Enzimologa Inmovilizacin de enzimas

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INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

Como producto del avance de la biotecnologa y su aplicacin en procesos industriales para la
obtencin de productos qumicos, farmacuticos o alimentarios se ha recurrido al uso de
enzimas. stas presentan grandes ventajas sobre catalizadores no biolgicos, entre ellas gran
actividad cataltica, a temperatura ambiente y presin atmosfrica, y gran especificidad de
sustrato.
La inestabilidad que presentan en los procesos qumicos industriales y la dificultad de poder
separarse de sustratos y productos, todos solubles en agua, hacen que las enzimas no se puedan
reutilizar. Como alternativa se ide el mtodo de inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer
factible que un proceso biotecnolgico sea rentable.
Se denomina una enzima inmovilizada aquella que est fsicamente localizada en una regin
definida del espacio, manteniendo su actividad cataltica y pudiendo ser usada repetida y
continuamente.
Las ventajas del proceso: a) aumento de la estabilidad b) reutilizacin de los componentes c) la
enzima no permanece en la solucin al finalizar el tratamiento y d) diseo de reactores
adaptables para cada enzima inmovilizada, permitiendo un reciclado de producto que aumente
su pureza. Bsicamente un reactor comprende un recipiente o tanque con agitacin con las
enzimas inmovilizadas, una va de entrada para sustrato y otra de salida para el producto.
Las desventajas a) alteracin de la enzima respecto de su estado nativo b) heterogeneidad del
sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas protenas inmovilizadas c) prdida de
actividad d) el sistema puede ser ms caro que la enzima nativa.













Mtodos de inmovilizacin














Segn se observa en el grfico los mtodos de inmovilizacin se pueden clasificar en 2 grandes
categoras:

1. Retencin fsica.
2. Unin qumica.
sustrato
producto
Tanque con
agitacin
Retencin fsica Unin qumica
Atrapamiento Inclusin en
membranas
Unin a soportes
Microencapsulacin Reactores de
membrana
Reticulado
Adsorcin Inica Quelacin Covalente
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1. Retencin fsica:
1.a. Atrapamiento: es la retencin de la enzima en cavidades interiores de una matriz slida
porosa constituida por prepolmeros entrecruzables o polmeros de tipo poliacrilamida,
colgeno, carraginato o resinas de poliuretano. Una suspensin de la enzima a inmovilizar se la
incluye en una solucin del monmero. Se inicia la polimerizacin con cambio de temperatura o
adicin de reactivo qumico. El atrapamiento pueden ser en geles o en fibras, ms resistentes
stas ltimas. No hay alteracin estructural de la enzima pero hay que vigilar el proceso de
polimerizacin.
1.b. Inclusin en membranas
1.b.a. Microencapsulacin: las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que
permiten el paso de sustratos y productos. Las microcpsulas tiene dimetros de 1 a 100 m
permitiendo encapsular enzimas, otro tipo de biomolculas y clulas.
2.b.b. Reactores de membrana: se emplean membranas permeables al producto final,
permeables o no al sustrato y no permeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un
flujo lquido de sustrato que atraviesa al reactor. La enzima se adsorbe previamente sobre la
membrana.

