ESCUELA POLITECNICA DEL EJERCITO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

I.A.S.A.



DIAGNOSTICO GENETICO

Nombre:
Gavilanes Cristhian
Iza Johanna
Nivel: Sexto B
Dr. Darwin Rueda

Sep. 2011 Ene. 2012

1. TEMA:
Ensayo de enzimas de restriccin para analizar el polimorfismo de globina beta S
mediante RFLP.
2. OBJETIVOS:

2.1. Objetivo General:

2.1.1. Conocer como se realiza la tcnica de diagnostico gentico mediante
Electroforesis.

2.2. Objetivo Especfico:

2.2.1. Conocer la funcin que tienen las enzimas de corte y en que nos ayudan
dentro del diagnostico gentico.

2.2.2. Realizar el diagnostico gentico de cuatro muestras de ADN y determinar
cules de las muestras presentan el polimorfismo de globina beta S.

2.2.3. Determinar donde se encuentra el polimorfismo que causa la enfermedad
mediante la corrida electrofortica.



3. HIPOTESIS.

La mayora de los 4 individuos a analizar posee anemia drepanoctica.



4. MARCO TEORICO.

LA ELECTROFORESIS.

Es un mtodo que permite la separacin de molculas en base a su tamao. Esta separacin
se realiza en un gel, que es una malla compleja de molculas polimricas.
Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida.
La agarosa es conveniente para separar fragmentos de cidos nucleicos en el rango desde
unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases.
La poliacrilamida es preferible para la separacin de fragmentos ms pequeos de cidos
nucleicos. Los segmentos de ADN agrupan desde 6 a 2000 pares de bases.

El fundamento de esta separacin est basado en que las molculas de cidos nucleicos
estn cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampn en el que se encuentran) y al
someterlas a un campo elctrico migran hacia el polo positivo de este a travs del gel, a
velocidades que dependen de sus tamaos: una molcula pequea puede seguir su camino a
travs del gel ms fcilmente que una molcula grande. Las velocidades de migracin de
las molculas de cidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus
pesos moleculares (Rueda, 2011).

Mtodos de deteccin:
En la deteccin UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a travs del capilar en una
pequea zona en la que se ha eliminado al revestimiento opaco.
La deteccin por fluorescencia resulta ms sensible si se emplea una fuente lser muy
intenso, asociado a menudo a un procedimiento de preformacin de derivados de los
analitos portadores de un fluoroforo.

Tcnicas electroforticas:

Electroforesis capilar en zona o en dilucin libre:
Es el procedimiento de electroforesis ms habitual en el cual el capilar es recorrido por el
electrolito a travs de un medio buffer que puede ser cido, bsico o anftero. El flujo
electroosmotico crece con el pH del medio electrofortico.

Electroforesis capilar en gel:
Esta es la transposicin de la electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa. El
capilar est relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtracin
que ralentiza a las grandes molculas y que minimiza los fenmenos de conveccin o de
difusin. Los oligonucletidos, poco frgiles, se pueden separar de este modo.


Isoelectroenfoque capilar:
Esta tcnica, tambin conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un
gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada q que contiene un anftero. Cada
compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoelctrico.
Seguidamente, bajo el efecto de una presin hidrosttica y manteniendo el campo elctrico,
se desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con
este procedimiento permiten separar pptidos con pH que apenas difieren entre s 0,02
unidades de pH (Morales, 2008).

Diagnostico gentico.
Las pruebas de diagnostico gentico se hacen en laboratorio e investigan nuestros genes, o
lo que viene a ser lo mismo el material ADN que cada uno hereda de su madre y su padre.
Una prueba ADN puede ser utilizado para identificar probabilidades de sufrir algunos
problemas de salud especifico y elegir o validar los posibles tratamientos en funcin de una
predisposicin inicial (GENETICAE, 2009).

