Trinity - Triniclot Proteina S t1602

INTENDED USE
TriniCLOT Protein S is intended for the quantitative determination of Protein S activity

in human plasma.
SUMMARY AND PRINCIPLE
The TriniCLOT Protein S assay is a clotting-based plasma assay. In the assay, dilutions
of patient plasma are mixed with Protein S depleted plasma. A reagent that contains
Factor Xa, activated Protein C and phospholipids is added to the mixture. Following a 5
minute incubation period, calcium chloride is added to initiate clot formation. Under
these conditions, the prolongation of the clotting time is directly proportional to the
concentration of the Protein S in the patient plasma.
DiScipio and colleagues1 first identified human Protein S (S for Seattle) in 1977. Human
Protein S is a single chain glycoprotein of 635 amino acids (69,000 kD) that circulates
in plasma at a concentration of about 320 nM. The active Protein S gene has 15 exons
and spans more than 80 kilobases on Chromosome 3.2 Protein S is a Vitamin K-
dependant protein primarily synthesized in the liver but also in the endothelium and
possibly in megakaryocytes. It is possible that all three sources of Protein S play a
significant role in regulating haemostasis.
Protein S did not appear to be the zymogen precursor of a serine proteinase and no
function was known until 1980 when Walker3 reported that the bovine Protein S
functions as a cofactor for activated Protein C in the inactivation of activated Factor V.
The biological importance of the regulation of coagulation by the pathway involving
Protein C, Protein S and thrombomodulin was soon substantiated by clinical studies. An
association between thrombosis and partial deficiencies of Protein S was documented
in certain families.4,5,6 Protein S was also found on the surface of endothelial cells and
platelets.7 Approximately 60% of Protein S in human plasma is bound tightly to C4b-
binding protein. Therefore, plasma levels of Protein S may not completely reflect its
bioavailability.8 This complex has no anticoagulant cofactor activity. It has been
suggested that Protein S may have a role in the complement system by mediating the
association of C4b-binding protein with cell surfaces that have been damaged or
activated to expose negatively charged phospholipids.9 This may represent another
important regulatory mechanism for Protein S.
REAGENT
For in vitro diagnostic use.
REAGENT DESCRIPTION
TriniCLOT PS Activator Reagent, 4 x 1 ml, T1602A
Each vial contains 1 ml lyophilized material containing human activated Protein C,
bovine Factor Xa, and rabbit brain phospholipid.
TriniCLOT PS Dilution Buffer (10X Concentrate), 2 x 2.5 ml, T1602B
Each vial contains 2.5 ml of concentrate for sample dilution, which, upon reconstitution,
contains 0.2 M NaCl, 0.03 M HEPES and a sufficient quantity of Polybrene to
neutralize up to 1.2 U/ml heparin in a plasma sample.
TriniCLOT PS Control Plasma, 2 x 0.5 ml, T1602C
Each vial contains 0.5 ml of citrated lyophilized normal human plasma.
TriniCLOT PS Depleted Plasma, 4 x 1 ml, T1602D
Each vial contains 1 ml of lyophilized human plasma that has been depleted of Protein
S by immunoadsorption on a column of immobilized goat antibody to human Protein S.
REAGENT PREPARATION
1. TriniCLOT PS Activator Reagent:
Reconstitute with 1 ml Type I deionized water. Let stand at room temperature
(18-25C) for 20 minutes for complete dissolution.
2. TriniCLOT PS Dilution Buffer:
Reconstitute contents of one vial to 25 ml with Type I deionized water.
3. TriniCLOT PS Control Plasma:
Reconstitute with 0.5 ml Type I deionized water. Mix gently and let stand at room
temperature (18-25C) for 20 minutes for complete dissolution. Transfer to a plastic
test tube.
4. TriniCLOT PS Depleted Plasma:
Reconstitute with 1 ml Type I deionized water. Mix gently and let stand at room
temperature (18-25C) for 20 minutes for complete dissolution.
ADDITIONAL MATERIALS REQUIRED
Automated photo-optical coagulation analyser, or mechanical clot timer, or stopwatch
0.025 M calcium chloride solution
Type I deionized water or equivalent
Incubator or water bath at 37C
25 ml graduated cylinder
100-1000 l variable volume pipette
Graph paper
Centrifuge (capable of 2500 x g)
MATERIALS AVAILABLE
T1902 TriniCLOT Calcium Chloride 0.025 M
T4101 TriniCHECK Control 1
T4104 TriniCHECK Abnormal Control
T5102 TriniCAL Reference Plasma
INSTRUMENTS
Applications / method adaptations for individual analysers are available upon request;
please contact your local representative.
STORAGE AND STABILITY
Before reconstitution, reagents are stable until the expiration date indicated on the vial
label, when stored at 2-8C.
After reconstitution:
Store at 2-8C and use within 4 hours. Reconstituted Activator reagent may be frozen
at -20C for 30 days.
Store at 2-8C for 30 days.
Reconstituted plasma is stable for one hour when stored at 2-8C.
Store at 2-8C and use within 4 hours. Plasma may be frozen at -20C for 30 days.
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
Nine volumes of blood are to be collected in one volume of 3.2% (0.109 M) sodium
citrate. Immediately after blood collection, samples are centrifuged at 1500 x g for 15
minutes. Please refer to the most recent version of the CLSI document H21 for further
instructions regarding specimen collection and storage.10
PROCEDURE
WARNINGS AND PRECAUTIONS
Each donor unit used in the preparation of the activator reagent, depleted and control
plasmas was tested by an FDA licensed method and found to be non-reactive for Hepatitis
B surface antigen (HBsAg), Hepatitis C virus (HCV), and Human Immunodeficiency Virus
Type 1 (HIV-1). As no known test method can offer complete assurance that HBsAg, HCV,
HIV-1 or other infectious agents are absent, this reagent should be handled as
recommended for any potentially infectious human serum or blood specimen.
To ensure accurate and reproducible results, use calibrated pipetting devices and
observe the recommended procedures with particular emphasis on incubation times and
temperature.
This test should not be used as the sole means of diagnosis. Standard coagulation testing
regimen should be followed.
Standard and samples dilutions should be stored on wet ice and tested within 30
minutes.
TEST PROCEDURE
Instrument specific applications are available upon request.
1. Transfer TriniCLOT PS Activator and calcium chloride 0.025 M to the 37C reagent
wells of a clot timer instrument. Incubate for at least two minutes.
2. Add 0.1 ml TriniCLOT PS Depleted Plasma and 0.1 ml test plasma dilution to
a coagulation cuvette. Incubate for 2 minutes at 37C.
3. Add 0.1 ml prewarmed TriniCLOT PS Activator to the cuvette. Incubate for exactly 5
minutes at 37C.
4. Add 0.1 ml prewarmed calcium chloride 0.025 M. Start the timer and record the
clotting time.
It is highly recommended to run each test sample and control in duplicate. The final
result is the average of the duplicate results.
Assay Calibration
A new standard curve must be constructed each time the assay is performed. Pooled
normal plasma (PNP), which has been collected in the same manner as the plasma to
be tested, should be used for the preparation of the Protein S calibration standards. At
least 20 normal donors should be used for the preparation of this PNP.
Commercially prepared reference plasma in which the Protein S level has been
determined (TriniCAL Reference Plasma Cat no. T5102) may also be used.
Prepare the Protein S standards, control and patient plasma samples just before testing
as follows:
Manual preparation of 1 ml dilutions for standard curve:
* On automated instruments, the lowest point will be a minimal dilution (approx. 12.5%)
and not a true 0% standard. Please refer to instrument specific documentation.
Note: When using commercial reference plasma, the assigned Protein S concentration
should be used instead of 100%, and for each dilution the % activity calculated as
follows: assigned value multiplied by the dilution factor.
Manual preparation of 500 l sample and control dilutions:
Store dilutions on wet ice and test within 30 minutes.
Calibration curve
Plot the percent Protein S activity of the calibration standards (x-axis) versus the mean
clotting time (y-axis) on linear graph paper. Draw the line of best fit between the resulting
points. For the patient and control samples, determine the percent Protein S activity by
interpolating from the standard curve. In those patients with lupus anticoagulant or with
abnormally high Protein S activity in which multiple dilutions were used, correct the
Protein S level with the dilution factor. If the corrected Protein S levels still do not agree,
the patient sample most likely has a very strong inhibitor for which an accurate activity
level cannot be determined with this assay.
The calibration curve shown below is for example only. Users must construct a new
standard curve each time the assay is performed. Do not use the sample curve below.
QUALITY CONTROL
The Protein S control plasma included in the kit may be used as a primary or secondary control.
Controls should be included when freshly reconstituted reagents are used. The Protein S level
obtained for each control plasma should fall within the range specified by the vendor or laboratory.
If quality control samples fail to yield Protein S levels within the ranges specified for any reference
plasma, in any given run, the run should be repeated.
RESULTS
EXPECTED RESULTS
The value for Protein S is usually expressed as a relative percent compared to the value
of a standard or pooled normal plasma. The expected normal range for Protein S is
55-160%.11 However, each laboratory should determine its own normal range.12 Males have
10-15% more plasma Protein S than females and the concentration increases somewhat
in both genders with age.9 A decrease in Protein S is associated with an increased incidence
of thromboembolism.13 A decrease in Protein S activity does not necessarily indicate a
decrease in Protein S plasma concentration. Protein S (total) is present in plasma as free
protein and as protein bound to C4b binding protein (C4bBP). Only the free Protein S acts
as a cofactor for activated Protein C. When the Protein S activity is decreased, it is
important to establish the plasma levels of both free Protein S and C4bBP bound Protein
S. Three types of congenital Protein S deficiency have been described, depending on the
relative levels of Protein S activity, free Protein S, Total Protein S.14
Levels of Protein S may also be decreased in liver disease and during anticoagulant
therapy. In addition, Protein S activity and free Protein S antigen may be reduced in
inflammatory disease in which the levels of C4bBP are elevated.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
The presence of heparin greater than 1.2 U/ml or lupus anticoagulants in the sample may
interfere with the assay results by prolonging the clotting time and giving an artificially
high Protein S value. Test these at multiple dilutions. Functional methods for Protein S
can be influenced by the presence of Factor V Leiden mutation.
To ensure accurate and reproducible results, use calibrated pipetting devices and observe
the recommended procedures with particular emphasis on incubation times and
temperature.
This test should not be used as the sole means of diagnosis. Standard coagulation testing
regimen should be followed.
The end-user should establish product performance characteristics for the specific method
or instrumentation used. Studies using an automated analyzer with photo-optical detection
produced the results shown below.
Accuracy
A study performed using another commercially available Protein S kit gave a correlation
coefficient of 0.868 for 78 samples tested, with a regression equation of y = 0.913x + 17.2.
Precision
The following coefficients of variation (CV's) were observed:
Sensitivity
TriniCLOT Protein S is designed to give a linear standard curve for Protein S levels between
0 and 100% when plotted as directed.
FRANAIS
UTILISATION
TriniCLOT Protein S sert la dtermination quantitative de l'activit de la Protine S dans
le plasma humain.
SOMMAIRE ET PRINCIPE
Le test TriniCLOT Protein S est un test plasmatique de coagulation. Au cours de ce test,
les dilutions du plasma du patient sont mlanges du plasma dplt en Protine S. Un
ractif contenant du Facteur Xa, de la Protine C active et des phospholipides est ajout
au mlange. Aprs une priode d'incubation de 5 minutes, la formation dun caillot est
dclenche par lajout de chlorure de calcium. Dans ces conditions, l'allongement du
temps de coagulation est directement proportionnel la concentration en Protine S dans
le plasma du patient.
DiScipio et ses collaborateurs1 ont identifi pour la premire fois la Protine S (S pour
Seattle) humaine en 1977. La Protine S humaine est une glycoprotine chane simple
compose de 635 acides amins (69 000 kD) qui circule dans le plasma selon une
concentration d'environ 320 nM. Le gne de la Protine S active possde 15 exons et
englobe plus de 80 kilobases sur le Chromosome 3.2 La Protine S est une protine
Vitamine K-dpendante principalement synthtise dans le foie mais galement dans
l'endothlium, et probablement dans les mgacaryocytes. Il est possible que ces trois
sources de Protine S jouent un rle significatif dans la rgulation de l'hmostase.
La Protine S n'est pas apparue comme un prcurseur du zymogne d'une srine protase.
Ce n'est qu'en 1980 que Walker3 prsente la Protine S bovine comme cofacteur de la
Protine C active dans l'inactivation du Facteur V activ. L'importance biologique de la
rgulation de la coagulation par un mcanisme impliquant la Protine C, la Protine S et
la thrombomoduline a ensuite t justifie par des tudes cliniques. L'association entre
thrombose et dficiences partielles en Protine S a t documente dans certaines
familles.4,5,6 Il a galement t dmontr que la Protine S tait prsente la surface des
cellules endothliales et des plaquettes.7 Environ 60% de la Protine S dans le plasma
humain est troitement lie la protine de liaison C4b. Ds lors, les niveaux
plasmatiques de Protine S ne peuvent entirement reflter sa biodisponibilit.8 Ce
complexe ne prsente aucune activit cofacteur anticoagulant. Il a t suggr que la
Protine S pouvait avoir un rle dans le systme du complment en servant d'intermdiaire
dans l'association de la protine de liaison C4b et des surfaces cellulaires qui ont t
endommages ou actives pour exposer des phospholipides chargs ngativement.9 Cela
peut constituer un autre mcanisme rgulateur important pour la Protine S.
RACTIF
Usage diagnostique in vitro
DESCRIPTION DU RACTIF
Chaque flacon contient 1 ml de matriel lyophilis contenant de la Protine C humaine
active, du facteur Xa bovin et du phospholipide de cerveau de lapin.
TriniCLOT PS Dilution Buffer (concentr 10X), 2 x 2,5 ml, T1602B
Chaque flacon contient 2,5 ml de concentr pour la dilution d'chantillon qui, une fois
reconstitu, contient du NaCl 0,2 M, de l'HEPES 0,03 M et une quantit suffisante de
Polybrene pour neutraliser jusqu' 1,2 U/ml d'hparine dans un chantillon plasmatique.
TriniCLOT PS Control Plasma, 2 x 0,5 ml, T1602C
Chaque flacon contient 0,5 ml de plasma humain normal citrat lyophilis.
Chaque flacon contient 1 ml de plasma humain lyophilis dplt en Protine S par
immunoadsorption sur une colonne d'anticorps de chvre la Protine S humaine coats.
PRPARATION DU RACTIF
Reconstruction avec 1 ml d'eau dionise de Type I. Laisser reposer temprature
ambiante (entre 18-25C) pendant 20 minutes pour une dissolution totale.
Dilution du contenu d'un flacon dans 25 ml d'eau dionise de Type I.
Reconstruction avec 0,5 ml d'eau dionise de Type I. Mlanger dlicatement et laisser
reposer temprature ambiante (entre 18-25C) pendant 20 minutes pour une
dissolution totale. Transfrer dans un tube essai en plastique.
Reconstruction avec 1 ml d'eau dionise de Type I. Mlanger dlicatement et laisser
reposer temprature ambiante (entre 18-25C) pendant 20 minutes pour une
dissolution totale.
AUTRES MATERIELS NECESSAIRES
Analyseur de coagulation photo-optique automatis, ou coagulomtre mcanique, ou
chronomtre
Solution de chlorure de calcium 0,025 M
Eau dionise de Type I ou quivalent
Incubateur ou bain d'eau 37C
Cylindre gradu de 25 ml
Pipette volume variable (entre 100-1000 l)
Papier millimtr
Centrifugeuse (capacit de 2500 x g)
MATERIELS DISPONIBLES
INSTRUMENTS
Les applications/adaptations de la mthode pour chaque analyseur sont disponibles sur
demande. Veuillez contacter votre reprsentant local.
CONSERVATION ET STABILITE
S'ils ne sont pas reconstitus, les ractifs restent stables jusqu' la date d'expiration
indique sur l'tiquette du flacon condition qu'ils soient conservs entre 2-8C.
Aprs reconstitution :
conserver entre 2-8C et utiliser dans les 4 heures. Un ractif Activateur reconstitu
peut tre congel -20C pendant 30 jours.
conserver entre 2-8C pendant 30 jours.
Le plasma reconstitu demeure stable pendant une heure lorsqu'il est conserv entre
