EL PAPEL DE LOS ANTIVIRALES EN TRATAMIENTO Y

PREVENCIN DE LA INFLUENZA

Introduccin:
Virus de la gripe A es el agente causante de las epidemias de gripe estacional. Las nuevas cepas pandmicas de la
gripe pueden surgir a travs de la recombinacin entre las cepas de la gripe que infectan a humanos y animales,
stos representan un riesgo an mayor para la salud humana. La reciente aparicin de varias cepas de influenza
zoonticas, incluida la 2005 H5N1 ("gripe aviar") y 2009 H1N1 ("gripe porcina"), demuestra la constante amenaza de
una nueva pandemia mortal.
Los medicamentos antivirales son un complemento importante de los programas de vacunacin, tanto por su uso en
el tratamiento de la gripe, y su capacidad para inhibir la propagacin de nuevas cepas de la gripe. Aunque varios
antivirales estn disponibles clnicamente, la aparicin de resistencia en las cepas circulantes de virus pone de
relieve la necesidad de una rpida identificacin de nuevos objetivos farmacolgicos y el desarrollo de nuevos
agentes antivirales.

Desarrollo
Descripcin general de Virus Influenza
Figura 2. La estructura de un antigripal de virus
El virus de la gripe es un miembro de la familia Orthomyxoviridae
de tipo V (-) virus de ARN. Hay tres gneros de virus de la gripe,
incluida la gripe A, B, y C, B y C, aunque normalmente slo
causan epidemias locales. Debido a su amplio rango de
hospedantes, la gripe A supone un riesgo mucho mayor para la
salud humana. El virus es capaz de infectar a los seres humanos,
cerdos, aves y caballos.




Estructura del virin
El virus de la gripe tiene un genoma segmentado compuesto por 8 distintos (-) cadenas de ARN que sintetizan 12
polipptidos conocidos. Cada hebra se envuelve por una nucleoprotena (NP) trmero, y empacado con una ARN
polimerasa dependiente de ARN. El genoma est contenido junto con otras protenas virales por una capa cerrada de
protenas de la matriz, que a su vez est encapsulado por la envoltura viral. La envoltura viral es una bicapa lipdica
derivada de clulas, salpicado de numerosas protenas de superficie virales incluyendo la neuraminidasa,
hemaglutinina, y M2 canal inico (M2).



Entrada viral y la replicacin
La protena de superficie HA de la gripe media la entrada viral en la clula husped mediante la unin con una
glicoprotena husped que contiene cido silico, haciendo que el virin sea absorbido por endocitosis. La
acidificacin del endosoma a continuacin, desencadena un cambio conformacional en el cido HA-silico unido,
exponiendo el pptido de fusin N-terminal. La envoltura viral se fusiona con la membrana del endosoma, y los
contenidos virales se liberan en la clula. El ARN (-) del genoma entra en el ncleo de la clula husped, momento
en el que la ARN polimerasa dependiente de ARN comienza la sntesis de (+) ARNm, coronando las transcripciones
por "robo de" tapas a partir de ARNm husped cebado.
Las protenas de la envoltura viral se sintetizan en el retculo endoplsmico, y luego se trasladan a la membrana
celular a travs del aparato de Golgi. Viral (-) segmentos de ARN y las protenas se empaquetan en cpsides en la
membrana celular. Las cpsides cargadas a continuacin, proceden a brotar fuera de la clula, la adquisicin de un
sobre cargado viral-protena cuando se aproximan.
Los antivirales actualmente usados contra la influenza


Figura 3. La estructura del tetrmero canal inico M2 influenza A, con destino a cuatro molculas de
rimantadina (en rojo). La rimantadina estabiliza la conformacin cerrada de la canal, evitando que se
abra y permitiendo que el interior del virin para ser acidificado.

En la actualidad, slo hay dos clases de frmacos antivirales disponibles para el
tratamiento de la gripe en los Estados Unidos. Estos dos tipos de medicamentos
incluyen inhibidores de M2 del canal inico (derivados de adamantano) y los
inhibidores de NA.


M2 canal inico Inhibidores
El canal inico M2 es una protena transmembrana viral que se extiende por la envoltura viral y cpside. Como se
muestra en la figura 3, M2 es un homotetrmero con cuatro hlices transmembrana que forman un poro en el virin
de la gripe, lo que permite el intercambio de iones entre el interior y el exterior de la partcula del virus. Como se
acidifica el endosoma, M2 responde a la cada del pH por el cambio de una formacin cerrada a una formacin
abierta. Esto permite la libre circulacin de protones entre la partcula viral y el endosoma, la acidificacin de este
modo el interior del virin. Este cambio de pH interna hace que las protenas de la matriz a disocian a partir de
material gentico del virus como la membrana del endosoma se fusiona con la envoltura. Esta disociacin de las
protenas de la matriz es un paso esencial en el desembalaje del genoma viral, y la inhibicin de este proceso impide
que la infeccin progrese.




