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OPTIMIZACIN DEL PROCESO DE BIOSEPARACIN DE

PIGMENTOS ORGANICOS A PARTIR DE DOS VARIEDADES DE


ROSA DE JAMAICA (nova y reina real) y CEREZO BELICEO PARA LA
INDUSTRIA DE ALIMENTOS ACIDOS.
BIOSEPARATION PROCESS OPTIMIZATION OF ORGANIC
PIGMENTS FROM TWO VARIETIES OF JAMAICA ROSE (Real Queen
and nova) and BELIZEAN CHERRY FOR ACID FOOD INDUSTRY.
Rafael Armando Zaldaa Deras
Universidad Nueva San Salvador, Facultad de Ciencias de la Salud, Escuela de
Qumica y Farmacia. San Salvador El Salvador, Centro America
rahzeldet@hotmail.com.
Resumen
La investigacin en el campo de los pigmentos naturales provenientes de flores y frutos,
permite establecer el potencial de estos como alimento con propiedades biofuncionales y el
desarrollo de productos con valor agregado que puedan ser usados como colorantes naturales.
Se cuantificaron dichos pigmentos y se evalu la estabilidad a diferentes valores de
temperatura (5 C 45 C, 86 C y 100 C T) y pH (3 y 5) condiciones de iluminacin utilizando
espectrofotometra ultravioleta-visible. Esto se realiz para determinar si posean las
caractersticas para ser utilizados como alternativas naturales de consumo de colorantes
sintticos como el Rojo No.40 que se utiliza en la industria de alimentos de carcter cido como
las salsas o los jugos de frutas. Los Extractos etanlicos de las dos variedades de rosa de
jamaica y del fruto del rbol de cerezo beliceo se liofilizacin y se adicionaron en
concentraciones de 0.02, 0.05, 0.10, 0.25 y 0.30g en sistemas modelo de bebidas en base a
bebidas comerciales con el fin igualar parmetros de color y pH para poder ser utilizados como
alternativa de colorantes. Se determino por un mtodo cromatogrfico que permiti la
identificacin del compuesto antocinico por medio de la tcnica HPLC-DAD
Se determin que nicamente los pigmentos presentes en la rosa de jamaica variedad reina
real pH 3 y 5 presentan las caractersticas para ser utilizados como alternativas naturales del
colorante artificial Rojo No.40 para alimentos cidos,
Abstract
Research in the field of natural pigments from flowers and fruit sets the potential of these as
food with biofunctional properties and the development of value added products that can be
used as natural dyes. These pigments were measured, the stability was evaluated at different
temperatures (5 C 45 C, 86 C and 100 C T) and pH (3 and 5) lighting conditions using
UV-visible spectrophotometry. This was done to determine whether the characteristics had to
be used as natural alternatives to use of synthetic dyes such as Red No.40 used in the food
industry as acidic sauces or fruit juices. The ethanolic extracts of both varieties of hibiscus pink
and the fruit of the cherry tree Belize is lyophilization and were added at concentrations of 0.02,
0.05, 0.10, 0.25 and 0.30g in model beverage systems on commercial drinks to matching color
and pH parameters to be used as an alternative to dyes. It was determined by a
chromatographic method that allowed the identification of anthocyanin compound by HPLC-
DAD technique It was determined that only the pigments in jamaica rose queen royal variety pH
3 and 5 have the characteristics to be used as natural alternatives to artificial colors Red No.40
acidic foods
I. Introduccin
El color es la primera sensacin que se percibe de un alimento, y la que determina el
primer juicio sobre su calidad. Es tambin un factor importante en el conjunto de
sensaciones que aporta el alimento y tiende, a veces, a modificar subjetivamente otras
sensaciones como el sabor y el olor. Gran parte de estos efectos est unido a que los
consumidores esperan, exigen y prefieren colores determinados en alimentos
especficos, adems de esperar que stos sean constantes entre lotes de fabricacin,
as como estables en el tiempo de conservacin.
Las antocianinas son colorantes naturales permitidos por la Comunidad Econmica
Europea pero no por la Administracin de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos de
Estados Unidos (FDA). Estos compuestos proporcionan un amplio espectro de
beneficios a la salud, debido a su capacidad antioxidante, presentan la propiedad de
prevenir y combatir enfermedades del corazn y varias formas de cncer, por ser
colorantes naturales no requieren certificacin.
La Rosa de jamaica
Es una planta anual, herbcea, de la familia de las Malvceas, que generalmente
alcanza de 1 a 2 mts de altura. La rosa de jamaica tiene los tallos, pecolos de las
hojas y clices de un color rojo oscuro o claro, tendiendo a morado o lila y las
variedades que generalmente son productoras de fibra tienen una coloracin verde o
amarillenta.