2-8C.
conserver entre 2-8C et utiliser dans les 4 heures. Le plasma peut tre congel
-20C pendant 30 jours.
PRLVEMENT ET CONSERVATION DES CHANTILLONS
Neuf volumes de sang doivent tre prlevs dans un volume de citrate de sodium 3,2%
(0,109 M). Les chantillons doivent tre centrifugs 1 500 x g pendant 15 minutes
immdiatement aprs le prlvement. Se reporter la dernire version du document CLSI
H21 pour de plus amples instructions concernant le prlvement et la conservation des
chantillons.10
PROCDURE
MISES EN GARDE ET PRCAUTIONS
Chacun des chantillons de donneur utilis dans la prparation du ractif activateur et des
plasmas dplt et de contrle a t test l'aide d'une mthode sous licence FDA et s'est
avr non-ractif l'antigne de surface de l'Hpatite B (HBsAg), au virus de l'Hpatite
C (HCV) et au virus de l'immunodficience humaine de Type 1 (VIH-1). Puisque aucune
mthode de test ne peut garantir l'absence de HBsAg, HCV, VIH-1 ou de tout autre agent
infectieux, ce ractif devra tre manipul l'instar de tout srum humain ou chantillon
sanguin potentiellement infectieux.
Pour garantir des rsultats prcis et reproductibles, utiliser des pipettes talonnes et
observer les procdures recommandes en veillant particulirement aux temps
d'incubation et la temprature.
Ce test ne doit pas reprsenter le seul moyen diagnostique. Une procdure de test de la
coagulation standard doit tre effectue.
Les dilutions standard et les dilutions d'chantillons doivent tre conserves sur de la
glace humide et tre testes dans les 30 minutes.
MODE OPERATOIRE DU TEST
Des applications spcifiques aux instruments sont disponibles sur demande.
1. Transfrer TriniCLOT PS Activator et chlorure de calcium 0,025 M dans les puits d'un
coagulomtre contenant du ractif 37C. Incuber pendant au moins deux minutes.
2. Ajouter 0,1 ml de TriniCLOT PS Depleted Plasma et 0,1 ml de dilution de plasma test
dans une cuve de coagulation. Incuber pendant 2 minutes 37C.
3. Ajouter 0,1 ml de TriniCLOT PS Activator prchauff dans la cuve. Incuber pendant
5 minutes 37C exactement.
4. Ajouter 0,1 ml de chlorure de calcium 0,025 M prchauff. Lancer le chronomtre et
consigner le temps de coagulation.
Il est fortement recommand de vrifier chaque chantillon test et chaque contrle deux
fois. Le rsultat dfinitif correspond la moyenne des deux rsultats.
talonnage du Test
Une nouvelle courbe de calibration doit tre labore chaque fois qu'un test est ralis. Le
pool de plasma normal (PPN), recueilli de la mme manire que le plasma devant tre test,
doit tre utilis dans le cadre de la prparation des normes d'talonnage de la Protine S. Au
moins 20 donneurs normaux doivent tre utiliss pour la prparation de ce PPN.
Le plasma de rfrence prpar dans le commerce dans lequel le degr de Protine S a
t dtermin (TriniCAL Reference Plasma Cat. n T5102) peut galement tre employ.
Prparer les talons de Protine S, les chantillons de contrle et les chantillons
plasmatiques du patient juste avant le dbut du test comme suit:
Prparation manuelle des dilutions 1 ml pour la courbe talon:
* Sur les instruments automatiss, le point le plus bas reprsentera une dilution minimale
(environ 12,5%) et non un vritable talon de 0%. Veuillez vous reporter la
documentation spcifique de l'instrument.
Remarque: lors de l'utilisation du plasma de rfrence commercial, la concentration de Protine
S attribue devra tre utilise la place de 100%, et pour chaque dilution, le % d'activit
devra tre calcul comme suit: valeur attribue multiplie par le facteur de dilution.
Prparation manuelle d'un chantillon de 500 l et des dilutions de contrle:
Conserver les dilutions sur de la glace humide et raliser le test dans les 30 minutes.
Courbe dtalonnage
Reporter l'activit de la Protine S en pourcentage selon les paramtres standards
d'talonnage (axe x) ainsi que la dure de coagulation moyenne (axe y) sur du papier
millimtr linaire. Tracer la droite de rgression entre les points obtenus. Pour le patient
et le contrle, dterminer l'activit en pourcentage de la Protine S en interpolant la
courbe talon. Pour les patients prsentant un lupus anticoagulant ou une activit de la
Protine S anormalement leve et pour lesquels de multiples dilutions ont t utilises,
corriger le niveau de Protine S avec le facteur de dilution. Si les niveaux de Protine S
corrigs ne conviennent toujours pas, l'chantillon du patient est susceptible de comporter
un trs fort inhibiteur dont le degr prcis d'activit ne peut tre dtermin par le biais
de ce test.
La courbe d'talonnage illustre ci-dessous n'est fournie qu' titre d'exemple. Les
utilisateurs doivent laborer une nouvelle courbe de calibration chaque fois qu'un test
est ralis. Ne pas utiliser la courbe de calibration ci-dessous.
CONTRLE DE QUALITE
Le plasma de contrle de la Protine S inclus dans le kit peut tre employ comme solution
de contrle principale ou secondaire. Les solutions de contrle doivent tre introduites
lorsque des ractifs frachement reconstitus sont utiliss. Le niveau de Protine S obtenu
pour chaque plasma de contrle doit se situer trouver la plage dfinie par le fournisseur ou
le laboratoire. Si les chantillons de contrle de la qualit ne permettent pas d'obtenir des
niveaux de Protine S se situant dans les plages spcifies pour un plasma de rfrence,
qu'il s'agisse du premier ou du deuxime test, ce test doit tre rpt.
RSULTATS
RSULTATS ATTENDUS
la diffrence d'un plasma standard ou d'un pool de plasma normal, la valeur de la Protine
S est gnralement exprime sous la forme d'un pourcentage relatif. La plage normale prvue
pour la Protine S est de 55-160%.11 Cependant, chaque laboratoire doit dterminer sa
propre plage normale.12 Les hommes possdent entre 10% et 15% de Protine S
plasmatique en plus que les femmes, et la concentration de Protine S augmente, quel que
soit le sexe, avec l'ge.9 Une diminution de la Protine S est associe une incidence accrue
de thromboembolie.13 Une diminution de l'activit de la Protine S n'indique pas
ncessairement une diminution de la concentration plasmatique en Protine S. La Protine
S (totale) est prsente dans le plasma sous la forme d'une protine libre et d'une protine
lie la protine de liaison C4b (C4bBP). Seule la Protine S libre fait office de cofacteur
de la Protine C active. Lorsque l'activit de la Protine S diminue, il est important d'tablir
les niveaux plasmatiques de la Protine S libre et de la Protine S lie la C4bBP. Trois types
de dficiences congnitales lies la Protine S ont t dcrits, en fonction des niveaux
relatifs de l'activit de la Protine S, de la Protine S libre et de la Protine S totale.14
Les niveaux de la Protine S peuvent galement diminuer en cas de maladie du foie et au
cours d'un traitement par anticoagulants. En outre, l'activit de la Protine S et l'antigne
de la Protine S libre peuvent tre rduits en cas de maladie inflammatoire entranant des
niveaux de C4bBP levs.
PERFORMANCES DU TEST
Une prsence d'hparine suprieure 1,2 U/ml ou de lupus anticoagulants dans
l'chantillon peut altrer les rsultats du test en prolongeant la dure de coagulation et
en confrant la Protine S une valeur faussement leve. Tester ces chantillons avec
diverses dilutions. Les mthodes fonctionnelles relatives la Protine S peuvent tre
influences par une mutation du Facteur V de Leiden.
Pour garantir des rsultats prcis et reproductibles, utiliser des pipettes talonnes et
observer les procdures recommandes en veillant particulirement aux temps
d'incubation et la temprature. Ce test ne doit pas reprsenter le seul moyen
diagnostique. Une procdure de test de la coagulation standard doit tre effectue.
L'utilisateur final devra tablir les caractristiques lies la performance du produit pour
la mthode ou les instruments spcifiques utiliss. Les tudes utilisant un analyseur
automatis avec dtection photo-optique ont produit les rsultats prsents ci-dessous.
Exactitude
Une tude ralise l'aide d'un autre kit pour Protine S disponible dans le commerce a
permis d'obtenir un coefficient de corrlation de 0,868 pour 78 chantillons tests, avec
une quation de rgression de y = 0,913x + 17,2.
Prcision
Les coefficients de variation (CV) qui suivent ont t observs :
Sensibilit
TriniCLOT Protein S est conu pour offrir une courbe de calibration linaire pour les
niveaux de Protine S compris entre 0 et 100% lorsque la courbe est trace comme
indiqu.
DEUTSCH
VERWENDUNGSZWECK
TriniCLOT Protein S ist zur quantitativen Bestimmung der Protein S-Aktivitt in humanem
Plasma vorgesehen.
ZUSAMMENFASSUNG UND PRINZIP
Der TriniCLOT Protein S-Assay ist ein auf der Gerinnung basierender Plasmatest. Fr den
Test werden die verdnnten Plasmaproben der Patienten mit Protein-S-freiem Plasma
gemischt. Der Mischung wird dann ein Reagenz aus Faktor Xa, aktiviertem Protein C und
Phosholipiden zugesetzt. Nach einer 5-mintigen Inkubationszeit wird Calciumchlorid
hinzugefgt, um die Gerinnungsbildung auszulsen. Unter diesen Bedingungen ist die
Verlngerung der Gerinnungszeit direkt proportional zur Protein-S-Konzentration in der
Plasmaprobe des Patienten.
DiScipio et al1 identifizierten im Jahre 1977 erstmals das humane Protein S (S steht fr
Seattle). Humanes Protein S ist ein einkettiges Glykoprotein aus 635 Aminosuren
(69 000 kD), das mit einer Konzentration von etwa 320 nM im Plasma zirkuliert. Das
aktive Protein-S-Gen besitzt 15 Exone und verteilt sich ber mehr als 80 Kilobasen auf
Chromosom 3.2 Protein S ist ein Vitamin-K-abhngiges Protein, das primr in der Leber
synthetisiert wird, aber auch im Endothelium und mglicherweise in den Megakaryozyten.
Alle drei Protein-S-Quellen spielen mglicherweise eine bedeutende Rolle bei der
Regulation der Hmostase.
Protein S schien nicht der Zymogenvorlufer einer Serinproteinase zu sein und seine
Funktion war bis 1980 unbekannt, als Walker3 berichtete, dass bovines Protein S bei der
Inaktivierung des aktivierten Faktor V als Cofaktor des aktivierten Protein C fungiert. Die
biologische Bedeutung der Gerinnungsregulation durch das auf den Aktivierungsweg
wirkende Protein C, Protein S und Thrombomodulin wurde schon bald darauf durch
klinische Studien belegt. In manchen Familien konnte ein Zusammenhang zwischen
Thrombose und partiellem Protein-S-Mangel dokumentiert werden.4,5,6 Protein S wurde
ebenfalls auf der Oberflche von Endothelzellen und Thrombozyten nachgewiesen.7
Annhernd 60% des Protein-S-Anteils im menschlichen Plasma sind eng an C4b-
bindendes Protein gebunden; folglich gibt der Plasmaspiegel mglicherweise nicht
vollstndig die Bioverfgbarkeit von Protein S wieder.8 Dieser Komplex weist keine
gerinnungshemmende Cofaktor-Aktivitt auf, es wird angenommen, dass Protein S im
Komplementsystem eine Rolle spielt, indem es die Anlagerung von C4b-bindendem
Protein an Zelloberflchen vermittelt, auf denen infolge einer Beschdigung oder
Aktivierung der Oberflche negativ geladene Phospholipide freiliegen.9 Dies knnte einen
weiteren wichtigen Regulationsmechanismus von Protein S darstellen.
REAGENZ
In-vitro-Diagnostika
BESCHREIBUNG DER REAGENZIEN
Flschchen mit je 1 ml lyophilisiertem Material; enthlt humanes aktiviertes Protein C,
Faktor Xa (Rind) und Phospholipid (Kaninchenhirn).
TriniCLOT PS Dilution Buffer (10X Konzentrat), 2 x 2,5 ml, T1602B
Flschchen mit je 2,5 ml Konzentrat zur Probenverdnnung, das nach Rekonstitution 0,2
M NaCl, 0,03 M HEPES und ausreichend Polybrene zur Neutralisation von bis zu 1,2
U/ml Heparin in einer Plasmaprobe enthlt.
Flschchen mit je 0,5 ml zitriertem lyophilisiertem, humanem Citratplasma im
Normalbereich.
Flschchen mit je 1 ml lyophilisiertem Humanplasma, befreit von Protein S durch
Immunoadsorption an einer Sule mit immobilisiertem Ziegenantikrper gegen humanes
Protein S.
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Mit 1 ml deionisiertem Wasser (Typ I) rekonstituieren. Bis zur vlligen Auflsung 20
Minuten bei Raumtemperatur (18-25C) stehen lassen.
Inhalt eines Flschchens auf 25 ml mit deionisiertem Wasser (Typ I) verdnnen.
Mit 0,5 ml deionisiertem Wasser (Typ I) rekonstituieren. Behutsam mischen und bis zur
vlligen Auflsung 20 Minuten bei Raumtemperatur (18-25C) stehen lassen. In ein
Plastik-Testrhrchen berfhren.
Mit 1 ml deionisiertem Wasser (Typ I) rekonstituieren. Behutsam mischen und bis zur
vlligen Auflsung 20 Minuten bei Raumtemperatur (18-25C) stehen lassen.
ZUSTZLICH BENTIGTE MATERIALIEN
Automatischer photooptischer Gerinnungsanalysator, mechanisches Gerinnungszeit-
Megert oder Stoppuhr
0,025 M Calciumchlorid-Lsung
Deionisiertes Wasser (Typ I oder gleichwertig)
Inkubator oder Wasserbad (37C)
Graduierter Zylinder (25 ml)
Pipette mit variablem Volumen (1001000 l)
Millimeterpapier
Zentrifuge (geeignet fr 2500 x g)
VERFGBARE MATERIALIEN
INSTRUMENTE
Anwendungs-/Verfahrens-Anpassungen fr einzelne Analysatoren sind auf Verlangen
erhltlich. Setzen Sie sich bitte mit ihrem Fachmann vor Ort in Verbindung.
LAGERUNG UND HALTBARKEIT
Nicht rekonstituierte, Reagenzien bleiben bei Lagerung bei 2-8C bis zu dem auf dem
Flschchenetikett angegebenen Verfallsdatum stabil.
Nach Rekonstitution:
Bei 2-8C lagern und innerhalb von 4 Stunden verwenden. Rekonstitutiertes Aktivator-
Reagenz kann fr 30 Tage bei -20C eingefroren werden.
Bei 2-8C fr 30 Tage lagern.
Bei Lagerung bei 2-8C ist das rekonstituierte Plasma fr eine Stunde stabil.
Bei 2-8C lagern und innerhalb von 4 Stunden verwenden. Plasma kann fr 30 Tage
bei -20C eingefroren werden.
PROBENENTNAHME UND LAGERUNG
Neun Volumeneinheiten Blut sind in einer Volumeneinheit mit 3,2-prozentiger
Natriumcitratlsung (0,109 M) zu sammeln. Sofort nach der Blutentnahme werden die
Proben bei 1 500 x g 15 Minuten lang zentrifugiert. Die aktuellste Version des
CLSI-Dokuments H21 enthlt weitere Anweisungen zur Probenentnahme und
Probenlagerung.10
VERFAHREN
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
Alle fr die Herstellung von Aktivatorreagenz, Protein-S-freiem Plasma und Kontrollplasma
verwendeten Spenderseren wurden mit einer von der FDA lizensierten Methode auf
Hepatitis-B-Oberflchenantigen (HBsAg), Hepatitis-C-Virus (HCV) und Humanes
Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) getestet und fr negativ befunden. Da sich HBsAg,
HCV, HIV-1 und andere Infektionserreger derzeit mit keiner bekannten Testmethode mit
vlliger Sicherheit ausschlieen lassen, muss dieses Reagenz als potentiell infektis
betrachtet und, wie bei humanen Serum- und Blutproben blich, entsprechend
gehandhabt werden.
Zur Gewhrleistung exakter und reproduzierbarer Ergebnisse mssen kalibrierte
Pipettiergerte verwendet werden. Die empfohlene Arbeitsanweisung ist insbesondere
hinsichtlich der Inkubationszeiten und -temperaturen exakt zu beachten.
Dieser Test sollte nicht als alleinige Grundlage fr die Diagnose herangezogen werden.
Die Standard-Verfahrensvorschriften fr Gerinnungstests sind einzuhalten.
Die Standard- und Proben-Verdnnungen im Eisbad lagern und innerhalb von 30 Minuten
testen.
TESTVERFAHREN
Gertespezifische Anwendungen sind auf Verlangen erhltlich.
1. TriniCLOT PS Activator-Reagenz und Calciumchlorid 0,025 M in die 37C warmen
Reagenzvertiefungen eines Gerinnungszeit-Messgertes berfhren. Mindestens zwei
Minuten inkubieren.
2. 0,1 ml TriniCLOT PS Depleted Plasma und 0,1 ml verdnntes Testplasma in eine
Gerinnungskvette geben. 2 Minuten bei 37C inkubieren.
3. 0,1 ml vorgewrmtes TriniCLOT PS Activator-Reagenz in die Kvette geben. Exakt 5
Minuten bei 37C inkubieren.
4. 0,1 ml vorgewrmtes Calciumchlorid 0,025 M zugeben. Zeitmesser starten und
Gerinnungszeit messen.
Jede Patientenprobe und Kontrolle ist doppelt zu testen. Das Endergebnis ist als Mittelwert
der beiden Ergebnisse anzugeben.
Test-Kalibrierung
Bei jeder Testdurchfhrung muss eine neue Standardkurve erstellt werden. Zur Herstellung
der Protein S-Kalibrierungsstandards sollte gepooltes Normalplasma (PNP) verwendet
werden, das auf die gleiche Weise gewonnen wurde, wie die zu testenden Plasmaproben.
Fr die Herstellung dieses PNP sollte das Plasma von mindestens 20 normalen Spendern
verwendet werden.
Kommerziell hergestelltes Referenzplasma mit einer bekannten Protein S-Konzentration
(TriniCAL Reference Plasma, Kat.-Nr. T5102) kann ebenfalls eingesetzt werden.
Die Protein-S-Standards, das Kontrollplasma und die Patientenproben unmittelbar vor der
Testdurchfhrung wie folgt herstellen:
Manuelle Herstellung von 1 ml Verdnnungen fr die Standardkurve:
* Bei automatisierten Gerten ist der niedrigste Punkt eine Mindestverdnnung (ca.
12,5%), kein "echter" 0%-Standard. Bitte beachten Sie die spezifischen Gerteunterlagen.
Hinweis: Bei der Verwendung von kommerziellem Referenzplasma die angegebene Protein
S-Konzentration anstelle des 100%-Wertes verwenden und die "% Aktivitt" fr jede
Testverdnnung wie folgt berechnen: angegebene Konzentration multipliziert mit
Verdnnungsfaktor.
Manuelle Herstellung von 500 l Proben- und Kontrollverdnnungen:
Verdnnungen im Eisbad lagern und innerhalb von 30 Minuten testen.
Kalibrierungskurve
Stellen Sie die prozentuale Protein-S-Aktivitt der Kalibrierungsstandards (x-Achse) im
Verhltnis zum Mittelwert der Gerinnungszeit (y-Achse) auf linearem Millimeterpapier dar.