A pesar que una prueba de ADN puede proporcionar informacin muy importante para
diagnosticar, tratar o prevenir enfermedades, tambin existen limitaciones:
Para una persona sana, un resultado positivo a una prueba ADN no siempre significa
que esta persona va a desarrollar una enfermedad.
De la misma forma un resultado negativo a una prueba ADN tampoco significa que una
persona esta inmune a ciertos trastornos al 100%.

El diagnstico gentico (DG) permite conocer la base gentica de una enfermedad
hereditaria, y la informacin que puede obtenerse es necesaria para la toma de decisiones
en varios aspectos.

Tratamiento: El resultado de un estudio gentico puede determinar el tipo de
tratamiento ms eficaz contra la patologa.

Evolucin y pronstico: Una patologa hereditaria puede tener diferente gravedad o
evolucin segn la mutacin causante. El DG permite adelantarse a su manifestacin y
prevenirla adecuadamente.

Forma de herencia: Una alteracin gentica puede transmitirse de forma recesiva,
dominante, dependiendo del sexo, etc. Interpretar este aspecto permite estimar las
posibilidades de que se transmita a la descendencia y de que se manifieste.

Evitar la transmisin de la patologa: El conocimiento de la base gentica de una
patologa permite prevenir su transmisin a la descendencia, utilizando mtodos de
diagnstico gentico prenatal o preimplantacional.

Estudio familiar: Las implicaciones de una prueba gentica tambin son importantes
para los familiares directos de los afectados, por lo que es conveniente valorar la
conveniencia de ampliarlo a otros miembros de la familia.

Marcadores Moleculares.

Los marcadores moleculares corresponden a cualquier gen cuya expresin permite un
efecto cuantificable u observable (caractersticas fenotpicas), que adems puede detectarse
fcilmente. Este tipo de marcadores pueden evaluarse desde que los individuos estn en sus
primeros estadios de desarrollo, y se pueden aplicar usando a todo el individuo o slo parte
de l. Se habla de marcadores genticos cuando se transmiten segn las leyes bsicas de la
herencia mendeliana, por lo que es importante destacar que no todos los marcadores
moleculares pueden considerarse como genticos. Existen dos tipos de marcadores
moleculares: los marcadores bioqumicos y los marcadores de ADN (Sols & Andrade,
2005).
Marcadores bioqumicos.
Los marcadores bioqumicos incluyen a las protenas y las isoenzimas o aloenzimas y
constituyen la primera generacin de marcadores moleculares. Las protenas son los
productos primarios de los genes y se forman mediante los procesos de transcripcin y
traduccin, por lo que se ven menos influidos por el ambiente. Las isoenzimas fueron
descubiertas por Hunter y Markert en 1957 y son diferentes variantes moleculares de una
misma enzima presentes en una especie, las cuales desempean la misma actividad pero
pueden tener diferentes propiedades.
Las isoenzimas se identifican mediante el proceso denominado electroforesis, que
consiste en colocar un extracto proteico del material a analizar en los pocillos de un soporte
(papel de celulosa o un gel hecho de agarosa o poliacrilamida) que se somete a un campo
elctrico durante varias horas para que se separen las protenas de acuerdo con su tamao o
carga elctrica. Una vez concluida la emigracin de las protenas por medio del frente de
corrida denominado Kohlrasusch, el gel es colocado en una solucin que contiene los
compuestos qumicos necesarios (colorantes) para que se lleve a cabo una reaccin y se
puedan observar posteriormente las isoenzimas en forma de bandas de color en el soporte o
gel. Las diferencias en la movilidad electrofortica de las isoenzimas son resultantes de las
diferencias en las secuencias del ADN que codifican tales enzimas.
Marcadores de ADN.
Los marcadores de ADN constituyen la nueva generacin de marcadores moleculares y
solucionaron el problema de la carencia de marcadores que tenan las isoenzimas, pues son
capaces de generar una cantidad virtualmente infinita de marcadores. Existen varias
tcnicas para identificar marcadores de ADN, las que se pueden agrupar en tres categoras:
las de hibridacin tipo Southern, las de reaccin de polimerizacin en cadena (PCR) y las
que combinan PCR o sus productos de ADN con la hibridacin tipo Southern.
La hibridacin consiste en la formacin de una molcula de doble cadena mediante el
apareamiento o unin de bases complementarias de dos molculas de una sola cadena. La
hibridacin tipo Southern explora las variaciones en la longitud o tamao de los fragmentos
de ADN ocasionadas por la restriccin del genoma mediada por una enzima particular
(endonucleasa). Esta tcnica comprende las siguientes etapas: primero se extrae el ADN del
material que deseamos estudiar; luego se le adicionan enzimas de restriccin
(endonucleasas), las cuales cortan el ADN en fragmentos de diferente longitud; estos
fragmentos son separados en geles de agarosa, para despus realizar por capilaridad o al
vaco la transferencia de los fragmentos a una membrana de papel de nitrocelulosa o de
nylon (transferencia tipo Southern). Finalmente, se hibridizan los fragmentos de la
membrana con sondas marcadas (radiactiva o no radiactivamente) para visualizar y detectar
las bandas hibridadas.
Dentro de esta tcnica se encuentran los marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de
los fragmentos de restriccin) y los VNTR (secuencias adyacentes que se repiten en
nmero variable).
La tcnica de PCR, o reaccin en cadena de la polimerasa, es una tecnologa utilizada para
multiplicar (sintetizar) in vitro fragmentos especficos de ADN con la finalidad de detectar
una secuencia o gen de inters en el genoma del individuo en estudio. Se basa en la
amplificacin de fragmentos de ADN a partir de secuencias de nucletidos denominadas
cebador (primer), que son capaces de reconocer una secuencia blanco para la cual es
complementaria.
Anemia falciforme.

