PRUEBAS INMUNOLGICAS DE LABORATORIO

TEMA 20
Reacciones de Precipitacin
Las reacciones de precipitacin, son las mas simples de las reacciones antgeno/anticuerpo y
en ellas se visualiza un precipitado visible, cuando reacciona un (ag) soluble (precipit!eno) y su
(ac) correspondiente (precipitina). Los precipitgenos pueden ser cualquier sustancia antignica en
suspensin coloidal, como protenas sricas, toxinas, extractos de bacterias, parsitos, !ongos, etc.
Mecanis"o de Reaccin
Las reacciones de precipitacin y aglutinacin tienen un mismo mecanismo de reaccin, y su
di"erencia depende de la naturaleza del #g. $n las reacciones de precipitacin el #g adems de ser
soluble, debe ser multivalente (es decir, debe contar con varias copias del mismo determinante
antignico). $llo conlleva a la "ormacin gradual de un entrecruzamiento o red entre los #cs
divalentes y los determinantes antignicos de #gs adyacentes, que al alcanzar ciertas dimensiones,
el comple%o "ormado precipita. La unin del precipitgeno y la precipitina ocurre rpidamente en
segundos, pero la "ormacin de los precipitados y por lo tanto, su visualizacin, puede demorar
desde minutos, !oras y !asta das.
&odalidades de las 'eacciones de (recipitacin
Las reacciones de precipitacin se pueden realizar en) *+ &edio lquido y ,+ &edio
semislido.
Medio Se"is#ido$ In"%nodi&%sin
Las reacciones de inmunodi"usin, son tcnicas de precipitacin que utilizan el agar con
medio de soporte, en donde el #g y/o el #c van a di"undir y en el sitio donde se encuentren en sus
proporciones ptimas, aparecer una linea, un anillo o un arco de precipitacin. $sta tcnica "ue
introducida por -udin en *./0, con su mtodo de di"usin simple en un tubo.
#gar) polisacrido derivado de ciertas algas, que viene en "orma granulada y se disuelve en agua
destilada o amortiguador (bu""er) caliente. La solucin al alcanzar la temperatura ambiente queda en
estado semislido
La inmunodi"usin se usa para el anlisis cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo de
antgenos y anticuerpos en el suero y otros lquidos corporales. La interpretacin del anlisis es el
desarrollo de una reaccin de precipitacin (la "ormacin de un comple%o antgeno+ anticuerpo
insoluble a partir de un antgeno y anticuerpo soluble).
In"%nodi&%sin Do'#e de O%c(ter#on)) $s una de las tcnicas mas utilizadas para evaluar en
"orma cualitativa o semicuantitativa la presencia de #gs o #cs en una muestra biolgica. 1e
"undamenta en el principio de que el #g y el #c di"unden a travs del agar "ormando lneas de
precipitacin que representan comple%os inmunes, los cuales pueden analizarse visualmente. $sta
prueba permite relacionar varios #gs o #cs a travs de 2 tipos de patrones) patrn de identidad, de
no identidad y de identidad parcial.
(atrn de 3dentidad) (atrn caracterizado por la "ormacin de dos lneas de precipitacin que
con"luyen en un punto y signi"ica que en , muestras biolgicas existe la presencia del mismo
anticuerpo espec"ico para un determinado antgeno.
(atrn de 4o 3dentidad) (atrn caracterizado por la "ormacin de , lneas de precipitacin que se
cruzan por completo y signi"ica que en una muestra biolgica existe la presencia de , anticuerpos
di"erentes, espec"icos para , antgenos.
(atrn de 3dentidad (arcial) (atrn caracterizado por la "ormacin de , lneas de precipitacin que
no se suponen por completo, debido a que los antgenos comparten un determinante antignico
(#gs que reaccionan cruzadamente), con la consecuente "ormacin de un espoln, debido a que una
de las lneas de precipitacin se proyecta en el agar.
5tilidad 6lnica de la 3nmunodi"usin de -uc!terlony
(osibilidad de !acer diagnstico y evaluar la evolucin de en"ermedades in"ecciosas
producidas por bacterias, !ongos, virus y parsitos.
In"%nodi&%sin Radia# de Mancini) 1e 7undamenta en el principio de que exista una relacin
cuantitativa entre la cantidad de #g colocado en un pozo de una lmina de #gar+#c y el dimetro del
anillo de precipitacin resultante.
(ara ello, se a8ade #c a un gel de agar, que a continuacin se vierte sobre un alamina de
vidrio y se de%a solidi"icar. 6uando el agar ya esta slido, se excavan en el mismo unos, unos
pocillos y se a8ade a cada uno un volumen estandr del #g problema a di"erentes concentraciones.
Las placas se incuban durante un periodo mnimo de ,/ !oras, durante el cual el #g se di"unde
!acia el exterior de los pocillos y "orma comple%os con el #. $stos se siguen di"undiendo !acia el
exterior, unindose cada vez mas a cantidad de #c, !asta que se alcanza el punto de equivalencia y
los inmunocomple%os precipitan "ormando un anillo. La super"icie que abarca el anillo, que es "uncin
del cuadrado de su dimetro, es proporcional a la concentracin del #g. La concentracin de la
muestra problema se determina mediante interpolacin a partir de una curva de calibracin. $l
proceso tambin se puede llevar a la inversa, utilizando un gel con #g para determinar
concentraciones desconocidas de #c.