Ziehen Sie eine Gerade zwischen den resultierenden Punkten nun so, dass die Summe der
Abweichungen am geringsten ist. Bestimmen Sie fr die Patientenproben und Kontrollen
die prozentuale Protein-S-Aktivitt durch Interpolation aus der Standardkurve. Bei
Patientenproben mit Lupus-Antikoagulans oder ungewhnlich hoher Protein S-Aktivitt,
bei denen mehrfache Verdnnungen verwendet wurden, muss die Protein S-Konzentration
mit dem Verdnnungsfaktor korrigiert werden. Falls die korrigierten Protein-S-Werte immer
noch nicht bereinstimmen, liegt in der Patientenprobe mit hoher Wahrscheinlichkeit ein
starker Hemmstoff vor, sodass sich die exakte Aktivitt anhand dieses Tests nicht ermitteln
lsst.
Die unten abgebildete Kalibrierungskurve ist lediglich als Beispiel angefhrt. Bei der
Anwendung des Tests muss bei jeder Testdurchfhrung eine neue Standardkurve durch
den Anwender erstellt werden. Die nachstehende Beispielkurve nicht verwenden!
QUALITTSKONTROLLE
Das in dem Kit enthaltende Protein S-Kontrollplasma kann als primre oder sekundre
Kontrolle verwendet werden. Das Kontrollplasma sollte immer dann mitgefahren werden,
wenn frisch rekonstituierte Reagenzien eingesetzt werden. Der Protein S-Spiegel fr jedes
Kontrollplasma muss in dem vom Hersteller bzw. Labor angegebenen Bereich liegen.
Liegen die gemessenen Protein-S-Konzentrationen der Qualittskontrollproben auerhalb
des fr das Referenzplasma angegebenen Bereichs, muss der Test wiederholt werden.
ERGEBNISSE
ERWARTETE ERGEBNISSE
Der Protein-S-Wert wird im Allgemeinen als relativer Prozentsatz des Wertes eines
Standard- oder gepoolten Normalplasmas angegeben. Der erwartete Normalbereich fr
Protein S liegt bei 55-160%.11 Jedes Labor sollte jedoch seinen eigenen Normalbereich
ermitteln.12 Bei Mnnern liegt die Protein-S-Konzentration im Plasma um 10-15% hher
als bei Frauen, und bei beiden Geschlechtern nimmt die Konzentration mit steigendem
Lebensalter leicht zu.9 Eine Verringerung des Protein-S-Wertes bedeutet eine erhhte
Inzidenz von Thrombembolien.13 Die Verringerung der Protein-S-Aktivitt bedeutet nicht
unbedingt einen Rckgang der Protein-S-Konzentration im Plasma Im Plasma liegt das
Gesamt-Protein S in Form von freiem Protein und als an C4b gebundenes Protein (C4bBP)
vor. Nur der freie Protein-S-Anteil wirkt als Cofaktor fr aktiviertes Protein C. Bei
verminderter Protein-S-Aktivitt ist es wichtig, die Plasma-Konzentrationen sowohl von
freiem Protein S als auch an C4bBP gebundenem Protein S zu bestimmen. Es sind drei
Typen von kongenitalen Protein-S-Mngeln beschrieben worden, die von den relativen
Werten der Protein S-Aktivitt, dem freien Protein S und dem Gesamt- Protein S
abhngen.14
Die Protein-S-Konzentration kann auch bei Lebererkrankungen und whrend der Therapie
mit Antikoagulanzien vermindert sein. Darber hinaus knnen Protein-S-Aktivitt und
freies Protein-S-Antigen bei entzndlichen Erkrankungen mit erhhten C4bBP-Spiegeln
vermindert sein.
LEISTUNGSDATEN
Die Gegenwart von Heparin in einer Konzentration von ber 1,2 U/ml oder von Lupus-
Antikoagulanzien in der Patientenprobe kann das Testergebnis durch Verlngerung der
Gerinnungszeit beeinflussen und einen knstlich erhhten Protein-S-Wert ergeben.
Diejenigen Proben sollten bei mehrfacher Verdnnung getestet werden. Funktionale
Verfahren wie dieser Protein S-Test knnen durch das Vorliegen einer Faktor-V-Leiden-
Mutation beeinflusst werden.
Zur Gewhrleistung exakter und reproduzierbarer Ergebnisse mssen kalibrierte
Pipettiergerte verwendet werden. Die empfohlene Arbeitsanweisung ist insbesondere
hinsichtlich der Inkubationszeiten und -temperaturen exakt zu beachten. Dieser Test sollte
nicht als alleinige Grundlage fr die Diagnose herangezogen werden. Die Standard-
Verfahrensvorschriften fr Gerinnungstests sind einzuhalten.
Der Endanwender sollte fr die jeweils verwendete spezifische Methode oder das jeweilige
Gert seine eigenen Leistungsdaten ermitteln. In Untersuchungen mit einem
automatisierten Analysator mit foto-optischem Nachweis wurden die nachfolgenden
Ergebnisse erzielt.
Genauigkeit
Die Untersuchung mit einem alternativen kommerziell erhltlichen Protein S-Testkit ergab
bei 78 getesteten Proben einen Korrelationskoeffizienten von 0,868 mit einer
Regressionsgleichung von y = 0,913x + 17,2.
Przision
Es wurden folgende Variationskoeffizienten (VK) ermittelt:
Empfindlichkeit
TriniCLOT Protein S ergibt bei einer wie vorher angegebenen grafischen Darstellung und
Protein-S-Konzentrationen zwischen 0 und 100% eine lineare Standardkurve.
ESPAOL
USO PREVISTO
TriniCLOT Protein S se utiliza para la determinacin cuantitativa de la actividad de la
Protena S en plasma humano.
RESUMEN Y PRINCIPIO
El ensayo TriniCLOT Protein S es un test plasmtico basado en el principio de la
coagulacin. En el ensayo, se mezclan diluciones de plasma del paciente con plasma libre
de Protena S. A la mezcla se le aade un reactivo que contiene Factor Xa, Protena C
activada y fosfolpidos. Tras un perodo de incubacin de 5 minutos, se aade cloruro de
calcio para provocar la coagulacin. En estas condiciones, la prolongacin del tiempo de
coagulacin es directamente proporcional a la concentracin de la Protena S en la
muestra de plasma del paciente.
En 1977 DiScipio et al1 identificaron por primera vez la Protena S (S de Seattle) humana.
La Protena S humana es una glucoprotena monocadena compuesta por 635 aminocidos
(69 000 KD) que circula en el plasma a una concentracin de aproximadamente 320 nM.
El gen activo de la Protena S presenta 15 exones y se extiende por ms de 80 kilobases
sobre el Cromosoma 3.2 La Protena S es una protena dependiente de la Vitamina K, que
se sintetiza principalmente en el hgado, pero tambin en el endotelio y posiblemente en
los megacariocitos. Es posible que estas tres fuentes de las cuales deriva la Protena S
desempeen una funcin importante en la regulacin de la hemostasis.
La Protena S no pareca ser el precursor cimgeno de una proteinasa serina y su
funcin fue desconocida hasta 1980, cuando Walker3 expuso que la Protena S bovina
actuaba como cofactor para la Protena C activada en el proceso de inactivacin del
Factor V activado. Estudios clnicos confirmaron pronto la importancia biolgica de la
regulacin de la coagulacin por parte de la va metablica en la que estn involucradas
la Protena C, a la Protena S y la trombomodulina. En ciertas familias se ha podido
documentar una relacin entre la trombosis y la carencia parcial de Protena S.4,5,6 La
Protena S ha sido hallada tambin en la superficie de clulas endoteliales y de
trombocitos.7 Alrededor del 60% de la Protena S presente en el plasma humano est
estrechamente ligado a la protena unida a C4b; los niveles plasmticos de Protena S
pueden por lo tanto no reflejar completamente su biodisponibilidad.8 Este complejo
no presenta ninguna actividad de cofactor anticoagulante. Se supone que la Protena
S puede estar implicada en el sistema del complemento actuando como intermediario
de la asociacin entre la protena unida a C4b y las superficies de la clula expuestas,
como consecuencia de haber sido daadas o activadas, a fosfolpidos con carga
negativa.9 Esto podra representar otro mecanismo importante de regulacin de la
Protena S.
REACTIVO
Para uso diagnstico in vitro.
DESCRIPCIN DEL REACTIVO
Cada vial contiene 1 ml de material liofilizado (contiene Protena C humana activada,
Factor Xa bovino y fosfolpido de cerebro de conejo).
TriniCLOT PS Dilution Buffer (concentrado 10X), 2 x 2,5 ml, T1602B
Cada vial contiene 2,5 ml cada uno de concentrado para dilucin de la muestra, el cual,
tras la reconstitucin, contiene 0,2 M de NaCl, 0,03 M de HEPES y una cantidad
suficiente de Polybrene para neutralizar hasta 1,2 U/ml de heparina en una muestra de
plasma.
Cada vial contiene 0,5 ml de plasma humano normal citratado liofilizado.
Cada vial contiene 1 ml de plasma humano liofilizado que se ha liberado de Protena S
mediante inmunoabsorcin sobre una columna de anticuerpos caprinos inmovilizados
contra la Protena S humana.
PREPARACIN DEL REACTIVO
Reconstituir con 1 ml de agua desionizada del Tipo I. Para garantizar una completa
disolucin, dejarlo 20 minutos a temperatura ambiente (18-25C).
Diluir el contenido de un vial con 25 ml de agua desionizada del Tipo I.
Reconstituir con 0,5 ml de agua desionizada del Tipo I. Mezclar cuidadosamente y
dejarlo 20 minutos a temperatura ambiente (18-25C) para garantizar una completa
disolucin. Transferirlo a un tubo de ensayo de plstico.
Reconstituir con 1 ml de agua desionizada del Tipo I. Mezclar cuidadosamente y dejarlo
20 minutos a temperatura ambiente (18-25C) para garantizar una completa
disolucin.
MATERIALES ADICIONALES NECESARIOS
Analizador automtico foto-ptico de coagulacin, coagulmetro mecnico o cronmetro.
Solucin de cloruro de calcio de 0,025 M.
Agua desionizada del Tipo I o equivalente.
Incubadora o bao de agua (37C).
Cilindro graduado de 25 ml.
Pipeta para dispensar volmenes variables de 100-1000 l.
Papel milimetrado.
Centrifugadora (capacidad: 2500 x g).
MATERIALES DISPONIBLES
INSTRUMENTOS
Existen adaptadores de mtodo/aplicaciones para analizadores especficos bajo peticin.
Para solicitar uno, pngase en contacto con su comercial local.
ALMACENAJE Y ESTABILIDAD
Si se conservan a una temperatura comprendida entre 2-8C, los reactivos no reconstituidos
se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial.
Tras la reconstitucin:
Conservar a 2-8C y utilizarlo dentro de las 4 horas siguientes. El reactivo Activador ya
reconstituido puede conservarse congelado a -20C durante 30 das.
Conservar a 2-8C durante 30 das.
El plasma reconstituido es estable durante una hora si se conserva a 2-8C.
Conservar a 2-8C y utilizarlo dentro de las 4 horas siguientes. El plasma puede
conservarse congelado a -20C durante 30 das.
OBTENCIN Y ALMACENAJE DE MUESTRAS
Se deben obtener nueve volmenes de sangre en un volumen de citrato de sodio al 3,2%
(0,109 M). Inmediatamente despus de obtener las muestras de sangre, las muestras se
centrifugan a 1 500 x g durante 15 minutos. Consulte la versin ms reciente del
documento H21 de CLSI para obtener instrucciones adicionales sobre la obtencin y el
almacenaje de muestras.10
PROCEDIMIENTO
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Todas las unidades de sangre donada empleadas para la fabricacin del reactivo activador,
del plasma libre de Protena S y del plasma de control, se han sometido a pruebas
mediante un mtodo homologado por la FDA y calificadas como no reactivas al antgeno
de superficie de la Hepatitis B (HBsAg), al virus de la Hepatitis C (HCV) y al virus de la
inmunodeficiencia humana del Tipo 1 (VIH-1). Dado que ninguno de los mtodos
analticos actualmente conocidos permite garantizar completamente la ausencia de
HBsAg, HCV, VIH-1 u otros agentes infecciosos, este reactivo debe considerarse como
potencialmente infeccioso y ser tratado segn las recomendaciones aplicables al suero y
a las muestras de sangre humana.
Para garantizar la exactitud y la reproducibilidad de los resultados, se deben utilizar
dispositivos de pipeta calibrados y atenerse exactamente a las indicaciones expuestas
aqu para el procedimiento, en particular las que conciernen a la duracin y las
temperaturas de incubacin.
No utilizar el presente ensayo como nico instrumento de diagnstico. Se deben respetar
las prescripciones estndares relativas a los ensayos coagulativos.
Conservar las diluciones estndar y de muestras sobre hielo mojado y analizar dentro de
los 30 minutos siguientes.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Existen aplicaciones de instrumentos especficos disponibles bajo peticin.
1. Transferir el TriniCLOT PS Activator y el cloruro de calcio de 0,025 M a los pozuelos
de los reactivos calentados a 37C de un coagulmetro. Incubar durante dos minutos
como mnimo.
2. Agregar en una cubeta de coagulacin 0,1 ml de TriniCLOT PS Depleted Plasma y
0,1 ml de plasma de ensayo diluido. Incubar a 37C durante 2 minutos.
3. Agregar en la cubeta 0,1 ml del TriniCLOT PS Activator precalentado. Incubar a 37C
durante 5 minutos exactos.
4. Agregar 0,1 ml de cloruro de calcio de 0,025 M precalentado. Poner en marcha el
cronmetro y anotar el tiempo de coagulacin.
Se recomienda especialmente analizar por duplicado cada muestra del ensayo y cada
control. El resultado final ser el valor medio de los resultados obtenidos.
Calibracin Del Ensayo
Cada vez que se efecte el ensayo es necesario determinar una nueva curva estndar. Para la
preparacin de los estndares de la calibracin de la Protena S se utilizar un pool de plasma
normal (PNP) tomado de la misma manera que las muestras de plasma que deban ser
analizadas. Se deben utilizar 20 donantes normales como mnimo para preparar este PNP.
Se puede utilizar tambin plasma de referencia preparado comercialmente con un nivel
de concentracin de Protena S conocido (por ej. TriniCAL Reference Plasma, n Cat.
T5102).
Inmediatamente antes de proceder a los anlisis, prepare los estndares de Protena S, el
plasma de control y las muestras de plasma de los pacientes segn se indica a
continuacin:
Preparacin manual de diluciones de 1 ml para la curva estndar:
* En el caso de aparatos automticos, el punto ms bajo corresponde a una dilucin
mnima (aprox. 12,5%) y no a un "verdadero" estndar 0%. Consulte la documentacin
especfica del aparato.
Nota: Cuando se utiliza plasma de referencia comercial, se debe utilizar la concentracin
de Protena S asignada en lugar del 100% y para cada dilucin se calcula la actividad de
porcentaje del modo siguiente: valor asignado multiplicado por el factor de dilucin.
Preparacin manual de muestra de 500 l y diluciones de control:
Conservar las diluciones sobre hielo mojado y analizar dentro de los 30 minutos siguientes.
Curva de Calibracin
Trazar en el papel milimetrado la actividad expresada en porcentajes de la Protena S de
los estndares de calibracin (eje x) respecto al tiempo medio de coagulacin (eje y).
Entre los puntos as obtenidos, trazar la recta de regresin. Determinar para las muestras
de los pacientes y muestras de control la actividad porcentual de la Protena S mediante
la interpolacin de los datos obtenidos en la curva estndar. En las muestras de pacientes
con anticoagulante lpico o bien con actividad de Protena S anormalmente elevada, y
para los cuales se han utilizado varias diluciones, corregir el nivel de Protena S segn el
factor de dilucin. Si los niveles de Protena S corregidos continan sin coincidir con los
valores previstos, es muy probable que la muestra del paciente contenga un potente agente
inhibidor que hace imposible determinar la actividad exacta mediante este ensayo.
La curva de calibracin mostrada a continuacin sirve slo de ejemplo. Cada vez que se
efecte un ensayo es necesario crear una nueva curva estndar. No utilice la curva que
aparece como ejemplo a continuacin!
CONTROL DE CALIDAD
El plasma de control de Protena S incluido en el kit puede analizarse como un control
principal o secundario. Los controles debern incluirse cuando se utilicen reactivos recin
reconstituidos. El nivel de concentracin de Protena S obtenida para cada plasma de
control debe encontrarse dentro del rango especificado por el proveedor o el laboratorio.
En caso contrario, debe repetirse el ensayo.
RESULTADOS
RESULTADOS ESPERADOS
El valor de la Protena S se expresa generalmente como un porcentaje relativo del valor
de un plasma estndar o de un plasma normal procedente de un pool. El rango normal de
valores que se espera obtener para la Protena S es de 55-160%.11 Sin embargo, cada
laboratorio deber determinar su propio rango de normalidad.12 En los hombres la
concentracin de Protena S en el plasma es un 10-15% mayor que en las mujeres y esta
concentracin aumenta ligeramente con la edad en ambos sexos.9 La disminucin de la
concentracin de Protena S est asociada a una incidencia mayor de tromboembolismo.13
La disminucin de la actividad de la Protena S no indica necesariamente una disminucin
del nivel de concentracin de Protena S en el plasma. La Protena S total se halla presente
en el plasma como protena libre y como protena ligada a C4b (C4bBP). nicamente la
Protena S libre acta como cofactor para la Protena C activada. Si la actividad de la
Protena S disminuye, es importante determinar los niveles de concentracin en el plasma
tanto de Protena S libre como de Protena S ligada a C4bBP. Los tres tipos conocidos de
deficiencias congnitas de Protena S se han descrito, segn los niveles de concentracin
relativos de actividad de Protena S, Protena S libre, Protena S total.14
Los niveles de concentracin de Protena S pueden disminuir tambin en el caso de
afecciones hepticas y durante un tratamiento con anticoagulantes. Por otra parte, la
actividad de la Protena S y el antgeno de la Protena S libre pueden verse reducidos en
el caso de una afeccin inflamatoria con niveles de concentracin de C4bBP elevados.
CARACTERSTICAS DEL ENSAYO
La presencia de heparina en la muestra en concentraciones superiores a 1,2 U/ml, as