La anemia falciforme es una enfermedad hereditaria, producida por la presencia de la
hemoglobina S en su forma homocigoto (Hb
s
Hb
s
), que produce un cambio de aminocidos
en la posicin 6 de beta globina normal, cambiando cido glutamico por valina, lo que
disminuye la solubilidad de la protena, de tal manera que la hemoglobina S forma
polmeros produciendo un glbulo rojo en forma de hoz. Esta caracterstica produce la
vaso-oclusin, as como la liberacin del grupo hemo, que interacciona con la membrana de
los glbulos rojos, causando hemlisis con la consecuente anemia. La enfermedad est
acompaada de varios sntomas caractersticos. La herencia de esta hemoglobina, sigue las
leyes mendelianas, de tal manera, que si un progenitor es portador de la hemoglobina S y el
otro no, lo probable es que la mitad de los hijos sean portadores de la HbS, en cada
gestacin hay una probabilidad del 25% de que el nio sea normal, una probabilidad de un
50% de que sea portador de HbS y un 25% de probabilidad de que el nio tenga
enfermedad falciforme por HbS. Los mtodos de identificacin de hemoglobina S son
electroforticos o cromatogrficos, utilizndose tambin en la actualidad mtodos de
anlisis del ADN del genotipo (Bustamante, Z. 2002).




5. MATERIALES VIRTUALES.

Software:
Laboratorio virtual de biologa molecular Cibertorio.

Reactivos virtuales:

Enzimas de restriccin.
Grupo de muestras para diagnstico gentico, que contiene las siguientes muestras
de DNA:
DNA del gen de globina de una persona homocigtica normal (representada
como AA o WW).
DNA del gen de globina de una persona homocigtica falciforme
(representada como SS).
Cuatro muestras de DNA de pacientes cuyo genotipo se pretende averiguar
(designadas Pt1, Pt2, Pt3 y Pt4).
Marcador de masa molecular de DNA.
Tampn universal de restriccin 10x.
Agua.
Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 L
Agarosa.
Tampn de electroforesis TBE (Tris/Borato/EDTA).
Bromuro de etidio.
Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol, xileno-cianol
y glicerol).