2. Unin qumica
2.a. Unin a soportes: son los ms utilizados y de los que se tiene mayor informacin. Se han
utilizado gran variedad de soportes. Estos deben cumplir ciertas normas para ser empleados:
aumentar la interaccin con el sustrato, disminuir la inhibicin por producto, cambiar el pH
aparente ptimo hasta el valor deseado, frenar el crecimiento microbiano y ser fcilmente
recuperable para su reutilizacin. Deber ser estable en solucin y rgido mecnicamente en
procesos de flujo continuo. Cuando la enzima inmovilizada se utilice en aplicaciones mdicas
no deber provocar reacciones inmunes o de coagulacin.
Los soportes pueden ser a) inorgnicos naturales (arcilla, bentonita, piedra pmez) o
inorgnicos manufacturados (xido de metales, vidrios de tamao de poro controlado,
cermicas) y b) orgnicos naturales (polisacridos o protenas fibrosas) o sintticos
(poliolefinas, polmeros acrlicos, poliamidas).
Las enzimas se pueden unir por adsorcin, unin inica, metlica o por unin covalente.
2.a.a. Adsorcin: la enzima se une por fuerzas de van der Waals, interacciones hidrofbicas y
por puentes de hidrgeno. Se deben controlar pH del medio, fuerza inica y dimetro del poro.
Tiene la ventaja de la preparacin sencilla, bajo costo, no cambia la especificidad enzimtica y
los derivados son estables con baja humedad. Desventajas: unin dbil al soporte (afectadas por
concentraciones elevadas de sustrato, cambios de pH y de fuerza inica) y poco estables
mecnicamente.
2.a.b. Unin inica: se utilizan intercambiadores orgnicos de iones (DEAE, CM, etc) e
inorgnicos (slice). Tiene las mismas desventajas que el mtodo anterior.
2.a.c. Quelacin o unin metlica: utiliza metales de transicin, normalmente titanio, como una
forma de activar la superficie del soporte. La enzima se acopla a este soporte.
2.a.d. Unin covalente: es el mtodo de inmovilizacin ms utilizado en la industria. El
procedimiento de inmovilizacin consiste en 1) la activacin de los grupos qumicos del soporte
2) los grupos activados de los soportes reaccionan con aminocidos de la enzima con la
formacin de enlaces peptdicos, de arilacin, de alquilacin, de formacin de enlace diazo,
base de Schiff o de intercambio tiol-disulfuro. Los aminocidos de las protenas ms empleados
para la formacin de enlaces con el soporte son Lys, CysSH, Tyr, Trp.
Ventajas: al tener su estructura terciaria estabilizada poseen mayor resistencia a la inactivacin.
Desventajas: se puede alterar el sitio activo. Se usan bloqueadores del sitio activo y luego se
procede a la inmovilizacin.
2.b. Reticulado: tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking. Utiliza reactivos
bifuncionales (dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de bis diazonio) que originan
uniones intermoleculares irreversibles entre las molculas de enzima, insolubles en agua pero
que no necesitan el uso de soportes adicionales. Son capaces de resistir condiciones extremas
de pH y temperatura.
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El co-reticulado es el entrecruzamiento de la enzima con protenas sin actividad enzimtica,
ricas en Lys (albmina bovina). Impide la prdida de actividad por efectos de difusin del
sustrato.
Uno de los mtodos ms novedosos en entrecruzamiento consiste en la cristalizacion de
enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehdo. La propia enzima acta como su soporte.
Estos cristales soportan altas temperaturas, pHs extremos y la accin de proteasas.

EFECTOS DE LA INMOVILIZACIN
La inmovilizacin altera el comportamiento de las enzimas. Generalmente se incrementa la
estabilidad conformacional de las mismas (mtodos de uniones de tipo covalente y aun ms, con
la adicin de grupos bifuncionales), se aumenta la proteccin frente a proteasas y se evita la
agregacin intermolecular. Se produce una alteracin del microentorno de la enzima debido a su
interaccin con el soporte, haciendo por ejemplo que enzimas sensibles al oxgeno, como
nitrogenasas hidrogenasas, vean favorecida su actividad cuando estn inmovilizadas, debido a
que la fuerza inica que tiene el entorno disminuye la concentracin efectiva de oxgeno en el
medio.
Pueden perder total o parcialmente la actividad por interacciones con el soporte, por
impedimento del paso del sustrato al sitio activo, por interaccin con grupos cargados del
soporte o por cambios conformacionales que den formas inactivas.
Otros cambios que afectan la actividad enzimtica, aumentndola o disminuyndola, son
producidos por efectos de difusin del sustrato al sitio activo (por insolubilidad del soporte en el
medio de reaccin, por impedimentos estricos o por efectos electrostticos entre el sustrato y el
soporte) y por efectos en el microentorno enzima-soporte.