como la presencia de anticoagulante lpico puede influir en el resultado del ensayo y
prolongar el tiempo de coagulacin, dando lugar en consecuencia a un valor de Protena
S artificialmente elevado. Analizar estas muestras con diluciones mltiples. La presencia
de una mutacin Leiden del Factor V en el paciente puede incidir en los mtodos
funcionales para la determinacin de la Protena S.
Para garantizar la exactitud y la reproducibilidad de los resultados, se deben utilizar
dispositivos de pipeta calibrados y atenerse exactamente a las indicaciones expuestas aqu
para el procedimiento, en particular las que conciernen a la duracin y las temperaturas de
incubacin. No utilice el presente ensayo como nico instrumento de diagnstico. Se deben
respetar las prescripciones estndares relativas a los ensayos coagulativos.
El usuario deber establecer las caractersticas de ejecucin del producto en funcin de
cada mtodo e instrumento especfico que utilice. En estudios realizados con un
analizador automtico con deteccin foto-ptica se obtuvieron los resultados que se
muestran ms abajo.
Exactitud
En un estudio realizado con otro kit disponible en el mercado de Protena S, se obtuvo un
coeficiente de correlacin de 0,868 para 78 muestras analizadas, con una recta de
regresin de y = 0,913x + 17,2.
Precisin
Se observaron los siguientes coeficientes de variacin (CV):
Sensibilidad
Conforme a las indicaciones de trazado, TriniCLOT Protein S mantiene una curva estndar
lineal entre 0 y 100%.
ITALIANO
INDICAZIONI D'USO
TriniCLOT Protein S utilizzato per la determinazione quantitativa dell'attivit della
Proteina S nel plasma umano.
RIEPILOGO E PRINCIPIO
Il dosaggio TriniCLOT Protein S un test plasmatico basato sul principio della
coagulazione. Nel dosaggio, diluizioni di campioni di plasma prelevati da pazienti vengono
miscelati con plasma privo di Proteina S. Un reagente contenente Fattore Xa, Proteina C
attivata e fosfolipidi viene aggiunto alla miscela. In seguito ad un periodo dincubazione
della durata di 5 minuti, viene aggiunto cloruro di calcio per dare inizio alla formazione
del coagulo. In queste condizioni, il prolungamento del tempo di coagulazione
direttamente proporzionale alla concentrazione di Proteina S presente nei campioni di
plasma dei pazienti.
DiScipio et al1 identificarono per primi la Proteina S (S sta per Seattle) umana nel 1977.
La Proteina S umana una glicoproteina a catena singola composta da 635 amminoacidi
(69 000 kD) che circola nel plasma ad una concentrazione di circa 320 nM. Il gene attivo
della Proteina S presenta 15 esoni e si estende per pi di 80 kilobasi sul Cromosoma 3.2
La Proteina S una Proteina Vitamina K-dipendente sintetizzata principalmente nel fegato
ma anche nell'endotelio e probabilmente nei megacariociti. possibile che le tre fonti da
cui deriva la Proteina S svolgano tutte un importante ruolo nella regolazione dell'emostasi.
La Proteina S non sembrava essere il precursore zimogeno di una proteinasi serinica e la
sua funzione rimasta ignota fino al 1980 quando Walker3 riport che la Proteina S bovina
funge da cofattore per la Proteina C attivata nel processo di inattivazione del Fattore V
attivato. Studi clinici confermarono ben presto l'importanza biologica della regolazione
della coagulazione da parte della via coagulativa che coinvolge la Proteina C, la Proteina
S e la trombomodulina. In certe famiglie stata documentata un'associazione tra trombosi
e carenza parziale di Proteina S.4,5,6 La Proteina S stata inoltre riscontrata sulla superficie
delle cellule endoteliali e nelle piastrine.7 All'incirca il 60% della Proteina S presente nel
plasma umano coniugata alla proteina C4b e pertanto i livelli plasmatici di Proteina S
possono non riflettere completamente la sua biodisponibilit.8 Questo complesso non
presenta alcuna attivit di cofattore anticoagulante. Si suppone che la Proteina S possa
essere implicata nel sistema del complemento mediando l'associazione tra la proteina
legante la C4b e le superfici cellulari che, in seguito a danneggiamento o attivazione,
espongono fosfolipidi a carica negativa.9 Ci potrebbe rappresentare un altro importante
meccanismo di regolazione della Proteina S.
REAGENTE
Per uso diagnostico in vitro.
DESCRIZIONE DEL REAGENTE
Ogni flacone contiene 1 ml di materiale liofilizzato contenente Proteina C umana attivata,
Fattore Xa bovino e fosfolipidi da cervello di coniglio.
TriniCLOT PS Dilution Buffer (10X Concentrate), 2 x 2,5 ml, T1602B
Ogni flacone contiene 2,5 ml di concentrato che, una volta ricostituito, contiene 0,2 M
di NaCl, 0,03 M di HEPES ed una quantit di Polybrene sufficiente per neutralizzare fino
a 1,2 U/ml di eparina in un campione di plasma.
Ogni flacone contiene 0,5 ml di plasma umano normale citratato liofilizzato.
Ogni flacone contiene 1 ml di plasma umano liofilizzato che stato privato di Proteina S
tramite immunoassorbimento su una colonna di anticorpi di capra immobilizzati diretti
contro la Proteina S umana.
PREPARAZIONE DEL REAGENTE
Ricostituire con 1 ml di acqua deionizzata di Tipo I. Per garantire una completa
dissoluzione, lasciare riposare a temperatura ambiente (18-25C) per 20 minuti.
Diluire il contenuto di un flacone con 25 ml di acqua deionizzata di Tipo I.
Ricostituire con 0,5 ml di acqua deionizzata di Tipo I. Miscelare delicatamente e lasciare
riposare a temperatura ambiente (18-25C) per 20 minuti per garantire una completa
dissoluzione. Trasferire in una provetta di plastica.
Ricostituire con 1 ml di acqua deionizzata di Tipo I. Miscelare delicatamente e lasciare
riposare a temperatura ambiente (18-25C) per 20 minuti per garantire una completa
dissoluzione.
SOSTANZE AGGIUNTIVE RICHIESTE
Analizzatore automatico per l'esecuzione di test coagulativi con metodo foto-ottico,
coagulometro meccanico oppure cronometro
Soluzione di cloruro di calcio da 0,025 M
Acqua deionizzata di Tipo I
Incubatore o bagnomaria regolato a 37C
Cilindro graduato da 25 ml
Pipetta per la dispensazione di volumi variabili da 100 a 1000 l
Carta millimetrata
Centrifuga (capacit: 2500 x g)
SOSTANZE DISPONIBILI
STRUMENTI
Su richiesta sono disponibili adattamenti metodologici e applicazioni per i singoli
analizzatori. Rivolgersi al rappresentante di fiducia.
CONSERVAZIONE E STABILIT
Se conservati ad una temperatura compresa tra 2-8C, i reagenti non ricostituiti si
mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta del flacone.
Dopo la ricostituzione:
Conservare a 2-8C ed utilizzare entro 4 ore. Il reagente Attivatore ricostituito pu
essere conservato congelato a -20C per 30 giorni.
Conservare a 2-8C per 30 giorni.
Se conservato ad una temperatura compresa tra 2-8C, il plasma ricostituito si
mantiene stabile per un'ora.
Conservare a 2-8C ed utilizzare entro 4 ore. Il plasma pu essere conservato
congelato a -20C per 30 giorni.
RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Nove volumi di sangue devono essere raccolti in un volume di citrato di sodio al 3,2%
(0,109 M). Immediatamente dopo la raccolta del sangue, i campioni vengono
centrifugati a 1 500 x g per 15 minuti. Fare riferimento alla versione pi recente del
documento CLSI H21 per ulteriori istruzioni relative alla raccolta e alla conservazione
dei campioni.10
PROCEDURA
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Ciascuna unit di sangue donato, utilizzata nella preparazione del reagente attivatore,
del plasma privo di Proteina S e del plasma di controllo, stata testata con un metodo
approvato dalla FDA ed risultata non reattiva per l'antigene di superficie del virus
dell'epatite B (HBsAg), del virus dell'epatite C (HCV) e del virus dell'immunodeficienza
umana di Tipo 1 (HIV-1). Nessuno dei metodi analitici conosciuti pu escludere in modo
assoluto la presenza di HBsAg, HCV, HIV-1 o di altri agenti infettivi; si raccomanda
pertanto di trattare questo reagente come se fosse siero o campione di sangue umano
potenzialmente infettivo e di adottare di conseguenza le necessarie misure di sicurezza.
Per garantire risultati accurati e riproducibili, utilizzare dispensatori calibrati ed attenersi
alle procedure raccomandate, in particolar modo per quanto riguarda i tempi e le
temperature di incubazione.
Non utilizzare il presente test quale unico strumento di diagnosi; esso va affiancato da
test coagulativi standard.
Conservare le diluizioni standard e di campioni in ghiaccio fondente ed analizzare entro
30 minuti.
PROCEDURA DI TEST
Applicazioni specifiche per determinati strumenti sono disponibili su richiesta.
1. Trasferire il TriniCLOT PS Activator e il cloruro di calcio da 0,025 M nei pozzetti
reagenti termostatati a 37C di un coagulometro. Incubare per almeno due minuti.
2. Dispensare in una cuvetta di coagulazione 0,1 ml di TriniCLOT PS Depleted Plasma
e 0,1 ml di plasma diluito. Incubare per 2 minuti a 37C.
3. Aggiungere nella cuvetta 0,1 ml di TriniCLOT PS Activator preriscaldato. Incubare per
5 minuti esatti a 37C.
4. Aggiungere 0,1 ml di cloruro di calcio da 0,025 Mpreriscaldato. Avviare il cronometro
e registrare il tempo di coagulazione.
Analizzare in duplicato ciascun campione del test e ciascun controllo. Il risultato finale
il valore medio dei risultati ottenuti.
Calibratura di Analisi
Ogni volta che si esegue il dosaggio necessario costruire una nuova curva standard. Per
la preparazione degli standard di calibratura della Proteina S va utilizzato un pool di
plasma normale (PNP) che sia stato prelevato allo stesso modo dei campioni di plasma
da analizzare. Usare almeno 20 donatori normali per la preparazione del PNP.
Pu essere anche utilizzato plasma di riferimento preparato in commercio con
concentrazione nota di Proteina S (TriniCAL Reference Plasma Cat no. T5102).
Preparare gli standard Proteina S, il plasma di controllo ed i campioni di plasma dei
pazienti subito prima dell'analisi procedendo come descritto di seguito:
Preparazione manuale di diluizioni di 1 ml per curva standard:
* Su strumenti automatici, il punto pi basso corrisponde ad una diluizione minima (ca.
12,5%) e non ad un "vero" standard 0%. Fare riferimento alla documentazione specifica
dello strumento.
Nota: In caso di uso di plasma di riferimento disponibile in commercio, deve essere
usata la concentrazione di Proteina S assegnata invece del 100%, e per ogni diluizione
la percentuale di attivit dovrebbe essere calcolata come descritto di seguito: valore
assegnato moltiplicato per il fattore di diluizione.
Preparazione manuale di un campione di 500 l e di diluizioni di controllo:
Conservare le diluizioni in ghiaccio fondente ed analizzare entro 30 minuti.
Curva di Calibratura
Tracciare su carta millimetrata lineare l'attivit espressa in percentuale della Proteina S
degli standard di calibrazione (asse x) rispetto al tempo di coagulazione medio (asse y).
Tracciare la retta di regressione (minimi quadrati). Determinare per i campioni dei
pazienti e di controllo l'attivit percentuale della Proteina S per interpolazione in base
alla curva standard. Nei campioni di pazienti con lupus anticoagulante o con attivit di
Proteina S patologicamente elevata, per i quali sono state utilizzate diluizioni multiple,
correggere il livello di Proteina S in base al fattore di diluizione. Se i livelli di Proteina
S corretti continuano a non corrispondere ai valori previsti, molto probabile che nel
campione del paziente sia presente un inibitore estremamente forte che rende
impossibile determinarne con questo dosaggio l'attivit esatta.
La curva di calibrazione sotto riportata solo a scopo esemplificativo. Ogni volta che si
esegue il dosaggio necessario costruire una nuova curva standard. Non utilizzare
lesempio di curva sotto riprodotta.
CONTROLLO QUALIT
Il plasma di controllo Proteina S contenuto nel kit pu essere usato come controllo
primario o secondario. I controlli devono essere inclusi ogniqualvolta vengano utilizzati
reagenti ricostituiti di fresco. Il livello di Proteina S ottenuto per ciascun plasma di
controllo deve rientrare nel range specificato dal venditore o dal laboratorio. Se i
campioni di controllo di qualit non riportano livelli di Proteina S contenuti nel range
specificato, per il plasma di riferimento, la seduta analitica deve essere ripetuta.
RISULTATI
RISULTATI PREVISTI
Il valore di Proteina S viene solitamente espresso come percentuale relativa in rapporto
al valore di uno standard o di pool di plasma normale. Il range di normalit atteso per la
Proteina S 55-160%.11 Tuttavia, ciascun laboratorio deve determinare il proprio range
di normalit.12 La concentrazione di Proteina S nel plasma dei maschi del 10-15%pi
elevata che non nelle femmine e la concentrazione tende ad aumentare in entrambi I
sessi con il progredire dell'et.9 Una diminuzione di Proteina S associata ad una
maggiore incidenza di tromboembolismo.13 Una riduzione dell'attivit della Proteina S non
indica necessariamente una riduzione della concentrazione della Proteina S nel plasma.
La Proteina S (totale) presente nel plasma come proteina libera e proteina legante la
C4b (C4bBP). Soltanto la frazione libera della Proteina S funge da cofattore per la
Proteina C attivata. In presenza di attivit ridotta della Proteina S, importante stabilire
i livelli plasmatici sia della Proteina S libera che della Proteina S legata a C4bBP. Sono
stati descritti tre tipi di carenza congenita da Proteina S, in base ai livelli relativi
dell'attivit della Proteina S, alla Proteina S libera, alla Proteina S totale.14
I livelli di Proteina S possono inoltre essere ridotti in presenza di epatopatia e nel corso
di terapia anticoagulante. Inoltre, l'attivit della Proteina S e l'antigene della Proteina
S libera possono risultare ridotti in concomitanza di malattia infiammatoria caratterizzata
da livelli elevati di C4bBP.
CARATTERISTICHE
La presenza di eparina a concentrazioni superiori a 1,2 U/ml oppure la presenza di lupus
anticoagulante pu interferire con i risultati del dosaggio prolungando il tempo di
coagulazione, dando luogo di conseguenza ad un valore artificialmente elevato di
Proteina S. Analizzare tali campioni a diluizioni multiple. La presenza di mutazione
Leiden del Fattore V pu incidere sui dosaggi funzionali della Proteina S.
Per garantire risultati accurati e riproducibili, utilizzare dispensatori calibrati ed attenersi
alle procedure raccomandate, in particolar modo per quanto riguarda i tempi e le
temperature di incubazione. Non utilizzare il presente test quale unico strumento di
diagnosi; esso va affiancato da test coagulativi standard.
Spetta all'utente finale stabilire le caratteristiche di prestazione del prodotto
relativamente al metodo specifico o alla strumentazione impiegata. Di seguito si
TriniCLOT PS Dilution Buffer Reference Plasma or PNP Protein S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l of 100% standard 50
1000 l - 0*
CV (%)
Normal plasma
(Protein S = 87%)
Abnormal plasma
(Protein S = 42%)
Intra-Assay 3.0 2.3
Inter-Assay 5.9 5.1
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
TriniCLOT PS Dilution Buffer Plasma de rfrence ou PPN Protine S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l de l'talon 100% standard 50
1 000 l - 0*
Plasma TriniCLOT PS Dilution Buffer
50 l 450 l
CV (%)
Plasma normal
(Protine S = 87%)
Plasma anormal
(Protine S = 42%)
Intra-essai 3,0 2,3
Inter-essai 5,9 5,1
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
TriniCLOT PS Dilution Buffer Referenzplasma oder PNP Protein S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l von 100%-Standard 50
1 000 l - 0*
50 l 450 l
VK (%)
Normalplasma
(Protein S = 87%)
Abnormes Plasma
(Protein S = 42%)
Innerhalb des Testlaufs 3,0 2,3
Zwischen den Testlufen 5,9 5,1
VK (%)
Plasma normal
(Protena S = 87%)
Plasma anormal
(Protena S = 42%)
Intraensayo 3,0 2,3
Interensayo 5,9 5,1
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
TriniCLOT PS Dilution Buffer Plasma di riferimento o PNP Proteina S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l di standard 100% 50
1 000 l - 0*
50 l 450 l
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
D
ure de coagulation (sec)
G
erinnungszeit (sek)
Tiem
po de coagulacin (seg)
50 l 450 l
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
TriniCLOT PS Dilution Buffer Plasma de referencia o PNP Protena S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l de estndar 100% 50
1 000 l - 0*
50 l 450 l
Tem
po di coagulaz. (sec)
riportano i risultati ottenuti da studi condotti utilizzando un analizzatore automatico con
metodo di rilevazione foto-ottico.
Accuratezza
Da uno studio eseguito utilizzando un altro kit per la Proteina S disponibile in commercio
stato ottenuto un coefficiente di correlazione di 0,868 per 78 campioni analizzati,
con un'equazione di regressione di y = 0,913x + 17,2.
Precisione
Si sono ottenuti i seguenti coefficienti di variazione (CV):
Specifit
Il dosaggio TriniCLOT Protein S stato messo a punto per fornire una curva standard
lineare per i livelli di Proteina S compresi tra lo 0 ed il 100%, se tracciata seguendo le
istruzioni summenzionate.