5tilidad 6linica de la 3nmunodi"usin 'adial de &ancini
9eterminacin cuantitativa de 3gs) 3g#, 3g: e 3g&
9eterminacin cuantitativa de 62 ; 6/(componentes del complemento)
In"%noe#ectro&oresis) este es un mtodo que combina el principio de la electro"oresis zonal, es
decir, la separacin de las protenas presentes en una muestra biolgica, mediante la aplicacin de
un campo elctrico y la inmunodi"usin doble. 5na vez separadas las protenas de la muestra se
!acen reaccionar con #cs espec"icos y al di"undir ambos elementos (#g y #c), se "orman arcos de
precipitacin caractersticos. (or lo tanto, se puede obtener la identi"icacin y cuanti"icacin
aproximada de protenas individuales presentes en el suero, orina u otros lquidos biolgicos.
$n esta tcnica, se cubre una portaob%etos con agar o agarosa "undidos en una solucin
amortiguadora alcalina. 5na vez geli"icado, se abre un pocillo para colocar la muestra bilogica y un
canal para los anticuerpos espec"icos. 6olocada la muestra se procede a aplicar una di"erencia de
potencial para que ocurra la separacin de las di"erentes protenas de la muestra, durante 2< a 0<
minutos. $ntonces se colocan los anticuerpos en el canal y se permite que las protenas (#gs) y los
#cs di"undan duante *= ,/ !oras.
$n el caso particular en el que por e%emplo se sospec!e de una mieloma productor de 3g:,
se utiliza un suero control, en el cual la concentracin de 3g: es normal y se realiza la corrida
electro"ortica simultneamente con el suero problema. Luego se a8ade anti+3g: !umana en el
canal y se espera a que ambos reactantes di"undan libremente. $l arco de precipitacin "ormado con
el suero del paciente se compara con el arco "ormado por el suero control.
5tilidad 6lnica de la 3nmunoelectro"oresis
9iagnostico de (araproteinemias (por e%emplo) &ieloma &ultiple)
3denti"icacin de cantidades elevadas de protenas presentes en el liquido ce"alorraqudeo,
en pacientes con diversas en"ermedades neurolgicas.
9isminucin o ausencia de inmunoglobulinas en diversos trastornos de de"iciencia
inmunitaria.
>ay reacciones de precipitacin anormales, llamadas de &#oc%#acin, en las que la
precipitacin se observa solamente en un intervalo muy estrec!o de concentraciones relativas de
#g y #c? los agregados insolubles no se "orman !asta que se !a a8adido una cantidad relativamente
grande de #g. $stas reacciones son producidas solamente por ciertos antisueros como por e%emplo)
antisueros de caballo contra la toxina di"trica y contra algunas toxinas estreptoccicas, algunos
antisueros !umanos contra la tiroglobulina y anticuerpos no treponmicos !umano contra la
cardiolipina del coraz8on de buey, utilizado en el diagnostico serolgico de s"ilis, mediante la prueba
@.9.'.L.
9iagnstico serolgico de la s"ilis (prueba de @.9.'.L)
La s"ilis es una en"ermedad de transmisin sexual de evolucin crnica, con periodos
asintomticos, cuyo agente etiolgico es Areponema pallidum. $sta en"ermadad se caracteriza por la
presencia de una lesin primaria (denominada c!ancro), una erupcin secundaria que a"ecta la piel
y las membranas mucosas, largos perodos de latencia y lesiones tardas en la piel, los !uesos, las
vsceras, los o%os, el sistema nervioso y el cardiovascular. Areponema pallidum es un patgeno
exclusivo del !ombre, quien es su Bnico reservorio. 1e adquiere por contacto directo
("undamentalmente por contacto sexual) con una lesin de s"ilis reciente, por va transplacentaria y
raras veces por trans"usiones de sangre? penetra a travs de la mucosa sana o la piel erosionada y
rpidamente se disemina en el organismo, por lo que la in"eccin es sistmica desde etapas
precoces.
$xisten bsicamente dos estrategias que son utilizadas en la prctica para el diagnstico de
la en"ermedad)
a) $xamen directo
b) Las reacciones serolgicas.
$l ob%etivo del examen directo consiste en demostrar la presencia de A. pallidum en los
exudados de las lesiones primarias (c!ancro) o en las serosidades de las lesiones secundarias
cutneos+mucosas. La "inalidad de las reacciones serolgicas es demostrar la presencia de
anticuerpos contra Areponema pallidum o antgenos relacionados (e%. 6ardiolipina) en muestras
obtenidas del paciente (e%. 1uero, plasma y lquido ce"alorraqudeo).
$n la mayora de las ocasiones, existen di"icultades o no es posible realizar el diagnstico
directo, por lo que el diagnstico indirecto o serolgico de la en"ermedad se !a convertido en el
procedimiento mas "recuente. Los anticuerpos producidos como consecuencia de la in"eccin por
Areponema pallidum, se clasi"ican operacionalmente en dos tipos) a) anticuerpos no treponmicos
(reciben tambin la denominacin de anticuerpos reaginicos o reginas si"ilticas), los cuales
reaccionan con antgenos lipdicos (e%. 6ardiolipina) y b) anticuerpos treponmicos que reaccionan
con Areponema pallidum o sus antgenos espec"icos.
*%nda"ento "etodo#!ico de #a pr%e'a de +,D,R,L
5no de los mtodos de laboratorio mas utilizados para establecer el diagnostico serolgico
de la s"ilis es la pruba conocida como @.9.'.L. $n la prueba en re"erencia, una suspensin de
cardiolipina(con lecitina y colesterol) en bu""er salino es mezclado con el suero del paciente, se agita
en un rotador mecnico y luego de un perodo de incubacin adecuado (/ minutos) se observa
microscpicamente. 1i el suero contiene anticuerpos reagnicos o anticuerpos no treponmicos se
observan "lculis ( conglomerados) producto de la reaccin #g+#c. $sta prueba puede realizarse de
manera cualitativa y semicuantitativa
Lectura 'eporte
1e observa una suspensin !omognea de partculas delgadas y
cortas, seme%antes a agu%as, sin la presencia de conglomerados
(grumos).
