dimetro menor que el ncleo del normoblasto por lo que al
atravesar dichos poros, la membrana y el citoplasma, que son deformables, pasan
fcilmente, pero el ncleo queda atrapado. La membrana se desgarra pero es reparada,
el ncleo expulsado queda en la mdula y es fagocitado por los macrfagos del estroma
medular
10, 52
.

Al perder su ncleo, el normoblasto ortocromtico se convierte en reticulocito
(eritrocito policromtico, Figura 4a), que es el eritrocito joven que sale a la circulacin.
Los eritrocitos policromticos tardan aproximadamente 48 horas para convertirse en
eritrocitos maduros (eritrocitos normocromticos, Figura 4b), y es a medida que aumenta
el contenido de hemoglobina, el citoplasma se vuelve menos azul y ms rojo.

Los eritrocitos policromticos constituyen aproximadamente 1% del total de la masa
eritroctica circulante, y el 99 % restante son eritrocitos normocromticos. Sin embargo
b a
Figura 4. Eritrocitos 4a) Reticulocitos, 4b) Eritrocito
ti
28
existen especies como los equinos, los bovinos, ovinos y caprinos en los que no se
observan en circulacin perifrica los eritrocitos policromticos, debido a que la vida
media del eritrocito es prolongada y el reticulocito madura en la mdula sea. La vida
media de los eritrocitos que dura en circulacin en algunos mamferos es la siguiente: en
el caballo (145 das), en la vaca (160 das), en la oveja (120 das), en la cabra (125 das
), en el perro (110 das), en el gato (68 das), en el cerdo (63 das), en el conejo (48
das), en el pollo (20 das), en la rata (48 das), en el ratn (25 das) y en el humano es
de 120 20 das
52
.
Las clulas del sistema reticuloendotelial destruyen los eritrocitos viejos, malformados
o con inclusiones. Estas clulas, conocidas tambin como histiocitos, macrfagos o
clasmatocitos, varan en tamao, aspecto y localizacin, poseen la propiedad de ingerir
materia particulada. Las clulas reticuloendoteliales incluyen a las clulas estrelladas o de
Kupffer que se encuentran en las paredes de los senos sanguneos del hgado, a otras
clulas similares del bazo y a ciertas clulas de la mdula sea y de los ganglios linfticos.
La mdula sea roja es el principal sitio de destruccin de eritrocitos en la mayora de los
animales domsticos; mientras que en el humano es el bazo el mas importante; y lo es
menos importante en los conejos y en el cobayo; mientras que en las aves el hgado
parece ser el sitio principal de destruccin de eritrocitos daados (Figura 5)
53
.
Es imprescindible sealar que en los mamferos, despus de que el eritroblasto
expulsa su ncleo para convertirse en eritrocito (aproximadamente cinco horas despus
de completar la ltima
mitosis), por razones no
conocidas los microncleos
permanecen en el
citoplasma de los eritrocitos
jvenes y es cuando es
posible visualizarlos (Figura
6)
24
.

Figura5 FuncinDel Bazo
29

Figura 6. Formacin de
Microncleos en Eritrocitos

1.7. SELECCIN DE BIOMONITORES. INVESTIGACIONES SOBRE
MICRONCLEOS.

Los microncleos estn presentes espontneamente en diferentes clulas, en el caso
de los eritrocitos varan desde 0 hasta 28 eritrocitos micronucleados dependiendo de la
especie y para el caso del humano en funcin de su condicin de esplenectomizado o
no
31-34
.
La presencia de los microncleos, se ha observado en algunos animales cuyo control
de calidad que ejerce el sistema reticuloendotelial, principalmente el bazo, es menor y por
tanto, cuando estos organismos son expuestos a genotxicos micronucleognicos, los
eritrocitos micronucleados se incrementan de manera significativa y pueden ser
organismos con caractersticas de bioindicadores naturales
30
.
En el humano en condiciones normales el nmero de eritrocitos con microncleos
espontneos en sangre perifrica es casi cero por cada 10,000 eritrocitos
35
y se ha
30
demostrado que aun recibiendo drogas genotxicas antineoplsicas con conocida
micronucleogenicidad, el valor de eritrocitos micronucleados en sangre perifrica no se
eleva de manera importante, debido a la eficiencia del bazo para eliminar los eritrocitos
daados
21
.
Sin embargo, en pacientes esplenectomizados se incrementa el nmero de eritrocitos
micronucleados de manera significativa a valores de 29.5 5.8/10,000 eritrocitos y si en
estas condiciones los pacientes se exponen a un genotxico propio de su tratamiento
mdico este valor se incrementa hasta 65 17.7/10,000 eritrocitos
35
(Figura 7).

Por lo tanto, la esplenectoma puede ser utilizada como una herramienta en especies
en las que el bazo es el responsable de eliminar a los eritrocitos micronucleados de la
circulacin
17
.
En otros animales como el conejo, se encontr un valor basal de eritrocitos
micronucleados, bajo el cual no se increment con inductores micronucleognicos,
aunque tampoco con la esplenectoma en presencia de inductores; esto indica que en
ausencia del bazo otros rganos como el hgado pudieran suplir la funcin del bazo
10
.
As mismo, en estudios con hmster, gerbo y rata expuestos a la colchicina (0.26 mg/kg)
Figura 7. Eritrocitos de Paciente Esplenectomizado con Quimioterapia
Antineoplsica
31
y a la arabinosa C (6 mg/kg) durante cuatro das, no se encontr incremento de
eritrocitos micronucleados; sin embargo al extirparles el bazo hubo un incremento
significativo en el nmero de eritrocitos micronucleados
10
.
En el ratn se presenta un nmero importante de eritrocitos micronucleados
espontneos y se recomienda usarlo como un biomonitor de genotxicos mediante el
conteo de eritrocitos policromticos y reticulocitos en pruebas a corto tiempo y de
exposicin aguda a genotxicos
54
.
La frecuencia de aparicin de microncleos en eritrocitos provenientes de sangre
perifrica y en eritrocitos de la mdula sea se han evaluado en cuatro especies
domsticas bovinos, ovinos, porcinos y equinos. La comparacin entre estas cuatro
especies demostr que la frecuencia en las ovejas y en el caballo es perceptiblemente
ms alto el nmero en sangre perifrica que en mdula, mientras que en bovinos es ms
alta la frecuencia en eritrocitos procedentes de la mdula, sin embargo, en cerdos la
diferencia no es significativa. Estos resultados podran indicar que en el bovino y en el
cerdo el bazo est implicado en el retiro de eritrocitos de la circulacin perifrica
55
.
En un estudio realizado para determinar la frecuencia de eritrocitos micronucleados
en 35 especies de mamferos con el objetivo de seleccionar a aquellas que presenten el
mayor nmero de stos, para proponerlos como probables biomonitores de dao
genotxico mostr que las especies con valores ms altos por cada 10,000 eritrocitos son
el ratn con 21.4 6.5, la jirafa con 18.0 0.0, el gato con 8.4 2.5, el gato siams
con 11.0 0.9, el gerbo con 9.4 1.3, el hmster con 6.3 1.0, la zarigeya con 7.5
0.0 y el cerdo con 6.9 4.0
32
. Investigaciones en sangre perifrica de gatos expuestos a
colchicina y arabinosa C, durante cuatro das en el estudio de la induccin de
microncleos demuestran un incremento significativo de eritrocitos microncleados
30
.
Tradicionalmente, se exponen a los probables biomonitores una vez a un genotxico
conocido y se toman muestras 24 y 48 horas despus, debido a que los eritrocitos
policromticos aparecen en la circulacin en este tiempo; su aparicin o presencia indica
la certeza de que los eritrocitos policromticos micronucleados son originados por la
exposicin al agente probado
7
.

Los eritrocitos policromticos son los eritrocitos jvenes
que posteriormente maduran a eritrocitos normocromticos y por esta razn, cuando son
32
expuestos a genotxicos en forma continua, es notable el incremento de eritrocitos
micronucleados, por su acumulacin
35
.

En un estudio hecho en cerdos jvenes (16-18 semanas) se encontr incremento
significativo de eritrocitos policromticos micronucleados en sangre perifrica inducidos
con diferentes grados de rayos X, demostrando as que es factible usar al cerdo para
llevar a cabo la prueba de microncleos con el fin de estimar daos citogenticos as
como para valorar el efecto de compuestos potenciales de genotoxicidad
56
, por otro lado
tambin se demostr que los cerdos ( 5 semanas de edad) reflejan de manera eficiente el
efecto de potentes micronucleognicos en reticulocitos, sin embargo, a esta edad
presentan el inconveniente de tener una produccin de eritropoyesis inestable que
interfiere con la interpretacin de resultados
57.