TriniCLOT Protein S
S .

TriniCLOT Protein S
. ,
S.
Xa, C
. 5 ,
. ,

S .
DiScipio ..1 S
( S Seattle) 1977.
S 635
(69 000 kD) 320 nM .
S 15 80
3.2 S
,
.
S .
S
1980 Walker3
S
C
V. C,
S
.

S.4,5,6 S
.7 60%
S
C4b. , S
.8
.
S

C4b
.9

S.
in vitro

1 ml
C, Xa
.
TriniCLOT PS Dilution Buffer ( 10X), 2 x 2,5 ml, T1602B
2,5 ml
, , 0,2 M NaCl, 0,03 M HEPES
Polybrene 1,2 U/ml
.
0,5 ml
.
1 ml
S
S.

1 ml I.
(18-25C) 20
, .
25 ml
I.
0,5 ml I.

(18-25C) 20 , .
.
1 ml I.

(18-25C) 20 , .

0,025 M
I
37C
25 ml
100-1000 l

( 2500 x g)

/
. ,
.

,
,
2-8C.
:
2-8C 4 .

-20C 30 .
2-8C 30 .
,
2-8C.
2-8C 4 .
-20C 30 .

3,2% (0,109 M). ,
1 500 x g 15 .
CLSI H21
.10

, S

FDA
B (HBsAg), C (HCV)
1 (HIV-1).
HBsAg,
HCV, HIV-1 ,

.

,

.

.
.

30 .

.
1. TriniCLOT PS Activator 0,025 M
37C
. .
2. 0,1 ml TriniCLOT PS Depleted Plasma 0,1 ml
. 2
37C.
3. 0,1 ml TriniCLOT PS Activator .
5 37C.
4. 0,1 ml 0,025 M.
.
.
.

. (PNP),
,

S. PNP
20 .
,
S (TriniCAL Reference Plasma,
. T5102).
S
:
1 ml :
* ,
( 12,5%) 0%.
.
: ,
S
100%,
: .
500 l:

30 .

S
( x) ( y)
(mm)
. ,
S
.
S, ,
S .
S ,
,

.
.

. .

S
.
,
. S

.
S
,
.

S

. S
55-160%.11 ,
.12 S
10-15%
.9
S
.13 S
S .
() S
C4b (C4bBP).
S
C. S,
S
S C4bBP.
S
S, S
S.14
, S
, .
, S
S
C4bBP.

1,2 U/ml

S.
.
S
V Leiden.

,

.
.
.

.