Inhibidores de la neuraminidasa
NA es una protena de virus de la influenza se encuentra en el sobre de la partcula de virin. La funcin ms
importante de NA es su capacidad para escindir el cido silico el mismo compuesto que l HA se une a fin de iniciar
la entrada del virin. Como las partculas de virus brote fuera de la clula husped, HA interacta con cido silico en
el exterior de la clula, evitando de este modo el virin de dispersin para infectar una nueva clula. Funcin de NA
es para escindir este cido silico, la prevencin de la agregacin de los viriones en la membrana de la clula
husped. Los inhibidores de la NA disponibles para uso clnico son oseltamivir (Tamiflu) y zanamivir. Cada uno de
estos compuestos es estructuralmente similar al cido silico, y las funciones de unin competitiva por el sitio activo
de NA.

Desarrollos antivirales: nuevos objetivos farmacolgicos y compuestos

Figura 4. Una ilustracin de los pasos generales de un protocolo de presentacin de fagos. Sui et al. . Hicieron su seleccin usando una
biblioteca de fagos que presentan diversos anticuerpos humanos, y se utilizan clulas de insecto que expresa hemaglutinina del subtipo 5
para seleccionar fagos HA vinculante.

Debido a la constante amenaza de la aparicin de cepas de influenza resistentes
a los antivirales, es importante continuar con la bsqueda de frmacos que
podran utilizarse para la profilaxis y el tratamiento de la influenza. Para ello, la
investigacin contina por hacer a fin de identificar nuevos antivirales contra la
influenza que se aprovechan de una gama ms amplia de objetivos
farmacolgicos.


















La hemaglutinina
El trimrica hemaglutinina protena de la superficie presenta un excelente objetivo de drogas, ya que es crtico para
las dos etapas de la replicacin viral: se une al cido silico en la membrana exterior de la clula con el fin de inducir
la endocitosis, y tambin sufre un cambio conformacional cuando se expone a un pH ms bajo, la induccin de la
fusin de membranas despus se acidifica el endosoma que contiene virin. Debido a que hay tantos como 16
distintos subtipos reconocidos de HA, hay un desafo a la identificacin de los antivirales que trabajaran contra
mltiples subtipos.


Figura 5. a) La presencia de anticuerpos humanos D8, F10, A66 o no inhibe la unin de un virin
de la gripe-H5 psuedotyped al cido silico en la membrana de la clula husped. 80R (un
anticuerpo anti-SARS) y 2A (un anticuerpo anti-monmero HA1) se sabe que no inhibe HA-5, y
actuaron como controles negativos. 17A.2.1.2 (un anticuerpo anti-ratn H5) es conocida para
inhibir la unin de HA-5, y actu como control positivo, junto con anti-suero de hurn. B) Un
ensayo de formacin de sincitios (vase el texto principal) demuestra que 0,13 concentraciones
micromolares de anticuerpos humanos D8, F10, A66 y inhiben HA-5 facilitado la fusin de
membranas. Tratamientos de ningn anticuerpo aadido o concentraciones iguales de 2A o acto
80R como controles.




Utilizando anticuerpos dirijan Hemaglutinina


Figura 6. Una imagen de la influenza A hemaglutinina protena de la
membrana viral (que se muestra como un modelo que llena el espacio),
vinculado con varios anticuerpos HA-unin (mostrados como modelos de
cinta). Tenga en cuenta cmo la mayora de los anticuerpos se unen a la
"cabeza" de la protena, y por lo tanto estn cepa especfica. Sin embargo,
los anticuerpos humanos CR6261 y F10 (este ltimo no se muestra) se unen
a la conserva "tallo" de la protena, lo que les permite obligarn a una mayor
variedad de subtipos de HA.