El valor basal de eritrocitos micronucleados encontrados en cerdos jvenes (5
semanas) es de 17.8 8.38/10,000 eritrocitos que difieren con los obtenidos en cerdos
adultos (25 semanas) de 6.9 4/10,000
13, 34
, esta diferencia tan marcada de eritrocitos
micronucleados entre animales jvenes y adultos, concuerda con los resultados
obtenidos en estudios con ardillas y gatos jvenes comparados con adultos
30,33
.
En tanto, el valor basal de los eritrocitos policromticos micronucleados en cerdos de
6 a 7 y de 16 a 18 semanas se encontraron valores de 3.55 3.0 y 1.76 1.0
respectivamente
56, 34
.
Por otra parte, estudios en nios prematuros, as como en ratas, conejos, cerdos,
perros y gatos lactantes tienen un nmero espontneo de eritrocitos micronucleados
debido a que el sistema retculo endotelial es inmaduro a esta edad, por lo contrario en
los animales y en el humano los eritrocitos micronucleados espontneos disminuyen al
aumentar la edad, lo cual pudiera deberse a la maduracin del sistema retculo endotelial
y por lo tanto una mayor eficiencia en la eliminacin de clulas con inclusiones
eritrocitarias
34
.

33
1.8.- AGENTE INDUCTOR- CI CLOFOSFAMIDA

La ciclofosfamida es un compuesto cclico, fosforado, con un grupo amino, es derivada
de la mostaza nitrogenada, por lo tanto es un agente alquilante que forma enlaces
covalentes con el ADN
29
.

Los principales efectos citotxicos y mutagnicos de los agentes alquilantes son
resultado de sus interacciones con el ADN. Estos agentes son capaces de formar iones
de carbono positivamente cargados que reaccionan con los grupos nuclefilos, como el
fosfato (PO
4
), sulfhidrilo (SH), amino (NH
3
), hidroxilo, carboxilo e imidazol en los
cidos nucleicos y en las protenas relacionadas al ADN
58
. El tomo N7 de la guanina es
particularmente susceptible a la formacin de enlaces covalentes con los agentes de
alquilacin monofuncionales y bifuncionales, (Ver Figura 8). Sin embargo, hay que
advertir que pueden ser alquilados en menor grado otros tomos en las bases de purina y
pirimidina de DNA, como seran los nitrgenos 1 y 3 de adenina, el nitrgeno 3 de
citosina y el oxgeno 6 de guanina, as como los tomos de fosfato en las cadenas de
DNA y las protenas en relacin con el ADN
8, 58, 28
. Estas interacciones tal vez se
presentan en una o ambas cadenas de ADN mediante la unin entrecruzada, ya que la
mayor parte de los agentes alquilantes son bifuncionales

34
Figura 8- Mecanismo de Alquilacin de la Guanina de ADN.

Una bis(cloroetil) amina forma un ion etilemonio y
un ion carbonio que reacciona con una base como
el N7 de la guanina en el ADN, produciendo una
purina alquilada. La alquilacin de un segundo
residuo de guanina, mediante el mecanismo
ilustrado, resulta en el entrecruzamiento de las
cadenas de ADN.
35
(grupo bicloroetil), contando con dos grupos reactivos
que interactan con dos bases opuestas (Ver Figura 9).
Esta reaccin del ADN con estas sustancias produce
aductos, que son las biomolculas modificadas por los
metabolitos mediante enlaces covalentes a las bases,
azcares y el fosfato. Siendo el sistema de reparacin de
dao del ADN por escisin de nucletidos y de bases, el
que elimina la regin daada produciendo una rotura de la cadena de ADN y por ltimo
se restituye ADN intacto, de secuencia correcta
2, 18, 23, 52
. Sin embargo, como
consecuencia de la alquilacin del ADN puede producirse el dao celular a partir de la
rotura de una sola cadena y el entrecruzamiento del ADN, lo cual interfiere en la
divisin celular
59
. La ciclofosfamida es una pro-droga inactiva que sufre activacin
metablica en el hgado a un metabolito intermediario (aldofosfamida), por el sistema de
las oxidasas del citocromo P-450, posteriormente se transporta por el sistema circulatorio
a los sitios de accin, penetra por difusin a la clula, lugar donde el metabolito activo se
enlaza, generndose dos metabolitos con propiedad citotxica, mostaza de fosforamida y
acrolena
59
. Segn se piensa, la primera es la que posee los efectos antitumorales y/o
mutgenos; la segunda, la que ocasiona la cistitis hemorrgica (Figura 10)
8, 11, 59
.

La actividad antitumoral de la ciclofosfamida depende de su biotransformacin en
mostaza de fosforamida y acrolena (Figura 10). Estas formas activas alquilan o se unen
en diversas estructuras intracelulares, como los cidos nucleicos. Aun cuando no se
conocen detalles del proceso, su accin citotxica final depende de la formacin de
enlaces cruzados con las cadenas de DNA y RNA, y de la inhibicin de la sntesis de
protenas
53
. Como agente antineoplsico alquilante, por su accin forma parte del grupo
de compuestos denominados clastgenos, los cuales durante la mitosis, pueden
intercalarse en el ADN, inhibir su sntesis y ocasionar posteriormente un debilitamiento de
enlaces, que terminan por producir una fractura cromosmica
23
.

Figura 9. Accin de los
36

Figura 10- Metabolismo de la Ciclofosfamida.

La ciclofosfamida se absorbe bien por va bucal aunque se puede administrar
intravenosa e intramuscular. Por la va oral el nivel plasmtico mximo se observa en una
CICLOFOSFAMIDA
4-hidroxiciclofosfamida
Enzimtica
aldofosfamida
No enzimtica
Aldehido deshidrogenasa
SISTEMA DE
CITOCROMO P450
HEPATICO
4-cetociclofosfamida
Carboxi-fosfamida
Acrolena
METABOLITOS INACTIVOS METABOLITOS TXICOS
Mostaza de
fosforamida
Orina Unin a ADN
37
hora y la vida media plasmtica es de unas siete horas. Una vez administrada la
ciclofosfamida es eliminada del plasma sanguneo en un 50% en las primeras 3 a 11
horas. El frmaco es excretado por la orina en un 66% aproximadamente; y el 25% de
la ciclofosfamida se elimina sin cambios
58-60
. Las dosis recomendadas de ciclofosfamida
en humanos como nica dosis es entre 40-50 mg/Kg va oral
60
; tambin puede
administrarse 4 mg/Kg/da durante 14 das
8
; as como 3.5 mg/Kg/da va oral por 10 das
y 16 mg/kg/da va oral durante 5 das
59
. Tambin se aplica a adultos 2 a 4 mg/Kg/da va
oral por 10 das y a nios de 2 a 8 mg/kg/da va oral por 6 das
60
.
En perros se recomienda utilizar la ciclofosfamida a dosis de 1.1-4.4 mg/Kg cada 24
horas, durante 6 das
61
.
Por otra parte, se ha descrito ampliamente en la literatura el efecto de la
ciclofosfamida en especies como la rata y el ratn, dejando claro que la dosis que se
requiere para poder utilizar este compuesto como control positivo en pruebas de dao
cromosmico. La ciclofosfamida es un compuesto con conocido efecto micronucleognico,
por lo que es utilizado en experimentos para observar incremento de clulas sanguneas
microncleadas, inducir aberraciones cromosmicas y como control positivo se aplica a
ratas y ratones dosis de 5, 10 y 20 mg/Kg incluso dosis de 50 y 100 mg/Kg
17, 39, 62
.
En un trabajo previo (tesis de maestra) realizado en cerdos jvenes de cinco semanas
de edad al exponerlos a dosis de 10 y 20 mg/Kg de ciclofosfamida, observamos que los
eritrocitos policromticos disminuyen por la citotoxicidad en su sistema mieloide, en
cambio con 5 mg/Kg los eritrocitos policromticos microncleados se incrementan
significativamente
57
.

38

PLANTEAMIENTO
DEL
PROBLEMA

39
La contaminacin con el paso del tiempo va en aumento, por otra parte da con da
son muchos los qumicos que aparecen en el mercado, y la rapidez con la que se generan
supera con mucho la velocidad con la que se diagnostica sus efectos sobre los seres
vivos
11
, por lo que es importante implementar alternativas para su deteccin y en forma
particular, la determinacin de aquellos agentes que producen dao a nivel cromosmico
y que pudieran ms tarde conducir al desarrollo de tumores o fallas en la transmisin de
la informacin gentica.
Por esto, es que nos hemos dado a la tarea de buscar nuevos biomonitores de
agentes genotxicos bsicamente micronucleognicos
32-38,
de entre los cuales se
encuentra el cerdo debido a que presenta las caractersticas ideales para ser utilizado
como tal
32, 34, 57
. En la literatura se destaca que es un organismo que al ser expuesto a la
radiacin permite fcilmente detectar el dao micronucleognico tanto in vivo como in
vitro
46, 56
. Adems, nosotros ya describimos que la frecuencia espontnea de
microncleos esta directamente relacionada con la edad del animal como se ve
continuacin
32, 34, 57
.