.
S
0,868 78
, y = 0,913x + 17,2.
(CV):
TriniCLOT Protein S
S 0 100%
.
PORTUGUS
UTILIZAO PREVISTA
O TriniCLOT Protein S destina-se determinao quantitativa da actividade da Protena S no
plasma humano.
RESUMO E PRINCPIO
O teste TriniCLOT Protein S um ensaio de plasma baseado na formao de cogulo.
No ensaio, so misturadas diluies de plasma do paciente com plasma sem Protena
S. Um reagente contendo Factor Xa, Protena C activada e fosfolpidos adicionado
mistura. Aps um perodo de 5 minutos de incubao, adicionado cloreto de clcio
para iniciar a formao de cogulos. Nestas condies, o aumento do tempo de
coagulao directamente proporcional concentrao de Protena S no plasma do
paciente.
DiScipio et al1 foram os primeiros a identificar a Protena S (S de Seattle) em 1977.
A Protena S humana uma glicoprotena de cadeia nica de 635 aminocidos
(69 000 kD) que circula no plasma numa concentrao de cerca de 320 nM. O gene
da Protena S activa tem 15 exes e ocupa mais de 80 kilobases no Cromossoma 3.2
A Protena S uma protena dependente da Vitamina K, sintetizada principalmente no
fgado, mas tambm no endotlio e possivelmente nos megacaricitos. possvel que
estas trs fontes de Protena S desempenhem um papel significativo na regulao da
hemstase.
A Protena S no parecia ser o precursor do zimogneo da protease serina e no era
conhecida nenhuma funo at 1980 quando Walker3 revelou que a Protena S bovina
funciona como cofactor da Protena C na inactivao do Factor V activado. A importncia
biolgica da regulao da coagulao pela via que envolve a Protena C, a Protena S e
a trombomodulina foi rapidamente substanciada por estudos clnicos. Foi documentada
uma associao entre trombose e deficincias parciais da Protena S em algumas
famlias.4,5,6 A Protena S foi tambm encontrada na superfcie de clulas endoteliais e
nas plaquetas.7 Aproximadamente 60% da Protena S do plasma humano est
estreitamente ligado protena de ligao ao C4b. Assim, os nveis plasmticos de
Protena S podem no reflectir completamente a sua biodisponibilidade.8 Este complexo
no apresenta actividade de cofactor anticoagulante. Os estudos sugerem que a Protena
S pode desempenhar um papel no sistema complementar, mediando a associao da
protena de ligao ao C4b s superfcies celulares danificadas ou activadas para expor
fosfolpidos carregados negativamente.9 Isto pode representar outro mecanismo
regulador importante para a Protena S.
REAGENTE
Para uso em diagnstico in vitro
DESCRIO DO REAGENTE
Cada frasco contm 1 ml de material liofilizado contendo Protena C humana activada,
Factor Xa bovino e fosfolpido de crebro de coelho.
TriniCLOT PS Dilution Buffer (10X Concentrate), 2 x 2,5 ml, T1602B
Cada frasco contm 2,5 ml concentrados para diluio da amostra, que, aps
reconstituio, contm 0,2 M NaCl, 0,03 M HEPES e uma quantidade suficiente de
Polybrene para neutralizar at 1,2 U/ml de heparina numa amostra de plasma.
Cada frasco contm 0,5 ml de plasma humano normal citratado liofilizado.
Cada frasco contm 1 ml de plasma humano liofilizado ao qual se retirou a Protena S por
imunoadsoro numa coluna de anticorpos caprinos imobilizados para a Protena S humana.
PREPARAO DO REAGENTE
1. TriniCLOT PS Activator Reagent
Reconstituir com 1 ml de gua desionizada de Tipo I. Deixar repousar temperatura
ambiente (18-25C) durante 20 minutos para uma dissoluo completa.
2. TriniCLOT PS Dilution Buffer
Diluir o contedo de um frasco em 25 ml de gua desionizada de Tipo I.
3. TriniCLOT PS Control Plasma
Reconstituir com 0,5 ml de gua desionizada de Tipo I. Homogeneizar suavemente e
deixar repousar temperatura ambiente (18-25C) durante 20 minutos para uma
dissoluo completa. Transferir para um tubo de ensaio de plstico.
4. TriniCLOT PS Depleted Plasma
Reconstituir com 1 ml de gua desionizada de Tipo I. Homogeneizar suavemente e
deixar repousar temperatura ambiente (18-25C) durante 20 minutos para uma
dissoluo completa.
MATERIAIS ADICIONAIS NECESSRIOS
Analisador de coagulao foto-ptico automtico ou temporizador de coagulao mecnico
ou cronmetro
Soluo de cloreto de clcio 0,025 M
gua desionizada de Tipo I ou equivalente
Incubadora ou banho de gua a 37C
Proveta graduada de 25 ml
Pipeta de volume varivel de 100-1000 l
Papel milimtrico
Centrifugadora (com capacidade para 2500 x g)
MATERIAIS DISPONVEIS
INSTRUMENTOS
Esto disponveis aplicaes/adaptaes do mtodo para analisadores individuais, a
pedido; contacte o seu representante local.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Antes da reconstituio, os reagentes mantm a sua estabilidade at data de validade
indicada no rtulo do frasco, quando armazenados a 2-8C.
Aps reconstituio:
Armazenar a 2-8C e utilizar nas 4 horas seguintes. O reagente activador reconstitudo
pode ser congelado a -20C durante 30 dias.
Armazenar a 2-8C durante 30 dias.
O plasma reconstitudo mantm a sua estabilidade durante uma hora, quando
armazenado a 2-8C.
Armazenar a 2-8C e utilizar nas 4 horas seguintes. O plasma pode ser congelado a
-20C durante 30 dias.
COLHEITA E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS
So colhidos nove volumes de sangue num volume de 3,2% (0,109 M) citrato de sdio.
Imediatamente aps a colheita de sangue, as amostras so centrifugadas a 1 500 x g
durante 15 minutos. Consulte a verso mais recente do documento CLSI H21 para obter
mais instrues relativamente colheita e armazenamento de amostras.10
PROCEDIMENTO
ADVERTNCIAS E PRECAUES
Cada unidade de dador utilizada na preparao do reagente activador, bem como os
plasmas sem protena e de controlo foram testados mediante um mtodo licenciado da
FDA e revelaram no ser reactivos a antignios de superfcie do vrus da Hepatite B (HBsAg),
Hepatite C (VHC) e da Imunodeficincia Humana Tipo 1 (VIH-1). Dado que nenhum mtodo
de teste pode assegurar com toda a certeza a inexistncia de HBsAg, VHC, VIH-1 ou outros
agentes infecciosos, este reagente devem ser manuseado de acordo com as recomendaes
aplicveis a qualquer amostra de soro ou sangue humano potencialmente infeccioso.
Para assegurar resultados exactos e reproduzveis, utilize pipetas calibrados e cumpra os
procedimentos recomendados, com especial realce para os tempos e temperatura de
incubao.
Este teste no deve ser utilizado como nico meio de diagnstico. Deve ser seguido um
esquema de testes standard de coagulao.
As diluies de padro e de amostras devem ser armazenadas em gelo seco e testadas nos
30 minutos seguintes.
PROCEDIMENTO DE TESTE
Esto disponveis aplicaes especficas do instrumento, a pedido.
1. Transfira o TriniCLOT PS Activator e o cloreto de clcio 0,025 M para dentro dos poos
de reagente a 37C do analisador de coagulao. Incube durante dois minutos, no
mnimo.
2. Adicione uma diluio de 0,1 ml de TriniCLOT PS Depleted Plasma e 0,1 ml de plasma
de teste a uma cuvete de coagulao. Incube durante 2 minutos a 37C.
3. Adicione 0,1 ml de TriniCLOT PS Activator pr-aquecido cuvete. Incube durante
exactamente 5 minutos a 37C.
4. Adicione 0,1 ml de cloreto de clcio 0,025 Mpr-aquecido. Inicie o analisador e registe
o tempo de coagulao.
Recomenda-se que cada amostra de teste e de controlo seja testada em duplicado. O
resultado final ser a mdia dos resultados duplicados.
Calibrao Do Ensaio
Deve ser criada uma nova curva padro de cada vez que o ensaio efectuado. Deve ser
utilizada um pool de plasma normal (PPN), recolhida mediante o mesmo procedimento
que o plasma de teste, para a preparao dos padres de calibrao da Protena S. Para
a preparao deste PPN, devem ser utilizados pelo menos 20 dadores normais.
Poder tambmser utilizado plasma de referncia, preparado para fins comerciais, emque
se determinou o nvel de Protena S (TriniCAL Reference Plasma Cat no. T5102).
Prepare os padres de Protena S, as amostras de controlo e de plasma de pacientes
imediatamente antes do teste, da seguinte forma:
Preparao manual de diluies de 1 ml para uma curva padro:
*Emanalisadores automticos, o ponto mais baixo ser uma diluio mnima (cerca de 12,5%)
e no um padro "verdadeiro" de 0%. Consulte a documentao especfica do analisador.
Nota: Se utilizar plasma de referncia disponvel comercialmente, dever ser utilizada a
concentrao de Protena S atribuda emvez de 100%, e para cada diluio a actividade em
%dever ser calculada da seguinte forma: valor atribudo multiplicado pelo factor de diluio.
Preparao manual de diluies de amostra e de controlo de 500 l:
Armazene as diluies em gelo seco e teste nos 30 minutos subsequentes.
Curva de Calibrao
Faa o traado da actividade da Protena S dos padres de calibrao (eixo x) versus tempo
de coagulao mdio (eixo y) em papel milimtrico linear. Desenhe a linha que melhor liga
os pontos resultantes. Para as amostras de pacientes e de controlo, determine a
percentagem de actividade da Protena S, interpolando a partir da curva padro. Nos
pacientes com anticoagulante de lpus ou com uma actividade anormalmente elevada da
Protena S, para os quais foram utilizadas mltiplas diluies, corrija o nvel de Protena
S com o factor de diluio. Se os nveis de Protena S corrigidos continuarem a no ser
concordantes, muito provvel que a amostra de paciente tenha um inibidor muito forte,
para o qual no possvel determinar um nvel exacto de actividade com este ensaio.
A curva de calibrao apresentada abaixo apenas um exemplo. Os utilizadores devero
criar uma nova curva padro sempre que o ensaio for efectuado. No utilize o exemplo de
curva apresentado abaixo.
CONTROLO DE QUALIDADE
O plasma de controlo da Protena S includo no kit pode ser utilizado como controlo
primrio ou secundrio. Os controlos s devem ser includos se utilizar reagentes recm-
reconstitudos. O nvel de Protena S obtido para cada plasma de controlo deve estar
compreendido no intervalo especificado pelo fornecedor ou pelo laboratrio. Se as
amostras de controlo de qualidade no produzirem nveis de Protena S situados dentro
dos intervalos especificados para qualquer plasma de referncia, em algum dos ensaios,
o ensaio dever ser repetido.
RESULTADOS
RESULTADOS PREVISTOS
O valor da Protena S habitualmente expresso sob a forma de percentagem relativa,
por comparao com o valor de um plasma padro ou um pool de plasma normal. O
intervalo normal esperado para a Protena S de 55-160%.11 Contudo, cada laboratrio
dever determinar o seu prprio intervalo normal.12 Os homens tm 10-15% mais
Protena S plasmtica que as mulheres e a concentrao aumenta ligeiramente, em
ambos os sexos, com a idade.9 Uma diminuio da Protena S est associada a uma
maior incidncia de tromboembolismo.13 Uma diminuio da actividade da Protena S
no indica necessariamente uma diminuio da concentrao plasmtica de Protena S.
A Protena S (total) est presente no plasma sob a forma de protena livre e de protena
ligada protena de ligao ao C4b (C4bBP). S a Protena S livre funciona como cofactor
para a Protena C activada. Quando h diminuio da actividade da Protena S,
importante estabelecer os nveis plasmticos tanto da Protena S como da Protena S
ligada a C4bBP. Foram descritos trs tipos de deficincia congnita de Protena S,
consoante os nveis relativos de actividade da Protena S, da Protena S livre e da Protena
S total.14
Os nveis de Protena S podem ainda diminuir em caso de doena heptica e durante a
teraputica com antigoagulantes. Alm disso, a actividade da Protena S e o antignio da
Protena S livre pode ser reduzida em caso de doena inflamatria, em que os nveis de
C4bBP so elevados.
COMPORTAMENTO FUNCIONAL
A presena de um nvel de heparina superior a 1,2 U/ml ou de anticoagulantes de lpus
na amostra pode interferir nos resultados do ensaio, prolongando o tempo de
coagulao e produzindo um valor artificialmente elevado de Protena S. Teste estas
amostras com mltiplas diluies. Os mtodos funcionais para a Protena S podem ser
influenciados pela presena de uma mutao do Factor V de Leiden.
Para assegurar resultados exactos e reproduzveis, utilize pipetas calibradas e cumpra os
procedimentos recomendados, com especial realce para os tempos e temperatura de
incubao. Este teste no deve ser utilizado como nico meio de diagnstico. Deve ser
seguido um esquema de testes standard de coagulao.
O utilizador final dever estabelecer caractersticas de desempenho do produto para o
mtodo ou kit especfico utilizado. Os estudos efectuados com um analisador automtico
com deteco foto-ptica produziram os resultados apresentados abaixo.
Exactido
Um estudo realizado com outro kit de Protena S comercialmente disponvel produziu um
coeficiente de correlao de 0,868 em 78 amostras testadas, com uma equao de
regresso de y = 0,913x + 17,2.
Preciso
Observaram-se os seguintes coeficientes de variao (CV):
Sensibilidade
O TriniCLOT Protein S foi concebido para produzir uma curva padro linear para nveis de
Protena S entre 0 e 100%, quando traado conforme definido.
POLSKI
PRZEZNACZENIE
Test TriniCLOT Protein S jest przeznaczony do ilociowego oznaczania aktywnoci
biaka S w ludzkim osoczu.
OPIS I ZASADY DZIAANIA
Test TriniCLOT Protein S jest oparty na analizie procesu krzepnicia osocza. W
niniejszym badaniu rozcieczone roztwory osocza pacjenta s mieszane z osoczem
pozbawionymbiaka S. Nastpnie do mieszaniny dodawany jest odczynnik zawierajcy
czynnik Xa, aktywne biako C i fosfolipidy. Po 5 minutowej inkubacji do roztworu zostaje
dodany chlorek wapnia, aby rozpocz proces formowania skrzepu. W tych warunkach