En la mayora de variedades las hojas son verdes con nervaduras rojas, siendo las
inferiores enteras y lanceoladas y las superiores palmeadas.
El nombre botnico o cientfico de la rosa de jamaica es Hibiscus sabdariffa L.
Los nombres comunes, populares o sinnimos son: rosa de jamaica, flor de dardo,
rosa de Jeric, t rojo, rosella, flor de jamaica, flor roja, de sus tallos, especialmente la
variedad Altsima, se obtiene una fibra de mejor calidad que la del Kenaf (Hibiscus
cannabinus), que puede sustituir al yute en la fabricacin de cordeles y sacos para
envasar productos agrcolas.
(1)
El Cerezo beliceo (Syzygium cumini Lamarck), tambin conocido como Jambolan
pertenece a familia Myrtaceae.
Originario de la India, Es un frondoso rbol que produce pequeos frutos ovoides de
color prpura al madurar, como una aceituna. El sabor es suave, sin aroma fuerte,
aunque un poco astringente al paladar.
(2)
.
En la India, adems de ser consumido la pulpa fresca de jambolan tambin se utiliza
en la produccin de pasteles. Las hojas en t y las semillas como especies, tambin
es bien conocido en la medicina popular de la India, principalmente por los efectos
hipoglucemiantes. Por otra parte diversos estudios reportan que el tratamiento con
extracto de semilla de jambolan reduce los niveles de glucosa en sangre en ratas
diabticas. Sin embargo, de acuerdo con Oliveira y colegas (2005) el extracto de las
hojas de jambolan no tiene el mismo efecto, la corteza se usa contra la disentera,
leucorrea y sangrado, en forma de decoccin.
Los colorantes naturales han sido ampliamente utilizados en la preparacin de
alimentos y bebidas, y siguen siendo a nivel mundial una contribucin significante en
la preparacin y procesamiento de los mismos.
Aunque el trmino colorante natural pueda prestarse a confusin, normalmente se
aplica a productos de origen animal, vegetal o incluso mineral en los cuales se
encuentra de forma tambin natural.
(3)
.
Los alimentos naturales tienen su propio color y lo ideal sera que se mantuviera
a lo largo del proceso de manipulacin e industrializacin, pero la mayora de veces no
es as. Sin embargo, los consumidores prefieren en determinados alimentos un color
constante, que no vare en los diferentes lotes de fabricacin de un producto y esto
solo puede obtenerse modificndolo de forma artificial
Los flavonoides son un amplio grupo de sustancias vegetales que fueron descubiertas
por el Dr. Albert Szent-Gyorgi, premio Nobel en Bioqumica, quien les denomin como
"vitamina P". El Dr. Szent-Gyorgi descubri que los flavonoides favorecen la funcin de
la vitamina C, mejorando su absorcin y protegindola de la oxidacin. Comprenden
varias clases de sustancias naturales, entre las cuales estn muchas de las que les
confieren colores amarillos, naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas y
frutos, especialmente.
Su esqueleto bsico es el difenilpropano (C6-C3-C6), consta de dos grupos fenilo (A y
B) unidos por un puente de tres carbonos que forma un anillo heterocclico oxigenado
(anillo C) (Fig. N 1)
Estructura qumica del esqueleto bsico de los flavonoides. (Fig. N 1)
Antocianinas
Generalidades
Las antocianinas (del griego anthos flor y kyanos azul), son el grupo ms importante
de pigmentos solubles al agua visibles para el ojo humano. Las antocianinas forman
parte de la familia de los polifenoles y se definen como flavonoides fenlicos. Los
colores rosa, rojo, azul, malva violeta de las flores, frutas y verduras se deben a la
presencia de estos pigmentos. Estructuralmente son glicsidos de polihidroflavilio en
los cuales la unin glicosdica esta principalmente en C-3.
Las antocianinas representan un factor importante en la industria alimenticia debido a
las restricciones sanitarias hacia el uso de colorantes sintticos, adems son
hidrosolubles, por lo que su incorporacin en sistemas acuosos alimentarios.
Figura 2. Purificacion del colorante por medio de Columnas Hypersep C18
2. Materiales y Mtodos
2.1 Extraccin
(20), (21), (19)
Realizar la extraccin por Maceracin usando los solventes: (agua), (agua, etanol al
30%, relacin 50:50 v/v) (agua, etanol al 70% relacin 70:30 v/v), y (etanol al 90%-
HCL 1.0 % 85:15 v/v).
Se utilizarn 2.0g de material vegetal; se sumergirn en las soluciones de los
diferentes solventes y se mantendr en refrigeracin durante una noche.
Las mezclas se cubrirn, con papel aluminio y se mantendr en agitacin a
temperatura ambiente durante dos horas; posteriormente, se filtra en un embudo
Bchner a travs de papel Whatman No 1, de acuerdo al mejor rendimiento del
solvente ese ser utilizado para experimentacin.