La posicin de hemaglutinina en la superficie del virin de la gripe
tambin hace que sea susceptible de reconocimiento y unin por
anticuerpos. Algunos estudios han considerado la orientacin HA utilizando anticuerpos neutralizantes humanos
(NABS), que funcionan unindose algn eptopo de HA para evitar que funcione correctamente. Por lo general, este
enfoque tiene un xito limitado debido a la regin variable de la protena es la parte ms accesible de la estructura, y
los anticuerpos que se dirigen a esa regin no sirven de nada contra otros subtipos de HA, moverse por esta
variacin natural es uno de los mayores problemas de este enfoque.
Esta tcnica utiliza una biblioteca de fagos mutantes, cada uno de los cuales tiene una protena de cubierta quimrica
que presenta un segmento de un anticuerpo humano. Estos fagos de anticuerpos se expresan a continuacin, se
ejecutan sobre una capa lmite de clulas diseadas para expresar HA trimrica subtipo 5 en sus membranas
celulares. Los fagos que expresan anticuerpos que se unen con xito para el "palo" HA a la capa de clulas a travs
de las interacciones anticuerpo / ha, mientras que los fagos con anticuerpos "incorrectos" son lavados. Los fagos que
expresan los anticuerpos deseables son luego aislados y amplificados, y su ADN se secuenciaron para identificar el
anticuerpo de inters. A travs de esta tcnica, Sui et al identificaron diez anticuerpos anti-HA diferentes. Los
investigadores procedieron a confirmar que los anticuerpos podran neutralizar el virus H5N1 y, a continuacin, pas
a probar tres de sus anticuerpos en un modelo de ratn. Ellos demostraron que 80% a 100% de los ratones tratados
con cualquiera de los anticuerpos entre 1 hora antes y 72 horas despus de la infeccin H5N1 sobrevivi, en
comparacin con el control de las tasas de 0% a 20% de supervivencia.
Sui et al. tambin investig el mecanismo de accin de los anticuerpos: se encontraron con que ninguna de sus
anticuerpos aislados inhibe la unin de partculas de virus de la gripe a cido silico en las superficies celulares
(Figura 5 Parte A). Siguieron en este resultado mediante la investigacin de si o no los anticuerpos fueron capaces de
inhibir la fusin, mediante la transfeccin de clulas HeLa con un subtipo 5-que contiene el plsmido HA, y a
continuacin, exponer las clulas a un tampn de pH 5,0 en presencia o ausencia del anticuerpo . En la ausencia de
la NABS, las condiciones de pH bajo inducido la HA en la superficie de las clulas transfectadas a someterse a su
cambio conformacional, revelando el pptido de fusin y la induccin de la fusin de las membranas de diferentes
clulas. Esto dio lugar a la formacin visible de masas de clulas multinucleadas. Sin embargo, estas clulas
multinucleadas no se formaron en presencia de la NABS, lo que implica que los Nabs eran capaces de inhibir la
funcin de fusin de HA-5 (Figura 5 inciso b).


Figura 7. Un modelo de la gripe A nucleoprotena (NP).Las localizaciones de la
cavidad de unin de la cola-loop y el surco de unin al ARN se indican. Se muestra
la cola de lazo de un segundo NP (se muestra en magenta) con destino en el
bolsillo de unin de la cola-loop. Tenga en cuenta la formacin de la estabilizacin
de NP-NP puente de sal en el bolsillo de unin de la cola de bucle. Imagen


As, mientras que la gran mayora de los anti-HA anticuerpos humanos trabajan apuntando la regin variable de la
"cabeza" de la protena que se une al cido silico, los anticuerpos aislados en este estudio trabajan mediante la
inhibicin de la funcin de la HA en la fusin .Los anlisis estructurales revelaron que lo hacen mediante la unin del
pptido de fusin, que est oculto en la regin conservada "tallo" en la base de la protena (Figura 6).Encuadernacin
esta regin impide que la protena objeto de un cambio conformacional inducido del pH, lo cual inhibe la entrada del
virus y la replicacin. Esta inusual caracterstica de sus NABS es probablemente el resultado de una presentacin
anormal de HA durante su protocolo de presentacin de fagos, que podra haber revelado el pptido de fusin por lo
general oculta. Debido a que esta regin se conserva a travs de una amplia variedad de subtipos de HA, estos
anticuerpos son capaces de inhibir una gran variedad de subtipos de HA, superando de este modo la mayor barrera
para el uso de HA como una diana de frmaco. Sui et al. Confirmado mediante la demostracin de que uno de sus
anticuerpos, F10, tambin podra neutralizar los virus con subtipos de HA 1, 2, 6, 8, 9, y 11.
Ekiert et al. Aislado un anticuerpo diferente, CR6261, que acta en contra de la misma manera. Debido a la
posibilidad de dirigir tantos subtipos de HA, estos anticuerpos humanos parecen ser prometedores nuevos candidatos
a frmacos antivirales. E incluso en el caso de complicaciones con la inmunoterapia, las estructuras de F10 y
CR6261 se pueden utilizar como herramientas para el diseo racional de frmacos para producir compuestos que
funcionan