Edad
Frecuencia de MN
en 10, 000 eritrocitos

J venes, (5 semanas)

17.8 8.38, espontnea
Adultos 6.9 4.0, espontnea

Sin embargo, encontramos que en animales jvenes (5 semanas de edad) sufren
mielodepresin al exponerlos a genotxicos an a dosis bajas (10, 20 y 30 mg/Kg) de las
recomendadas para los roedores
14, 34
, y por lo tanto disminuye la eritropoyesis y por ende
no podramos observar incremento en la frecuencia de microncleos, por otra parte
tambin observamos que cerdos de la misma edad si respondieron satisfactoriamente a la
induccin de EPCMN al ser expuestos a 5mg/Kg de ciclofosfamida.
Estos datos nos indican que el cerdo joven podra ser un excelente biomonitor de
concentraciones mas bajas de genotxicos que las citadas en la literatura para otros
bioindicadores micronucelognicos.
40
Por lo tanto nos preguntamos Si en el cerdo de 10 13 semana de edad se
incrementa la frecuencia de eritrocitos micronucleados cuando se expone al organismo a
concentraciones bajas de ciclofosfamida (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg /Kg)?.

41

J USTIFICACIN
42
En toxicologa gentica se acepta el hecho de que una sola prueba no puede detectar
con exactitud o predecir con confiabilidad los efectos genotxicos de una sustancia en el
ser humano
14
. Ante esto es que se han implementado diversos modelos, a los cuales se
les induce con altas dosis de genotxicos conocidos para demostrar su eficacia, pero
muchas veces en la realidad frecuentemente algunos grupos de personas se ven
expuestos de manera continua a concentraciones casi imperceptibles de compuestos
genotxicos, como es el caso del personal responsable de preparacin y aplicacin de la
quimioterapia antineoplsica, de aquellos encargados de agroqumicos, as tambin los
trabajadores de industrias o incluso el mismo ambiente de las ciudades, entre otros.
De tal suerte que contar con un modelo biolgico que nos permita detectar
rpidamente dichos compuestos sera el primer paso para prevenir futuros daos al ser
humano irreversibles.
43

HIPTESIS
44
En el cerdo de 10 13 semana de edad se incrementa la frecuencia de eritrocitos
micronucleados cuando se expone al organismo a concentraciones bajas de
ciclofosfamida (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg /Kg).

45

O
O
B
B
J
J
E
E
T
T
I
I
V
V
O
O
S
S
46
OBJ ETIVO GENERAL

Establecer la respuesta eritrocitaria micronucleada del cerdo joven (10 a 13
semanas/edad) expuesto a la ciclofosfamida (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg /Kg), como un
bioindicador de concentraciones bajas de genotxicos micronucleognicos.

OBJ ETIVOS PARTICULARES

1. Determinar el valor basal de eritrocitos micronucleados (EMN) en 10,000
eritrocitos (E), eritrocitos policromticos micronucleados (EPCMN) en 1,000
eritrocitos policromticos (EPC) y eritrocitos policromticos (EPC) en el cerdo
joven.

2. Inducir incremento de EMN/10,000 eritrocitos y EPCMN/ 1,000 EPC en cerdo
joven expuesto a dosis nica de ciclofosfamida a diferentes concentraciones.

3. Inducir incremento de EMN/10,000 eritrocitos y EPCMN/ 1,000 EPC en cerdo
joven expuesto a dosis continua/24h/4das de ciclofosfamida a diferentes
concentraciones.

4. Comparar el valor basal vs inducido de EMN/10,000 eritrocitos, EPCMN/ 1,000
EPC y EPC/ 1, 000 eritrocitos de los en cerdo joven expuesto a dosis nica de
ciclofosfamida a diferentes concentraciones.

5. Comparar el valor basal vs inducido de EMN/10,000 eritrocitos, EPCMN/ 1,000
EPC y EPC/ 1, 000 eritrocitos en cerdo joven expuesto a dosis
continua/24h/4das de ciclofosfamida a diferentes concentraciones.

47

M
M
A
A
T
T
E
E
R
R
I
I
A
A
L
L
E
E
S
S

Y
Y

M
M
T
T
O
O
D
D
O
O
S
S

48
6.1 DISEO EXPERIMENTAL

6.1.1.- Tipo de estudio: Experimental
Por la captacin de la informacin: Prospectivo.
Por el fenmeno en el tiempo: Longitudinal.
Por la presencia de un grupo control: Comparativo.

6.1.2.- DEFINICIN DE VARIABLES
I ndependiente
Inductor ciclofosfamida.
Dependientes
Eritrocitos micronucleados.
Eritrocitos policromticos micronucleados.
Eritrocitos policromticos.

6.1.3.-CRITERIOS SELECCIN
Criterios de inclusin
- Organismos: Cerdos machos y hembras.
- Peso: 20 a 25 kg.
- Edad: 10 a 13 semanas de edad.
Criterios de no inclusin
- Estado de salud:
Cerdos golpeados.
Heridos.
Enfermos.
Criterios de exclusin
- Cerdos que enfermaron durante el experimento.
- Laminillas que por razones metodolgicas no pudieron ser analizadas.

49
6.1.4.- SELECCIN DE ANIMALES
Se utilizaron 50 cerdos (Sus scrofa), de la cruza Landrace/Yorkshire, 25
hembras y 25 machos castrados (practica rutinaria en la porcicultura, que se realiza a los
10 das de edad). Todos los organismos se mantuvieron por un lapso de 16 das en
experimentacin, tiempo durante el cual consumieron agua y alimento (porcino etapa I)
add limitum. Los animales fueron alojados en corraletas para engorda y se identificaron
con el mtodo de arete.

50
6.2.- REALIZACIN
Este trabajo se realiz en la granja porcina de la Unidad Acadmica de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autnoma de Nayarit, as como la colaboracin
del Laboratorio de Mutagnesis del Centro de Investigacin Biomdica de Occidente IMSS
y apoyo de la Facultad de Medicina de la Universidad Autnoma de Guadalajara.

6.3.- TOMA DE MUESTRAS
Para analizar la presencia de eritrocitos micronucleados se tomaron muestras de
sangre de cada animal. La extraccin de la sangre se realiz de la vena cava anterior con
la tcnica descrita por Carle y Dewhirst
52
; sobre una mesa se sujet al animal en
posicin dorsal, de los miembros posteriores, de los miembros anteriores y del cuello y
mediante el uso de jeringas con aguja del calibre 20 y 2 pulgadas se penetr a 1.25 cm
del vrtice del cartlago cariniforme, sobre una lnea trazada desde dicho vrtice a la base
de la oreja con la aguja en direccin hacia adentro, hacia abajo y hacia atrs, se ingres
al trax entre el primer par de costillas pasando una torunda de algodn impregnado de
alcohol en la zona a tomar la muestra, la aguja fue penetrada a la vena cava en el punto
donde convergen las venas yugulares y las braquiales, se hizo fluir sangre al interior de la
jeringa mediante aspiracin ligera y una vez tomada la muestra se presion con el
algodn en el lugar de la puncin a fin de cerrar la herida
52
.

6.4.- PREPARACIN DE LAS MUESTRAS
Se realiz un frotis sanguneo, en tres laminillas de las cuales fueron analizadas dos y
la otra fue almacenada como archivo para ser utilizada solo en caso necesario de
confirmacin o prdida (Figura 10). Los frotis fueron llevados al

51
laboratorio donde se fijan en etanol al 80% por 15 minutos y posteriormente fueron
teidos con anaranjado de acridina.
En trabajos de esta naturaleza se recomienda la tincin con anaranjado de acridina y
microscopio de fluorescencia ya que este flouorocromo es especfico para cidos
nucleicos. Como el contenido de los microncleos es ADN se observan verde limn
brillante (Figura11) y los reticulocitos por poseer todava grnulos ribosmicos se ven rojo
naranja
31-34,45,63
.
Procedimiento de la tincin
1. La muestra fue tratada con agua destilada, pasada sucesivamente por alcohol etlico
de 80, 70 y 50 %.
2. Fue enjuagada de 3 a 10 segundos en cido actico al 1%.
3. Se ti durante 3 minutos en anaranjado de acridina al 0.01% amortiguado (1:9
anaranjado de acridina concentrado al 0.1% y amortiguador de fosfato a pH 6.0).
4. Se dej un minuto en amortiguador de fosfato para quitar el colorante no fijado.
5. Se diferenci con cloruro de calcio 0.1M durante 30 segundos a un minuto o hasta
que los ncleos presenten una evidente fluorescencia verde clara.
6. Se lav cuidadosamente en amortiguador de fosfato para quitar el cloruro de calcio.
7. Se mont poniendo bajo el cubreobjetos una o dos gotas de amortiguador de
fosfato y las laminillas fueron observadas con un microscopio de fluorescencia con
excitacin azul (488 nm) y filtro amarillo (515 nm), con el objetivo de inmersin.