Instrumentacin virtual:

Micropipeta variable hasta 100 L.
Incubador con regulacin de temperatura BobCo Temp-O-Matic
TM

Cubeta de electroforesis horizontal en agarosa BobCo Gel-O-Matic
TM

Fuente de corriente continua BobCo 1000ZX
TM
(de 10 a 1000V)
Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)
Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV

6. METODOLOGIA DEL TRABAJO:

Ingresar al laboratorio virtual.
Llenar el formulario de registro y escoger el tema en el que se va a proceder a
trabajar.
De acuerdo al tema escoger cuatro enzimas de corte.
Se debe proceder a trabajar en el laboratorio de acuerdo a las instrucciones que
fueron indicadas antes.
Llenar los tubos de ensayo con 10 L de cada muestra de ADN, 4 L de solucin
tampn 10x, 25 L de agua y 1 L de una enzima de corte.
Despus de haber llenado los tubos de ensayo con las muestras de ADN, con las
enzimas de corte, la solucin tampn y el agua, se procede a incubar por 30 minutos.
Despus de haber transcurrido este tiempo se debe cargar las muestras para realizar
la electroforesis, para lo cual se debe calibrar los voltios y el tiempo.
Despus de haber realizado la corrida electrofortica se ven los resultados.
Si las enzimas de corte que se escogieron no cortaron ningn segmento de ADN, se
deben escoger otras enzimas de corte y probar hasta ver cules son las que nos
indican en donde estn las mutaciones en el ADN.
Interpretar los resultados de acuerdo a lo que se obtuvo.
Para el laboratorio de secuenciacin en cada tubo de ensayo se coloca una cantidad
cualquiera de ADN, se pone a incubar por 30 minutos.
Despus que ha transcurrido este tiempo se calibra los voltios a 1000 y un tiempo de
1 hora, se autocarga las muestras y se prende el detector.
Con los resultados obtenidos se interpreta los resultados.
Para el anlisis de secuenciacin se va a la base de datos de Bob Co en los que se
escoge las secuencias de nucletidos.
Con esta secuencia de nucletidos se puede realizar la traduccin de ARNm y l
traduccin de protenas; adems con esta secuencia se hace el mapeador de
restriccin, utilizando las diferentes enzimas de restriccin antes usadas.

7. RESULTADOS.

Laboratorio de electroforesis
Primeramente se procedi a determinar la enzima de restriccin que nos serva para
identificar el fragmento de ADN que diferenciaba a las personas sanas de las que tenan
anemia falciforme.


La prueba se realiz con la enzima Bsu 36I y la enzima Dde I, las cuales se agregaron a
todas las muestras de ADN, con esta enzima se pudo observar que la muestra PT3 es la que
tiene la enfermedad de la anemia drepanoctica, porque tiene la misma en la corrida
electrofortica presentan las mismas bandas que la muestra de ADN SS que es el que tiene
la enfermedad.

Laboratorio de secuenciacin
Despus de haber realizado la corrida con las diferentes muestras de ADN se obtuvo el
siguiente esquema en el que se puede observar en que bases difieren las muestras sanas de
las que padecen la enfermedad.
Con esto se pudo determinar que la muestra AA presenta una banda adicional en Adenina,
por lo que la muestras SS y PT3 padecen de la enfermedad de anemia drepanositica;
anlisis las muestras AA y Pt1 carecen de una banda en Timina