4o 'eactivo
(4')
1e observa la presencia de numerosos conglomerados peque8os
repartidos entre partculas sueltas.
9bilmente
'eactivo (9')
1e observa la presencia de conglomerados relativamente
voluminosos medianos y grandes sobre un "ondo claro.
'eactivo (')
Los procedimientos cualitativos Bnicamente permiten demostrar la presencia (muestra
reactiva) o ausencia (muestra no reactiva) de los anticuerpos no treponmicos en la muestra
analizada. Los procedimientos semicuantitativos (en el caso del @.9.'.L. se denomina @.9.'.L.
cuantitativo) permiten la obtencin de ttulos de anticuerpos que se correlacionan bastante bien con
el estado clnico del paciente, de manera que son usadas para evaluar la e"icacia de los tratamientos
(el titulo de #cs no treponmicos tiende a disminuir con el tiempo en la medida que el paciente
me%ora).
1i en la muestra de suero se detecta la presencia de anticuerpos reaginicos (@.9.'.L. cualitativo), se
realizara entonces la prueba semicuantitativa (@.9.'.L. cuantitativo), realizando diluciones seriadas
del suero. $l titulo corresponder a la mayor dilucin del suero donde se produzca un resultado
reactivo. # continuacin se presentan dos e%emplos que muestran los resultados obtenidos despus
de realizado el @.9.'.L. cuantitativo y el reporte correspondiente, segBn el caso o suero examinado.
$l reporte mencionado le es enviado posteriormente al mdico que prescribi la prueba en
re"erencia.

Reacciones de A!#%tinacin ) -e"a!#%tinacin
Las pruebas de aglutinacin, son aquellas reacciones que se caracterizan por la "ormacin de
agregados visibles, cuando se mezclan antgenos (#gs) particulados o insolubles (a!#%tin!enos)
con sus anticuerpos (#cs) espec"icos (a!#%tininas). Los aglutingenos mas "recuentes utilizados en
la reaccin son) bacterias, partculas inertes (de latex, poliestireno, bentonita, etc) sobre la cual se
!an acoplado #gs solubles. Los agentes que actBan como antgenos no necesariamente deben
estar vivos, porque reaccionan igual estando muertos.
$n estas reacciones tambin se utilizan glbulos ro%os, bien sea para detectar #gs propios de
su membrana (tipi"icacin #C- y "actor '!) o tambin para ser utilizados como reactivos en varias
pruebas de laboratorio. 6uando se utilizan como reactivos, previamente se absorben sobre su
super"icie #gs solubles o #cs, se dice que los globulos ro%os se !an sensibilizado in vitro. 6uando se
utilizan globulos ro%os, la reaccin se denomina !emaglutinacin y los #cs involucrados,
(e"a!#%tininas,
*. :eneralidades de las reacciones de #glutinacin
$stas pruebas pueden detectar el #g o el #c en una muestra biolgica y se puede realizar en
"orma cualitativa o semicuantitativa, no pudindose obtener resultados cuantitativos exactos. 1in
embargo, la "acilidad con que se e%ecutan y la capacidad que tienen para detectar peque8as
cantidades de #g o #c (alta sensibilidad) las !acen muy Btiles en el inmunodiagnstico.
2, Mecanis"o de #a reaccin
La unin del aglutingeno y la aglutinina ocurre en segundos, pero la "ormacin de los agregados,
puede tardar desde minutos !asta !oras o das. $n estas reacciones el #g o aglutingeno debe ser
multivalente. $sto conlleva la "ormacin gradual de un entrecruzamiento (una red) entre el #c y los
determinantes antignicos, que al "inal de la reaccin da como resultado la "ormacin de grumos
visibles.
., Uti#idad C#/nica de #as reacciones de A!#%tinacn$
9eteccin de aglutininas en el suero de pacientes con) salmonelosis, brucelosis,
leptospirosis, "iebres t"icas, etc.
9eterminacin del 7actor 'eumatoideo en la #rtritis 'eumatoidea.
9eterminacin en suero de (rotena 6 'eactiva ((6') en procesos in"lamatorios.
9eterminacin en orina de :onadotro"ina 6orinica >umana (:6>) (prueba de
embarazo).
0, Uti#idad C#inica de #as reacciones de -e"a!#%tinacin$
Aipi"icacin #C- y 7actor '!
9eterminacin de #cs anti+Aoxoplasma gondi y anti+tripanosoma cruzi.
Pr%e'a de #a Anti1In"%no!#o'%#ina -%"ana 2Pr%e'a de Coo"'s3
$ste es un mtodo ingenioso para detectar #cs incompletos o bloqueantes. $stos #cs
probablemente son molculas bivalentes que "orman un enlace mongamo (a grupos antignicos de
repeticin de la super"icie celular), por lo que no se produce la reaccin de aglutinacin. (7igura 0)
-tros autores explican esta observacin, basndose en el !ec!o de que en la super"icie celular no
!ay su"icientes determinantes antignicos para que los #cs superen la repulsin electrosttica
normal que existen entre los #gs.("iguraD)
(ara la obtencin de la anti+inmunoglobulina !umana o reactivo de 6oombs puede utilizarse
diversos mtodos inmunoqumicos, uno de ellos es el denominado "raccionamiento 3gs !umanas.
Luego de esta "raccin se inyecta a una especie animal !eterloga (cone%o, carnero). $l animal
empezara a producir #cs contra las 3gs !umanas (reactivo de coombs polivalente)
La prueba de 6oombs tiene , modalidades)
(rueba de 6oombs 9irecta ) 9etecta la presencia de #cs imcompletos sobre glbulos ro%os
provenientes de individuos sensibilizados. $l e%emplo clsico, es la deteccin de #cs anti+'!
sobre los glbulos ro%os de un recin nacido '! positivo, cuya madre es '! negativo.