APLICACIONES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS
-Biosensores: son de gran utilidad en el campo del diagnstico clnico. Se determinan niveles
sanguneos de glucosa (electrodo de D-glucosa. Ver ms adelante), lactato, urea, colesterol,
creatinina y cido rico. Hay biosensores para control de calidad en la industria alimentaria,
para la determinacin de contaminacin microbiana o deteccin de polucin ambiental,
presencia de residuos txicos, pesticidas, herbicidas o microorganismos.








Esquema de biosensor








La superficie externa de la capa de enzima est expuesta a la solucin a analizar. El sustrato se difunde en la capa de enzima y se
transforma en un compuesto electroactivo que se mide por el traductor.

Electrodo de glucosa (Updike y Hicks, 1967): la D-glucosa oxidasa se inmoviliza en un gel de
poliacrilamida y se mantiene alrededor de un electrodo de oxgeno mediante un trozo de acetato
de celulosa.
La enzima inmovilizada cataliza la reaccin:
-D-glucosa + O
2
D-glucono-1,5-lactona + H
2
O
2

Analito
Enzima
inmovilizada
Otros
compuestos
Superficie de
inmovilizacin
Traductor
Amplificador
Resultado
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El electrodo de oxgeno mide la prdida de oxgeno de la solucin que se produce a una
velocidad que depende de la concentracin de D-glucosa presente.
Se utilizan tambin electrodos que miden el H
2
O
2
producido.

Otras aplicaciones:
- mdicas: en enfermedades causadas por alteracin o carencia de una determinada enzima.
La entrega eficaz de la enzima al tejido adecuado tiene cierto xito mediante el uso de
liposomas.
Se utilizan enzimas con actividad antitumoral: la L-asparaginasa se inmoviliza en un
hemodializador y captura a la Asn circulante, necesaria para el desarrollo de leucemias y
cnceres diseminados.
La tripsina o la colagenasa se utilizan para eliminar tejidos muertos de heridas, quemaduras,
lceras, etc. Estas enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o fibras que formarn parte del
tejido de apsitos y vendas.
- farmacuticas: obtencin de antibiticos beta lactmicos y frmacos pticamente puros.
- alimentarias: en hidrlisis de protenas, de hidratos de carbono, en las mejoras de las
caractersticas organolpticas de ciertos alimentos, en la obtencin de edulcorantes y aditivos
alimentarios.
- qumicas: sntesis de acrilamida, pptidos, fragancias e insecticidas, tratamiento de aguas
residuales.



































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APLICACIONES CLNICAS DE ENZIMAS

USO Y DETERMINACIN DE ENZIMAS EN LABORATORIOS CLNICOS
Las enzimas como reactivos ofrecen las ventajas sobre los procedimientos qumicos de poseer
mayor eficacia cataltica y especificidad. Esto hace que se pueda realizar un anlisis rpido,
reproducible y adaptable fcilmente a sistemas automatizados de determinadas sustancias
presentes en medios complejos como sangre, suero, plasma u orina sin necesidad de etapas
previas de purificacin.
Las enzimas se miden en los fluidos corporales como ayuda al diagnstico y tambin para
seguir los efectos del tratamiento mdico.

Entre otras actividades en el laboratorio clnico se realiza
1) la determinacin de actividades enzimticas y
2) el dosaje de sustratos por enzimas especficas.

1) Medida de enzimas: las enzimas se encuentran en alta y baja concentracin en sangre. Las
que poseen alta concentracin son aquellas que tienen un rol especfico intravascular.
Las de baja concentracin no cumplen funcin en la sangre. Cuando hay una injuria en un
tejido u rgano, por un cambio en la permeabilidad de la membrana celular o por muerte celular,
pueden pasar enzimas a la circulacin. Se observa un aumento de la actividad y luego un
decaimiento, dependiendo de su estabilidad y de la capacidad de captacin del sistema retculo-
endotelial.
Debido a que el metabolismo de los rganos es similar, encontramos pocas enzimas rgano-
especficas. Entre ellas tenemos:
-Alcohol deshidrogenasa en hgado.
-Fosfatasa cida en prstata.
Otras se encuentran en distintas proporciones en cada rgano o tejido. En el siguiente grfico
vemos la variacin sangunea de distintas enzimas frente a una injuria cardaca.