Figura 8. El efecto de la presencia de la gripe NP pptido de la cola de bucle en los niveles
de protena viral y la replicacin viral. Clulas de rin embrionarias humanas fueron
transfectadas con un plsmido de GFP como un control, o un plsmido de bucle-GFP de la
cola. superior) Ambos tratamientos de clulas se infectaron con el virus H1N1. Western blot
para el canal de iones M2 (una protena viral) y actina (una protena celular) revel que los
niveles de protenas virales se redujeron significativamente en el tratamiento de la cola de
bucle en comparacin con el control. Las barras de error representan la desviacin
estndar. Baja) Los ttulos virales a partir de cultivos de las clulas infectadas descritas
anteriormente se midieron a travs de una placa de ensayo, y se encontr que los niveles
virales haber disminuido significativamente en el tratamiento de la cola de bucle en
comparacin con el control. . Las barras de error representan la desviacin estndar




Nucleoprotena
La funcin de la nucleoprotena (NP) es para formar un trmero para recubrir ARNm viral y enlazar con la ARN
polimerasa viral con el fin de facilitar la replicacin del ARN viral.
NP contiene tres regiones de unin diferentes, que permiten que se forme el trmero que recubre ARN. La primera es
la ranura de unin al ARN, la superficie de la protena que interacta con el ARN viral. El segundo es el bucle de cola,
una hebra pptido que sobresale desde el cuerpo principal de la protena y interacta con un NP vecina. La tercera
regin es el bolsillo de la cola de bucle, una cavidad en la protena que acepta la cola de bucle de otro NP.


La Figura 9. Clulas MDCK fueron infectadas con el virus H1N1 en presencia de 5 Nucleozin
micromolar o 50 micromolar "compuesto 3". Las clulas fueron fijadas y immunostained con el
ratn fluorescente anti-NP y DAPI.Los tratamientos NC (sin compuesto) y NI (sin infeccin) se
utilizaron como controles. Nota la distribucin uniforme de NP en todo el compuesto 3-expuesta
celular, lo que demuestra que la NP no est agregando. Por el contrario, tenga en cuenta la
distribucin desigual de la NP en la clula Nucleozin expuestos, y los "grumos" de NP, dentro y
fuera de la clula, indicativos de agregacin anormal. F



El examen de un anlogo de Nucleozin revel que las funciones compuestos por la unin a dos copias de NP y la
formacin de dmeros anormales, causando las protenas para agregar y evitando que funcione
normalmente. Nucleozin tambin ha demostrado inhibir el virus de la influenza in vitro y en un modelo de ratn, por lo
que es un candidato prometedor para una nueva droga antiviral.

Diseo racional de frmacos: el bolsillo de unin de cola-Loop
La identificacin de Nucleozin y compuestos Nucleozin similares posteriores representa un avance significativo en la
bsqueda de frmacos contra la gripe. Este hallazgo demuestra la forma en que siempre es posible la resistencia a
emerger, haciendo hincapi en la necesidad de continuar la bsqueda de compuestos que trabajan contra la NP en
diferentes maneras. Shen et al. han abordado este problema desde una perspectiva de diseo racional de frmacos,
aprovechando la idea de que podran ser capaces de usar NP informacin estructural para identificar (o diseo) un
compuesto que podra unirse a un sitio importante en la protena, y por lo tanto inhibir estricamente algunos
importante funcin.
Antes de la identificacin de compuestos, Shen et al. demostr que la sustitucin de uno de los dos residuos de NP
importantes, cido glutmico 399 o arginina 416, con alanina tanto impide subunidades NP de la unin entre s e
inhibe la replicacin viral. Estos residuos son sensibles a mutaciones porque combinan en el bolsillo de unin de la
cola de bucle para formar un puente de sal crtico, que es esencial para la formacin de una conexin slida entre
monmeros NP (Figura 6). Debido a que este puente salino es tan importante, que la hiptesis de que un compuesto
con la capacidad de interrumpir esta conexin podra ser un antiviral eficaz. Para buscar la prueba de concepto para
su idea, investigaron si un pptido de cola-loop (sin el resto de la NP) se unira en el bolsillo y evitar que las
subunidades de NP de la unin entre s de forma competitiva que ocupa el espacio. Con el fin de responder a esta
pregunta, se transfectaron clulas embrionarias de rin humano, ya sea con una simple protena verde fluorescente
(GFP) plsmido, o un plsmido Loop-GFP cola, y luego infectan las clulas con una cepa H1N1. Ellos encontraron
que la presencia del pptido de cola-loop reduce la sntesis de protenas virales y la disminucin de la produccin de
viriones (Figura 8), lo que sugiere que podra ser posible hacer lo mismo con un compuesto diferente.
Shen et al. a continuacin, se procedi a utilizar una tcnica de cribado virtual para identificar compuestos conocidos
a partir de una biblioteca que se ajuste a la cavidad de unin a NP cola de bucle tanto estructural como
electrostticamente. Su mtodo de cribado revel 24 hits, de los cuales identificaron cuatro compuestos eficaces. Los
cuatro de estos compuestos mostraron ser capaces de proporcionar clulas MDCK con un cierto grado de proteccin
contra la gripe H1N1, y fueron capaces de reducir la actividad de la transcripcin viral in vitro. Los autores utilizaron
inmunofluorescencia para visualizar la distribucin NP travs de las clulas infectadas con el compuesto expuesto
(Figura 9). Una comparacin de "compuesto 3"-expuesta clulas infectadas con clulas infectadas por Nucleozin
expuesto demostr que estos nuevos compuestos no causan NP a agregarse como Nucleozin y su anlogo no,
proporcionando pruebas de que la funcin de estos nuevos compuestos a travs de un mecanismo diferente. Por lo
tanto, Shen et todos varios compuestos anti-influenza nuevos identificados con xito, todos los cuales podran pasar
a ser optimizado durante el desarrollo de drogas. Este estudio ilustra la utilidad del diseo racional de drogas, y cmo
el estudio continuado de las protenas de la gripe puede conducir directamente a la evolucin de la bsqueda de
antivirales.