6uando una mu%er es "actor '! negativo, que da embarazada y el !i%o es "actor '! positivo,
entonces de acuerdo al estado "uncional de la placenta o en el momento del parto los
eritrocitos "etales pueden pasar a la circulacin materna. Los glbulos ro%os "etales son
antignicamente extra8os a la madre y ella empieza a producir anticuerpos anti+'! positivo.
$stos #cs son de la clase 3g: y tienen capacidad de atravesar la placenta, por lo que
reacciones con "actor '! positivo de los glbulos ro%os del "eto, quedando recubiertos de
estos #cs. $stos glbulos ro%os empiezan a ser lisados por el complemento o son destruidos
en el bazo y el "eto empieza a su"rir de anemia. 6uando el ni8o nace y se sospec!a de
anemia !emoltica del recin nacido, el mdico ordena 6oombs directo para detectar los #cs
anti+'! positivos sobre los glbulos ro%os del recin nacido. (ara ello se le extrae sangre al
recin nacido y sus glbulos ro%os se !acen reaccionar con el 'eactivo de 6oombs.
(rueba de 6oombs 3ndirecta ) 9etecta la presencia de #cs incompletos en el suero, mediante
una reaccin en , etapas, que comprende la incubacin de la muestra srica con glbulos
ro%os con el ob%eto de sensibilizarlos y en una segunda etapa ocurre la aglutinacin de los
glbulos ro%os sensibilizados por el reactivo de 6oombs.
$n la misma circunstancia del e%emplo anterior, es importante determinar el ttulo de #cs anti+
'! en la mu%er embarazada. (ara ello en una primera etapa se !acen reaccionar glbulos ro%os
conocidos ('! positivos) con el suero de la paciente. Luego de un periodo de incubacin, en una
segunda etapa se a8ade el reactivo de 6oombs (anti+3g) y si la mu%er tiene #cs anti+'! positivos
se observar la aglutinacin de los glbulos ro%os.
Las pruebas de 6oombs pueden usarse para detectar)
9etectar #cs incompletos sobre la membrana plasmtica del glbulo ro%o en individuos
sensiblizados (coombs directo)
#nemias !emolticas inducidas por "rmacos
#nemia !emoltica del recin nacido
#nemias !emolticas autoinmunitarias
9etectar #cs incompletos que se encuentran libres en el suero (coombs indirecto)
Pr%e'as de In"%no&#%orescencia
$xisten sustancias denominadas "luorocromos, que emiten una luz o radiacin lumnica
("luorescencia) cuya longitud de onda se ubica dentro del espectro visible cuando se les !ace incidir
otra luz de menor longitud de onda (mayor energa), como la luz ultravioleta. $ntre estas se pueden
mencionar) 7luorescena, 'odamina y naran%a de acridina. $stas sustancias tienen la propiedad de
que puedan acoplarse a molculas proteicas tales como los #cs "ormndose con%ugados (#c al que
se le !a acoplado un "luorocromo) que pueden ser utilizados para detectar #gs presentes en la
membrana celular, inmunocomple%os depositados en te%idos y #cs de una determinada especi"icidad
circulantes en lquidos orgnicos.
6on base a lo expuesto, el principio bsico en el que se "undamentan las pruebas de
inmuno"luorescencia, es !acer reaccionar un #c espec"ico con%ugado a un "luorocromo con el #g
correspondiente y la reaccin #g+#c. 6abe destacar, que en la apreciacin de estas reacciones se
usan equipos para permitir visualizar la "luorescencia emitida por el "luorocromo en "orma cualitativa
(e%., microscopios de "luorescencia) o cuantitativa (e%., micro"luormetros).
Los tipos de muestras que se pueden examinar mediante las pruebas de
inmuno"luorescencia incluyen cortes o biopsias de te%ido, alimentos envasados contaminados,
suspensiones celulares y lquidos orgnicos.
$xisten varias modalidades de las pruebas de inmuno"luorescencia, de estas las que se
realizan con mayor "recuencia "iguran la inmuno"luorescencia directa e indirecta.
$n la inmuno"luorescencia directa se utilizan #cs con%ugados a "luorocromos espec"icos
contra bacterias, virus, !ongos, y parsitos tambin anti inmunoglobulina !umana con%ugada a un
"luorocromo (e%., en casos de la deteccin de comple%os inmunolgicos en diversos te%idos). $l
ob%etivo de esta modalidad es demostrar la presencia del #g correspondiente en la muestra que se
est examinando. $ntre sus utilidades)
9eteccinn del virus de la rabia en cortes de te%ido cerebral de animales
9eteccin de inmunocomple%os depositados en biopsias de rganos como piel o ri8n
9eteccin de gonococos en secreciones uretrales
9eteccin de 6!lamydia trac!omatis en "rotis endocervical
9eteccin de Areponema pallidum en "rotis de los exudados de las lesiones pimarias o en las
serosidades de las lesiones secundarias cutneomucosas de pacientes con s"ilis.
3denti"icacin y conta%e de clulas C y A en sangre peri"rica !umana
$l ob%etivo de la inmuno"luorescencia indirecta es la deteccin de #cs espec"icos contra un
determinado #g presente en un lquido orgnico, para ello en una primera etapa del
procedimiento se !ace reaccionar la muestra antignica con #cs espec"icos presentes en el
suero del paciente. $n la segunda etapa se agrega anti+inmunoglobulina !umana con%ugada a un
"luorocromo. 1i en la primera etapa se produce la reaccin #g+#c, se "i%ar el con%ugado de anti+
inmunoglobulina !umana y por tanto !abr "luorescencia entre sus utilidades)
9eteccin de #cs antinucleares en pacientes con lupus eritematoso sistmico y de
otros autoanticuerpos en en"ermedades autoinmunes.