Figura 11.- Realizacin de frotis
52

6.5.- ANLISIS DE LAMINILLAS
El conteo de eritrocitos normocromticos micronucleados (EMN), eritrocitos
policromticos micronucleados (EPCMN), as como la proporcin de eritrocitos
policromticos (EPC), con respecto a los normocromticos se llev a cabo de la siguiente
manera; se observ el frotis sanguneo y se busc una zona uniforme de eritrocitos para
el conteo, observando campo por campo, donde se contaron de la siguiente manera:
1. Eritrocitos micronucleados: Una vez ubicada una zona uniforme y calculado el nmero
de eritrocitos normocromticos por campo, se identificaron los micronucleados,
contando uno por uno. Este mismo procedimiento se repiti hasta contar 10,000
eritrocitos normocromticos.
2. Los eritrocitos policromticos micronucleados, fueron contados por campos uno por
uno hasta contar 1,000 eritrocitos policromticos.
3. Eritrocitos policromticos: Una vez ubicada una zona uniforme, y calculado el
nmero de eritrocitos normocromticos por campo, se identificaron los eritrocitos
policromticos, contando uno por uno, este mismo procedimiento se repiti hasta
contar 1,000 eritrocitos normocromticos.
Figura 12).-Eritrocitos de cerdo con tincin con anaranjado
de acridina. a) MN b) Reticulocito
a
b
53

6.6.- MODELO EXPERIMENTAL
Se utilizaron 50 cerdos, de manera aleatoria se formaron 5 grupos con 10 individuos
cada uno (5 hembras y 5 machos) y a cada grupo, excepto el control fueron sometidos
a dos tipos de exposiciones con ciclofosfamida;

Exposicin 1) Administracin de ciclofosfamida va oral en dosis nica,
Grupo 1) Control.
Grupo 2) tratamiento 0.5 mg/Kg de ciclofosfamida.
Grupo 3) tratamiento 1 mg/Kg de ciclofosfamida.
Grupo 4) tratamiento 2 mg/Kg de ciclofosfamida.
Grupo 5) tratamiento 4 mg/kg de ciclofosfamida.

Exposicin 2) Administracin de ciclofosfamida va oral en dosis continua/ 24
h / 4 das.
Grupo 1) Control.
Grupo 2) tratamiento total 2 mg/Kg de ciclofosfamida. Fraccionada a 0.5 mg/Kg
de ciclofosfamida/ 24h/4 das.
Grupo 5) tratamiento total 16 mg/Kg de ciclofosfamida. Fraccionada a 4.0
mg/Kg de ciclofosfamida/ 24h/4 das.

Todos los grupos de cerdos fueron sometidos a dos exposiciones con la misma
dosis de ciclofosfamida. La primera exposicin que recibieron fue la de dosis
nica, se dejaron reposar 8 das para posteriormente administrarles la dosis
continua.

54
Tiempo de muestreo

Dosis nica
Se tomaron las muestras sanguneas: basal, 24 h, 48 h y 72 h despus de
iniciado el tratamiento y una vez analizadas se compararon todos los tiempos
con la muestra basal.

Dosis continua
Se tomaron las muestras sanguneas a las 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h y 144
h despus de iniciado el tratamiento, para su posterior comparacin con el
valor basal.

6.7.- TAMAO DE MUESTRA

En todas las especies estudiadas hasta el momento se observa que los valores
sanguneos tienen una variacin muy amplia respecto a la media de la muestra, por lo
que al calcular el nmero de repeticiones nos resultara un gran tamao de muestra. Sin
embargo, en experimentos de este tipo se ha trabajado con 10 animales, incluso se
recomienda usar de 4 a 5 individuos
63
. En base a estos antecedentes, el tamao de
muestra por grupo fue de 10 cerdos, formados por 5 machos y 5 hembras. Se usaron las
mismas proporciones de cerdos machos y hembras para evitar una posible interferencia
por diferencia en sexos.

6.8.- ANLISIS ESTADSTICO
Todos los grupos se analizaron con la prueba ANOVA de Friedman para identificar
diferencias significativas intragrupales. En los grupos que mostraron diferencia
significativa se aplic la prueba de Wilcoxon con correccin de Bonferroni para mltiples
comparaciones para identificar el tiempo en el cual es visible el efecto, las comparaciones
pareadas se hicieron con su respectivo tiempo basal. En todas las pruebas se utiliz un
55
intervalo de confianza de 95% y las diferencias fueron consideradas significativas cuando
el valor de p<0.05. Las pruebas estadsticas se realizaron por medio del programa SPSS
(v.10.0) para Windows.

6.9.- ASPECTOS TICOS
Los animales fueron tratados de acuerdo a las Normas y Reglamentos Institucionales, a
la Ley General de Salud en materia de investigacin para la salud y a la NOM-062-ZOO-
1999
64-65
.
Los cerdos despus del experimento continuaron con su crecimiento y engorde
tradicional para su posterior sacrificio (25 semanas/edad) en el rastro. Se debe sealar
que no existi ningn riesgo con respecto al consumo de esta carne porque el 75 % de
la ciclofosfamida se elimina en las primeras 11 horas
58-59
, el resto es eliminado en las
siguientes horas. Los animales se sacrificaron casi 3 meses despus de la
administracin del compuesto genotxico.
El manejo de la ciclofosfamida como el colorante naranja de acridina fue de acuerdo a
la Ley General de Salud y la Normas Oficiales Mexicanas
64,66-67
. La ciclofosfamida usada
fue presentacin comercial (Genoxal del Laboratorio Baxter). De acuerdo a los
lineamientos se usaron guantes, bata u overol y cubre bocas para evitar contacto. Los
excedentes de ciclofosfamida, las jeringas, las agujas, los guantes, los cubre bocas y
las laminillas usadas se depositaron en un recipiente especial, para su posterior
destruccin de acuerdo a las Normas Oficiales Mexicanas.

56

R
R
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A
A
D
D
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O
S
S

57
VALOR BASAL
Se tomaron muestras de 50 cerdos cruza Landrace/Yorkshire de 10 semanas de edad
para obtener el valor basal de los eritrocitos micronucleados (EMN), eritrocitos
policromticos micronucleados (EPCMN) y eritrocitos policromticos (EPC). Los
parmetros sanguneos se presentan en medias y desviacin estndar, como se observan
en el cuadro I.

CUADRO I
Valor basal de EMN, EPCMN y EPC en cerdos jvenes
EMN/10,000 eritrocitos 7.68 4.7
EPCMN/1,000 eritrocitos
policromticos
2.6 1.5
EPC/1,000 eritrocitos 10.42 5.7
As se observaron los eritrocitos micronucleados, con microscopio de fluorescencia.

Figura 13. Eritrocitos micronucleados de cerdo.
a- eritrocito normocromtico micronucleado
b- eritrocito policromtico micronucleado

a
b
58
DOSIS NICA
Anlisis de Eritrocitos Micronucleados (EMN)
Al analizar el total de datos del grupo control no encontramos diferencia significativa. Con
respecto al tratamiento 0.5 mg/Kg observamos aumento significativo a las 48 y 72 h.
Mientras que en el tratamiento de 1 mg/kg hay disminucin significativa a las 48 y 72 h.
El de 2.0 mg/kg no produjo aumento. Y el de 4.0 mg/Kg indica incremento de EMN a las
24 h (Cuadro II y Grfica I).
Cuadro No. II EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica.
GRUPO
n=10 DOSIS
TIEMPO
BASAL 24h 48h 72h

P

1

CONTROL

6.32.66

7.44.12

5.42.76

7.03.65

p=0.288

2

0.5 mg/Kg

5.12.07

7.33.62

7.72.21
**p=0.012
8.94.07
**p=0.008

p=0.018

3

1 mg/Kg

10.76.32

6.53.41

5.62.37
**p=0.005
6.12.85
**p=0.007

p=0.008

4

2 mg/Kg

9.56.06

12.75.46

13.96.52

14.87.32

p=0.012

5

4 mg/Kg

6.82.82

11.95.57
**p=0.011

10.84.44

10.34.24

p=0.038
ANOVA de Friedman: comparacin entre los diferentes tiempos.
** Wilcoxon: comparacin del tiempo basal con 24 h, 48 h y 72 h (p<0.016, correccin de Bonferroni).
Datos en Medias y desviacin estndar
Eritrocitos micronucleados/10,000 eritrocitos
Aplicacin de tratamiento

59

Figura 14.
EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica.
ERITROCITOS MICRONUCLEADOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS NICA)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Control 0.5 mg/kg 1 mg/kg 2 mg/kg 4 mg/kg
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5
tiempo/ horas
M
e
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i
a
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d
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1
0

0
0
0

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c
i
t
o
s
T.Basal 24 h 48 h 72 h

P=0.012 P=0.008
P=0.005
P=0.007
P=0.011
60
Anlisis de Eritrocitos Policromticos Micronucleados (EPCMN)
respecto al tratamiento 0.5 mg/Kg observamos aumento significativo en la frecuencia de
EPCMN a las 48 h. El anlisis de 1.0 mg/Kg y 2.0 mg/Kg no existi diferencia significativa
en ningn tiempo. En cambio en el tratamiento de 4 mg/Kg los EPCMN muestran
diferencia significativa a las 24 h ( Cuadro III y Grfica II).
Cuadro No. III
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica.