2.2 Purificacin del pigmento
(20), (21), (19)
El extracto obtenido anteriormente contiene la antocianina de inters pero a su vez
contiene interferencias para su anlisis tales como fenlicos, azcares y cidos por lo
que para eliminarlas se utiliza el siguiente mtodo:
1. Resina PVPP (Polivinil-poli-pirrolidona).- Su uso principalmente seenfoca al
aislamiento de compuestos polares no fenlicos. Esteprocedimiento consiste
en colocar en un embudo Buchner un filtroWhatman No.1 junto con una capa
de 1 cm de la resina. sta se activa por medio de agua acidificada al 1.0 % de
HCl seguido de etanol acidificado al 1.0 %. El extracto se pasa por la resina
recuperando la antocianina con el etanol acidificado. Posteriormente se
concentra la antocianina purificada evaporando en Rotavapor Bchi a 40C
para eliminar la porcin etanlica.
2. Cartuchos fase reversa C18. Su propsito es separar compuestos
relativamente hidrofbicos como las antocianinas, de azcares y cidos.Se
acondiciona el cartucho con 10 ml de agua acidificada seguido de 25 mL de
etanol acidificado y 10 mL de agua acidificada de nuevo, para remover el
etanol restante. Se filtra el extracto obtenido de la PVPP y se lava el cartucho
con etanol acidificado en un matraz Kitasato; en seguida se eluye la
antocianina por el cartucho por medio de etanol acidificado en otro kitasato.
Como siguiente paso, se remueve el etanol para obtener el extracto puro por
medio de un rotavapor Bchi a 40 grados centgrados.
2.3. Evaluacin de la Estabilidad de los Pigmentos Naturales.
2.3.1. Efecto Temperatura.
(13), (18)
Para la evaluacin de la estabilidad trmica del pigmento a partir de los extractos
etanlicos se preparan las siguientes soluciones:
Se toma con una pipeta volumtrica 10 mL de extracto de cada muestra, se pasa a un
baln volumtrico de 100 mL y se afora con agua destilada.
Procedimiento:
En 5 tubos de ensayo Pyrex
Se ponen 10 ml de solucin al 10 % de extracto etanlicos muestra A: Rosa de
jamaica variedad Nova
Y se rotulan de la siguiente forma:
Se someten de acuerdo a las temperaturas y los diferentes intervalos de tiempo en
una estufa Tabla N 1
Cuando se termina el intervalo de tiempo de los tubos, fueron retirados y rpidamente
enfriados en un bao de hielo, realizar el anlisis del contenido de pigmento
antocinico monomrico (CPAM mg/L) para determinar la estabilidad (degradacin)
del pigmento por temperatura.
Se efecta el mismo procedimiento para las muestras:
B: rosa de jamaica variedad reina real
C: cerezo beliceo
2.3.2. Efecto del pH
(15)
,
(17)
Evaluar las muestras a dos valores de pH (3 y 5) y temperatura de 35 C para ello se
utiliza una estufa calibrada para mantener dicha temperatura. Esta debe de estar
conectada durante todo el proceso experimental. Analizar las muestras en el
espectrofotmetro UV-Vis a una longitud de onda de 540 nm
Procedimiento:
Aadir 20 mL de solucin buffer pH 3 a 9 tubos de 30 mL y seidentificaron como TpH3
Mx.
Aadir 20 mL de solucin buffer pH 5 a 9 tubos de 30 mL y se identifican como TpH5
Mx.
Se agrega 5 ml del extracto de cada muestra. Determinar las absorbancia para cada
uno de los tubos diariamente (excepto sbado y domingo) durante 10 das
A continuacin se presenta la Tabla N 2 Efecto del pH para las diferentes muestras.
Evaluar el colorante sinttico Rojo N 40 FD&C como se tratan las muestras hacer una
curva de calibracin de 1 ppm a 10 ppm.
2.3.3. Iluminacin y Oscuridad
(14), (16)
La estabilidad de los pigmentos depende de factores como, pH, temperatura,
oxgeno, luz, etc.
Investigaciones recientes demostraron que existen pigmentos con ciertas
caractersticas, presentando una mayor estabilidad y otros con menor estabilidad.
La luz afecta a los pigmentos en dos formas diferentes: la luz es esencial para
la biosntesis de estos, pero tambin acelera su degradacin.
Procedimiento:
En 3 botellas PET de 200 mL se agrega 150 mL de buffer pH 3, y se agregan
50 ml de extracto etanlico de las 3 muestras en anlisis. Se homogeniza la solucin y
se almacena en la oscuridad a temperatura de 8 C por 10 das se cuantifica el
(CPAM mg/L) para observar la degradacin del pigmento.