9eteccin de #cs espec"icos que contribuyen al diagnstico serolgico de
en"ermedades in"ecciosas como s"ilis, rubeola, sarampin, toxoplasmosis,
tripanosomiasis (mal de c!agas)
Radioin"%noan4#isis
$stas pruebas se "undamentan en que son procedimientos en los cuales se utilizan #gs o
#cs marcados con un isotopo radiactivo con el ob%eto de estudiar #gs o #cs de una determinada
especi"icidad en muestras biolgicas. La reaccin #g+#c se evidencia en estas pruebas mediante la
emisin radiactiva por parte del isotopo que "ue utilizado para el marca%e respectivo. La
radioactividad emitida puede ser medida por instrumentos adaptados para tal "in.
$s importante destacar, que estas pruebas tienen importantes #i"itaciones ya que el costo
de los equipos ya que el costo de los equipos y reactivos radioactivos es muy elevado, adems,
existen potenciales problemas de contaminacin ambiental por el tratamiento inadecuado de los
desec!os y por otra parte riesgo de contaminacin para el personal de laboratotio. $stas limitaciones
y ante el advenimiento de pruebas muy sensibles y espec"icas que no presentan las desventa%as
mencionadas (e%., $L31#), !an limitado en la actualidad el uso de estos procedimientos.
$l 'adioinmunoanlisis !a sido utilizado en la determinacin de) !ormonas, drogas,
"rmacos, 3g$ total, 3g$ espec"ica contra un determinado alrgeno, #cs contra parsitos, bacterias y
virus, #gs bacterianos, virales y parasitarios.
Pr%e'as I"%noen5i"4ticas 2ELISA3
$stas pruebas se basan en la deteccin de comple%os #g+#c mediante el empleo de enzimas
unidas al #g o al #c, los cuales actBan sobre determinados sustratos para dar origen a productos
coloreados que pueden ser medidos espectro"otomtricamente. La intensidad del color ser
directamente proporcional a la cantidad de comple%os #g+#c que se !a "ormado y por tanto
directamente proporcional a la concentracin del #c o #g investigado en la muestra analizada (e%.,
suero). $stas pruebas constituyen una de las !erramientas actuales mas Btiles en el laboratorio de
inmunodiagnstico debido a que las mismas presentan las siguientes venta%as)
#lta sensibilidad y especi"icidad
1on pruebas de gran aplicabilidad clnica
1on de "cil realizacin
1on pruebas cuyos resultados se obtienen en un tiempo relativamente corto
1on pruebas seguras ya que los reactivos empleados no presentan riesgos a la salud
Los reactivos empleados por lo general son bastantes estables.
Las pruebas de $L31# se pueden realizar de diversas "ormas o modalidades segBn el
ob%etivo propuesto, entre estas modalidades "iguran el mtodo indirecto y el mtodo de captura,
tambin denominado Ede doble #cF EsndGic!F. &ediante la aplicacin del mtodo indirecto, es
posible detectar en muestras obtenidas de pacientes #cs de una determinada especi"icidad de
combinacin antignica, mientras que el desarrollo de la modalidad de captura o de doble #c,
permite la deteccin de #gs diversos en la muestra analizada (e%., #gs>C son !erramientas muy
Btiles para establecer el diagnstico de di"erentes en"ermedades !umanas.
Las aplicaciones de $L31# abarcan un espectro amplio de en"ermedades in"ecciosas,
en"ermedades autoinmunes, deteccin de marcadores tumorales, en"ermedades endocrinas,
cuanti"icacin de drogas, medicamentos, !ormonas, marcadores virales, etc. #plicaciones
clnicas)
9eteccin de #cs diversos, entre los que "iguran) anti+@3>, anti+citomegalovirus
!umano (3g&/3g:) anti+virus del sarampin, antivirus de la !epatitis C los , tambin
con (3g&/3g:), anti+esperma, anti+ovario, autoanticuerpos de di"erentes
especi"icidades.
9eteccin de #cs, tales como) #gs >C, !ormonas tiroideas, !ormonas de la
"ertilidad, !ormonas esteroideas, "erritina, interleuquinas, inter"eron gamma, "actor de
necrosis tumoral, antgeno prosttico espec"ico
9entro de las aplicaciones de estas pruebas inmunoenzimticas, "igura la deteccin
sero#!ica de Acs de c#ase I!M espec/&ica contra una gran variedad de antgenos
de di"erentes microorganismos in"ecciosos (e%., 3g& anti+toxoplasma gondii, 3g& anti+
Aripanosoma cruzi, 3g& anti+virus dengue). La presencia de #cs de clase 3g&
antgeno espec"ica es indicativo que la in"eccin ocurri recientemente. $n casos de
los ni8os recin nacidos se correlaciona con in"eccin congnita o que la in"eccin
ocurri durante el nacimiento.
6estern1B#ot 2In"%notrans&erencia1 In"%noe#ectrotrans&erencia3
La prueba HC es una tcnica que incluye la trans"erencia de protenas desde un gel a una
membrana. $ste procedimiento proporciona un medio muy espec"ico para identi"icar reactividad de
#cs en muestras biolgicas. $sta tcnica se puede realizar con la "inalidad de detectar la presencia
de #cs contra una determinada protena antignica o identi"icar un determinado #g. La prueba se
realiza en 2 etapas)
*+ 1eparacin de los #gs mediante electro"oresis en gel de dodecil sul"ato sdico+poliacrilamida
(191+(#:$)
,+ Arans"erencia de los #gs proteicos separados en la electro"oresis inicial, desde el gel a una
matriz de soporte
2+ 9eteccin de los #cs espec"icos contra los #gs trans"eridos al papel de nitrocelulosa
identi"icacin de de los #gs trans"eridos a la matriz de soporte mencionada
5no de los usos mas "recuentes de la HC es la con"irmacin de las pruebas de deteccin
serolgica reactivas para #cs anti+@3>. $n este caso, los #gs virales se separan mediante
electro"oresis en gel de 191+(#:$. $l tratamiento del lisado viral con 191 imparte una carga
negativa a las protenas. Las protenas virales en seguida son ob%eto de electro"oresis en un gel
de poliacrilamida. 6omo las protenas estn cargadas negativamente migrarn al polo positivo y
se separan en "uncin de su peso molecular. Las protenas mas grandes tendrn una distancia
de migracin in"erior a la ex!ibida por las protenas de menor peso molecular.