GRUPO
(n=10)
DOSIS

TIEMPO
BASAL
24h

48h

72h

1

CONTROL

2.71.49

2.21.23

21.05

2.81.32

p=0.208

2

0.5 mg/Kg

1.90.99

2.21.14

4.61.51
**p=0.007
2.21.32

p=0.001

3

1 mg/Kg

21.80

1.80.83

3.11.92

1.71.66

p=0.053

4

2 mg/Kg

3.31.88

5.32.21

4.22.1

5.72.83

p=0.028

5

4 mg/Kg

3.11.28

6.92.33
**p=0.005
42.05

3.31.77

p=0.000
ANOVA de Friedman: comparacin entre los diferentes tiempos (p<0.05).
Eritrocitos policromticos micronucleados/1,000 eritrocitos policromticos

61
Figura 15.
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica.

ERITROCITOS POLICROMTICOS MICRONUCLEADOS EN
CERDO (CICLOFOSFAMIDA DOSIS NICA)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tiempo/ horas
M
e
d
i
a
s

d
e

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1
0
0
0

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p
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c
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o
m
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i
c
o
s

P=0.007
P=0.005
62

Anlisis de Eritrocitos Policromticos (EPC)
respecto al tratamiento 0.5 mg/Kg observamos aumento significativo en la frecuencia de
EPC a las 48 h y 72 h. El anlisis de 1.0 mg/Kg no encontramos diferencias y a los 2.0
mg/Kg detectamos diferencia significativa a las 72 h. En cambio en el tratamiento de 4
mg/Kg no se observ diferencia alguna (Cuadro IV y Grfica III).
Cuadro No. IV
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica.

GRUPO

DOSIS

TIEMPO
BASAL
24h

48h

72h

1

CONTROL

17.76.51

13.44.20

15.44.35

14.73.53

p=0.309

2

0.5 mg/Kg

5.10.73

5.30.82

7.61.84
**p=0.009

81.49
**p=0.011

p=0.001

3

1 mg/Kg

13.82.53

14.43.92

13.03.09

12.33.27

p=0.498

4

2 mg/Kg

9.41.57

101.83

10.21.48

12.63.53
**p=0.014

p=0.020

5

4 mg/Kg

6.11.19

6.41.35

51.56

5.61.07

p=0.144
ANOVA de Friedman: comparacin entre los diferentes tiempos (p<0.05)
Eritrocitos policromticos/1,000 eritrocitos

63

Figura 16.
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis nica.

ERITROCITOS POLICROMTICOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS NICA)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Tiempo/ horas
M
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a
s

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P
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1
0
0
0

e
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t
r
o
c
i
t
o
s

P=0.009
P=0.011
P=0.014
64
DOSIS CONTINUA
Anlisis de Eritrocitos Micronucleados (EMN)
Al analizar el total de datos solo encontramos diferencia en el tratamiento de 4mg/Kg en
los tiempos 48 h, 72 h y 144 h (Cuadro V y Grfica IV)

Cuadro No. V
EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua

GRUPO

DOSIS

TIEMPO
BASAL
24h

48h

72h

96h

120h

144h

1

CONTROL

6.32.66

5.32.31

52.49

4.81.99

5.52.42

4.71.83

4.21.93

p=0.582

2

0.5 mg/Kg/da

5.12.07

3.52.22

4.21.69

3.21.48

3.61.65

3.71.77

3.92.18

p=0.119

3

1 mg/Kg/da

10.76.32

6.32.79

6.82.25

5.43.24

7.12.56

7.53.34

6.23.22

p=0.112

4

2 mg/Kg/da

9.56.06

169.48

17.38.0

15.55.54

11.76.29

16.38.47

13.18.08

p=0.002

5

4 mg/Kg/da

6.82.82

10.32.8

125.5
**
p=0.007

145.7
**
p=0.007

8.83.43

10.33.2

10.53.5
**
p=0.007

p=0.009
** Wilcoxon: comparacin del tiempo basal con 24 h, 48 h, 72 h, 96 h , 120 h y 144 h (p<0.008, correccin
de Bonferroni).
Eritrocitos micronucleados/10,000 eritrocitos

65

Figura 17.
EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua

ERITROCITOS MICRONUCLEADOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS CONTINUA)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Control 0.5 mg/kg/da 1 mg/kg/da 2 mg/kg/da 4 mg/kg/da
Tiempo/ horas
M
e
d
i
a
s

d
e

E
M
N
/
1
0

0
0
0

e
r
i
t
r
o
c
i
t
o
s
T.Basal 24 h 48h 72 h 96 h 120 h 144 h

P=0.007
P=0.007
P=0.007
66
Anlisis de Eritrocitos Policromticos Micronucleados (EPCMN)
Al analizar el total de datos solo encontramos diferencia en el tratamiento de 1mg/Kg en
los tiempos 72 h y 120 h (Cuadro VI y Grfica V).

Cuadro No. VI
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua

GRUPO

DOSIS

TIEMPO
BASAL
24h

48h

72h

96h

120h

144h

1

CONTROL

2.71.49

1.81.03

1.51.08

1.60.97

2.01.05

1.11.29

1.30.82

p=0.150

2

0.5 mg/Kg/da

1.90.99

2.12.23

2.81.93

2.71.57

4.22.2

2.11.37

1.21.23

p=0.038

3

1 mg/Kg/da

21.80

2.31.05

6.53.24

5.51.30
**p=0.007

5.62.0

5.81.30
**p=0.007
1.90.93

p=0.000

4

2 mg/Kg/da

3.31.88

4.82.82

52.71

4.12.02

2.82.1

2.91.73

1.41.71

p=0.072

5

4 mg/Kg/da

3.11.28

2.51.65

3.61.9

5.33.09

1.61.35

4.22.15

41.89

p=0.002
de Bonferroni).
Eritrocitos policromticos micronucleados/1,000 eritrocitos policromticos

67

Figura 18.
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua
ERITROCITOS POLICROMTICOS MICRONUCLEADOS EN
CERDO (CICLOFOSFAMIDA DOSIS CONTINUA)
0
1
2
3
4
5
6
7
Tiempo/ horas
M
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d
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0
0

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m
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i
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o
s
T.Basal 24 h 48h 72 h 96 h 120 h 144 h

P=0.007
P=0.007
68
Anlisis de Eritrocitos Policromticos (EPC)
Al analizar el total de datos solo encontramos diferencia en el tratamiento de 2.0
mg/Kg en los tiempos 120 h y 144 h (Cuadro VII y Grfica VI).

Cuadro No. VII
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua

GRUPO

DOSIS

TIEMPO
BASAL
24h

48h

72h

96h

120h

144h

P

1

CONTROL

17.76.51

16.12.47

13.53.44

14.32.67

15.74.76

13.12.18

14.33.23

p=0.119

2

0.5
mg/Kg/da
5.10.73

5.31.25

4.50.85

6.30.67

4.81.75

6.21.03

6.92.77

p=0.002

3

1
mg/Kg/da
13.82.53

12.92.88

14.54.97

14.83.01

15.72.11

153.97

17.56.11

p=0.305

4

2
mg/Kg/da
9.41.57

14.45.08

12.54.01

11.53.78

9.21.32

4.51.72
**p=0.005
3.41.78
**p=0.005

p=0.000

5

4
mg/Kg/da
6.11.19

5.71.7

5.61.17

6.51.58

4.31.25

4.41.07

4.60.84

p=0.000
de Bonferroni).
Eritrocitos policromticos/1,000 eritrocitos

69

Figura 19.
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua

ERITROCITOS POLICROMTICOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS CONTINUA)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Tiempo/ horas
M
e
d
i
a
s

d
e

E
P
C
/
1
0
0
0

e
r
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t
r
o
c
i
t
o
s
T.Basal 24 h 48h 72 h 96 h 120 h 144 h

P=0.005
P=0.005
70

D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
I
I
N
N

71
Como antecedente sabemos que para que un organismo sea un buen
bioindicador de sustancias micronucleognicas debe presentar una frecuencia mayor o
igual a 6 EMN espontneos, pues esto nos indica que su sistema depurador no es muy
eficiente y por lo tanto cuando dicho organismo sea expuesto a un genotxico nos
permitir fcilmente identificar el dao. Este sistema depurador no es otra cosa que el
sistema reticuloendotelial, que en el hombre el bazo es muy importante, mientras que en
conejos y cobayos es menos su actividad; en las aves el hgado parece ser el sitio
principal, pero sobre todo la mdula sea roja es el principal sitio de destruccin de los
eritrocitos viejos, daados o con inclusiones en la mayora de los animales domsticos
53
.
Actualmente se cuenta con diversos biomonitores en los cuales es esencial tomar en
cuenta la edad del organismo para aprovechar al mximo su poder para detectar los
agentes genotxicos bsicamente micronucleognicos, ya que a menor edad mayor
respuesta en la formacin de eritrocitos micronucleados
31,33-34
.

Para el caso del cerdo, con este trabajo demostramos que tiene estas
caractersticas, ya que a las 10 semanas de edad presenta 7.6 EMN/10,000 eritrocitos, lo
cual es un buen nmero de eritrocitos micronucleados espontneos.

En el presente trabajo encontramos resultados similares a los registrados en otras
especies animales, en donde a mayor edad del animal menor nmero de eritrocitos
micronucleados de origen espontneo. Los cerdos adultos presentan espontneamente
una frecuencia de 6.9 EMN/1.7 EPCMN
32
, los cerdos de 5 semanas 17.8 EMN/ 3.5
EPCMN
34
y nosotros encontramos en cerdos de 10 semanas de edad 7.6 EMN/ 2.6
EPCMN. Estos datos indican que la edad ideal para usar este organismo como biomonitor
podra ser a las 5 semanas de edad, sin embargo hay que recordar que los cerdos desde
su nacimiento hasta las 5 semanas tienen una eritropoyesis acelerada e inestable lo que
interfiere en la interpretacin de resultados, as como en la reproducibilidad del modelo.
72
En los cerdos de 10 semanas de edad el sistema de eritropoyesis ya se encuentra estable
como se demuestra en nuestros resultados de eritrocitos policromticos (EPC), esta
frecuencia es similar a la del adulto con un promedio de 10 EPC/1,000 eritrocitos totales,
(Cuadro I.)
34,68
.

Por otra parte muchos de los compuestos son txicos hasta que son
metabolizados, tal es la situacin de la ciclofosfamida, y en el caso del cerdo su sistema
microsomal dependiente de citocromo P-450, que es el responsable de metabolizar
compuestos, en el cerdo este sistema termina de madurar a las 6 semanas de edad
69
, un
argumento ms para definir la edad de 10 semanas como la ms satisfactoria para utilizar
al cerdo con estos fines.

En el presente trabajo se administr la ciclofosfamida en dos exposiciones: en
dosis nica y en dosis continua.
Se realiz la dosis nica porque se busca un efecto entre las 24 h y 72 h, el cual se
ver reflejado en los eritrocitos policromticos ya que estos son los eritrocitos recin
formados, de tal suerte que si estos policromticos presentan microncleos entonces
tenemos la certeza de que son originados por la exposicin al inductor usado
70
. Los
eritrocitos policromticos maduran posteriormente a eritrocitos normocromticos (ENC) y
por esta razn, cuando la exposicin es continua, es notable el incremento de eritrocitos
micronucleados por su acumulacin
50
.
Para valorar el incremento de clulas micronucleadas por su acumulacin se llev a
cabo la exposicin en dosis continua durante 4 das, como se ve en los resultados.
73
El cerdo joven mostr el efecto de la ciclofosfamida en la dosis nica a los
tratamientos 0.5 y 4 mg/Kg en eritrocitos policromticos micronucleados y eritrocitos
micronucleados (Cuadros 2,3). En la dosis continua respondi a los tratamientos 1 y 4
mg/Kg en eritrocitos policromticos micronucleados y eritrocitos micronucleados
respectivamente(Cuadros 5, 6).

Con respecto al tratamiento de 2 mg tanto para la dosis nica como la continua se
observa tendencia a incremento de clulas micronucleadas (EMN y EPCMN) sin embargo
este incremento no es significativo; cabe sealar que en la dosis continua hubo una
franca miolodepresin en respuesta al dao del inductor, lo que queda demostrado por la
disminucin estadstica significativa de los eritrocitos policromticos, (cuadro 7).

Resultados similares se han descrito en otros trabajos
57,70
. Se conoce que muchos
compuestos dependiendo de la dosis y el perodo de administracin pueden inhibir la
mitosis, lo que se ve reflejado en el nmero de EPC en la circulacin sangunea, y si hay
disminucin de mitosis tambin baja la formacin EPCMN
70
. Lo anterior explica por qu
no hubo incremento significativo en el tratamiento de 2 mg/Kg/da de ciclofosfamida.

En el tratamiento de 0.5 mg/Kg, con la primera exposicin que fue la de dosis
nica posiblemente se activaron los diferentes sistemas de destoxificacin con los que
cuentan los seres vivos como son el caso de la glutation-S-transferasa y la N-acetil
transferasa y por lo cual no se observ incremento en la dosis continua
4,71-72
.

Por otro lado, en los cerdos quizs existe una variabilidad gentica entre
individuos como la que existe en el humano, y por lo tanto diferencias en el metabolismo
de la ciclofosfamida. Estas variaciones metablicas de los individuos permiten entender
diferentes tipos de respuestas entre organismos a los efectos de los genotxicos y por lo
tanto diferentes grados de susceptibilidad
73
.

74
Como se observa en este trabajo la respuesta micronucleognica fue muy variada,
por lo que investigadores especialistas recomiendan que en este tipo de trabajos se usen
diferentes dosis altas, medianas y bajas del agente en cuestin y tomar en cuenta los
eritrocitos policromticos y eritrocitos normocromticos
63
. Tambin recordar que cuando
se estudia un compuesto con posible actividad genotxica se debe analizar con varios
modelos, ya sea in vivo o in vitro.

Estos resultados concuerdan perfectamente por los descritos en otros trabajos en
los que usaron como bioindicador a gatos, ardillas y ratones, cabe sealar que en dichos
trabajos utilizaron como inductores a la colchicina y arabinosa C
30,33,54
. En un trabajo
previo encontramos resultados similares en cerdos de 5 semanas de edad, con una dosis
mayor (5 mg/Kg).

Como se ve en nuestros resultados, el cerdo es un excelente bioindicador de
agentes micronucleognicos de dosis bajas de agentes genotxicos, esto se constata al
observar que hay incremento significativo de clulas micronucleadas a las dosis de 0.5, 1
y 4 mg/Kg.

Algunos autores sealan que este animal tiene una alta sensibilidad a diversos
compuestos as por ejemplo cuando se expusieron a la ocratoxina presentan incremento
en la frecuencia de intercambio de cromtidas hermanas y que este animal tiene un DL50
para el compuesto antes mencionado menor que para la rata y el ratn
74-75
, por otra
parte se describe que el cerdo responde a menor dosis de radiacin ionizante que otros
organismos
56,76
.

75
Como ya lo habamos mencionado La ciclofosfamida es un compuesto de uso
comn para demostrar dao genotxico mediante la prueba de microncleos, e
induccin de aberraciones cromosmicas, sin embargo a las dosis usadas al menos en
ratas
17
y ratones
77
van de 5,10,20 e incluso hasta 50 y 100 mg, adems es importante
sealar que la dosis letal en ratas es de 160 mg/Kg/iv como podemos darnos cuenta las
dosis usada en los diversos modelos son muy superiores a las que nosotros usamos,
incluso realizamos un experimento piloto en 2 cerdos para analizar el comportamiento del
cerdo a 50 mg de ciclofafosfamida en dosis nica. De estos dos animales, uno muri
repentinamente a las 72 h, el otro mostr diarrea y recibi tratamiento, logrndose
recuperar, esto causado por el gran efecto citotxico mielodepresivo a esta dosis de
ciclofosfamida en el cerdo
57
. La diferencia tan marcada de la dosis de ciclofosfamida,
entre roedores y el cerdo, posiblemente se deba a la variacin de la va metablica a la
ciclofosfamida entre las especies
78-79
.

En un estudio con eritrocitos policromticos micronucleados en sangre perifrica de
cerdos jvenes (16 a 18 sem.) inducidos con rayos X, concluyen que es factible usar al
cerdo con la prueba de microncleos para estimar daos citogenticos, causado por
radiaciones ionizantes o compuestos qumicos potenciales
56
.

Tambin existen trabajos donde se demostr en cerdos el efecto genotxico de la
hormona beta agonista mediante la prueba de intercambio de cromtidas hermanas y la
prueba de microncleos. La frecuencia de la aberracin cromosmica fue correlacionada
positivamente a la cantidad de la hormona usada
80
.

Estudios con cerdos infestados con el cisticerco Taenia solium, demuestran dao
genotxico en la forma de intercambio de cromtides hermanas y tambin con la prueba
de microncleos en la que se observaron 4000 linfocitos por cerdo resultando 0.212 %
clulas de linfocitos micronucleados en cerdos infectados y un valor de 0.027 % para el
grupo control
81
.

76
Por todo lo anterior se deduce que el cerdo presenta respuesta eritrocitaria
micronucleognica a la ciclofosfamida, an a dosis ms bajas de las recomendadas para
otros modelos en pruebas de dao cromosmico. Por lo tanto puede ser considerado
como una prueba confiable para detectar genotxicos micronucleognicos.

77

C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
I
I
O
O
N
N
E
E
S
S

78
1. El nmero de eritrocitos micronucleados en cerdos jvenes (10 a 13 semanas de
edad), se incrementa cuando se expone a los animales a concentraciones bajas de
ciclofosfamida.

2. En el cerdo la proporcin basal de: eritrocitos microncleados, eritrocitos
policromticos micronucleados y eritrocitos policromticos respectivamente son
7.684.7, 2.6 1.5 y 10.42 5.7.

3. En los cerdos inducidos con ciclofosfamida con dosis nica encontramos
incrementos significativos en los valores de eritrocitos micronucleados y en los
eritrocitos policromticos micronucleados en los tratamientos de 0.5 mg/Kg y 4
mg/Kg.

4. En los cerdos inducidos con ciclofosfamida con dosis continua encontramos
incrementos significativos en los valores de eritrocitos micronucleados en el
tratamiento 4 mg/Kg/da y en los eritrocitos policromticos micronucleados en el
tratamiento de 1 mg/Kg/da.

5. El cerdo joven es un indicador biolgico capaz de detectar concentraciones ms
bajas de genotxicos que las detectadas por otros biomonitores, mediante la
prueba de microncleos en eritrocitos normocromticos y policromticos.

