Classificazione

Curve di calibrazione
Caratteristiche di una misura analitica: Accuratezza Sensibilit
Precisione -Intervallo di linearit
Selezione del metodo analitico
Campionamento
Metodi analitici
IL PROCESSO ANALITICO
la determinazione della quantit di un analita in un campione.
Unanalisi pu essere suddivisa nei seguenti stadi:
1. Materiale da analizzare
1.1 Campionamento
campione rappresentativo del materiale da analizzare
1.2 Preparazione del campione
Conversione del campione in una forma adatta allanalisi
e rimozione degli interferenti.
1.3 Analisi
Determinazione della quantit di analita contenuta nel
campione
1.4 Valutazione dei risultati
Determinazione del risultato finale e valutazione della sua
attendibilit.


1.4 Studio dellaffidabilit del metodo
(accuratezza, precisione, ecc).
1.3 . Individuazione del metodo analitico
Esame della letteratura, metodi gi utilizzati su
matrici simili, ecc.
Ottimizzazione
Adattamento della procedura di analisi al
campione in esame.
CAMPIONAMENTO
In generale, unoperazione di campionamento pu essere divisa in due fasi:
Prelievo dal campione da analizzare
prelevare un certo numero di aliquote del campione da analizzare in modo
tale da garantire che il campione sia rappresentativo del materiale da
analizzare nel suo complesso.
I problemi di campionamento
maggiori si incontrano nel caso
di materiali solidi, di grandi
dimensioni e caratterizzati da un
elevato grado di eterogeneit.
Il campionamento dei liquidi
presenta problemi minori. La
situazione pi complessa per le
sospensioni, poich se le
particelle della sospensione sono
presenti in piccolo numero,
difficile ottenere un campione
grossolano rappresentativo.
Le procedure di campionamento vengono stabilite in funzione dello
stato fisico del materiale da analizzare (solido, liquido, gassoso).
CAMPIONAMENTO
adsorbimento:
Durante il prelievo lanalita viene legato
fisicamente sulla superficie di un adeguato
materiale adsorbente (es. carbone attivo)
I gas sono omogenei, e quindi il loro prelievo relativamente semplice.
Poich le specie gassose occupano elevati volumi, si cerca spesso di
concentrare lanalita durante il prelievo (preconcentrazione), ad esempio
mediante una delle seguenti procedure:
condensazione
Il prelievo viene effettuato
mediante passaggio
dellanalita allo stato
liquido o solido per
raffreddamento
intrappolamento
Durante il prelievo lanalita viene
legato chimicamente mediante una
reazione chimica (es. CO
2
(g) + 2NaOH
Na
2
CO
3
)
Il campione non deve subire alterazioni prima dell'analisi. I processi di
alterazione dipendono da una serie di fattori controllabili (temperatura, umidit,
pH, presenza di ossigeno, esposizione alla luce). I principali processi di
alterazione sono:

processi fisici
Evaporazione, sublimazione, precipitazione, degradazione fotochimica

processi chimici
Reazioni con la matrice, ossidazione da parte dellossigeno atmosferico

processi biologici
Attivit enzimatica endogena in campioni clinici, contaminazione batterica

Un altro fattore da tenere in considerazione, in particolare per analiti in tracce,
sono le interazioni con il contenitore (es. le materie plastiche possono adsorbire
analiti poco polari, il vetro pu rilasciare ioni metallici, adsorbire analiti polari o
catalizzare reazioni di decomposizione). In casi limite si possono effettuare le
analisi direttamente sul luogo con strumenti portatili o utilizzare sistemi on line
che eseguono lanalisi in tempo reale.
CAMPIONAMENTO
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
La preparazione del campione ha la funzione di convertire lanalita
presente nel campione nella forma pi adatta per lanalisi,
specificatamente una soluzione. Sebbene in alcuni casi ci si possa
effettuare semplicemente aggiungendo un solvente, spesso occorre
effettuare trattamenti per renderlo solubile
La scelta del procedimento ottimale di trattamento richiede la
conoscenza di:
chimica degli analiti
chimica della matrice
chimica delle interazioni fra matrice ed analiti
Nel trattamento del campione vengono anche comprese le procedure
necessarie per l'eliminazione delle interferenze, specifiche per ogni tipo
di analisi.
Loperazione di trattamento del campione spesso unoperazione critica per
lanalisi nel suo complesso, e pu essere origine di errori rilevanti:

solubilizzazione incompleta dell'analita
Decomposizione e solubilizzazione incompleta dell'analita (oppure della matrice)
determinano un recupero incompleto.

perdite di analita per volatilizzazione
La combinazione di trattamenti ad elevata temperatura ed impiego di certi reagenti pu
portare per determinati analiti alla formazione di specie volatili.

introduzione di analita come contaminante del solvente o dei reagenti
Solventi e reagenti vengono impiegati in forte eccesso: l'impiego di prodotti non
sufficientemente puri pu portare allintroduzione di quantit significative di analita, in
particolare nel caso di analisi di tracce.

introduzione di un analita attraverso le apparecchiature utilizzate
Durante trattamenti drastici piccole quantit di analita (es. cationi metallici) possono
derivare dallattacco delle pareti del recipiente da parte dei reagenti utilizzati.
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
La definizione del metodo analitico da utilizzare presuppone la
conoscenza di una serie di fattori, fra i quali:
SELEZIONE DEL METODO ANALITICO

1. Natura dellanalita
2. Natura del campione: la presenza di particolari sostanze nella
matrice del campione pu influenzare l'applicabilit o le prestazioni
di una tecnica analitica.

3. La concentrazione dellanalita
4. Affidabilit richiesta per lanalisi
Questi parametri determinano la scelta della tecnica (alcune potrebbero non
essere utilizzabili perch le concentrazioni da determinare sono troppo basse
oppure la tecnica non abbastanza precisa). Daltra parte, effettuare una
analisi pi precisa o accurata del necessario spesso comporta una spesa
aggiuntiva inutile.

Le prestazioni richieste ad una metodica analitica dipendono anche dalla
quantit di analita nel campione: per analiti presenti in tracce ed ultratracce
sono tollerate accuratezze e precisioni molto minori rispetto a quelle richieste
nella determinazione dei costituenti principali di un campione.
SELEZIONE DEL METODO ANALITICO
Deviazioni standard dei
risultati di analisi
effettuate in diversi
laboratori in funzione
della concentrazione
dellanalita da
determinare.
La conoscenza delle caratteristiche di una metodica analitica permette di
verificare l'adeguatezza della tecnica a quella particolare applicazione. I
parametri quantitativi che definiscono le prestazioni della tecnica analitica.



Accuratezza
Precisione
Sensibilit
Limite di rivelabilit (LR) e di dosabilit (LD)
Intervallo di linearit
Selettivit



CARATTERISTICHE DI UNA METODICA ANALITICA
Questi parametri sono i primi dati
da verificare per stabilire se un
metodo analitico adatto per una
determinata analisi.



Classificazione in base al metodo di
analisi
metodi classici
gravimetria
volumetria
metodi strumentali (fisici e chimico-
fisici)
spettrofotometria Conduttometria
Potenziometria,
ecc
PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE QUANTITATIVE
CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI
Metodi gravimetrici:
L'analita viene determinato misurando la sua massa oppure la
massa di un composto ad esso correlato.
Si trasforma lanalita in una specie chimica che possa essere
separata, purificata e pesata.
Ad esempio, in una determinazione gravimetrica dello ione Ba
2+
esso
viene precipitato sotto forma di BaSO4 mediante aggiunta di un eccesso
di ione SO4
2-
. Se mBaSO
4
la massa del precipitato di BaSO4, la massa
dello ione Ba
2+
contenuta nel campione analizzato data dalla relazione




Oltre alla massa di BaSO4, in questa relazione non sono presenti altre
grandezze che devono essere determinate (o confermate)
sperimentalmente.
4
4
2
2
BaSO
BaSO
Ba
Ba
m
M
M
m
+
+
=

Metodi volumetrici: L'analita viene determinato misurando il volume di una
soluzione contenente un reagente (titolante) in quantit sufficiente per reagire
completamente con esso.
Si misura il volume di una soluzione contenente il reagente a concentrazione nota
(soluzione titolata) necessario per reagire completamente con lanalita contenuto in un
volume noto di soluzione

La standardizzazione comporta l'impiego di un adatto analita (standard primario), del quale
possibile prelevare una quantit esattamente nota mediante pesata diretta. Questa
soluzione viene poi titolata con il titolante da standardizzare per determinarne la
concentrazione. Ad esempio, se la titolazione con NaOH (titolante da standardizzare) di una
massa eq
C6H5COOH
di acido benzoico (standard primario) richiede un volume V
NaOH
di
titolante, la concentrazione N
NaOH
di NaOH data dalla relazione







NaOH
COOH H C
COOH H C
NaOH
COOH H C
NaOH
V
ME
m
V
eq
N
|
|
.
|

\
|
= =
5 6
5 6
5 6
CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI
Metodi strumentali
Si eseguono analisi qualitative e quantitative misurando una
grandezza fisica o una propriet chimico-fisica che in relazione
con il tipo e/o con la quantit di analita presente.

Metodo basato su una relazione matematica che lega il parametro
misurato con la concentrazione (o la quantit assoluta) dellanalita.
In questa categoria di metodi (a cui appartiene la maggior parte dei metodi
analitici strumentali) la dipendenza fra la grandezza misurata e la
concentrazione deve essere determinata sperimentalmente mediante la
costruzione di una curva di calibrazione o retta di taratura.
CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI
La curva di calibrazione descrive landamento del segnale ottenuto in un
metodo analitico strumentale in funzione della concentrazione dellanalita.
[Fe
2+
]
A
s
s
o
r
b
a
n
z
a

a

4
1
2

n
m

N
N
Fe
N
N
++
3
Fe
++
+ 3
Metodi analitici che richiedono calibrazione.
fenantrolina [Fe(fenantrolina)
3
]
2+

CURVE DI CALIBRAZIONE
In generale nella messa a punto di un metodo analitico si cerca
di ottenere una curva di calibrazione di tipo lineare, nella quale
il segnale (S) legato alla concentrazione dell'analita (C) da
una equazione generale del tipo




dove b il segnale del bianco (che pu anche essere nullo).
b mC S + =
Una curva di calibrazione lineare :
dipende da due soli parametri (k ed b), facilmente calcolabili
mediante una procedura di regressione lineare
1. ha un valore costante per ogni misura
effettuata nelle medesime condizioni
sperimentali, quindi pu essere
corretto;
2. ha - almeno in linea di principio - una
origine definita che pu essere
individuata ed eventualmente
eliminata.

presente in ogni misura;
non pu essere eliminato in
quanto insito nella misura
stessa;
Ha un valore variabile in modo
casuale ed il suo effetto sul
risultato pu essere studiato
con un approccio statistico.
TIPI DI ERRORE NELLE ANALISI CHIMICHE
Gli errori sperimentali possono essere suddivisi in
casuali,
sistematici

Lindividuazione del tipo di errore presente in una misura importante poich da questo
dipendono le sue caratteristiche ed il modo in cui pu essere gestito.
Errore sistematico (o determinato)
Errore casuale (o indeterminato)
ERRORE CASUALE: PRECISIONE
Ogni misura soggetta ad errori estremamente piccoli e con uguale probabilit di
essere positivo o negativo.
Sebbene l'errore casuale non possa essere eliminato, il suo effetto pu essere analizzato mediante un
approccio di tipo statistico che permette di valutare l'errore casuale presente nella misura. Inoltre la
media di un insieme di misure pi affidabile del risultato di una misura singola.
La curva che descrive la distribuzione dell'errore casuale in un insieme infinito di misure la curva
Gaussiana definita da una equazione matematica contenente due soli parametri, la media () e la
deviazione standard () della popolazione .

x
N
x
N
1 i
i
=
=
N
x
N
i
i
=

=
1
2
) (
o
La media della popolazione () - il
valore della grandezza che si sta
misurando - definita come la media
aritmetica della popolazione dei dati. In
assenza di errori sistematici, la media
della popolazione coincide con il valore
vero della grandezza che si sta
misurando.
La deviazione standard della
popolazione () - che una
misura della dispersione della
popolazione di dati - data dalla
relazione seguente:
Una curva Gaussiana (il concetto di grandezze statistiche relative alla popolazione
verr definito meglio in seguito).
CURVA GAUSSIANA
Dal punto di vista matematico questa funzione rappresenta una distribuzione di
probabilit, quindi il suo significato pratico il seguente.
P(x
1
,x
2
)

x
x
1
x
2
In una misura, la probabilit P(x
1
,x
2
) di ottenere un risultato compreso fra x
1
ed x
2

corrisponde all'area sottesa dalla curva fra questi due valori.
CAMPIONE E POPOLAZIONE
La deduzione dei parametri statistici (es. la media) di una popolazione - cio il dato che
effettivamente si vorrebbe ottenere da unanalisi - a partire da quelli misurati in un suo
campione rappresenta uno dei problemi principali affrontati mediante la statistica.
La curva Gaussiana descrive rigorosamente la distribuzione dell'errore casuale in un
insieme infinito di dati (popolazione), ma in pratica lo sperimentatore ha accesso soltanto
ad numero limitato di dati (campione).
POPOLAZIONE
insieme di
tutte le misure
CAMPIONE
Misure
realmente
effettuate



CAMPIONE E POPOLAZIONE

x
Popolazione

x
Campione
s
A causa delle dimensioni limitate, il campione non rappresentativo dell'intera
popolazione: in genere media e deviazione standard misurati su di un campione non
coincidono con quelli della popolazione (i parametri misurati sul campione sono pertanto
stime statistiche di quelli della popolazione).
x
Per questa ragione, le grandezze statistiche vengono definite in modo differente a seconda
che si riferiscano alla popolazione di dati o ad un campione di dati.
N
x
x
N
1 i
i
=
=
La media
definita esattamente nello stesso modo della media della
popolazione,
La deviazione standard (s) del campione data dalla equazione seguente,
ottenuta utilizzando x al posto di ed introducendo (N 1) al posto di N:
1 N
) x x (
s
N
1 i
2
i

=
Le relazioni statistiche valide per una popolazione devono essere corrette se applicate
ad un campione, Una serie limitata di misure non permette di determinare il valore vero
di una grandezza o la sua deviazione standard , ma soltanto x ed s. Utilizzando la
statistica per possibile definire un intervallo di valori (intervallo di fiducia) allinterno
del quale si dovrebbe trovare la media della popolazione..
STATISTICA SU DATI REALI
intervallo di fiducia: un intervallo attorno al
valore sperimentale all'interno del quale cadr, con una
certa probabilit, il valore vero
N
x
x
N
1 i
i
=
=
Se N troppo piccolo, la media del
campione pu non coincidere con la
media della popolazione a causa della
non rappresentativit del campione
stesso.
1 N
) x x (
s
N
1 i
2
i

=
La deviazione standard (s) del
campione data dalla equazione
seguente, ottenuta utilizzando x al
posto di ed introducendo (N 1) al
posto di N:
La definizione di intervallo di fiducia valida solo in assenza di
errori di tipo sistematico (le misure sono affette soltanto dallerrore
casuale).
Limite di fiducia
Data una serie di misure di cui sia nota la media e la relativa deviazione
standard (s anzich o con un numero limitato di dati) possibile definire
dove to un parametro numerico (t di Student), il cui valore pu
essere ricavato da apposite tabelle. Il valore di t dipende dal livello di
fiducia desiderato e dal numero di gradi di libert del sistema, cio in
ultima analisi dal numero di dati del campione.
to
o = 5%
12,706
4,303
3,182
2,776
2,571
2,447
2,365
2,306
2,262
2,228
2,201
x
x
Intervallo di fiducia
Limite di fiducia
inferiore
Limite di fiducia
superiore
Intervallo di fiducia: intervallo centrato attorno ad x allinterno del
quale ci si aspetta di trovare con una determinata probabilit (95%
livello di fiducia, esiste comunque il 5% di probabilit che essa sia
dovuta all'errore casuale) il valore della media della
popolazione.
x
TABELLA DEI VALORI DELLA t DI STUDENT


50 80 90 95 99
1 1,000 3,078 6,314 12,706 63,657
2 0,816 1,886 2,920 4,303 9,925
3 0,765 1,638 2,353 3,182 5,841
4 0,741 1,533 2,132 2,776 4,604
5 0,727 1,476 2,015 2,571 4,032
6 0,718 1,440 1,943 2,447 3,707
7 0,711 1,415 1,895 2,365 3,500
8 0,706 1,397 1,860 2,306 3,355
9 0,703 1,383 1,833 2,262 3,250
10 0,700 1,372 1,812 2,228 3,169
15 0,691 1,341 1,753 2,131 2,947
20 0,687 1,325 1,725 2,086 2,845
0,674 1,282 1,645 1,960 2,576
Gradi di
Libert = numero
di dati
Livello di fiducia (%)
TABELLA DEI VALORI DELLA t DI STUDENT


50 80 90 95 99
1 1,000 3,078 6,314 12,706 63,657
2 0,816 1,886 2,920 4,303 9,925
3 0,765 1,638 2,353 3,182 5,841
4 0,741 1,533 2,132 2,776 4,604
5 0,727 1,476 2,015 2,571 4,032
6 0,718 1,440 1,943 2,447 3,707
7 0,711 1,415 1,895 2,365 3,500
8 0,706 1,397 1,860 2,306 3,355
9 0,703 1,383 1,833 2,262 3,250
10 0,700 1,372 1,812 2,228 3,169
15 0,691 1,341 1,753 2,131 2,947
20

0,687

1,325

1,725

2,086

2,845

0,674 1,282 1,645 1,960 2,576
Gradi di
libert
Livello di fiducia (%)
Il valore di t aumenta
allaumentare del livello
di fiducia richiesto
Il valore di t diminuisce
allaumentare del numero
di gradi di libert
Per N = il valore del
parametro t coincide con
quello di z (vedi dopo)
Alcune considerazioni sull'ampiezza dell'intervallo di fiducia:

Lampiezza dellintervallo di fiducia proporzionale al valore di s.

Lampiezza dellintervallo di fiducia inversamente proporzionale a N.
Lampiezza pu essere ridotta aumentando il numero delle misure. Aumentare
il numero delle misure per conveniente solo fino ad un certo punto, oltre al
quale il miglioramento non giustifica il tempo richiesto per le analisi aggiuntive.

Lampiezza dellintervallo di fiducia direttamente proporzionale a t. In
base alla tabella precedente,

(a) t cresce allaumentare del livello di fiducia richiesto

(b) t cresce al diminuire del numero dei dati.
INTERVALLO DI FIDUCIA
Perch l'intervallo di fiducia sia abbastanza piccolo da
avere utilit pratica, talvolta si potrebbe dovere
accettare un livello di fiducia inferiore.
ORIGINE DELL'ERRORE SISTEMATICO
Errori sistematici
strumentali
Errori sistematici
personali
Errori sistematici
di metodo
1. malfunzionamenti nella
strumentazione
2. errori nella calibrazione delle
apparecchiature
3. misure effettuate in condizioni
non appropriate

1. dovuto all'errore umano: ad
utilizzo scorretto
della strumentazione
delle apparecchiature di
laboratorio e
delle procedure analitiche
Gli errori sistematici hanno in genere una causa definita, e possono essere corretti
eliminandola o semplicemente applicando una correzione ai risultati dopo avere
stabilito l'entit dell'errore. I pi comuni tipi di errore sistematico sono:
Errori sistematici di metodo
lentezza o incompletezza di una reazione
instabilit di una specie chimica
non perfetta specificit dei reagenti
reazioni secondarie che competono con
quella principale
Rivelazione di errori
sistematici strumentali
Calibrazione periodica della
strumentazione per compensare
fenomeni quali usura dei componenti
dello strumento, risposta variabile nel
tempo, ecc.
Utilizzo di tecniche specifiche di
calibrazione (es. metodo delle aggiunte
standard) per compensare le
interferenze dovute a specie presenti
nel campione.
Rivelazione di errori
sistematici personali
Verifica sistematica delle letture
strumentali, dei dati e dei
calcoli.
Ripetizione dellesperimento da
parte di un altro sperimentatore.
Scelta di procedure analitiche
che non richiedono valutazioni
soggettive.
CORREZIONE DELL'ERRORE SISTEMATICO
es.:errore fotometrico
Per l'adeguatezza della tecnica a quella particolare applicazione, si
valutano i parametri quantitativi che definiscono le prestazioni della
tecnica analitica. Questi parametri sono i primi dati da verificare per
stabilire se un metodo analitico adatto per una determinata analisi.
CARATTERISTICHE DI UNA METODICA ANALITICA
Accuratezza
Precisione
Sensibilit
Limite di rivelabilit (LOD) e di quantificazione o dosabilit (LOQ o LOD)
Intervallo di linearit
Selettivit
L'accuratezza rappresenta l'errore commesso nell'analisi e viene in genere
espressa attraverso lerrore relativo percentuale dell'analisi e indica quanto una
misura sia approssimabile al valore vero










Siccome le caratteristiche di un metodo possono variare in funzione della
concentrazione di analita presente nel campione, spesso esse vengono
determinate per differenti concentrazioni di analita. corrispondenti a valori bassi,
medi ed alti nell'intervallo di applicazione del metodo.
ACCURATEZZA
100
. conc
. conc . conc
(%) relativo Errore
vera
vera misurata

=
scarto tra il valore vero della quantit di analita
presente ed il valore stimato espresso dalla media
Errore fotometrico
In spettrofotometria
A = - log T = bc

Un errore dT comporta un errore dc:
T = 10
-bc
( una esponenziale)
a concentrazioni elevate, al
di l delle possibili interazioni
fra le molecole, la radiazione
uscente risulta troppo tenue,
per cui il rivelatore, anche
con elevata sensibilit, non
in grado di apprezzarla
a basse concentrazioni
interviene lerrore di
lettura del rivelatore.
Si pu calcolare lerrore relativo percentuale:
dc : c
vero
= x :100
cio:
100 %
c
dc
E =
Si vede che lerrore minimo se la
T% compresa tra il 20% e il 60% o tra
0,69 e 0,22 di A.
Il valore ottimale corrisponde al punto di minimo della funzione in cui
T% = 36,8% e lA = 0,434
La precisione di una metodica analitica esprime la riproducibilit di una misura,
ovvero la dispersione dei dati ottenuti da una serie di misure attorno al loro valore
medio
PRECISIONE
La precisione di una misura viene espressa come deviazione standard del valore
ottenuto dall'analisi dei replicati o attraverso grandezze correlate. In particolare,
una grandezza molto utilizzata il coefficiente di variazione (deviazione
standard relativa percentuale):











Come l'accuratezza, anche la precisione di un metodo pu variare in funzione
della concentrazione di analita e pu essere determinata per differenti
concentrazioni.
Deviazione standard


Deviazione standard
relativa

Coefficiente di variazione (dev.
st. relativa percentuale)
1 N
) x x (
s
N
1 i
2
i

=
% 100
x
s
% CV =
x
s
DSR =
I parametri relativi
sono preferiti in quanto
forniscono maggiori
informazioni sulla
precisione della misura
Per misurare la PRECISIONE viene misurato un parametro statistico s
scarto quadratico medio o deviazione standard; pi alta la
precisione minima sar s, che quantifica la dispersione dei valori
ottenuti in una serie di misure
PRECISIONE
n-1 = 3
n C (mg/L) Media scarto quadrato somma /n-1

1 1.36 1,33 0,03 0,0009 0,0013667 0,0004556 0,0213437
2 1,35 0,02 0,0002778
3 1,32 -0,013333 0,0001778
4 1,33 -0,003333 1,111E-05
o
o
Precisione ed accuratezza di una misura sono grandezze indipendenti fra di loro.
Elevate precisione ed accuratezza Bassa precisione ed accuratezza








Elevata precisione, bassa accuratezza Bassa precisione, elevata accuratezza
ACCURATEZZA vs. PRECISIONE
ACCETTABILITA'
I valori di accuratezza e precisione minimi richiesti per una metodica analitica
variano con limportanza relativa del componente da analizzare. Nell'analisi di
componenti in tracce (a livello di ppm) ed ultratracce (a livello di ppb), quali ad
esempio gli inquinanti, sono tollerate accuratezze e precisioni molto minori
rispetto a quelle richieste nella determinazione dei componenti principali del
campione.
Deviazioni standard relative
percentuali dei risultati di una
analisi in funzione della
concentrazione dellanalita da
determinare.
La sensibilit della calibrazione definita come la variazione del segnale per
unit di variazione della concentrazione dell'analita, ed quindi la pendenza
della curva di calibrazione.


La sensibilit di una metodica analitica rappresenta una misura della variazione
del segnale in funzione della concentrazione dell'analita.
. conc
segnale
ne calibrazio della Sensibilit
A
A
=
Concentrazione
S
e
g
n
a
l
e

A conc.
A segnale
SENSIBILITA
Se la curva di calibrazione lineare, la sensibilit della
calibrazione costante ed indipendente dalla
concentrazione dell'analita. In caso contrario, la
sensibilit della calibrazione dipende dalla
concentrazione alla quale essa viene calcolata.
La sensibilit della calibrazione non indica per la capacit del metodo di
discriminare fra differenti concentrazioni di analita, poich non considera l'errore
associato alla misura del segnale.
SENSIBILITA'
Per una funzione L = f; la SENSIBILITA'
la pendenza della retta di taratura
ossia la derivata della funzione (dL/dC)
Per misurare la PRECISIONE viene misurato un parametro statistico o
scarto quadratico medio o deviazione standard , pi alta la precisione
minima sar o, che quantifica la la dispersione dei valori ottenuti in una serie di
misure
AC
1

AC
2

AL
L
M
1

M
2

Il limite di rivelabilit (LR) di una metodica analitica definito come la minima
concentrazione di analita rivelabile ad un determinato livello di fiducia, cio che
produce un segnale discriminabile dal segnale del bianco. Siccome a questa
concentrazione non possibile ottenere dati quantitativi affidabili, il LR viene
utilizzato solo per definire la presenza o lassenza dellanalita.
Esistono varie definizioni del limite di rivelabilit. Per i metodi che utilizzano una
curva di calibrazione lineare il LR, definito come la concentrazione di analita che
produce un segnale pari al segnale del bianco (S
b
) pi k volte la sua deviazione
standard (s
b
), pu essere calcolato sulla base della pendenza della curva di
calibrazione.
LIMITI DI RIVELABILITA' E DI DOSABILITA
pendenza
s k
LR
b

=
Concentrazione
S
e
g
n
a
l
e

S
b
S
b
+ k s
b
LR
Il valore di k dipende dal livello di fiducia
prescelto (ad esempio per k ~ 3 solo l1%
dei bianchi presenter un segnale
maggiore di S
b
+ 3 s
b
, causando quindi un
falso positivo).
I valori di k' impiegati per il calcolo del LD sono per significativamente pi
elevati (ad esempio, se per determinare il LR stato usato k = 3, per calcolare il
LD si usa in genere k' = 10).
LIMITE DI RIVELABILITA' E DI DOSABILITA
Il limite di dosabilit (LD) di una metodica analitica definito come la minima
concentrazione di analita quantificabile con precisione ed accuratezza
accettabili.
Come per il limite di rivelabilit, esistono varie definizioni del limite di
quantificazione. Nel caso di una curva di calibrazione lineare, il LD pu essere
definito e calcolato in modo analogo al LD sulla base della pendenza della curva
di calibrazione.
In termini quantitativi la minima concentrazione determinabile da un metodo
invece rappresentata dal limite di quantificazione.
pendenza
s k
LD
b
'
=
Le definizioni di LR e LD possono dipendere anche dalla tecnica analitica. In una
tecnica cromatografica il segnale viene misurato in funzione del tempo. Per
individuare i segnali significativi si determinano il valore medio e la deviazione
standard del segnale di un bianco (o del segnale di un campione in una zona
priva di analita). Soltanto i segnali con ampiezza pari al segnale medio del bianco
pi k volte la sua deviazione standard verranno considerati indicativi della
presenza di un analita.
Tempo
S
e
g
n
a
l
e

Cromatogramma
di un bianco
LIMITE DI RIVELABILITA' E DI DOSABILITA
Sb
Sb + ksb
Segnale
non significativo
Segnale
significativo
Tempo
S
e
g
n
a
l
e

Cromatogramma
di un campione
Sb
Sb + ksb
Limite
LIMITE DI
LEGGIBILITA
(LL=3s)
buretta con divisione
0,1 mL:
LL = 0,1mL
Spettrofotmetro con
1%T = 0,044 A
LL = 0,044

LIMITE DI
RIVELABILITA
(LR= 3s)
L'analita sar
rivelabile se
LL = 3s= LR
LIMITE DI
DOSABILITA
(LD = 10s)
L'analita sar
dosabile se
LL = 10 s = LR
1
) (
1

n
x x
n
i
o
LL = 10 s, L'analit
rivelabile e dosabile
LL = 3s, l'analita sar
rilevabile ma non
dosabile non suscettibile
di determinazione
quantitativa
La lettura < 3s non
significativa
Pochi metodi analitici sono specifici (cio rispondono soltanto all'analita in
esame), soprattutto in presenza di composti con caratteristiche chimico-fisiche
simili. In generale i metodi analitici sono selettivi, cio la loro risposta in presenza
dell'analita maggiore se confrontata a quella ottenuta dalle specie interferenti
presenti nel campione. La selettivit di un metodo analitico nei confronti di un
interferente X pu essere descritta attraverso il coefficiente di selettivit, dato dal
rapporto fra le sensibilit della calibrazione relative all'interferente ed all'analita
(assumendo una curva di calibrazione lineare):
(analita) ne calibrazio della Sensibilit
(X) ne calibrazio della Sensibilit
k
X analita,
=
La selettivit di una metodica analitica la capacit di un metodo analitico di
rispondere preferenzialmente allanalita in esame piuttosto che ad altre
sostanze presenti nel campione.
SELETTIVITA
Se il coefficiente di selettivit maggiore di 1, il metodo risponde
in realt preferenzialmente all'interferente. Tanto pi il
coefficiente di selettivit basso, tanto pi grandi sono le
concentrazioni della specie interferente che possono essere
presenti durante lanalisi senza influenzare in modo significativo la
determinazione dellanalita
Questo intervallo rappresenta quindi la zona di validit di una curva di
calibrazione lineare. Esso delimitato dal limite di quantificazione del metodo e
dalla concentrazione alla quale termina la relazione lineare fra il segnale e la
concentrazione dellanalita (questa deviazione pu essere dovuta a fattori quali
comportamento non ideale del sistema o una intensit di segnale troppo alta).
Lintervallo di linearit di un metodo rappresenta lintervallo di concentrazioni
all'interno del quale esiste una relazione lineare fra il segnale e la
concentrazione dellanalita.
INTERVALLO DI LINEARITA
S
e
g
n
a
l
e

LOQ
Lampiezza dellintervallo dinamico di
linearit dipende dalla tecnica utilizzata e
pu variare da 1-2 a 5-6 ordini di grandezza.
Un metodo analitico pu non avere un
intervallo dinamico di linearit molto ampio
se le variazioni attese della concentrazione
dellanalita sono relativamente piccole.
Concentrazione
Intervallo
di linearit
La curva di calibrazione alla base della maggior parte delle tecniche di analisi
strumentale.
CURVE DI CALIBRAZIONE
Soluzioni standard
Bianco
Campione incognito
Curva di
calibrazione
Concentrazione del
campione incognito
Tipica curva di calibrazione lineare
e principali parametri che la
definiscono.
Concentrazione
S
e
g
n
a
l
e








Intervallo
di linearit
Segnale del
bianco (Sb)
Soluzioni
standard
Bianco
Limite di rivelabilit (LR) Limite di dosabilit (LD)
Parametri dell'equazione della retta:
pendenza (m) ed intercetta (b)
La curva di calibrazione viene ottenuta preparando soluzioni standard. La
concentrazione dei campioni viene poi determinata per interpolazione del loro
segnale sulla curva di calibrazione.
CURVA DI CALIBRAZIONE
Soluzioni standard a
concentrazione nota di analita
Bianco
Campione
La concentrazione dei campioni deve
essere compresa nell'intervallo di
concentrazioni degli STD, una curva di
calibrazione non pu essere utilizzata
al di fuori di tale intervallo.
Concentrazione analita
nella soluzione misurata
0 C
1
C
2
C
3
C
4
C

Segnale analita S
b
S
1
S
2
S
3
S
4
S

Sono indicate le concentrazioni finali nelle soluzioni analizzate.



Sottrazione del segnale del bianco Sb
a tutti i segnali misurati per ottenere i
segnali corretti S. (autozero)


Costruzione della curva di
calibrazione usando i valori di segnale
corretto S' misurati nelle soluzioni
standard e le loro concentrazioni.

Interpolazione del segnale S misurato
nel campione sulla curva di calibrazione
per ottenere la concentrazione C del
campione.
Procedura per una analisi con calibrazione
La concentrazione del campione incognito deve essere compresa nell'intervallo di
concentrazioni degli standard: non corretto utilizzare una curva di calibrazione al di fuori
di tale intervallo (cio ricavare la concentrazione di un campione per estrapolazione).
Concentrazione
S
e
g
n
a
l
e




S
C
CURVA DI CALIBRAZIONE
Vantaggi Semplicit. L'analisi molto semplice, i campioni e le soluzioni
standard devono essere semplicemente analizzati utilizzando la
stessa procedura.

Rapidit. Una sola curva di calibrazione pu essere impiegata
per l'analisi di un numero elevato di campioni.

Necessit di un numero ridotto di soluzioni standard. Una curva
di calibrazione (soprattutto se una retta) pu essere ottenuta
con un numero limitato di soluzioni standard di analita.
Svantaggi Risente dell'effetto matrice. Questo metodo di calibrazione
presuppone che le soluzioni standard e il campione non devono
presentare interferenze da parte degli altri costituenti del
campione (effetto matrice). Questa condizione pu essere
difficile da soddisfare, soprattutto per campioni a composizione
complessa (es. materiali biologici).
La calibrazione mediante standard esterno la tecnica di calibrazione pi
utilizzata in chimica analitica.
CURVA DI CALIBRAZIONE
Una operazione comune in chimica analitica consiste nel ricavare una curva di
calibrazione o di taratura, cio la relazione fra un segnale misurato e la
concentrazione di un analita, mediante analisi di campioni a concentrazione nota
(campioni standard).

In termini matematici, questo significa trovare i coefficienti dell'equazione che lega la
variabile segnale (y) alla concentrazione dell'analita (x). Anche conoscendo la forma
matematica dell'equazione della curva di calibrazione, la presenza dell'errore casuale
nelle misure sperimentali rende per difficoltoso l'ottenimento dell'equazione esatta.
concentrazione
s
e
g
n
a
l
e





concentrazione
s
e
g
n
a
l
e





ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE
Errore casuale
?
Nel caso pi semplice il segnale direttamente proporzionale alla concentrazione e la
curva di calibrazione una retta. Lanalisi di regressione lineare applicata attraverso il
metodo dei minimi quadrati permette di ottenere la migliore retta che passa attraverso
una serie di punti sperimentali.
ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE
x
y




Dati sperimentali:
coppie di valori (x
i
,y
i
)
affette da errore casuale
Retta migliore con equazione
y = mx + b:
pendenza (m)
intercetta (b)
coefficiente di determinazione (r
2
)
x




y
In una analisi di regressione lineare si ipotizza che
la dipendenza del segnale dalla concentrazione
(modello di regressione) sia descritta da una
equazione del tipo y = mx + b. Inoltre, si assume
normalmente che la deviazione dei dati sperimentali
dalla retta dipenda soltanto da errori commessi nella
misurazione del segnale: lerrore soltanto sulla
variabile y ed definito per ogni dato sperimentale
(x
i
,y
i
) dal suo residuo r
i
.
ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE
x
i
m x
i
+ b
y
i
punto sperimentale (x
i
,y
i
)
corrispondente punto teorico
sulla retta di calibrazione
(x
i
, mx
i
+ b)
r
i
Il calcolo dei coefficienti della retta mediante il metodo
dei minimi quadrati si effettua assumendo una
distribuzione Gaussiana degli errori sullasse y, e
l'equazione della retta viene ricavata da considerazioni
statistiche: i coefficienti ottenuti descrivono la retta che ha
massima probabilit di rappresentare la reale dipendenza
di y da x.
x
i
mx
i
+ b
y
i
r
i
La retta migliore che approssima i punti sperimentali quella con coefficienti m e b tali che la
somma dei quadrati dei residui minima:

dove N il numero di punti sperimentali presi in considerazione.

dove N il numero di punti sperimentali presi in considerazione.
| | MINIMO ) b mx ( y r SS
N
1 i
2
i i
N
1 i
2
i resid
+ = =

= =
ANALISI DI REGRESSIONE LINEARE
| | 0 ) b mx ( y
m
SS
m
N
1 i
2
i i
N
1 i
resid
= +
c
c
=
c
c

= =
| | 0 ) b mx ( y
b
SS
b
N
1 i
2
i i
N
1 i
resid
= +
c
c
=
c
c

= =
Per determinare i valori di m e b che minimizzano la somma dei residui SS
resid
si calcolano
le sue derivate parziali rispetto ad m e b e le si pongono pari a zero:







La risoluzione di queste due equazioni porta alle due espressioni
xx
xy
S
S
m= x m y b =

=
=
N
1 i
2
i xx
) x x ( S

=
=
N
1 i
2
i yy
) y y ( S ) y y ( ) x x ( S
i
N
1 i
i xy
=

=
EFFETTO MATRICE
Con il termine effetto matrice si indica linterferenza dei componenti del
campione (matrice del campione) sul segnale dellanalita. Questo effetto
determina differenze nel segnale ottenuto da standard e campioni ad eguale
concentrazione, falsando il risultato di unanalisi effettuata con il metodo di
calibrazione con standard esterno.
Leffetto matrice pu verificarsi in qualunque tipo di campione, sebbene sia pi
probabile nei campioni complessi (es. biologici) e/o contenenti concentrazioni
elevate di altre sostanze.
CALIBRAZIONE CON AGGIUNTA DI STANDARD
Bianco Campione
Aggiunte sequenziali di analita
a concentrazione nota
Concentrazione analita aggiunto C
agg
2C
agg
3C
agg
Concentrazione analita totale 0 C C + C
agg
C +
2C
agg
C +
3C
agg
Segnale analita S
b
S

S
1 agg
S
2 agg
S
3 agg
Se il metodo analitico impiegato di tipo non distruttivo, possibile ridurre la
quantit di campione necessaria effettuando aggiunte sequenziali di analita
alla stessa aliquota di campione e misurando il segnale prima di ogni ulteriore
aggiunta.
CALIBRAZIONE CON AGGIUNTA DI STANDARD
Procedura per una analisi con calibrazione mediante aggiunta di standard.
Sottrazione del segnale del bianco Sb a tutti i
segnali misurati per ottenere i segnali corretti S
(autozero).


Costruzione della curva di calibrazione (in
questo caso necessariamente una retta)
usando i segnali corretti S' misurati campione
prima e dopo l'aggiunta di concentrazioni
note di analita e le concentrazioni di analita
aggiunto.

Estrapolazione della curva di calibrazione
per ottenere la concentrazione del campione
C, corrispondente all'intersezione della retta
con l'asse orizzontale.
...
S S S
S S S
S S S
b agg 2
'
agg 2
b agg 1
'
agg 1
b
'
=
=
=
Concentrazione aggiunta
S
e
g
n
a
l
e

S
e
g
n
a
l
e

C
Concentrazione aggiunta
Sull'asse orizzontale si riporta la concentrazione di
analita aggiunto.
Espressione dei dati analitici
n-1 4 n = 5 2,236068
n C (mg/L) Media scarto quadrato Devianza Varianza

LR LD to
1 1,35
1,34
0,01 0,0001 0,0046 0,00115 0,033912 0,101735 0,339116 o = 5%
2 1,30 -0,04 0,0016 12,706
3 1,34 0,00 0 4,303
4 1,32 -0,02 0,0004 3,182 0,015166
5 1,39 0,05 0,0025 2,776
6 2,571
7 2,447
8 2,365
9 2,306
10 2,262
11 2,228
12 2,201
1,34 0,0046
ESPRESSIONE DEI RISULTATI ANALITICI
1,34

0,04
LIMITI FIDUCIALI al 95%
medio valore deviazione = o
n
o
o =
o
n
o
o
* t
medio valore