(ara la deteccin de #cs contra los #gs del @3>, las protenas se trans"ieren del gel a la
matriz de soporte (papel de nitrocelulosa). $sta trans"erencia tiene como resultado una copia
exacta del patrn del gel en matriz. La tira de papel de nitrocelulosa donde se !an trans"erido los
#gs virales se incuba con el suero del paciente. 6abe destacar, que tiras de papel de
nitrocelulosa similares se incuban simultneamente con sueros controles positivos y negativos.
1i el suero del paciente tiene #cs espec"icos contra los #gs del @3>, estos interaccionarn con
los #gs virales respectivos. 9espus del lavado para eliminar todo aquello que no se !aya
combinado, se procede a revelar la reaccin #g+#c.
$xisten varios procedimientos de revelado, uno de los mas utilizados es agregar
antiinmunoglobulina !umana con%ugada a una enzima. $l con%ugado en re"erencia se combinar
con el #c anti+@3> que esta interaccionando con el #g "i%ado a la matriz de nitrocelulosa de un
determinado peso molecular. 1eguidamente se agrega el sustrato de la enzima, el cual se
trans"ormar en productos insolubles coloreados que precipitan en la zona de reaccin, de%ando
una Emanc!a coloreadaF visible al o%o !umano. La presencia del precipitado coloreado es
indicativo que el suero del paciente tena #cs contra la protena antignica de @3>.
6abe destacar, que el suero del paciente puede tener #cs espec"icos contra di"erentes
protenas virales de di"erentes pesos moleculares, por lo que mediante esta prueba pueden
detectarse la presencia de estos. Las reaccionas se reportan como positivas cuando una lnea
de precipitacin coloreada se "orma en la zona del papel de nitrocelulosa donde estaba presente
el correspondiente #g viral de un determinado peso molecular.
La prueba HC !a demostrado ser muy Btil en la identi"icacin de ags importantes en
microorganismos bacterianos, micticos, virales y parasitarios, adems tiene otras aplicaciones
clnicas aparte de ser utilizada como prueba con"irmatoria de la in"eccin por @3>)
9iagnstico de en"ermedad gastrointestinal autoinmune
9iagnstico de en"ermedad reumatoide autoinmune
9iagnstico de @asculitis autoinmune
Unidad -e"o#/tica C-70 se de"ine como la cantidad de suero necesario para realizar el I< J de
!emlisis de una suspensin de eritrocitos de carnero, sensibilizados con anticuerpos anticarnero de
cone%o (!emolisina).
Pr%e'as de In"%no(e"#isis 2Co"p#e"ento -e"o#/tico Tota# C-703
Principio de #a In"%no(e"#isis$ 1e re"iere a la liberacin de !emoglobina por parte de eritrocitos,
luego que ste interactBa con un #c espec"ico para determinantes antignicos situados en su
super"icie, debido a la participacin del sistema del complemento en el suero de un paciente. Las
clulas utilizadas son glbulos ro%os de carnero o de cone%o.
#nlisis 6uantitativo de la actividad !emoltica del complemento ((rueba del 6omplemento
>emoltico Aotal 6>I<) $s una prueba "uncional que re"le%a la actividad de los componentes de la
va clsica del complemento. $sta prueba resulta Btil para evaluar la integridad del sistema,
particularmente en casos de de"iciencias genticas donde la ausencia de uno de los componentes
se re"le%a en ttulos ba%os de 5nidades >emolticas 6>I<.

(rincipio) $l anlisis cuantitativo de la actividad !emoltica del complemento, basado en la unidad
!emoltica 6>I< depende de la capacidad de la va clsica del complemento para inducir la
!emlisis de eritrocitos de carnero sensibilizados con cantidades ptimas de anticuerpos
antieritrocito (!emolisina). Luego se a8ade el suero del paciente y "inalmente se determina el grado
o porcenta%e de !emlisis. La !emlisis ocasionada por los componentes de la va clsica del
complemento se mide de manera espectro"omtrica y puede relacionarse la cantidad de suero con
la cantidad de !emoglobina liberada.
9eterminacin del ttulo en la (rueba de 6omplemento >emoltico Aotal 6>I<) (ara la realizacin
de la prueba, inicialmente se a8ade a una serie de tubos de ensayos cantidades variables y
crecientes del suero diluido */I< en estudio al sistema indicador (eritrocitos de carnero mas
anticuerpos antieritrocitos) 9espus de un periodo de incubacin adecuado se determina la cantidad
de !emoglobina liberada con ayuda de un espectro"otmetro. 1eguidamente se determina el
porcenta%e de !emlisis obtenida en cada tubo. # continuacin se gra"ica en un papel milimetrado
porcenta%e de !emlisis (ordenada) y el volumen de suero diluido */I< que se agreg a cada tubo
(abscisa) lo que permite calcular el volumen de suero diluido */I< necesario para causar la
!emlisis del I<J de los eritrocitos indicadores, el valor obtenido constituye la unidad !emoltica
6>I<. 7inalmente se determina el ttulo el cual es reportado al mdico que prescribi la prueba.