En 3 botellas PET de 200 mL se agrega 150 mL de buffer pH 5, y se agregan
50 ml de extracto etanlico de las 3 muestras en anlisis. Se homogeniza la solucin y
se expone a la luz solar y a temperatura ambiente por 10 das se cuantifica el (CPAM
mg/L) para observar degradacin del pigmento.
2.4. Ensayos fsicos y qumicos preliminares.
2.4.1. Determinacin de un espectro de absorcin
(9), (23)
Se determin, con ayuda del espectrofotmetro, la medida de la transmitancia.
Las mediciones de las transmitancias se realizaron a diferentes longitudes de onda
que van desde 450nm a 700nm (intervalo correspondiente al rango visible).
2.4.2 Espectro infrarrojo de la fraccion colorante
(9), (23)
Para obtener el espectro infrarrojo de los extractos de las muestras se uso un FT-IR,
marca Perkin-Elmer modelo FT-IR spectrum RX-1 ATR accessories; la muestra se
analiz directamente.
Del extracto obtenido con etanol + HCL 1% se realizara la lectura de la muestra en el
infrarrojo de la siguiente manera:
1. Se realizara un barrido de Background desde 4,500 cm-1 a 450 cm-1
Colocar una cubierta de acero inoxidable sobre el ATR
Homogenizar
Colocar la muestra de extracto colorante en un ATR (placa seleniuro de zinc
transparente al Infrarrojo). Correr el espectro e imprimir.
2.4.3 Determinacin de la concentracin de antocianinas por medio del mtodo
de pH diferencial (CPAM mg/L)
(12), (17)
- Calentar el equipo, encendindolo 30 min antes de iniciar las lecturas.
- Calibrar el equipo usando agua destilada.
- Tomar 300 L del extracto etanlico y mezclar con 600 L de buffer pH:1.0, depositar
en una cubeta
- Tomar 300 L del extracto etanlico y mezclar con 600 L de buffer pH:4.5, depositar
en una cubeta.
- Se lee la absorbancia de cada una de las mezclas colocadas en las cubetas en un
rango de 400- 700 nm, de tal manera que la absorbancia sea menor de
0,8 UA.
- Se toma la lectura de los picos ms altos a pH. 1.0 y a pH: 4.5, as como las lecturas
a 700 nm.
La concentracin de antocianinas se calcula mediante la siguiente ecuacin:
A= (A vis-mx - A 700nm) pH: 1.0 - (A vis-mx - A 700nm) pH: 4.5
A vis-mx: Es la lectura del pico ms alto a pH: 1.0 y a pH: 4.5
A 700nm: Es la lectura a 700 nm tanto a pH: 1.0 y a pH: 4.5
La concentracin de la antocianina expresada como cianidina- 3,5- diglucsido en la
muestra original se determina con la siguiente frmula.
C = (mg/L) = (A) * PM * (1000/)FD
Donde:
PM 646.70: Es la masa molecular de la cianidna-3,5 -diglucsido.
: Es la absortividad molar. (41120 g/mol. cm)
FD: Es el factor de dilucin.
2.4.4 Anlisis Cualitativos
Investigaciones de taninos
(8)
Se extraer 10.0g de material vegetal pulverizado con 30mL de etanol o metanol al
80%; se filtrara y evaporara a sequedad. Se aadir 25mL de agua caliente al residuo
y se agitara con varilla de vidrio y se dejara enfriar. Agregar 1mL de solucin de
cloruro de sodio al 10 % y se filtrara. Se adicionara 3mL del filtrado a 4 tubos de
ensayo:
Tubo 1: testigo.
Tubo 2: agregar 4 a 5 gotas de solucin de gelatina al 1 % (p/v).
Tubo 3: agregar 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1 % de gelatina y cloruro de sodio al
10%).
Tubo 4: agregar 3 a 4 gotas de solucin de cloruro frrico al 10 % (p/v).
Deteccin:
Observar la formacin de precipitado y/o cambio de coloracin.
Con cloruro frrico: grisceo-negro: catecol; negro-azulado: pirogalol.
2.4.5 Investigaciones de flavonoides y antocianinas.
(8),
Ensayos macro y semimicro:
Extraer 2.0g de material vegetal pulverizado con 10mL de etanol o metanol al 80 %,
filtrar y concentrar. Enfriar a temperatura ambiente y hacer lavados en una ampolla de
separacin con 15mL de ter de petrleo hasta que la extraccin sea incolora.
Concentrar el extracto etreo en hot plate hasta que el ter se evapore, disolver el
residuo en 30mL de metanol al 80 %, filtrar y dividir en 6 tubos:
Tubo 1: agregar 0.5mL de cido sulfrico concentrado.
Tubo 2: agregar 3 a 5 gotas de cloruro frrico al 10 % (p/v).