Anlisis de secuenciacin
Para en anlisis de secuenciacin se tomo la base de datos de Bob Co, en los que se busco
donde se encuentra la mutacin que produce la anemia drepanositica.
Alelo normal
TCC TAA GCC AGT GCC AGA AGA GCC AAG GAC AGG TAC GGC TGT CAT CAC TTA
GAC CTC ACC CTG TGG AGC CAC ACC CTA GGG TTG GCC AAT CTA CTC CCA GGA
GCA GGG AGG GCA GGA GCC AGG GCT GGG CAT AAA AGT CAG GGC AGA GCC ATC
TAT TGC TTA CAT TTG CTT CTG ACA CAA CTG TGT TCA CTA GCA ACC TCA AAC
AGA CAC CAT GGT GCA CCT GAC TCC TGA GGA GAA GTC TGC CGT TAC TGC CCT
GTG GGG CAA GGT GAA CGT GGA TGA AGT TGG TGG TGA GGC CCT GGG CAG GTT
GGT ATC AAG GTT ACA AGA CAG GTT TAA GGA GAC CAA TAG AAA CTG GGC ATG
TGG AGA CAG AGA AGA CTC TTG GGT TTC TGA TAG GCA CTG ACT CTC TCT GCC
TAT TGG TCT ATT TTC CCA CCC TTA GGC TGC TGG TGG TCT ACC CTT GGA CCC
AGA GGT TCT TTG AGT CCT TTG GGG ATC TGT CCA CTC CTG ATG CTG TTA TGG
GCA ACC CTA AGG TGA AGG CTC ATG GCA AGA AAG TGC TCG GTG CCT TTA GTG
ATG GCC TGG CTC ACC TGG ACA ACC TCA AGG GCA CCT TTG CCA CAC TGA GTG
AGC TGC ACT GTG ACA AGC TGC ACG TGG ATC CTG AGA ACT TCA GGG TGA GTC
TAT GGG ACC CTT GAT GTT TTC TTT CCC CTT CTT TTC TAT GGT TAA GTT CAT GTC
ATA GGA AGG GGA GAA GTA ACA GGG TAC AGT TTA GAA TGG GAA ACA GAC GAA
TTC
Traduccin de protena:
Los cdigos de loa aminocidos que estn formando la protena se detalla a continuacin:

S.ASARRAKDRYGCHHLDLTLWSHTLGLANLLPGAGRAGARAGHKSQGRAIYCLHLLLTQ
LCSLATSNRHHGAPDS.GEVCRYCPVGQGERG.SWW.GPGQVGIKVTRQV.GDQ.KLGMWR
QRRLLGF..ALTLSAYWSIFPPLGCWWSTLGPRGSLSPLGICPLLMLLWATLR.RLMARKCSV
PLVMAWLTWTTSRAPLPH.VSCTVTSCTWILRTSG.VYGTLDVFFPLLFYG.VHVIGRGEVTG
YSLEWETDEF
ALELO MUTADO
TCC TAA GCC AGT GCC AGA AGA GCC AAG GAC AGG TAC GGC TGT CAT CAC TTA
GAC CTC ACC CTG TGG AGC CAC ACC CTA GGG TTG GCC AAT CTA CTC CCA GGA
GCA GGG AGG GCA GGA GCC AGG GCT GGG CAT AAA AGT CAG GGC AGA GCC ATC
TAT TGC TTA CAT TTG CTT CTG ACA CAA CTG TGT TCA CTA GCA ACC TCA AAC
AGA CAC CAT GGT GCA CCT GAC TCC TGT GGA GAA GTC TGC CGT TAC TGC CCT
GTG GGG CAA GGT GAA CGT GGA TGA AGT TGG TGG TGA GGC CCT GGG CAG GTT
GGT ATC AAG GTT ACA AGA CAG GTT TAA GGA GAC CAA TAG AAA CTG GGC ATG
TGG AGA CAG AGA AGA CTC TTG GGT TTC TGA TAG GCA CTG ACT CTC TCT GCC
TAT TGG TCT ATT TTC CCA CCC TTA GGC TGC TGG TGG TCT ACC CTT GGA CCC
AGA GGT TCT TTG AGT CCT TTG GGG ATC TGT CCA CTC CTG ATG CTG TTA TGG
GCA ACC CTA AGG TGA AGG CTC ATG GCA AGA AAG TGC TCG GTG CCT TTA GTG
ATG GCC TGG CTC ACC TGG ACA ACC TCA AGG GCA CCT TTG CCA CAC TGA GTG
AGC TGC ACT GTG ACA AGC TGC ACG TGG ATC CTG AGA ACT TCA GGG TGA GTC
TAT GGG ACC CTT GAT GTT TTC TTT CCC CTT CTT TTC TAT GGT TAA GTT CAT GTC
ATA GGA AGG GGA GAA GTA ACA GGG TAC AGT TTA GAA TGG GAA ACA GAC GAA
TTC
Traduccin de protena:
S.ASARRAKDRYGCHHLDLTLWSHTLGLANLLPGAGRAGARAGHKSQGRAIYCLHLLLTQ
LCSLATSNRHHGAPDSCGEVCRYCPVGQGERG.SWW.GPGQVGIKVTRQV.GDQ.KLGMW
RQRRLLGF..ALTLSAYWSIFPPLGCWWSTLGPRGSLSPLGICPLLMLLWATLR.RLMARKCS
VPLVMAWLTWTTSRAPLPH.VSCTVTSCTWILRTSG.VYGTLDVFFPLLFYG.VHVIGRGEVT
GYSLEWETDEF
Mapeador de restriccin
Para el mapeador de restriccin se utilizaron las secuencias de nucletidos que se mostraron
antes con estas secuencias se procedi a ver los puntos en los que cortaron las diferentes
enzimas de restriccin que se utilizaron.
Alelo normal con enzima Bsu 36I