6. Por lo tanto, el cerdo puede ser considerado como una prueba confiable para
detectar genotxicos micronucleognicos.

79

BIBLIOGRAFA

80
1.- Salamanca F. (1990). Citogentica Humana. (1 ed.). Mxico: Md.Panamricana.
2.- Crdoba D. (2000). Toxicologa. (4 ed.). Colombia: Manual Moderno.
3.- Klaassen CD., Watkins, J .B. (2001). Manual de Toxicologa. (5 ed.). Mxico: McGraw-
Hill Interamricana.
4.- lvarez Moya C.(2001). Gentica, ambiente y salud. (2 ed.). Mxico: Universidad de
Guadalajara.
5.- Linet MS. (2000). Evolution of cancer epidemiology. Epidemiol Rev., 22:1, 35-56.
6.- Wiley J . (1990). Mutation and the environment. Part. A: Basic mechanisms. J ohn
Wiley, vol.340-A.
7.- Lodish H., Berk, A., Zipursky, S., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J . (2002).
Biologa Celular y Molecular. (4 ed.). Espaa: Mdica Panamricana.
8.- Goodman Gilman A., Hardman J ., Limbird L., Molinoff P., Ruddon R.(1996). Las Bases
Farmacolgicas de la Teraputica. (9 ed). Mxico: Mc. Graw-Hill Interamericana.
9.- Guzar-Vzquez J . (1994). Gentica Clnica. (2 ed). Manual Moderno. Mxico.
10.- Lewin B. (2000). Genes VII. (2 ed.). USA: Oxford University Press, Inc. New York.
11.- Griffiths A., Miller J ., Suzuki D., Lewontin R., Gelbart W. (2000). An
introduction to genetic analysis . (7 ed.). USA: Freeman and company.
12.- Luque J ., Herraez A., (2001). Biologa Molecular e Ingeniera Gentica. (1 ed.).
Espaa: Harcourt.
13.- Suzuki DJ ., Griffiths, J F., Miller, J H., Lewontin, RC. (1992). Gentica (4 ed.).
Espaa:Interamericana-McGraw-Hills.
14.- J ena GB., Bhunya, SP. (1995). Use of chick, Gallus domesticus, as an in vivo model
for the study of chromosome aberration: A study mitomycin C and probable location of a
hot spot. Mutat Res, 334, 167-174.
81
15.- Rodrguez A., Nieves A., Navas J I., Dorado G., Lpez-Barea J ., Pueyo C. (1992).
Metal mutagenicity and biochemical studies on bivalve molluscs from Spanish coasts.
Environ Mol Mutagen, 19, 112-124.
16.- Han X., Liehr J ., Bosland M. (1995), Induction of a DNA adduct detectable by 32P-
postlabeling in the dorsolateral prostate of NBI/Cr rats treated with estradiol-17Bb and
testosterone. Carcinognesis, 16, 951-954.
17.- Hayashi M., Kodama Y., Awogi T., Suzuki T., Asita AO., Sofuni T. (1992). The
micronuclous assay using peripherial blood reticulocytes from mitomycin-C and eye
clophosphamide-treated rats. Mutat Res, 278, 209-213.
18.- Herrera A., Barrueco C., Caballo C., de la Pena E. (1992). Effect of permethrin on the
induction of sister chromatid exchanges and micronuclei in cultured human limphocytes.
Environ Mol Mutagen, 20: 218-222.
19.- Rieger R.,Michaelis A., Takehisa S. (1992). Low temperature between conditioning
and challenge treatment prevents the adaptative response of Vicia faba root tip
meristem cells. Mutat Res, 282: 69-72.
20.- Rieger R.,Michaelis A., Takehisa S. (1992). Low temperature between conditioning
and challenge treatment prevents the adaptative response of Vicia faba root tip
meristem cells. Mutat Res, 282: 69-72.
21.- Corazza G., Ginaldi L., Zoli G., Frisoni M., Lalli G., Gasbarrini G., Quaglino D. (1990).
Howell-J olly body counting as a measure of splenic function. A ressessment. Clinical Lab
Haematol. 12, 269-275.
22.- Fuic A., Mijic A. (1999). In vitro and in vivo micronucleus tests in genotoxicity
research. Arh Hig Rada Toksikol. 50, 299-306.
23.- Heddle J .,Cimino M., Hayashi M., Romagna F., Shelby M., Tucker J ., McGregor J . (
1991). Micronuclei as and index of cytogetic damage : past, present and future. Environ
Mol Mutag, 18, 277- 291.
82
24.- Schmid W. (1975). The micronucleus test. Mutat Res, 31, 9-15.
25.- Hatanaka Y., Kitagawa Y., Toyoda Y., Kawata T., Ando N., Kawabata Y., Iwai M.,
Arimura H. (1992). Micronucleus test with cyclophosphamide using mouse peripheral
blood reticulocytes. Mutat Res, 278, 99-101.
26.-Dorothea K.,Stephen D., Nikki E., Carol R.(1998). An automated method for
discriminating aneugen-vs. Clastogen-induced micronuclei. Environ Mol Mutagen, 31,
340-344.
27.- Tinwell H., Ashby J .(1991). Micronucleus morphology as a means to distinguish
aneugens and clastogens in the mouse bone marrow micronucleus assay. Environ Mol
Mutagen. 6, 193-198.
28.- Lozano J .A., Galindo J D., Garcia J C., Martnez J H., Peafiel R., Solano F., (2000).
Bioqumica y Biologa Molecular para Ciencias de la Salud. (2 ed.). Espaa: Mc. Graw
Hill-Interamricana.
29.- Katzung B. (1999). Farmacologa Bsica y Clnica. (7 ed.). Mxico D.F. El Manual
Moderno.
30.- Ziga G., Ramrez M.P., Torres, O., Prez J ., Ramos A., Zamora A., Gallegos M.P.,
Snchez J .(1998). Induction of micronuclei in the domestic cat (felis domesticus)
peripheral blood by colchicine and cytosine-arabinoside. Mutat Res, 413, 187-189.
31.- Ziga G., Torres O., Luna J ., Zamora A., Gmez B., Ventura A., Ramos A., Ramos
M., Ortz G., Gallegos M. (2000). Spontaneous micronuclei in peripheral blood
erythrocytes from 54 animal species (mammals,reptiles and birds): Part two. Mutat Res,
467, 99-103.
32.- Ziga G., Torres O., Ramrez M.P., Ramos A., Fanti E., Portilla E., Garca D.,Cant
J .M., Gallegos M.P., Snchez J .(1996). Spontaneous micronuclei in peripheral blood
erythrocytes from 35 mammalian species. Mutat Res, 369, 123-127.
83
33.- Ziga G., Torres O., Ramos M., Zamora A., Gmez B., Ventura A., Ramos A., Ortz
G., lvarez C., Gonzlez A., Luna J ., Gallegos M. (2001). Variation of micronucleated
erythrocytes in peripheral blood of Sciurus aureogaster in relation to age: An increment of
micronucleated polychromatic erythrocytes after the administration of colchicine. Environ
Mol Mutagen, 37, 173-177.
34.- Ziga G., Torres O., Zamora A., Gmez B., Ramos M., Martnez S., Gonzlez A.,
Luna J ., Ramos A., Ontiveros D., Gallegos M. (2001). Differences in the number of
micronucleated erythrocytes among young and adult animals including humans
spontaneous micronuclei in 43 species. Mutat Res, 494, 161-167.
35.- Ziga G., Torre, O., Ramrez M.P., Delgado J L., De Loza R., Cant J M. (1996).
Micronucleated erythrocytes in splenectomized patients with and without chemotherapy.
Mutat Res, 361, 107-112.
36.- Torres-Bugarn O., Zamora-Prez A., Esparza-Flores A., Lpez-Guido B,. Feria-
Velasco A., Cant J M., Ziga G. (1999). Eritrocitos micronucleados en nios
esplenectomizados con y sin quimioterapia. Bol Md Hos Infan Mx. 56, 212-217.
37.- Torres-Bugarn O., Ventura Aguilar A., Zamora-Perez A., Gmez-Meda BC., Ramos-
Ibarra ML., Morgan-Villela G., Gutirrez-Franco A., Ziga-Gonzlez G. (2003). Evaluation
of cisplatin +5-FU, carboplatin +5FU, and ifosfamida + epirubicine regimens using the
micronuclei test and nuclear abnormalities in the bucal mucosa. Mut Res Genetc
Toxicology, 539 , 177-186.
38.- Torres-Bugarn O., De Anda-Casillas A., Ramrez-Moz MP., Snchez-Corona J .,
Cant J M., Ziga G.(1998) Determination of diesel genotoxicity in firebreathers by
micronuclei and nuclear abnormalities in buccal mucosa. Mutat Res. 413, 277-281.
39.- Choy W.N., Henika P.R., Willhite C.C., Tarantal A.F. (1993). Incorporation of a
micronucleus study into a developmental toxicology and pharmacokinetic study of L-
selenomethionine in non human primates. Environ Mol Mutagen, 21, 73-80.
84
40.- Rudek Z., Rozek M.(1992). Induction of micronuclei in tadpoles of Rana temporaria
y Xenopus laevis by the pyretroid Fastac 10 EC. Mutat Res , 298, 25-29.
41.- Zamora-Perez A., Ziga-Gonzlez G., Gmez-Meda BC., Ramos-Ibarra ML., Batista-
Gonzlez CM., Torres-Bugarn O. (2004). Induction of micronucleated cells in the shed
skin of salamanders (Ambystoma sp.) treated with colchicine or cyclophosphamide.
Environ Mol Mutagen. 44, 00-00 (en imprenta).
42.- Bhunya SP., J ena GB. (1992). Genotoxic potential of the organochlorine insecticide
lindane (gamma-BCH): an in vivo study in chicks. Mutat Res, 272, 175-181.
43.- Al-Sabti K., Metcalfe, CD. (1995). Fish micronuclei for assessing genotoxicity in
water. Mutat Res, 343, 121-135.
44.- Burgeot T., His E., Galgani F. (1995). The micronucleus assay in Crassostrea gigas
for the detection of seawater genotoxicity. Mutat Res, 342, 125-140.
45.- Hayashi M., Morita T., Kodama Y., Sofuni T., Ishidate M.J r. (1990). The micronuclei
assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides.
Mutat Res, 245, 245-249.
46.- Se R K., Tae H K., Si Y R., Hae J L., Heon O., Sung K J ., Ki S O., In C P., J ong C K.,
Chang M K., Sung H K. (2003) Measurement of micronuclei by cytokinesis-block method
in human, cattle, goat, pig, rabbit, chicken and fish peripheral blood lymphocytes
irradiated in vitro with gamma radiaton. In vivo, 17, 433-438.
47.- Ramos-Remus C., Dorazco-Barragn G., Aceves-vila FJ ., Alcaraz-Lpez F., Fuentes-
Ramrez F., Michel-Daz J ., Torres-Bugarn O., Ventura - Aguilar A., Ziga - Gonzlez
G.(2002) Genotoxicity assessment using micronuclei assay in rheumatoid arthritis
patients. Clin Exp Rheumatol, 208-212.
48.- Grant WF., Lee HG., Logan DM., Salamone MF. (1992). The use of Tradescantia and
Vicia faba bioassays for the in situ detection of mutagens in an aquatic enviroment.
Mutat Res, 270, 53-64.
85
49.- Helma C., Kronberg L., Ma T.H., Knasmuller S. (1995). Genotoxic effects of the
chlorinated hydroxifuranones 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone and
3,4-dichloro-5-hydroxy-2(5H)-furanone in Tradescantia micronucleus assay. Mutat Res,
346, 181-186.
50.- Ma T.H., Xu Z., Xu C., McConell H., Rabago EV, Arreola GA, Zhang H.(1995). The
improved Allium/Vicia root tip micronucleus assay for clastogenicity of environmental
pollutants. Mutat Res, 334,185-195.
51.- Ruz EF., Rbago VM., Lecona SU., Prez AB., Ma TH. (1992). Tradescantia
micronucleus (Trad-MCN) bioassay on clastogenicity of wastewater and in situ
monitoring. Mutat Res, 270, 45-51.
52.- Krogh P (1987) Ochratoxins in food. En: P Krogh Mycotoxins in food. Food science
and technology series of monographs, USA: Academic Press , Inc. New York.
53.- Swenson MJ ., Reece WO. (1999). Fisiologa de los Animales Domsticos De Dukes
(2 ed.). Mxico: Limusa.
54.- Kishi M., Horiguchi Y., Watanabe S., Hayashi M.(1992). Validation of the mouse
peripheral blood micronucleus assay using acridine orange supravital staining with
urethane. Mutat Res, 278, 205-208.
55.- Cristaldi M., Anna L., Udroiu I., Zilli R. (2004). Comparative evaluation of background
micronucleus frequencies in domestic mammals. Mutat Res, 559, 1-9.
56.- Ludewig E., Koch F., Kamprad F., Melzer R. (1991). The micronucleus test in pigs:
induction of micronuclei in polychromatic erythrocytes by various doses of x-rays. Mutat.
Res, 249, 1-6.
57.- Martnez, S.(2000) Respuesta micronucleognica de los eritrocitos del cerdo (Sus
scrofa) a la ciclofosfamida. Tesis de Maestra no publicada. Universidad de Colima, Centro
universitario de investigaciones biomdicas, Colima.
86
58.- Smith C., Reynard A., (1998). Farmacologa (1 ed.). Mxico D.F. Mdica
Panamricana.
59.- Rodrguez R.(1999). Vademcum Acadmico de Medicamentos. (3 ed.). Mxico:
McGraw-Hill Interamricana.
60.- Mcvan BF. (1995). Indice de medicamentos.(1
a
ed.). Mxico : Manual Moderno.
61.- Stephen,J B., Sherding , RG. (1996). Manual clnico de pequeas especies. (1
a

ed.).Mxico: Mc Graw Hill-Interamericana.
62.- Krishna G., Petrere J ., Anderson J ., Theiss J . (1995). Use of cyclophosphamide as a
positive control in dominant lethal and micronucleus assays. Mutat Res, 335, 331-337.
63.- Hayashi M., MacGregor J T., Gatehouse DG., Adler ID., Blakey DH., Dertinger SD.,
Krishna G., Morita T., Russo A., Sutou S. (2000). In vivo rodent erythrocyte micronucleus
assay. II. Some aspects of protocol desing including repeated treatment, integration
with toxicity testing, and automated scoring. Environ Mol Mutagen, 35, 234-252.
64.- Ley General de Salud. (2002);(17 ed.) Mxico: Porrua.
65.- Norma oficial mexicana -NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones tcnicas para la
produccin, cuidado y uso de los animales de laboratorio.
66.- Norma oficial mexicana-NOM-052-ECOL-1993. Que establece las caractersticas de
los residuos peligrosos, el listado de los mismos y los lmites que hacen a un residuo
peligroso por su toxicidad al ambiente. Mxico.
67.- Norma oficial mexicana-NOM-087-ECOL-1994. Requisitos para la separacin,
envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los
residuos biolgico-infecciosos que se generen en establecimientos que presten atencin
mdica, tales como hospitales y consultorios mdicos, as como laboratorios de
produccin de biolgicos, de enseanza e investigacin, tanto humanos como
veterinarios. Mxico.
87
68.- Fuchs A., Eder H. (1991) Zahl und reifegradverteilung der retikulozyten von sechs
tierarten. J . Vet Med Assoc, 38:749 754.
69.- Davis LE. (1989). Drugs disposition in neonatal animals. J . A. Vet. Med Admon. 320,
1161-1162.
70.- Beaula KD., Subramanyam, S. (1991). Genotoxic evaluation of ara-c by multiple
parameters. Mutat Res, 263, 185-196.
71.- Perera FP.(1997). Environ and cancer. Who are susceptible?. Science , 28, 1068-
1073.
72.- Feigleson HS., Ross RK. Yu MC., Coetzee G., Reichard J K., Henderson BE.(1996).
Genetic susceptibility to cancer from exogenous and endogenous exposures. J . Cel.
Biochem- Suppl, 25, 15-22.
73.- Bartsch H., Hietanen E., (1996). The role of individual susceptibility in cancer burden
related to environ-mental exposure. Environ Health Perspec, 104, 569-578.
74.- Krogt P.(1987). Ochratoxins in food. En: Mycotoxins in food. Food science and
technology series of monographs, USA: Oxford University Press, Inc. New York.
75.- Rutqvist L., Bjrklund NE., Hult K., Hokby E., Carlsson B. (1978) Ochratoxin A as the
cause of spontaneous nephropathy in fattening pigs. App Environ Microb, 36, 920-925.
76.- Se R K., Tae H K., Si Y R., Hae J L., Heon O., Sung K J ., Ki S O., In C P., J ong C K.,
Chang M K., Sung H K. (2003) Measurement of micronuclei by cytokinesis-block method
in human, cattle, goat, pig, rabbit, chicken and fish peripheral blood lymphocytes
irradiated in vitro with gamma radiaton. In vivo, 17, 433-438.
77.- Mukherjee A., Agarwal K., Aguilar MA., Sharma A. (1991). Anticlastogenic activity of
B-caroteno against ciclophosphamide in mice in vivo. Mutat Res, 263, 41- 46.
78.- Shaw I.C. (1990). Species differences in the metabolism and toxicity of
agrochemicals and veterinary medicines. St. Vet. J . 44, 54-65.
88
79.- Connors T.A., Grover P.L., McLoughlin A.M. (1970). Microsomal Activation of
cyclophosphamide in vivo. Biochem.Pharmac. 19, 1533-35.
80.- Liu W., Lu X., Liu X.,Tang H.,Xhao Q., Zhou Q., Ding Q. (1992). Effects of beta -
agonist ans steroid hormone on chromosome aberration in finishing pigs. Hered, 33, 26-
28.
81.- Herrera LA., Santiago P., Rojas G., Salazar PM., Tato P., Molinari J L., Schiffmann D.,
P. Ostrosky-Wegman (1994). Inmune response impairment, genotoxicity and
morphological transformation induced by Taenia solium metacestodo. Mutat Res, 305,
223-228.

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