Pr%e'as de Ne%tra#i5acin
La neutralizacin o actividad neutralizante se re"iere a la capacidad de un suero inmune
espec"ico (antisuero o acs espec"icos) de reducir o in!ibir la actividad biolgica de un
microorganismo o de algBn producto derivado del mismo. $sta propiedad de los #cs !a permitido
desarrollar un con%unto de tcnicas de laboratorio, las cuales se identi"ican de manera genrica con
el trmino de Epruebas o reacciones de neutralizacinF. $stas pruebas presentan varias
modalidades, las cuales estn directamente relacionadas con el tipo de microorganismo o producto
derivado del mismo, cuya actividad biolgica !a sido ob%eto de neutralizacin total o parcial por un
determinado #c o antisuero espec"ico.
&odalidades de las pruebas de neutralizacin
La mayora de las pruebas de neutralizacin que tienen utilidad clnica se pueden agrupar en
2 modalidades)
4eutralizacin de toxinas (exotoxinas) y productos extracelulares secretados por bacterias.
4eutralizacin de enzimas
4eutralizacin @iral
4eutralizacin de Aoxinas bacterianas y productos extracelulares secretados por bacterias
#lgunos microorganismos bacterianos elaboran y secretan toxinas, enzimas y otros
productos (!emolisinas, leucocidinas, !ialuronidasa, entre otros). 9ic!os productos contribuyen a la
patogenicidad, virulencia y poder invasivo de las bacterias. &uc!os de estos productos son
inmunognicos, por lo que estimulan en el !ospedador una respuesta inmune !umoral espec"ica
contra los mismos. 5n e%emplo de este tipo de prueba lo constituye la prueba de #ntiestreptolisina
E-F la cual es Btil en el diagnstico de in"ecciones causadas por estreptococos beta !emolticos del
grupo # (bacterias patgenas al !ombre) estos pueden ocasionar en"ermedades, tales como
in"ecciones agudas (e%., "aringitis estreptoccicas), erisipela (in"lamacin de la piel), escarlatina
(erupcin eritemato+papulosa di"usa) y procesos tardos, producto de complicaciones de in"ecciones
estreptoccicas no tratadas (e%., "iebre reumtica y glomerulone"ritis aguda). $ste grupo bacteriano
produce $streptolisina E-F y la secretan a los te%idos in"ectados? esta es una !emolisina y ocasiona
la !emlisis de eritrocitos (e%., eritrocitos !umanos, de carnero y de cone%o). Los pacientes in"ectados
producen #cs #ntiestreptolisina E-F que neutralizan la actividad !emoltica de la estreptolisina E-F.
Los #cs mencionados se encuentran presentes en casi todas las personas a ttulos ba%os. 9ebido a
que estas in"ecciones son comunes, un ttulo alto o creciente es indicativo de in"eccin reciente por
estos microorganismos.
$l *%nda"ento "etodo#!ico de la misma se resume de la siguiente manera)
1e colocan diluciones (crecientes) de un suero (paciente) en presencia de un volumen
constante de estreptolisina E-F
1e produce la reaccin #g/#c que neutraliza la actividad !emoltica de la estreptolisina E-F
La neutralizacin se evidencia por la in!ibicin de la !emlisis al agregar un volumen
constante de una suspensin de eritrocitos (2,IJ)
$l ttulo de #ntiestreptolisina E-F se calcula determinando la recproca (el inverso) de la
mxima dilucin del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente a la $streptolisina
E-F ( es decir, lamayor dilucin del suero donde no se observa !emlisis alguna)
$l ttulo se expresa en Eunidades Aodd/mlF
@alores re"erenciales normales oscilan alrededor de *00 unidades Aodd/ml.
Pr%e'as D8r"icas de -ipersensi'i#idad Retardada
La prueba de piel de !ipersensibilidad retardada es la tcnica mas antigua para evaluar la
inmunidad mediada por clulas. # pesar del desarrollo de multitud de procedimientos comple%os para
la evaluacin de la inmunidad celular, las pruebas intradrmicas, relativamente simple, permanece
como un arma muy Btil y a menudo contribuye para establecer el diagnstico de diversas patologas.
La reaccin de !ipersensibilidad retardada es una respuesta inmune adaptativa mediada por
clulas que se genera como consecuencia de la inyeccin intradrmica de un #g a la cual la persona
se !an sensibilizado previamente, es decir, la respuesta es inducida por los lin"ocitos A de memoria
inmunolgica que se generaron como producto de una respuesta previa contra el #g que se
administra a nivel de piel.
#l nivel celular la inyeccin de un #g causa una in"lamacin detectable e in"iltracin de
clulas mononucleares dentro de las primeras *0 !oras. La reaccin se intensi"ica alcanzado su
mximo /=+D, !oras despus de la inyeccin observndose en la super"icie de la piel un rea
eritematosa y una induracin palpable, siendo esta Bltima verdaderamente signi"icativa y la que
determina si la prueba es positiva o negativa.
$stas pruebas detectan !ipersensibilidad cutnea a un antgeno o grupos de antgenos. 1in
embargo, cuando se e"ectBan pruebas para una en"ermedad in"ecciosa, una respuesta positiva no
indica una in"eccin activa con el microorganismo, sino ms bien exposicin previa al
microorganismo.
