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17 Mtodos Basados en la unin Ag-Ac

R. Gonzlez, R. Tarazona, M.D. Galiani, G. Bugella y J. Pea




INTRODUCCIN.
Gran parte de los progresos alcanzados por la biologa moderna se deben al
perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida. La introduccin de los procedimientos
basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante avance en el anlisis
de sustancias de inters en biologa animal y vegetal difciles de medir empleando los mtodos
bioqumicos habituales.

Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos
que se basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a
un Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los
fenmenos de precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con
fluorescena, con radioistopos o con enzimas) hacen que estos mtodos se empleen
ampliamente.

Existen diversos mtodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unin
Ag-Ac (Tabla 17.1).


TABLA 17.1.
Principales mtodos analticos basados en la unin Ag-Ac

Trazador

Denominacin

Complejo Ag-Ac

Aglutinado

Fluorocromo
Radioistopos
Enzimas
Tcnicas de inmunoprecipitacin. (tcnica de Ouchterlony,
inmunoelectroforesis, difusin radial Mancini, nefelometra, etc.)
Tcnicas de inmunoaglutinacin. (Hemaglutinacin directa e indirecta
y otras tcnicas con ltex, etc.)
Tcnicas inmunofluorimtricas
Tcnicas inmunorradiolgicas (Radioinmunoensayo -RIA-)
Tcnicas inmunoenzimticas

As tenemos:

1. Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgenos e encuentra unido o formando parte de
clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el
aglutinado celular o bacteriano formado.

2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas el
anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la
fluorescencia emitida.

3. Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo
radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad
emitida.

4. Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para obtener
Acs y Ags puros.

5. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antgenos
y anticuerpos especficos.



TCNICAS DE PRECIPITACIN


Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se
encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-Ac.
Existen diferentes modalidades siendo las principales:

1. Tcnica de precipitacin propiamente dicha.

2. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony.

3. Tcnica de inmunoelectroforesis.

4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini.


Tcnica de precipitacin

El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la
proporcin de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la Figura 17.1 se muestra un
esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con
diferentes cantidades de antgenos a los que se aaden igual cantidad de un anti-suero.

La precipitacin es
mxima all donde la
proporcin entre
ambos es ptima (parte
central de la curva),
pero va disminuyendo
a medida que
predomine el Ac o el
Ag (izquierda y
derecha de la curva
respectivamente) Este
tipo de reaccin no es
muy utilizado al
requerirse grandes
concentraciones de
antgeno y de
anticuerpo para poder
medir el precipitado
formado.


Tcnica de difusin radial doble de Ouchterlony
Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 17.2).
En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el
anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar.

Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de
equivalencia el complejo Ag-Ac correspon-diente que se hace visible en forma de una lnea de
precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples lneas
de precipitado.



Figura 17.1

La tcnica de Ouchterlony
permite identificar sustancias segn
la forma de unirse las lneas de
precipitacin de dos o varios
sistemas.

Tcnica de inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis es
una tcnica que se realiza en dos
fases. Primero se separa la mezcla
de Ags por electroforesis y
posteriormente el antgeno que se
desea detectar se hace reaccionar
con un anticuerpo especfico colocado en un pocillo lateral. Por difusin llegan a encontrarse
los antgenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de lneas de
precipitacin que pueden ser estudiadas por comparacin con un sistema estndar (Figura
17.3). En
Inmunologa clnica, esta tcnica puede utilizarse en la identificacin de las protenas de
mieloma.

Tcnica de difusin radial simple de Mancini
Esta tcnica se basa en la difusin de un antgeno colocado en un pocillo en un gel de
agarosa que lleva incorporado un anticuerpo
especfico. Este anillo de precipitacin es fcilmente
visible y las concentraciones ant-gnicas estn en
relacin directa con el rea del crculo de precipitacin.
Al difundir el antgeno se genera un gradiente de
concentracin desde el pocillo donde se ha colocado.
Cuando la concentracin del antgeno es la adecuada
(zona de equivalencia) el inmunocomplejo se
insolubiliza y se forma un anillo de precipitacin (Figura
17.4).


TCNICAS DE AGLUTINACIN
En estas tcnicas se hacen visibles los
complejos Ag-Ac por la aglutinacin que producen los
anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido
artificialmente a la superficie de glbulos rojos,
plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc.
Normalmente se utilizan glbulos rojos
(hemaglutinacin) o partculas de ltex.


Hemaglutinacin directa
La presencia de antgenos en la superficie de
los glbulos rojos se puede detectar por la
hemaglutinacin producida cuando se aade un
antisuero con anticuerpos frente a dichos antgenos.