Tubo 3: agregar 0.5mL de cido clorhdrico concentrado y calentar en bao de mara
por 5 minutos (prueba para leucoantocianinas).
Tubo 4: agregar magnesio metlico y 0.5mL de cido clorhdrico concentrado.
Tubo 5: agregar un lcali a un extracto acuoso.
Tubo 6: agregar solucin de cido brico en anhdrido actico.
Tubo 7: testigo.
Deteccin:
Evaluar las reacciones, cambios de color y/o formacin de precipitado comparados
con el testigo.
Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo),
flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul),
isoflavonas (amarillo); isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloracin.
2.4.6 Anlisis Cuantitativos.
(7)
Anlisis cuantitativo por espectrofotometra UV-VIS.
Tratamiento de muestra
Pese 1g de muestra seca y molida en un baln volumtrico de 50 mL, aada 20 mL de
etanol al 80%. Lleve al ultrasonido por 30 minutos a temperatura de 60 C (o utilice un
hot plate). Filtre, recogiendo el extracto en un baln volumtrico de 25 mL y lleve a
volumen con etanol al 80%.
En una baln volumtrico de 10 mL coloque 100 L del extracto, 200 L de solucin
de acetato de potasio 1M y 200 L de nitrato de aluminio al 10% y lleve a volumen con
etanol al 80%.
Deje reposar por 40 minutos y proceda a leer a 415 nm.
Preparacin de curva de calibracin
Pese 2,7 mg de quercetina en un baln volumtrico de 10 mL y lleve a volumen con
etanol al 80%. Tome 700 L, 350 L, 175 L y 100 L en 4 balones volumtricos de 10
mL, y aada en cada uno 200 L de acetato de potasio 1M y
200 L de nitrato de aluminio al 10% en cada uno; finalmente lleve a volumen con
etanol al 80%.
Proceda a leer a 415 nm cada solucin y elabore la curva estndar.
Calcular el contenido de flavonoides totales, segn la ecuacin:
Q = Flavonoides totales, expresados como quercetina (%)
A = Absorbancia de la solucin muestra
m = Peso de la droga vegetal
Pd = Porcentaje de humedad (%).
Fenoles totales.
(24), (7)
Procedimiento:
1 En el caso de extractos se efecta una dilucin de 10 mL de muestra a 100 mL con
agua. Se emplea 1 mL de esta dilucin.
2. En un matraz de 100 mL se vierte 1 mL de la solucin anterior.
3. Se aaden 60mL de agua destilada y se agita.
4. A continuacin se adicionan 5 mL del reactivo de Folin- Ciocalteu, se agita bien y se
deja en reposo unos 2-3 minutos.
5. Se aaden 15 mL de solucin de carbonato sdico, se completa a volumen con
agua y se deja en reposo 2 horas a 20 C
6. Se determina la absorbancia a 765 nm, en cubetas de 10 mm de paso de luz.
7. Conviene preparar una curva de calibracin, empleando la solucin stock de cido
glico. Para ello, en matraces de 100 mL se vierten: 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 10 mL de la
solucin stock de fenol y se completa el volumen con agua destilada.
La concentracin de fenol en estos matraces, expresada como equivalente en cido
glico, es de 0, 50, 100, 150, 250 y 500 g/mL.
8. Con estas soluciones patrn se opera como se indica en el paso 2) y sucesivos.
Con base en la curva patrn se obtuvo la siguiente ecuacin de la recta:
Al obtener los Eq de cido glico se calcul los valores de Eq cido glico por mililitro
de jugo, de la siguiente forma:
2.4.7 Acidez Titulable
(6)
Tratamiento de muestra
Se determin en beakeres de 250ml con una muestra de 5.0g diluida en 25 mL de
agua destilada, adicionndose 4 gotas de fenolftalena y homogenizndose todo. La
mezcla se titul con hidrxido de sodio valorado 0.1N, hasta alcanzar (vire de
fenolftalena). El % de acidez de expres como porcentaje de cido ctrico,
calculndose con la siguiente frmula:
3. Resultados y Discusin
3.1 Extraccin
El anlisis de la seleccin del solvente de acuerdo a sus diferentes fases dieron los
siguientes resultados: (Grafico 1)
De acuerdo al CPAM mg/L el solvente que mejor da resultado en la obtencin de
pigmentos es el Etanol 90 + HCL 1.0 % (85:15).
3.2 Evaluacin de la Estabilidad de los Pigmentos Naturales
Efecto de la Temperatura
Al evaluar la estabilidad del pigmento en los extractos de las dos variedades de
Rosa de jamaica y del rbol de Cerezo beliceo, se observo que hubo un cambio de
color de los extractos sometidos a diferentes temperaturas, se procedi a la
determinacin de CPAM de los extractos por la tcnica espectrofotomtrica de pH
diferencial.