wyduenie czasu krzepnicia jest wprost proporcjonalne do stenia biaka S w osoczu
pacjenta.
DiScipio i wsppracownicy1 jako pierwsi zidentyfikowali ludzkie biako S (S od pierwszej
litery nazwy miasta Seattle) w 1977 r. Biako S jest jednoacuchow gilkoprotein
skadajc si z 635 aminokwasw (masa 69 000 kD), ktra kry w osoczu w steniu
okoo 320 nM. Gen biaka S skada si z 15 egzonw i obejmuje wicej ni 80 kilozasad
na chromosomie 3.2 Biako S jest zalen od witaminy K protein syntetyzowan gwnie
w wtrobie, ale rwnie w rdbonku i prawdopodobnie w megakariocytach. Jest
moliwe, e wszystkie trzy rda biaka S maj istotne znaczenie w regulacji
hemostazy.
Okazao si, e biako S nie jest prekursorem proteinazy serynowej, a jego funkcja
zostaa poznana dopiero w 1980 r., kiedy Walker3 ogosi, e woowe biako S spenia
rol kofaktora dla aktywnego biaka C w procesie inaktywacji aktywowanego czynnika
V. Wkrtce potembiologiczne znaczenie regulacji krzepnicia drog dziaania biaka C,
biaka S i trombomoduliny zostao potwierdzone wynikami bada klinicznych. W
niektrych rodzinach udokumentowano zwizek pomidzy zakrzepic i czciowym
niedoborem biaka S.4,5,6 Biako S zostao rwnie znalezione na powierzchni komrek
rdbonka i pytek krwi.7 U czowieka okoo 60% osoczowego biaka S jest cile
poczone z biakiem wicym C4b. Zatem osoczowe poziomy biaka S mog nie w
peni odzwierciedla jego biodostpno.8 Ten kompleks biakowy nie posiada
aktywnoci antykoagulacyjnej kofaktora. Zasugerowano, i biako S moe odgrywa
rol w ukadzie dopeniacza, poredniczc w poczeniu pomidzy biakiem wicym
C4b a powierzchniami komrek, ktre zostay uszkodzone lub pobudzone do
odsonicia ujemnie naadowanych fosfolipidw.9 Moe to wskazywa na inny wany
mechanizm regulacyjny, w ktrym bierze udzia biako S.
ODCZYNNIK
Do diagnostyki in vitro
OPIS ODCZYNNIKA
Kada fiolka zawiera 1 ml liofilizowanego materiau z ludzkim aktywnym biakiem C,
woowym czynnikiem Xa i krliczym fosfolipidem mzgowym.
TriniCLOT PS Dilution Buffer (10X stony), 2 x 2,5 ml, T1602B
Kada fiolka zawiera 2,5 ml koncentratu, ktre po rozcieczeniu zawieraj 0,2 M NaCl,
0,03 M HEPES i odpowiedni ilo Polybrene, aby zneutralizowa do 1,2 U/ml
heparyny w prbce osocza.
Kada fiolka zawiera 0,5 ml liofilizowanego prawidowego osocza ludzkiego z
dodatkiem cytrynianu.
Kada fiolka zawiera 1 ml liofilizowanego ludzkiego osocza, ktre zostao pozbawione
biaka S metod immunoadsorpcji z zastosowaniem kolumny z unieruchomionymi
przeciwciaami kozimi przeciw biaku S.
PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKA
Rozpuci odczynnik z trombin w 1 ml destylowanej lub demineralizowanej wody.
Pozostawi w temperaturze pokojowej (1825C) przez 20 minut do cakowitego
rozpuszczenia.
Rozpuci zawarto jednej fiolki w 25 ml destylowanej lub demineralizowanej
wody.
Rozpuci odczynnik z trombin w 0,5 ml destylowanej lub demineralizowanej
wody. Delikatnie wymiesza i pozostawi w temperaturze pokojowej (1825C)
przez 20 minut do cakowitego rozpuszczenia. Przenie do plastikowej probwki
przeznaczonej do badania.
Rozpuci odczynnik z trombin w 1 ml destylowanej lub demineralizowanej wody.
Delikatnie wymiesza i pozostawi w temperaturze pokojowej (1825C) przez 20
minut do cakowitego rozpuszczenia.
WYMAGANE MATERIAY DODATKOWE
Automatyczny fotooptyczny analizator koagulacji lub mechaniczne urzdzenie do
pomiaru czasu krzepnicia, bd te stoper
0,025 M roztwr chlorku wapnia
Woda dejonizowana typ 1 lub odpowiednik
Inkubator lub ania wodna o temperaturze 37C
Cylinder z podziak 25 ml
Pipety o zmiennych objtociach 1001000 l
Papier milimetrowy
Wirwka (do 2500 x g)
DOSTPNE MATERIAY
APARATURA
Informacje dotyczce zastosowania/moliwoci adaptacji metody w poszczeglnych
urzdzeniach analizujcych dostpne s na yczenie. W celu ich uzyskania naley
skontaktowa si z lokalnym przedstawicielem.
PRZECHOWYWANIE I TRWAO
Przed rozpuszczeniem odczynniki zachowuj trwao przed upywem daty wanoci
na etykiecie fiolki, jeli s przechowywane w temperaturze 28C.
Po rozpuszczeniu:
Przechowywa w temperaturze 28C i zuy w cigu 4 godzin. Rozpuszczony
odczynnik z aktywatorem moe by zamroony do -20C przez 30 dni.
Przechowywa w temperaturze 28C przez 30 dni.
Rozpuszczone osocze jest stabilne przez godzin, jeli przechowuje si je w
temperaturze 28C.
Przechowywa w temperaturze 28C i zuy w cigu 4 godzin. Osocze moe by
zamroone do -20C przez 30 dni.
POBIERANIE I PRZECHOWYWANIE PRBEK
Naley pobra dziewi czci objtoci krwi na jedn objto 3,2% (0,109 M)
cytrynianu sodu. Prbki, natychmiast po pobraniu, naley odwirowa z
przyspieszeniem 1500 x g przez 15 minut. W celu uzyskania dodatkowych informacji
na temat pobierania prbek oraz ich przechowywania, naley zapozna si najnowsz
wersj dokumentu H21 opracowanego przez CLSI.10
SPOSB POSTPOWANIA
RODKI BEZPIECZESTWA I OSTRONOCI
Kady dawca jednostki krwi uytej do przygotowania odczynnika z aktywatorem,
osocza pozbawionego biaka S i osocza kontrolnego by przebadany, metod
posiadajc licencj FDA, w kierunku WZW B (HBsAg), WZW C (HCV) i ludzkiego wirusa
niedoboru odpornoci Typu 1 (HIV-1). Wyniki byy ujemne. adna znana metoda
pomiarowa nie jest w stanie zapewni penej gwarancji braku HBsAg, HCV, HIV-1 lub
innych czynnikw zakanych w materiale badawczym, dlatego te z prbkami powinno
si postpowa tak, jak z potencjalnie zakanymi produktami surowicy lub krwi.
Aby zapewni waciwe i powtarzalne wyniki, naley uywa kalibrowanych pipet i
kontrolowa, zgodnie z zaleceniami, ze szczegln uwag wartoci czasu inkubacji i
temperatury.
Niniejszy test nie powinien by uywany jako jedyna metoda diagnostyczna. Naley
przestrzega podstawowych zasad zwizanych z badaniem parametrw krzepnicia.
Rozcieczone roztwory standardowe i prbek powinny by przechowywane na mokrym
lodzie i zbadane w cigu 30 minut.
METODA WYKONANIA TESTU
Aplikacje przeznaczone do konkretnych urzdze s dostpne na yczenie.
1. Przenie odczynnik z aktywatorem TriniCLOT PS Activator oraz chlorek wapnia
0,025 M do pojemnikw na odczynniki w urzdzeniu pomiarowym w temperaturze
37C. Inkubowa przez co najmniej dwch minut.
2. Doda 0,1 ml TriniCLOT PS Depleted Plasma i 0,1 ml rozcieczonego osocza
badanego do kuwety koagulacyjnej. Inkubowa przez 2 minuty w temperaturze
37C.
3. Doda 0,1 ml uprzednio ogrzanego aktywatora TriniCLOT PS Activator do kuwety
pomiarowej. Inkubowa przez 5 minut w temperaturze 37C.
4. Doda 0,1 ml wczeniej ogrzanego roztworu chlorek wapnia 0,025 M. Wczy
zegar i zmierzy czas krzepnicia.
Zaleca si dwukrotne przeprowadzenie bada prbek materiau oraz prbek
kontrolnych. Wynik kocowy stanowi rednia z dwch pomiarw.
Kalibracja Testu
Za kadym razem naley stworzy now krzyw standardow. Mieszanina
nagromadzonego osocza, ktre zostao pobrane w ten sam sposb, co materia do
badania, powinna zosta wykorzystana do stworzenia standardowych krzywych
kalibracji dla biaka S. Potrzeba co najmniej 20 zdrowych dawcw w celu przygotowania
nowej mieszaniny osocza.
Mona rwnie zastosowa osocze referencyjne, w ktrym okrelono poziom biaka S
(TriniCAL Reference Plasma, nr katalogowy T5102).
Przygotowa roztwory standardowe biaka S, prbki osocza kontrolnego i osocza
pacjenta, tu przed rozpoczciem analizy, w nastpujcy sposb:
Rczne przygotowanie 1 ml rozciecze do krzywej standardowej:
* W urzdzeniach automatycznych najniszy punkt stanowi minimalne rozcieczenie
(okoo 12,5%), a nie prawdziwy standard 0%. Naley zapozna si z dokumentacj
konkretnego urzdzenia.
Uwaga: Podczas uywania osocza referencyjnego dostpnego na rynku, naley
stosowa przypisan warto stenia biaka S zamiast 100%; dla kadego
rozcieczenia % aktywnoci jest obliczany nastpujco: przypisana warto pomnoona
przez wspczynnik rozcieczenia.
Rczne przygotowanie 500 l prbki i rozciecze kontrolnych:
Rozcieczone roztwory powinny by przechowywane na mokrym lodzie i zbadane w
cigu 30 minut.
Krzywa Kalibracji
Na papier milimetrowy ze skal liniow nanie warto % aktywnoci biaka S w
stosunku do standardw kalibracyjnych (o x) i wartoci redniego czasu krzepnicia
(o y). Wykreli lini najlepiej dopasowan do punktw otrzymanych na wykresie. W
przypadku prbek pacjenta i kontrolnych naley okreli % aktywnoci biaka S przez
interpolacj z krzywej standardowej. U pacjentw z antykoagulantem toczniowym lub
z nieprawidowo wysokim poziomem aktywnoci biaka S, u ktrych zastosowano
rozcieczenia wielokrotne, naley skorygowa wartoci poziomu biaka S o odpowiedni
czynnik rozcieczenia. Gdy nadal poziomy biaka S nie zgadzaj si, to w prbkach
pacjenta znajduje si najprawdopodobniej bardzo silny inhibitor, ktry nie pozwala na
okrelenie poziomu aktywnoci biaka w tym tecie.
Poniej pokazano jedynie przykad krzywej kalibracji. Za kadym razem naley
stworzy now krzyw kalibracyjn. Nie uywa krzywej narysowanej poniej.
KONTROLA JAKOCI
Osocze kontrolne zawarte w zestawie, moe zosta uyte jako kontrola pierwszo- lub
drugorzdowa. Kontrole naley przeprowadza ze wieo rozpuszczonymi
odczynnikami. Warto poziomu biaka S, otrzymana podczas kadego oznaczenia
kontrolnego, powinna si zawiera w przedziale okrelonym przez sprzedawc lub
laboratorium. Jeli pomiary kontrolne w ktrymkolwiek badaniu nie mieszcz si w
dopuszczalnych zakresach stenia biaka S, okrelonych dla kadego osocza
referencyjnego, to procedur naley powtrzy.
WYNIKI
OCZEKIWANE WYNIKI
Warto biaka S jest z reguy wyraana jako wzgldny wynik procentowy, odniesiony
do wartoci otrzymanych dla osocza standardowego lub mieszaniny prawidowego
osocza. Oczekiwany prawidowy zakres wartoci dla biaka S wynosi 55160%.11
Niemniej jednak kade laboratorium moe ustali wasny przedzia wartoci.12
Mczyni maj 1015% wicej osoczowego biaka S ni kobiety i u obu pci stenie
wzrasta z wiekiem.9 Obnienie poziomu biaka S jest zwizane ze wzrostem czstoci
wystpowania przypadkw zatorowoci.13 Obnienie poziomu aktywnoci biaka S nie
oznacza od razu zmniejszenia jego stenia w osoczu. Biako S (frakcja cakowita) jest
obecne jako frakcja wolna oraz zwizana z biakiem C4b (C4bBP). Tylko frakcja wolna
biaka S dziaa jako kofaktor w procesie aktywacji biaka C. W momencie spadku
aktywnoci biaka S jest istotne, aby ustali osoczowe poziomy zarwno wolnej, jak i
zwizanej z C4bBP frakcji tego biaka. W zalenoci od wzgldnych poziomw
aktywnoci biaka S, frakcji wolnej i frakcji cakowitej, zidentyfikowano trzy rodzaje
wrodzonego niedoboru biaka S.14
Poziomy biaka S mog by rwnie zmniejszone w chorobach wtroby i podczas
terapii przeciwzakrzepowej. Dodatkowo aktywno biaka S i antygenu wolnej frakcji
tego biaka mog by obnione w chorobach zapalnych, w czasie trwania ktrych
poziomy biaka C4bBP s zwikszone.
CHARAKTERYSTYKA DZIAANIA
Obecno heparyny w steniu wikszym 1,2 U/ml lub stwierdzenie antykoagulantu
toczniowego w prbce mog mie wpyw na wynik testu przez wyduenie czasu
krzepnicia i sztuczne zwikszenie wartoci biaka S. Wykonaj testy dla prbek przy
rozcieczeniach wielokrotnych. Obecno mutacji czynnika V Leiden moe mie wpyw na
funkcjonalne metody oznaczania biaka S.
Aby zapewni waciwe i powtarzalne wyniki, naley uywa kalibrowanych pipet i
kontrolowa, zgodnie z zaleceniami, ze szczegln uwag wartoci czasu inkubacji i
temperatury. Niniejszy test nie powinien by uywany jako jedyna metoda
diagnostyczna. Naley przestrzega podstawowych zasad zwizanych z badaniem
parametrw krzepnicia.
Uytkownik kocowy powinien ustali charakterystyk dziaania produktu w stosunku
do wykorzystanych metod i sprztu. Badania przy uyciu automatycznego analizatora
koagulacji z fotooptycznym systemem detekcji day ponisze wyniki.
Dokadno Pomiaru
Badania przy uyciu innego dostpnego na rynku zestawu do oznaczania biaka S
wykazay wspczynnik korelacji rzdu 0,868 dla 78 przebadanych prbek z
rwnaniem regresji
y = 0,913x + 17,2.
Precyzja
Zaobserwowano nastpujce wspczynniki wariancji (CV):
Czuo
Test TriniCLOT Protein S zosta stworzony w taki sposb, aby krzywa kalibracyjna bya
liniowa dla wartoci poziomw biaka S w przedziale pomidzy 0 a 100%.
REFERECES / RFRENCES / LITERATUR /
REFERENCIAS / RIFERIMENTI / /
REFERNCIAS / LITERATURA
1. Discipio, R. G., et al. A comparison of human Prothrombin, factor IX (Christmas
Factor) factor X (Stuart Factor) and Protein S. Biochemistry 1977, 16: 698-706.
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10. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Collection, Transport, and
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H21-A5 Vol. 28, No. 5, 2008.
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Edition. CLSI document C28-A3 Vol. 28, No. 30, 2008.
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14. Comp, P. C. Laboratory evaluation of Protein S status. Seminars in Thrombosis and
Hemostasis 1990, 16 (2), 177-181.
ORDERING INFORMATION / INFORMATIONS GNRALES /
/ BESTELLINFORMATIONEN / INFORMACIN SOBRE
EL PEDIDO / INFORMAZIONI PER GLI ORDINI /
/ / INFORMAO
DE ENCOMENDA / INFORMACJA DOTYCZCA ZAMWIENIA
KIT TriniCLOT Protein S
Catalogue No. T1602
Kit Content Item Quantity
TriniCLOT PS Activator Reagent 4 x 1 ml
TriniCLOT PS Depleted Plasma 4 x 1 ml
TriniCLOT PS Dilution Buffer 2 x 2.5 ml
TriniCLOT PS Control Plasma 2 x 0.5 ml
Additional Products Available
Catalogue Number Item Quantity
T4101 TriniCHECK Control 1 10 x 1 ml
T4104 TriniCHECK Abnormal Control 10 x 1 ml
T5102 TriniCAL Reference Plasma 10 x 1 ml
Polybrene is a registered trademark of Abbott Laboratories.
CV (%)
Plasma normale
(Proteina S = 87%)
Plasma anormale
(Proteina S = 42%)
Intra-dosaggio 3,0 2,3
Inter-dosaggio 5,9 5,1
CV (%)