Objetivos potenciales del futuro de la droga

Informacin estructural ya est disponible para muchas protenas de la gripe, y el continuo anlisis de sus diferentes
dominios de unin podra potencialmente conducir a su uso como nuevos objetivos farmacolgicos. Aunque muchas
protenas virales dentro de esta categora, incluyendo protena de la matriz 1, protena de exportacin nuclear, y la
protena no estructural 1, uno de los objetivos potenciales ms prometedores es la ARN polimerasa.

ARN-polimerasa de ARN dependiente
ARN polimerasa viral de la influenza es un trmero, compuesto por protenas virales PB1, PB2, y PA. Su funcin
principal es la de utilizar su funcin de sntesis de ARN dependiente de ARN para crear (+) ARNm virales de los
sentidos, y tambin para replicar el sentido (-) del genoma viral. La polimerasa viral tambin es responsable de la
limitacin de los mRNAs que se sintetiza con un "tope guanosina de metilo, que lo hace por" robo de la tapa ", la
escisin y el robo de 5 '5 tapas de los ARNm celulares para uso en la limitacin de los ARNm virales.
ARN polimerasa viral tiene varios dominios diferentes que se necesita para llevar a cabo todas sus funciones,
incluyendo un dominio polimerasa, un dominio de unin al ARN, un dominio de unin de topes, un dominio
endonucleasa, y ms. Esta amplia gama de posibles sitios de unin de la droga, junto con la importancia de la
protena, hacen de este muy atractivo para la investigacin blanco de la droga. Hay seales de que podran ser
objeto de esta manera en un futuro prximo: el grupo de investigacin de Iwai et al. recientemente identificado el
compuesto "marchantin E" por seleccin aleatoria. Ellos demostraron que este compuesto es capaz de inhibir la
actividad de endonucleasa viral ARN polimerasa in vitro, lo que impedira la protena de robo de la tapa, y por lo tanto
evitar que los ARN virales de ser traducido. Como confirmacin adicional, los autores encontraron que E marchantin
es capaz de inhibir el crecimiento de H3N2 y los virus H1N1. Este reciente descubrimiento podra arrojar nuevas vas
de investigacin sobre la polimerasa viral como una meta de la droga, y potencialmente conducir a toda una nueva
clase de antivirales de la gripe.

Conclusin:
El papel de los antivirales es crucial para el tratamiento de la influenza ya que cada dia, el virus muta constantemente
y es imprescindible mejorar los antivirales para evitar ms defunciones causadas por este virus, refirindonos a la
influenza AH1N1, que en 2009 desato una pandemia.
En la actualidad se estn investigando nuevos antivirales con un espectro de actividad ms ptimo y con un mejor
perfil farmacolgico para el tratamiento de la influenza. Idealmente, los nuevos frmacos deberan ser ms eficaces
en trminos de inhibicin de la replicacin viral, deberan asociarse con mayor vida media plasmtica o pulmonar que
permita esquemas ms cmodos de tratamiento y con bajo riesgo de aparicin de resistencia, concluyen el experto.