En la Tabla N 1 se muestran los datos de CPAM analizado por el mtodo de pH
diferencial para la determinacin de estabilidad trmica de los extractos que contiene
pigmentos de las dos variedades de Rosa de jamaica y del rbol de
Cerezo beliceo.
El efecto de la temperatura en la estabilidad de antocianinas influye notoriamente en la
destruccin del pigmento por el calor durante el procedimiento realizado en las
muestras de los extractos de las dos variedades de rosa de jamaica y del rbol de
cerezo beliceo
Cuando los extractos de pigmentos antocinicos se someten a temperaturas mayores
a 100C, ocurre una degradacin ms rpida del color, mientras que alas temperaturas
por debajo de los 90C resulta en una degradacin mnima.
Con respecto a la temperatura los pigmentos antocinicos se presentan inestables,
existe una degradacin de color por temperaturas mientras que a menor temperatura
(5 C) permanecen con menor prdida de color.
3.3 Efecto del pH
El modelo matemtico que mejor encaj para el comportamiento de Absorbancia
respecto al tiempo fue: logartmico (Absorbancia = a * Ln (tiempo) + b, donde a y b son
constantes) para los extractos acuosos provenientes de las dos variedades de rosa de
jamaica y el fruto de cerezo beliceo y lineal (Absorbancia = m * (tiempo) + b, donde m
es la pendiente y b constante) para el colorante artificial Rojo No.40 FD&C.
Para poder comparar la estabilidad de los diferentes extractos, se procedi a calcular
la primera derivada de cada una de las ecuaciones, as se determin el cambio de la
absorbancia (Absorbancia) respecto al tiempo (tiempo), es decir la estabilidad que
presenta cada extracto. Y utilizando el valor de la pendiente para el colorante artificial
Rojo No.40 FD&C (m= Absorbancia/tiempo).
Se determin que el orden de estabilidad de los extractos acuosos provenientes de las
diferentes variedades de rosa de jamaica y del fruto del cerezo beliceo es el
siguiente:
Rosa de jamaica reina real pH 3, 35 C > Rosa de jamaica reina real pH 5, 35
C > Cerezo beliceo pH 3, 35 C > Rosa de jamaica nova pH 3, 35 C > Rosa de
jamaica nova pH 5, 35 C > Cerezo beliceo pH 5, 35 C .
Se puede afirmar que los diferentes extractos acuosos provenientes de las diferentes
especies de estudio a pH indicado, pueden utilizarse como opciones de consumo
natural del colorante artificial Rojo N 40 FD&C
De los resultados obtenidos sobre la estabilidad de los pigmentos, podemos
mencionar que la muestra de Rosa de jamaica reina real pH 3, 35 C (extracto ms
estable) es 4.16 veces ms estable que el extracto de Cerezo beliceo pH
5, 35 C (extracto ms inestable).
Acerca de la estabilidad del colorante artificial Rojo No.40 FD&C a los diferentes
valores de pH y a 35 C de temperatura en la investigacin, se determin que el grado
de degradacin de este pigmento sinttico es menor en comparacin con los extractos
de los diferentes frutos, esto se pudo observar tanto en el modelo matemtico que rige
la degradacin de los colorantes (lineal para el Rojo No.40
FD&C y logartmico para los extractos de los de las dos variedades de rosa de jamaica
y del cerezo beliceo. Algo interesante de mencionar es que a una misma temperatura
(35 C) y diferente pH (3 y 5) el colorante Rojo No.40 FD&C.
3.4 Iluminacin y Oscuridad
El contenido de pigmento antocinico monomrico (CPAM) valorado a los extractos
etanlicos de antocianinas a diferentes tiempos de almacenamiento es presentado en
las tablas siguientes.
El contenido de pigmento monomrico de los EEA de antocianinas es mostrado en las
Tablas, como se puede observar bajo oscuridad pH 3 y 5 C fue la condicin que
presento menor cambio de concentracin de pigmento antocinico monomrico
durante todo el almacenamiento. Bajo estas condiciones son ms estables las
antocianinas al sufrir menos reacciones de degradacin.
La prdida de pigmento por el efecto de la luz se debe a que tanto la radiacin
electromagntica como el oxgeno aceleran las reacciones para que se rompa la
estructura de resonancia de los pigmentos, los cuales son las responsables de impartir
el color y existe una degradacin de los pigmentos a pH 5
3.5. Ensayos fsicos y qumicos preliminares.
3.5.1. Determinacin de un espectro de absorcin
Se determino el espectro de absorcin de la muestra de rosa de jamaica variedad
nova que la cianidna-3,5 diglucsido es la antocianina presente en esta muestra.
Tambin se encuentra en la muestra de rosa de jamaica variedad reina real.
No hay presencia de cianidina-3,5 diglucsido en la muestra de cerezo beliceo.