( S = 87%)

( S = 42%)
3,0 2,3
5,9 5,1
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
50 l 450 l
TriniCLOT PS Dilution Buffer
Osocze referencyjne lub mieszanina
zebranego osocza Biako S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l 100% produktu standardowego 50
1 000 l - 0*
Osocze TriniCLOT PS Dilution Buffer
50 l 450 l
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
VK (%)
Prawidowe osocze
(Biako S = 87%)
Nieprawidowe osocze
(Biako S = 42%)
Wewntrzseryjny 3,0 2,3
Midzyseryjny 5,9 5,1
Protect from light
Conserver labri de la lumire
Lichtgeschtzt lagern
Conservar protegido de la luz
Conservare al riparo della luce
-
Chroni przed wiatem
Manter ao abrigo da luz
Fragile, handle with care
Fragile, manipuler avec prcautions
Zerbrechlich, mit Sorgfalt behandeln
Frgil, manipular con cuidado
Fragile, maneggiare con cura
,
Ostronie, kruche
Frgil, manipular com cuidado
Caution, consult accompanying documents
Attention, consulter la notice d'instructions
Achtung, Begleitdokumente beachten
Atencin, consultar instrucciones de uso
Attenzione, vedere le istruzioni per luso
,
Uwaga! Przed uyciem zapoznaj si z treci
zaczonej ulotki
Cuidado, consulte a documentao que
acompanha o equipamento
Trinity Biotech Plc
Bray, Co. Wicklow, Ireland
Tel. 353 1 2769800
Fax. 353 1 2769888
www.trinitybiotech.com
USA ENQUIRIES:
Trinity Biotech USA
2823 Girts Road,
Jamestown, NY 14701.
USA
Tel. 1800 325 3424
Fax. 908 898 1539
Consult Instructions for Use
Consulter les instructions dutilisation
Gebrauchsanweisung beachten
Consulte las instrucciones de uso
Consultare le istruzioni per luso
o
Sprawd w instrukcji uycia
Consultar as Instrues de Utilizao
Temperature limitation
Limites de temprature
Temperaturbegrenzung
Lmite de temperatura
Limiti di temperatura

Przechowywa w okrelonej temperaturze
Limites de Temperatura
Use by
Date limite d'utilisation
Verwendbar bis
Fecha de caducidad
Utilizzare entro

Data wanoci
Uso por
Add
Ajouter
Hinzuf
Aadir
Aggiungere
Doda
Adicionar
Catalogue number
Rfrence du catalogue
Bestellnummer
Nmero de catlogo
Numero di catalogo
A
Numer katalogowy
Nmero do catlogo
Manufacturer
Fabricant
Hersteller
Fabricante
Fabbricante
K
Producent
Fabricante
+
For in vitro Diagnostic Use
Usage diagnostique in vitro
In-vitro-Diagnostika
Para diagnstico in vitro
Per uso diagnostico in vitro
in vitro
Do diagnostyki in vitro
Para uso diagnstico in vitro
Sodium Azide
Azide de sodium
Natriumazid
Azide sdica
Sodio azide

Azydek sodu
Azida de sdio
Batch code
Code du lot
Chargenbezeichnung
Cdigo de lote
Codice del lotto
A
Kod partii
Cdigo do Lote.
Contains sufficient for <n> tests
Contenu suffisant pour n tests
Inhalt ausreischende fr <n> Prfungen
Contenido para <n> ensayos
Contenuto sufficiente per "n" test
<n>
Wystarczajcy do wykonania <n> testw
Contedo Suficiente para <n> Testes
T1602-29A
07/2010
Xn
Harmful
Nocif
Gesundheitsschdlich
Nocivo
Nocivo
Szkodliwy
Nocivo
Xi
Irritant
Irritant
Reizend
Irritante
Irritante
Dranicy
Irritante
Toxic
Toxique
Giftig
Txico
Tossico
Toksyczny
Txico
Corrosive
Corrosif
tzend
Corrisivo
Corrosivo
rcy
Corrosivo
GUIDE TO SYMBOLS / GUIDE DES SYMBOLES /
SCHLSSEL ZU DEN SYMBOLEN / GUIA DE
SIMBOLOS / GUIDA AI SIMBOLI /
/ GUIA PARA OS SMBOLOS /
LEGENDA SYMBOLI

(sec)
Tem
p de coagulao (seg.)
TriniCLOT PS Dilution Buffer PNP S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l 100% 50
1 000 l - 0*
TriniCLOT PS Dilution Buffer
50 l 450 l
TriniCLOT PS Dilution Buffer Plasma de Referncia ou PPN Protena S (%)
900 l 100 l 100
500 l 500 l de padro de 100% 50
1 000 l - 0*
VK (%)
Plasma normal
(Protena S = 87%)
Plasma patolgico
(Protena S = 42%)
Intra-ensaio 3,0 2,3
Inter-ensaio 5,9 5,1
TriniCLOT
TM
Protein S
T1602 1 Kit
Czasy krzepnicia (sek)
Biological Risks
Risques biologiques
Biogefhrdung
Riesgo biolgico
Rischio biologico

Zagroenie Biologiczne
Risco Biolgico

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