CPK Creatinfosfoquinasa
LDH Lactato deshidrogenasa
TGO Transaminasa glutmico- oxalactica
HBDH -hidroxibutirato deshidrogenasa







Por otro lado tenemos las llamadas isoenzimas. stas catalizan la misma reaccin y estn en
distintos rganos o tejidos. Se diferencian entre s por su desplazamiento electrofortico. As por
ejemplo tenemos la creatinfosfoquinasa (CPK). Dmero con subunidades M y B. Tiene tres
isoenzimas: CPK1 (BB)(cerebro), CPK2 (MB)(miocardio) y CPK3 (MM)(msculo
esqueltico). En un infarto cardaco la CPK2 tiene su mxima actividad a las 24 hs de
producido. Comienza a decaer y toma importancia la CPK3 a las 48 hs, para tambin decaer.
La enzima lactato deshidrogenasa es un tetrmero con subunidades H y M. Se han determinado
5 isoenzimas que se encuentran en miocardio, hemates, cerebro, rin, hgado y msculo
esqueltico, todas ellas con distinto porcentaje de subunidades.
La fosfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliza los
monosteres del cido fosfrico en medio alcalino. Tiene distintas isoenzimas, una (o dos)
heptica, una enteral y otra sea, todas ellas diferenciables por su corrida electrofortica. Se han
encontrado otras variantes, una placentaria y otra que aparece en procesos cancerosos.
CPK
HBDH
LDH
Normal
Das 1 3 6
Actividad
TGO
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La actividad enzimtica desconocida se mide normalmente mediante anlisis cinticos o
continuos y la cantidad de enzima debe ser la limitante de la velocidad. Un buen ensayo debe
comprender temperatura y pH ptimos para la reaccin, fuerza inica adecuada y tambin
niveles saturantes de sustrato, cosustratos y cofactores. De esta forma se asegura que la reaccin
sea de orden 0 y que la velocidad o actividad hallada dependa exclusivamente de la
concentracin de enzima presente. (cc de sustrato >10 a 20 K
m
).
Hay enzimas que utilizan NAD, NADP o FAD como cofactores. Estas enzimas son sencillas
de medir debido a las propiedades pticas de aquellos. Muchas enzimas son difciles de analizar,
pero en algunos casos la adicin de otras enzimas (enzimas acopladas) que usan estos cofactores
simplifica su medida.
La aspartato aminotransferasa (AST o TGO) fue la primer enzima medida usando una enzima
acoplada, la malato deshidrogenasa (MDH). La reaccin es la siguiente:


2-oxoglutarato +L-aspartato L-glutamato +oxalacetato


oxalacetato +NADH +H
+
L-malato +NAD
+

El oxalacetato formado reacciona segn se va produciendo en el proceso catalizado por la
MDH, por lo que la medida de la velocidad de conversin de NADH en NAD
+
constituye un
anlisis preciso para la AST. La reaccin catalizada por la MDH se produce en condiciones
desfavorables ya que la concentracin de uno de los sustratos es virtualmente cero, habiendo un
tiempo de latencia hasta que llegue el oxalacetato a una concentracin ptima para la reaccin.
Para solucionar esto se debe tratar de que la actividad de la enzima acoplada sea 40 veces mayor
que la enzima a ensayar.
El NADH debe tener una concentracin inicial de por lo menos 0,2 mmol/l para que la
absorbancia inicial a 340 nm sea de 1,26 para 1 cm de recorrido.
Tanto la fase de latencia como las medidas de velocidad deberan completarse antes de que la
reaccin se desviara significativamente de la velocidad real por agotamiento del sustrato.

2) Medida de sustratos: los sustratos se miden en la sangre, plasma, suero y orina para ayudar al
diagnstico y control de muchas enfermedades, siendo esencial recoger datos de la poblacin
sana a fin de poder compararlos.
Existen 2 mtodos para el dosaje de sustratos: mtodo de equilibrio y mtodo cintico.
-Mtodo de equilibrio
Consideremos medir al sustrato S
S +C P +Q
C es correactante o coenzima y P y Q los productos de la reaccin catalizada por la enzima.
Cuanto mayor sea la concentracin de S y cuanto ms elevada sea la K
eq
, ms preciso ser su
dosaje. Una K
eq
baja podra traer problemas de insolubilidad de C, inhibicin de la enzima o
elevada absorbancia inicial.

S Para este mtodo se debe calcular el tiempo para que una
a reaccin alcance el equilibrio (parte b de la curva de reaccin) y
deesta manera estimar la concentracin de sustrato incgnita.
v
o
b

tiempo
Esto se logra integrando la ecuacin de Michaelis- Menten:


t = 2,3 K
m
log S
o
+(S
o
S
t
)
V S
t
V
AST
MDH
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donde t es el tiempo de reaccin, S
o
es la concentracin inicial de sustrato y S
t
es la
concentracin a tiempo t.
Si se acepta para el clculo que una conversin del 99 % de S en P es adecuada, log S
o
=2
S
t


y si S
o
no es muy distinta del K
m
, podemos aproximar a que t =5,6 K
m.

V
Si S
o
> K
m
el tiempo aumentar considerablemente, as como los potenciales problemas
causados por la formacin de producto. La presencia de activadores o inhibidores reducirn o
aumentarn el cociente, respectivamente.

-Mtodo cintico
Es aquel en que los datos se obtienen cuando la concentracin de S vara en funcin del
tiempo, siendo S el limitante de la velocidad.
La introduccin de analizadores cinticos permiti seguir el progreso de la reaccin,
generalmente a un nmero de intervalos fijos, controlando la linealidad de la curva y calculando
la velocidad inicial (v
o
, parte a de la curva).
La sensibilidad para detectar la concentracin de sustrato disminuye claramente cuando S
o
>
K
m
. Por lo tanto el lmite superior de uso de los mtodos cinticos es S
o
= K
m
. Si la
concentracin de S a dosar es K
m
/20, la desviacin de la linealidad es inferior al 3,3 %. Por todo
esto es necesario obtener una curva de calibracin en un rango de concentracin de sustrato para
tener en cuenta la no linealidad de la grfica.


Los indicadores en anlisis clnicos rutinarios son el sistema a)NAD(P)- NAD(P)H por sus
propiedades pticas a 340 nm y b) la formacin de H
2
O
2
a partir de glucosa (o colesterol o cido
rico o triacilglicridos). Al H
2
O
2
formado se lo hace reaccionar con un cromforo mediante la
enzima peroxidasa, dando un producto que absorbe en el visible (505 nm). Ej

glucosa + O
2
+ H
2
O Ac glucnico + H
2
O
2


H
2
O
2
+ cromforo colorante + H
2
O



USO DE ENZIMAS INMOVILIZADAS PARA MEDIR CONCENTRACIN DE
SUSTRATO.
a. Tubos reactores
Normalmente se utilizan tubos de nylon de 1 mm de dimetro impregnados internamente con
la enzima que se halla unida a stos de forma covalente. Este reactor est adaptado a sistema de
flujo continuo en analizadores clnicos que dosan la concentracin de sustrato por colorimetra.
b. Sondas bioanalticas (bioensores, vistos anteriormente)
c. Reactivos en fase slida
Free et al. (1957) desarrollaron el sistema que se utiliz para la medida de concentracin de
glucosa en orina. Consista en una tira de papel (celulosa) sobre la cual se adsorba el sistema
enzimtico (glucosa oxidasa, peroxidasa y un cromgeno). El papel cambiaba de color cuando
se lo embeba en una solucin con glucosa. Posteriormente se fue perfeccionando el sistema y
en la actualidad se pueden utilizar enzimas y cromgenos apropiados impregnados en un papel
de filtro montados sobre una tira plstica para medir cuali y cuantitativamente la presencia de
glucosa en sangre y orina, as como otros compuestos, como colesterol, cido rico,
triacilglicridos, urea, creatinina. Se compara el color frente a una escala cromtica
(visualmente o a travs de un microprocesador) y se estima la concentracin del sustrato.
Son mtodos rpidos que sirven para la urgencia clnica. Los datos exactos se los obtienen en
el laboratorio. Las enzimas preparados en forma de reactivo en fase slida son desechables.

Glucosa oxidasa
Peroxidasa
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ANLISIS INMUNOENZIMTICO
Se utiliza para el dosaje de protenas del suero sanguneo, factores de coagulacin de la sangre,
inmunoglobulinas, anticuerpos contra hormonas y un amplio rango de drogas, virus, bacterias y
parsitos.
El fundamento del mtodo original usando radioistopos (Radioinmunoensayo- RIA) es el
siguiente:

Anticuerpo (Ac) +Antgeno (Ag) +Antgeno marcado (Ag*) AcAg + AcAg*

Las molculas de Ag (marcado y no marcado) libres compiten por un nmero fijo y limitado
de puntos de unin especficos en las molculas de anticuerpo. Despus de un tiempo de
incubacin el antgeno libre y el ligado se separan y se los mide frente a una curva patrn.
El mtodo tiene muchas desventajas de manipuleo, de vida til de reactivos y de costo, por lo
que se ide un mtodo alternativo usando marcadores enzimticos.
Las enzimas marcadoras se unen covalentemente a antgenos o anticuerpos y a haptenos
(molculas pequeas (drogas o esteroides) que no son usualmente inmunognicas, pero que
pueden serlo si son acopladas a una protena transportadora ms grande), mediante diversas
reacciones qumicas. (Mtodos del glutaraldehdo, del periodato, de la maleimida, del anhdrido,
de la carbodiimida, del imidato bifuncional, etc). Siguiendo el ejemplo anterior, a la enzima
unida al antgeno (que reaccion con el anticuerpo) se le mide la actividad y se estima la
concentracin del anticuerpo presente.
Estos marcadores enzimticos tienen la ventaja del no uso de radiacin, son baratos, el producto
marcado tiene una vida til muy larga y tiene la posibilidad de automatizacin. Tienen la
desventaja que constituyentes del plasma pueden influir en el dosaje de la actividad enzimtica.


En la prctica se utilizan soportes en fase slida, fabricados con distintos plsticos (polivinilos,
poliestirenos) que tienen la particularidad de adsorber capas monomoleculares de protenas
sobre su superficie. Si bien algunas molculas adsorbidas pueden perder algunas determinantes
antignicas, otras quedan inalteradas y son las que van a reaccionar con su respectivo
anticuerpo. La presencia del anticuerpo unido al antgeno adsorbido, es detectado por
inmunoglobulinas anti-anticuerpo, unidas a enzimas.







Luego de varios lavados, en donde se eliminan las inmunoglobulinas-enzima que no se
unieron, se hacen reaccionar a las enzimas unidas al soporte (Complejo Ag-Ac-AntiAc-Enzima)
con su sustrato correspondiente (revelado). Frente a curvas de calibracin previamente
realizadas se puede estimar, por la actividad enzimtica hallada, la concentracin de Ac
Antgeno adsorbido
a soporte plstico
Anticuerpos
Inmunoglobulinas
anti-anticuerpo
unidas a enzimas
Representacin de inmunoensayo en fase slida
+ +
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buscada. Estos tipos de anlisis se denominan ELISA enzyme linked immunoabsorbent assay,
habiendo muchas variantes respecto del esquema original.
La mayora de las enzimas utilizadas como marcadores son de origen bacteriano o vegetal. Las
ms usadas son: peroxidasa: glicoprotena que puede ser conjugada por el mtodo del periodato,
fosfatasa alcalina de hgado de ternera, ureasa, galactosidasa y lisozima.