Esta tcnica se emplea
habitualmente para la
identificacin de los grupos
sanguneos y Rh, para lo cual a
la sangre heparinizada se le
aaden los antisueros
correspondientes: anti- A, anti-
B o anti-AB (todos ellos anti-Rh
negativos). Habr aglutinacin
Figura 17.2
Figura 17.3


Figura17.4
cuando los glbulos rojos posean la especificidad del antisuero aadido (Tabla 17.2).
De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinacin de los
distintos grupos Rh.





TABLA 17.2
Determinacin del grupo sanguneo
Grupo
sanguneo
Aglutinacin con suero
Anti-A Anti-B Anti-AB


O
A
B
AB
-
+
-
+

-
-
+
+
-
+
+
+


Hemaglutinacin indirecta
Se basa en el principio de la inhibicin de la hemaglutinacin. Para su realizacin se
precisan glbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar
o cuantificar (Figura 17.5). Si estos glbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos
preparados frente a dicha sustancia se producir su aglutinacin. Por el contrario, cuando se
aade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se
unirn a dicha sustancia y no a los glbulos rojos. En este caso no se producir la
hemaglutinacin. Por tanto, aglutinacin (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y
aglutinacin (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotrofina corinica (HCG)
para el diagnstico de embarazo puede realizarse por esta tcnica.


Figura 17.5





TCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA

La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con
energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de longitud de onda
caracterstica permitiendo su cuantificacin.

Las molculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y
convierten la luz absorbida de alta energa (longitud de onda ms corta) en luz de menor
energa (longitud de onda ms larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y
excitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto
espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de
dos colores).

La inmunofluorescencia se utiliza
esencialmente en la deteccin de
autoanticuerpos y anticuerpos contra
antgenos de superficie de clulas y tejidos.
Para ello se emplean anticuerpos
preparados frente a la protena que se
desea detectar marcados con molculas
fluorescentes (Figura 17.6).
Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con
el antgeno por la fluorescencia emitida, que
se observa bajo microscopio de luz
ultravioleta. Este procedimiento
(Inmunofluorescencia directa) tiene la
limitacin del marcaje con un fluorocromo
de cada uno de los anticuerpos necesarios
para cada una de las sustancias a
investigar. Para evitar esto, lo que se hace
es tratar el tejido o clulas con antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y
secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia
indirecta)


CITOMETRA DE FLUJO


La tcnica de
inmunofluorescencia se suele utilizar
en el estudio de poblaciones de clulas
de sangre perifrica. Actualmente el
anlisis de una suspensin de clulas
vivas marcadas con un fluorocromo se
realiza mediante un citmetro de flujo.
La suspensin celular se hace circular
en forma de gotas microscpicas. Las
clulas pasan por un campo de
deteccin atravesado por un potente
rayo lser que produce la dispersin de
la luz y la activacin de la
fluorescencia. Mediante sensores
especficos se analizan y cuantifican
las poblaciones en estudio en funcin
de sus propiedades fisicoqumicas y
del marcaje efectuado. Para la
separacin celular este aparato lleva
acoplado un sistema que carga
elctricamente las clulas y con placas
deflectoras se realiza su separacin (Figura 17.7). Adems de basarse en la deteccin de la
Figura 17.6
Figura 17.7

fluorescencia emitida por las clulas marcadas, tambin lo hace en otras propiedades
diferenciales de las clulas en estudio como tamao (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura
17.8).

Figura17.8

La seal producida como consecuencia de la excitacin del fluorocromo, permite
conocer el porcentaje de clulas reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como
consecuencia se observan imgenes en dos dimensiones (Dot-Plot) (Figura 17.9).o en una
dimensin (Histograma) (Figura 17.10) en las que se distinguen las diferentes poblaciones
celulares marcadas.

Figura 17.9



La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjugan los
avances de
informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis fenotpico y funcional de
las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se disponga de un antisuero que las
identifique. En la tabla 17.3 se recogen los valores normales obtenidos en clulas de sangre
perifrica.


Figura 17.10



TABLA 17.3
Niveles en suero de las inmunoglobulinas (mg/dl)

IgG IgA IgM
R.N.
1-3 meses
4-6 meses
6-12 meses
1 a 2 aos
2 a 3 aos.
3 a 4 aos
4 a 7 aos
7 a 10 aos
Adultos
500-1000
300-500
300-500
500-700
600-1200
750-1500
750-1800
800-1800
800-1800
800-1800
0-5
2-16
15-30
30-60
30-175
70-250
90-390
90-450
90-450
90-450
0-10
15-30
35-60
60-180
60-220
60-250
60-280
60-280
60-280
60-280


Marcadores de linfocitos B. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador
CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresin de las molculas
CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresin de molculas HLA-DR y de receptores
de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el
CD23, ausente en linfocitos B en reposo.

Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8
presentes de forma especfica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones de clulas T de
colaboracin y citotxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activacin celular T se
expresan nuevas molculas de superficie, son principalmente receptores para factores de
crecimiento y proliferacin celular. Entre estos nuevos antgenos de activacin expresados en
la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la molcula CD25 que
corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de la insulina y de la
transferrina (CD71); c) antgenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II,
que no estn presentes en linfocitos T en reposo; y d) una gran variedad de molculas de
superficie, cuya funcin no es totalmente conocida (por ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69).

n(Ac)+c(Ag) + m(Ag*)
<--->
h(Ag-Ac)+j(Ag*-Ac)+K(Ag*)+I(Ag)


En donde: Ac: Anticuerpo; Ag: Antgeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antgeno
marcado con un istopo; Ag-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos no marcados y Ag*-Ac:
Complejos de anticuerpos y antgenos marcados




TCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO

Figura17.11


El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a
anticuerpos especficos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma
sustancia marcada con un istopo. Al establecerse esta competicin resulta que a mayor
cantidad de sustancia a cuantificar, menor ser la cantidad de sustancia radiactiva que se une
al anticuerpo y viceversa (ver esquema anexo).

Este tipo de reaccin se encuentra esquematizado en la Figura 17.11. Los resultados
se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la
hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre
queda en solucin y la hormona unida al anticuerpo forma agregados fcilmente precipitables.
Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con
cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores
obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentracin de la hormona no marcada a
investigar.

En el RIA directo, a la fase slida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes
concentraciones conocidas de antgeno marcado se incuban con una concentracin constante
de la muestra de la que se desea conocer la concentracin del antgeno en cuestin.
El fundamento y la deteccin no sufriran cambios respecto lo anteriormente
comentado. El RIA de inhibicin tambin sera una tcnica competitiva de anlisis pero lo que
se une a la fase slida es una cantidad fija de antgeno. Para el proceso de inhibicin se
incuba una concentracin fija de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la
muestra que contiene el antgeno. Existe una tcnica no competitiva que es el denominado
sandwich: Se une un Ac en cantidades constantes a la fase slida. Una vez realizado el
bloqueo, se aade el antgeno en concentraciones variables. Posteriormente se aade un
segundo anticuerpo contra el antgeno, pero esta vez marcado. Adems del
radioinmunoensayo antes descrito hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez ms
frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con istopos radiactivos para su posterior
aplicacin en diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antgenos especficos,
en tcnicas inmunorradiohistolgicas y tcnicas de anlisis no competitivo que pueden ser una
alternativa al RIA en la determinacin de algunas molculas que no pueden ser marcadas
directamente con radioyodo, en la deteccin de tumores primarios o metastsicos
(inmunoescintografa) e incluso la posibilidad de irradiacin local de clulas neoplsicas
(inmunorradioterapia).

Todas las posibilidades anteriormente indicadas se basan en la posibilidad de marcar el
anticuerpo con radioyodo sin mermar su inmunorreactividad. El marcaje de protenas o
pptidos con yodo radiactivo I125 I132 puede realizarse por diferentes mtodos. La
incorporacin del yodo a la molcula se realiza en los aminocidos aromticos que forman
parte de la estructura de la cadena peptdica: tiroxina, fenilalanina, triptfano o histidina.

La tcnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la
necesidad de utilizar istopos. Adems de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de
instalaciones adecuadas para su utilizacin, existen istopos que tienen el inconveniente de su
pronta caducidad.


TCNICA DE ENZIMOINMUNOENSAYO.

Esta tcnica, tambin se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay). La identificacin de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien
unidas al antgeno, o bien unidas al anticuerpo. El test de ELISA puede ser directo o no
competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo
especfico frente al antgeno a determinar. b) Se aade la muestra con el antgeno. c) Se
adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da
un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA
(Figura 17.12) e indirecto o competitivo, se diferencia del caso anterior en que se aaden los
anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los
antgenos de la muestra lo harn a los antgenos de los pocillos (Figura 17.13) Como enzimas
se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa.



















Figura 17.12


Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y otras
muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones.

Figura 17.13


Una variante de esta tcnica de gran utilidad se conoce como test en fase slida y est
orientada a la determinacin de anticuerpos frente a un determinado antgeno. Para ello el
antgeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plstico). Al aadir la muestra con
el posible anticuerpo se unir y podr ser detectado aadiendo anti-inmunoglobulinas
marcadas con el enzima.

Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimticas es cuando el antgeno se
encuentra fijo en clulas o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de
inmunofluorescencia indirecta, en este caso tambin se emplean dos anticuerpos. El primero,
con actividad frente a los antgenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y
que acta de puente con el complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la
peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) (Figura 17.14).

La diferencia
principal entre las tcnicas
de RIA y ELISA es que la
primera utiliza como
marcador un istopo y la
segunda la actividad de un
enzima, as el RIA directo y
el ELISA competitivo seran
equivalentes, y tambin
existira ELISA de inhibicin
y ELISA en Sandwich.
Existen inmunoensayos
que se denominan
homogneos en los cuales
no es necesario la
separacin de los
inmunocomplejos de los
reactivos libres. Son
tcnicas muchas de ellas
patentadas por diferentes
firmas comerciales.

TCNICAS NEFELOMTRICAS

Estas tcnicas se basan en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la refraccin que
dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antgeno
y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una
relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados (Figura 17.15).
Este procedimiento es rpido y sensible y se est utilizando en la actualidad, sobre todo, para
la cuantificacin de protenas en suero y en otros lquidos biolgicos.

Figura 17.5


SELECCIN DE CLULAS UNIDAS A UN ANTICUERPO
En la actualidad disponemos de varios mtodos para seleccionar clulas a las que
previamente se ha unido un anticuerpo. La adicin de complemento elimina dicha poblacin
celular (seleccin negativa), es la denominada tcnica de inmunotoxicidad.
Figura 17.4





La separacin inmunomagntica se basa en la interaccin entre antgenos celulares
superficiales y anticuerpos unidos a bolas magnticas (Figura 17.16). La aplicacin de un
campo magntico permite separar las clulas unidas a las bolas (seleccin positiva) de las
clulas no unidas (seleccin negativa).

Figura 17.16
Es un mtodo fcil, rpido y no muy costoso. Este mtodo presenta muchas
aplicaciones no slo en Inmunologa sino tambin en Microbiologa, utilizando bolas unidas a
anticuerpos frente a un determinado microorganismo; en Biologa Molecular para aislamiento
de DNA y mRNA utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia
de oligonucletidos respectivamente. Tambin se pueden usar para la purificacin de protenas
si se unen las bolas a anticuerpos especficos.

La separacin de clulas puede realizarse mediante el FACS (Fluorescence activated
cell sorting) en la que adems de los dispositivos de citometra ya mencionados se dispone de
mecanismos de separacin celular en funcin de la fluorescencia emitida por las clulas
marcadas con anticuerpos. Esta es la tcnica que actualmente ofrece mejores resultados.

TCNICAS USADAS EN EL AISLAMIENTO DE ANTICUERPOS O ANTGENOS PUROS.
Esta tcnica es ampliamente utilizada en Bioqumica e Inmunologa. Puede aplicarse
en el aislamiento de una poblacin pura de anticuerpos. Para ello se prepara un
inmunoabsorbente en fase slida, que es un antgeno unido covalentemente a un soporte
inerte, como por ejemplo bolitas de dextrano entrecruzadas. El inmunoabsorbente, se coloca
en una columna y la mezcla de anticuerpos se hace pasar a travs de l bajo condiciones
fisiolgicas. Los anticuerpos especficos para el antgeno permanecen unidos a la columna, y
aquellos que no se unen son eliminados mediante lavado. En el segundo paso, se eluye la
columna, usando un tampn de elucin que disocia la unin antgeno-anticuerpo (por ej.,
acetato a pH 3.0) para obtener el anticuerpo que se uni al inmunoabsorbente. A la inversa,
colocando anticuerpos en la columna se tendr antgeno puro. Esta tcnica permite obtener
otros tipos de molculas. As una columna de lectina absorber todas las molculas con
determinados residuos azcar, que pueden eluirse en un tampn con el azcar libre, ya que
ste compite con la protena ligada por los sitios de unin a la lectina.


INMUNOPRECIPITACIN E INMUNOBLOTTING
La inmunoprecipitacin es una de las tcnicas inmunolgicas ms tiles cuando se
asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se pueden determinar la
presencia y cantidad de un antgeno, el peso molecular relativo de una cadena polipeptdica, su
sntesis y degradacin, la interaccin con protenas, cidos nucleicos u otros ligandos. La
tcnica de inmunoprecipitacin se divide en cuatro pasos (Figura 17.17):

Figura 17.17

1. Marcaje del antgeno (opcional)

2. Lisis de las clulas para liberar el Ag

3. Formacin del complejo Ag-Ac

4. Purificacin de los inmunocomplejos

En la mayora de los casos el antgeno se marca incubndolo con un precursor
radiactivo aunque muchos antgenos se pueden detectar por medios que no requieren marcaje
directo. El antgeno se extrae de las clulas mediante lisis. Despus, los anticuerpos se aaden
al lisado y se forman los inmunocomplejos Ag-Ac. Estos se unen por adsorcin a una fase
slida que contiene protena A.

Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel pero tambin
pueden ser usados en diferentes tcnicas incluyendo estudios enzimticos, unin a ligandos,
inmunizaciones, inmunoblotting, etc.

Una de estas tcnicas es el Western blot que combina la resolucin de la electroforesis
en gel con la especificidad de la deteccin inmunoqumica. Se utiliza para determinar la
presencia y cantidad de antgenos y de anticuerpos especficos. En la actualidad es el test
confirmatorio ms empleado para el diagnstico del SIDA. Se emplean antgenos virales
obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes protenas vricas
por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y
secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan aadiendo
una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda coloreada
al aadir un sustrato. Esta tcnica identifica anticuerpos especficos frente a las distintas
protenas del VIH.

OTRAS TCNICAS BASADAS EN LA UNION ANTGENO-ANTICUERPO
Hay otros modos para detectar el complejo antgeno-anticuerpo una vez que ste se ha
formado, adems de los descritos en los apartados anteriores. Son, por ejemplo, las tcnicas
basadas en el marcaje de anticuerpos con ferritina u oro coloidad, de gran utilidad en
microscopa electrnica.

La tcnica de anticuerpos marcados con ferritina se basa en el hecho de que casi el
25% de esta molcula est formada por hierro que, al ser opaco a los electrones, puede ser
detectado en microscopa electrnica. Los anticuerpos pueden ser combinados a la ferritina (u
otras protenas) mediante ligandos bivalentes como el 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenceno o la
bencidina bidiazoica entre otros.

La tcnica basada en el marcaje de anticuerpos con oro coloidal y su uso en
microscopa electrnica se basa, al igual que en el caso anterior, en la opacidad de estas
molculas a los electrones. Estas tcnicas son de gran utilidad en inmunohistologa e
inmunocitologa humana, animal y vegetal.

Tambin estn tomando cada vez mayor auge las tcnicas quimioluminiscentes. La
quimioluminiscencia consiste en trminos generales en la produccin qumica de la luz. Los
marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la
energa de una reaccin qumica oxidativa, son colocadas en un estado de excitacin
electrnica. La emisin de luz se produce al volver a su estado inicial y la energa qumica
absorbida se cede en forma de fotones fcilmente cuantificables con un fotodetector. Los
marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de istopos radiactivos en
el inmunoanlisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la
emisin de luz slo se produce cuando se provoca la reaccin oxidativa siendo posible
almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes.

Las tcnicas anteriores as como las de inmunofluorescencia, radioinmunoanlisis e
enzimoinmunoensayo pueden realizarse utilizando un sistema de ampliacin de las seales
empleando el complejo avidina-biotina. La biotina es una vitamina de bajo peso molecular, y la
avidina es una glicoprotena, contenida en la clara del huevo. La biotina se une covalentemente
al anticuerpo a travs de un grupo amina, carboxilo sulfhidrilo o tiosil. Varias molculas de
biotina, pueden unirse a una de anticuerpo y dada la afinidad biotina-avidina resulta que, cada
molcula proteica, se vera unida, a travs de la biotina, con varias molculas de avidina a su
vez unidas al marcador correspondiente.

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR UTILES EN INMUNOLOGA.


Figura 17.8



Otro grupo de tcnicas ampliamente utilizadas en inmunologa son de biologa
molecular. Una de las ms utilizadas es la Southern Blot. Esta tcnica consiste en la
separacin de fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestin con enzimas de
restriccin. La separacin se hace mediante electroforesis y despus este DNA es transferido a
membranas de nylon o nitrocelulosa (blot). Despus, para la identificacin de la banda que
interesa se realiza un proceso llamado hibrizacin, en el que la membrana es "incubada" con
un fragmento de DNA complementario al gen de inters (sonda) previamente marcada,
generalmente con un istopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante
autoradiografa la banda en la cual se ha producido unin (Figura 17.18),










BIBLIOGRAFA

1. Bloisi, R.M. 1988. Principles of Immunology and Inmunodiagnostic. Ed. Lea/Tebiger.

2. J ohnstone, A. and Thorpe, R. 1987. Immunochemistry in Practice. 2nd ed.

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5. Lefkovits, I. y Pernis, P. 1997. Immunological Methods. Academic Press.

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