3.5.2 Espectro infrarrojo de la fraccion colorante
Se obtuvo los espectros infrarrojos, en donde se pueden observar varias seales de
grupos funcionales entre las que destacan: un pico a 3402 cm-1 (OH), un pico a 1.609
cm-1 (grupo carbonilo), los cuales son caractersticos de los compuestos de tipo
flavnico en los extractos de las muestras a estudio.
3.5.3 Determinacin de la concentracin de antocianinas por medio delmtodo
de pH diferencial (CPAM mg/L)
En la cuantificacin de antocianinas por la tcnica de pH diferencial, se analizaron solo
los extractos con el solvente Etanol 90 + HCL 1 % (85:15 v/v) ya que este solvente
asegura el mayor contenido de las antocianinas en las diferentes muestras.
En la cuantificacin de antocianinas por la tcnica de pH diferencial, se analizaron los
extractos. En la Tabla se muestran los resultados de las tres muestras en anlisis. El
extracto de Rosa de jamaica variedad reina real tiene una mayor contenido de
pigmento antocinico monomrico de 708.75 mg/L
3.5.4 Investigaciones de taninos
Se puede observar tanto en las dos variedades de Rosa de jamaica y del rbol de
Cerezo beliceo presentaron presencia de taninos dentro de su composicin, tras el
anlisis macro y semimicro de coloracin y precipitacin, lo cual se observo cambio de
color negro-azulado que cambio a un color amarillo determinando presencia del tanino
pirogalol.
3.5.5 Investigaciones de flavonoides y antocianinas.
Se muestra los resultados del anlisis macro y semimicro para la deteccin de
flavonoides y antocianinas en las dos variedades de Rosa de jamaica y del rbol de
Cerezo beliceo los cuales fueron positivos en las flores de las dos variedades de
Rosa de jamaica y en el fruto del rbol de Cerezo beliceo los cuales presentaron
cambio de color y formacin de precipitados comparados con el testigo.
En la prueba de Shinoda da positivo la presencia de antocianinas con un cambio de
color rojo intenso.
3.5.6 Anlisis cuantitativo por espectrofotometra UV-VIS.
Flavonoides Totales
En la Tabla se expresan los resultados para la cuantificacin de flavonoides
totales expresados como porcentaje de quercetina mediante espectrofotometra
UV-VIS, de los extractos de las dos variedades de Rosa de jamaica y del rbol
de Cerezo beliceo estos resultados reflejan que los frutos de Cerezo beliceo
tiene una presencia mayor de flavonoides totales expresados como porcentaje
de quercetina.
Fenoles totales
Se demuestra que todos los extractos contienen compuestos fenlicos en
cantidades significativas.
En la Tabla se expresan los resultados de fenoles totales expresados como
microgramos de cido glico mediante espectrofotometra UV-VIS, de losextractos
de las dos variedades de Rosa de jamaica y del rbol de Cerezo beliceo debido a
su polaridad los compuestos fenlicos permiten su separacin por solubilidad a
solventes polares, como sucede con el etanol. El etanol permite la extraccin de
estos compuestos, la concentracin de fenoles totales ms alta la posee la Rosa
de jamaica variedad reina real 14.71 microgramos de acido glico / volumen de
muestra en mL, por su gran cantidad de antocianinas. La Rosa de jamaica
variedad nova es la que contiene una menor concentracin de fenoles totales.
3.5.7 Acidez Titulable
En la Tabla se muestran los datos de acidez de los extractos de las dos variedades de
rosa de jamaica y del rbol de Cerezo beliceo, la acidez esta directamente
relacionada con la cantidad de cidos presentes en las diferentes muestras de los
extracto de las especies en estudio.
En el caso de las dos variedades de Rosa de jamaica presentan los diferentes cidos
en su composicin: cido ctrico, ascrbico, mlico y el protocatecuico los que le
proporcionan una acidez expresada como porcentaje de acidez como cido ctrico. En
el caso del rbol de cerezo beliceo presenta los diferentes cidos en su composicin:
cido elgico, cido glico, cido ferlico, y el cido cafeico. El rbol de Cerezo
beliceo es el que posee el mayor porcentaje de acidez: 11.73 % de acidez como
acido ctrico, la Rosa de jamaica variedad nova es la que presenta menor porcentaje
de acidez: 9.92 % de acidez como acido ctrico.
4. Liofilizacin.
(10), (11)
El liofilizado involucra la remocin de agua u otro solvente de un producto congelado
por un proceso llamado sublimacin. La sublimacin ocurre cuando un lquido
congelado pasa directamente al estado gaseoso sin pasar por la fase lquida. En
contraste, el secado a temperatura ambiente de la fase lquida, usualmente resulta en
cambios en el producto y puede ser deseable solamente para algunos materiales. Sin
embargo, en el liofilizado, el material no pasa por la fase lquida y esto permite la
preparacin de un producto ms estable que es ms fcil de usar y esttico en
apariencia.