Alelo mutado con enzima Bsu 36 I


Alelo normal con enzima Dde I

Alelo mutado con enzima Dde I

8. CONCLUSIONES:

8.1. Se determin que para la anemia drepanoctica solo existen tres enzimas de
restriccin que nos permiten la identificacin de la misma y estas son: Bsu 36I,
Dde I y Sau I, las enzimas que utilizamos para poder identificar los individuos que
poseen la enfermedad son Bsu 36I y Dde I.

8.2. Se observ que el individuo PT3 posee anemia falciforme, los individuos PT2 y
PT4 son portadores de la misma y solo el individuo PT1 es sano.

8.3. No se encontr gran presencia de individuos enfermos debido a que solo 1 de los 4
individuos posee la enfermedad, esto nos indica que un 25% de los individuos
posee la enfermedad, un 50 % son portadores y un 25% son sanos.

8.4.


9. RECOMENDACIONES:

9.1. Tenemos que probar con cada una de las enzimas para poder determinar las
enzimas de corte que nos ayudaran para la identificacin de la enfermedad y de los
individuos portadores.

9.2. Se debe tener mucho cuidado al momento de la preparacin de los tubos, para que
no se ponga dos veces un componente en un tubo, ya que esto nos puede generar
errores.

9.3. Se debe tener mucho cuidado al momento de manejar las muestras para no
contaminar los tubos, para esto se debe cambiar de punta cada vez que se cambie
de muestra.

10. BIBLIOGRAFIA:

Rueda, D. 2011. Gentica General. La Electroforesis. Tercera Edicin. Quito,
Ecuador. P.: 152.

Bustamante, Z. 2002. Gentica. Caractersticas de la Hemoglobina S, Anemia
Falciforme Y Haplotipos. En lnea. Disponible en
(http://www.umss.edu.bo/epubs/earts/downloads/ 85.pdf 2002). Consultado el 14-
01-2012.

GENETICAE. 2009. Enfermedades genticas y diagnostico gentico. En lnea.
Disponible en (http://www.riesgogenetico.com/). Consultado el 12-01-2012.

Morales, I. 2008. Electroforesis. En lnea. Disponible en
(http://depa.pquim.unam.mx/amyd/.../Exposicion_electroforesis_5087.pdf)
Consultado el 12-01-2012.

Sols, L. & Andrade, A. 2005. Qu son los marcadores moleculares? En lnea.
Disponible en
(http://www.uv.mx/cienciahombre/revistae/vol18num1/articulos/moleculares/index.
htm) Consultado el 12-01-2012.

Annimo. 2012. Diagnostico gentico. En lnea. Disponible en
(http://www.progenie-molecular.com/Servicio_Diagnostico_DG_ES.html).
Consultado el 13-01-2012.


11. ANEXOS: