JTP: Ing. Marta Ortega AUX 1 : Ing. Pablo Garibaldi CATEDRA BIOTECNOLOGIA PCR (Polymerase chain reaction) Reaccin en cadena de la polimerasa Definicin La reaccin en cadena de la polimerasa, ya ms conocida como PCR, es una tcnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeas cantidades de ADN. Etapas de la PCR 1- Desnaturalizacin del ADN doble cadena. 2- Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de las hebras. 3- Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa. Para que el proceso se lleve a cabo en el tubo de reaccin debemos encontrar: a- ADN objetivo ( el que se quiere amplificar) b- ADN Polimerasa c- Deoxinucletidos d- Primers Para replicar el ADN, la tcnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizarla doble cadena del ADN, por lo cual deba agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila" Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taq polimerasa, acta eficientemente entre los 75C y los 80C y resiste ms de dos horas a 93C. De es ta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reaccin en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarn los ciclos trmicos programados. Los primers, tambin conocidos como iniciadores o cebadores, son cadenas cortas de nucletidos (oligonucletidos). Cada uno de ellos debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN objetivo. Es importante aclarar que los primers no deben ser complementarios entre s para evitar la propia replicacin. Deoxiadenosina trifosfato Deoxicitidina trifosfato Deoxiguanosina trifosfato Deoxitidimina trifosfato Deoxinucletidos (dNPTs) Adenina Citosina Guanina Timina Bases nitrogenadas Deoxinuclesidos Deoxiadenosina Deoxicitidina Deoxiguanosina Deoxitidimina Base + Azcar Base + Azcar + Fosfato En la primera etapa (desnaturalizacin) la doble hlice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas temperaturas (93-97C). La renaturalizacin s producir cuando la temperatura disminuya. En el segundo paso (hibridacin) los cebadores se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65 C) En la tercera etapa (elongacin) se produce la sntesis de una cadena sencilla (producindose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Deoxiadenosina trifosfato Deoxicitidina trifosfato Deoxiguanosina trifosfato Deoxitidimina trifosfato Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers. Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador. Este aparato realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta. Aplicaciones -Biotecnologa y Ciencias agropecuarias -Secuenciacin de ADN -Estudios de evolucin molecular -Diagnstico de enfermedades hereditarias -Diagnstico de enfermedades oncolgicas -Diagnstico prenatal Secuenciacin de ADN Es una tcnica propia de la Ingeniera Gentica que consiste en la determinacin de la secuencia de nucletidos de un ADN. Secuenciacin de ADN El mtodo dideoxi de secuenciacin ideado por Sanger est basado en el empleo de dideoxinucletidos, que son nucletidos que carecen de uno de los grupos hidroxilo de la pentosa, de manera que cuando uno de estos nucletidos se incorpora a la cadena de ADN en crecimiento, la misma no puede continuar elongndose ya que la ADN polimerasa necesita un extremo 3 OH para aadir el siguiente nucletido. Secuenciacin de ADN