Cuando se renen todos los extractos etanlicos purificados de las dos variedades de
de rosa de jamaica y del cerezo beliceo se concentra en un Rotavapor
Buchi para eliminar el etanol.
Se toman 100 mL de extracto concentrado de cada muestra y se pasan a (PROPER
FLASK) que son parte del equipo liofilizador.
Los Extractos concentrados en los viales se llevan a un congelador de nitrgeno
Thermo Forma Thermo Scientific a temperatura de 70 C.
Los extractos congelados se liofilizaron en un equipo
Se requiere que el liofilizador se mantenga a una presin de vaco de 1.33 x 10-
3
mBar. La temperatura alcanza hasta 40 C y es en este momento en que el modo
automtico del liofilizador empieza a funcionar.
El producto final es un polvo fino de color rojo fuerte
5. Deteccin de antocianinas (HPLC DAD).
(4), (5)
Se realiz el anlisis de antocianinas usando un Agilent Technologies serie 1200
HPLC (Agilent, Palo Alto, CA, USA) que fue equipado con un detector modelo G1315D
arreglo de diodos (DAD), un desgasificador G1379B modelo, una bomba de gradiente
binaria modelo G1312A, un modelo G1329A thermo auto muestrador y un horno de
columna modelo G1316A. La separacin de fase inversa fue realizada en una columna
de identidad simetra C18 250 x 4,6 mm, partculas tamao 5 m (Waters, MA, USA)
con una Nova-Pak 4 m C18 guard column 3,9 20 mm operando a 35 C y con un
caudal de 1,0 mL/min. Los compuestos fueron separados con gradiente elucin de (A)
4,5% cido frmico acuoso y (B) 80% acetonitrilo en solucin A. El programa de
gradiente fue: 0-15% B (9 minutos), 15-45% B (22 min), 45-100% B (6 minutos), 100-
0% B (1 min), min 2 0% B. El volumen de inyeccin era 10 uL. La supervisin fue
realizada a 520 nm y el detector de arreglo de diodos se fij en un rango de 200 nm a
700 nm a un radio de espectro de 1.25 escaneo s-1 (anchura del pico 0,2 min). La
cuantificacin se realiz por LC-DAD con calibracin externa utilizando un conjunto de
siete diluciones estndar de cianidina-3,5-di-O-glucsido a 520 nm. Una solucin de 1
mg/mL en un 80% metanol en acuosa 0.1% de cido frmico se prepar y almaceno a
20 C. Las curvas de calibracin fueron lineales en el rango de 1 a 200 g/mL con un
coeficiente de correlacin de 0.99. Para la cuantificacin, reas de pico fueron
correlacionadas con las concentraciones de acuerdo con las curvas de calibracin. Los
datos se informaron como medio desviacin estndar de anlisis independientes por
triplicado.
Figura 1. Separacin de antocianinas del extracto de la Flor de Jamaica Reina
Real y Nova por HPLC-DAD (520 nm).
6. Conclusiones
Las tres muestras de estudio contienen pigmentos de origen antocinico.
Las antocianinas son pigmentos que dan color a las frutas, flores y algunas verduras,
como el rojo de la rosa de jamaica y el fruto del cerezo beliceo, la Rosa de jamaica
variedad reina real posee la mayor cantidad de antocianinas, fenoles totales.
El mtodo de extraccin de antocianinas de las muestras en anlisis con etanol
acidificado es mas alto, menos complicado y con menos tiempos de espera
comparado con el mtodo de extraccin con agua.
El fruto del cerezo beliceo contiene una mayor cantidad de flavonoides totales en su
composicin fitoqumica.
El pH es muy importante un pH 3 hay una estabilidad del color, en el caso de pH
mayores a 4 existe una degradacin lo que con lleva a una perdida de color.
Las mejores condiciones de almacenamiento en oscuridad de los extractos etanlicos
acidificados de antocianinas de las dos variedades de rosa de jamaica y del fruto de
cerezo beliceo son a pH 3 y temperatura de 5 C.
Los pigmentos antocinicos presentes en la Rosa de jamaica variedad reina real
Hibiscus sabdariffa pH 3 y pH 5 poseen las caractersticas para ser utilizados como
alternativas naturales de consumo del colorante sinttico Rojo N 40 en alimentos de
pH cido.
La aplicacin como pigmento en alimentos ha estado limitado por su susceptibilidad,
entre otros factores, al pH y a la temperatura, por lo que es viable colorear alimentos
de bajo pH.
Por medio de la tcnica de HPLC-DAD se determino la identificacin de la antocianina
presente en los extractos en estudio.
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