La incapacidad para reaccionar contra un con%unto de antgenos cutneos !abitualmente
utilizados en este tipo de pruebas se denomina anergia o aner!ia c%t4nea, lo que sugiere que la
respuesta inmune celular del paciente est deteriorada. Los trastornos clnicos vinculados con este
estado anrgico se observan en una gran varieadad de a"ecciones tales como) inmunode"iciencias
congnitas, inmunode"iciencias adquiridas, en"ermedades coexistentes, en"ermedades in"ecciosas y
tratamientos "armacolgicos
(ara el desarrollo de estas pruebas se utilizan antgenos de diversos microorganismos. $ntre
los antgenos que con mayor "recuencia se utilizan en nuestro pas para realizar este tipo de prueba
drmica)
PPD T%'erc%#ina
Candidina E9tracto anti!8nico de# (on!o candida a#'icans
S:;SD
2estrepto<%inasa;estreptodornasa3 En5i"asprod%cidas por'acterias2estreptococos3
Tr)cop()ton E9tracto anti!8nico de# (on!o
La prueba se considera positiva si el promedio de los , dimetros perpendiculares de la
induracin resultan mayores o iguales a I mm por el contrario la prueba resultara negativa si el
dimetro de la induracin es in"erior a I mm o si se observa slo eritema.
5tilidad) Las pruebas de !ipersensibilidad retardada tambin son de gran valor en estudios
epidemiolgicos, ya que permite evidenciar in"ecciones previas ocasionadas por microorganismos
bacterianos, micticos y parasitarios, estos estudios epidemiolgicos son de utilidad para determinar
la prevalencia de la in"eccin y/o la endenmicidad de un microorganismo en una determinada
poblacin. $ntre los #gs utilizados en nuestro pas para realizar estos estudios epidemiolgicos
"iguran) tuberculina, leis!manina, toxoplasmina, !istoplasmina y paracoccidiodina.
Indice CD0;CD=
1e estima que del total de los lin"ocitos de sangre peri"rica !umana entre D< y DIJ son
lin"ocitos A, mientras que el ,<J son clulas C y el resto de los lin"ocitos pueden considerarse
clulas nula o clulas 4K. #simismo, se !a se8alado que en sangre peri"rica y en la mayora de los
te%idos lin"oides secundarios la proporcin de clulas 69/L es de 0IJ mientras que la proporcin de
clulas 69=L es de 2IJ. &uc!os laboratorios expresan los resultados de conta%e de clulas
cooperadoras/citotxicas, como un ndice o cociente (ndice 69//69=) cuyo valor de re"erencia
norma se !a establecido entre *,I y ,.
Pr%e'as de Trans&or"acin Lin&o'#4stica
Las pruebas de trans"ormacin lin"oblstica miden la capacidad "uncional de los lin"ocitos de
proli"erar luego de un estimulo inducido por un #g o mitgeno y es por lo tanto una prueba de
inmunocompetencia. La activacin de lin"ocitos es una tcnica in vitro comBnmente utilizada para
evaluar la inmunidad celular y es aplicable en los casos de pacientes con inmunode"iciencias
congnitas o adquiridas, autoinmunidad, en"ermedades in"ecciosas, cncer, entre otras. $stas
pruebas permiten la exploracin invitro de la depresin invivo de la inmunidad mediada por clulas
en combinacin con otras pruebas de inmunidad celular y el seguimiento longitudinal del !ospedador
inmunocomprometido.
$ste procedimiento se re"iere a una correlacin in vitro de un proceso que ocurre
normalmente in vivo cuando el #g interactBa con lin"ocitos espec"icamente sensibilizados en el
individuo. #si, cuando los lin"ocitos aislados de sangre peri"rica son cultivados in vitro en presencia
de mitogenos o antgenos stos proli"eran en respuesta al estmulo? lo que se conoce como
blastognesis o trans"ormacin blstica.
6uando los lin"ocitos son estimulados ocurre una gran variedad de cambios mor"olgicos y
bioqumicos que incluyen "enmenos tales como incremento en) la "ormacin de lin"oblastos, sntesis
de protenas y sntesis de #94. $ste Bltimo evento tardo es el que a la larga origina la divisin
celular y constituye la base de la mayor parte de los anlisis de relevancia clnica para la
trans"ormacin de lin"ocitos. $s precisamente la sntesis de #94 lo que los inmunlogos utilizan
como indicador de activacin lin"ocitaria.
Los acti>adores po#ic#ona#es "it!enos, son sustancias capaces de inducir la
proli"eracin de lin"ocitos pertenecientes a mBltiples clones, en otras palabras los mitgenos
estimulan en "orma no espec"ica la lin"oblastognesis de mBltiples clones celulares sin la
sensibilizacin previa del individuo e independientemente de la especi"icidad de combinacin
antignica de su receptor de membrana.
$n el caso de los activadores oligoclonales o antgenos utilizados en las pruebas de
trans"ormacin lin"oblstica, la blastognesis o activacin de los lin"ocitos depender de la
sensibilizacin previa que in vivo !aya tenido el individuo con el antgeno en particular. #dems, la
respuesta ser producto de la activacin de un nBmero restringido de clones de lin"ocitos
sensibilizados, es decir, solo se estimularn aquellos clones de lin"ocitos que posean en su
membrana receptores antignicos capaces de interactuar con los determinantes antignicos que
tenga el antgeno utilizado en la prueba, la misma es por lo tanto espec"ica. $ntre los antgenos ms
utilizados en la prueba de trans"ormacin lin"oblstica en nuestro pas, "iguran)((9, extracto de
6andida albicans (candidina), toxoide tetnico y la estreptolisina E-F.
Uti#idad C#/nica
Los ensayos de trans"ormacin lin"oblstica proveen un medio prctico y adecuado para
determinar y controlar estados de inmunode"iciencia gentica y adquirida. #dems provee un
indicador sensible de "uncin lin"ocitaria deprimida, asi como tambin los e"ectos de diversas
terapias inmunoestimulantes o inmunosupresoras. 1e !a sugerido que el grado de deterioro de la
reactividad lin"octica en paciente con cncer y el me%oramiento de stas siguiente a la reseccin o
quimioterapia, se puede utilizar como indicadores del pronstico de estado inmunitario de estos
pacientes. #simismo, provee una poderosa !erramienta para detectar reacciones inmunitarias !acia
agentes patgenos, alrgenos y autoantgenos.