genero Chlorella, aisladas de la Octava Regin y del territorio Antrtico chileno. Nombre de los estudiantes que integran el equipo de trabajo (mximo 3) Nombre completo: Curso: 1. Mara Paz Soto Vergara 3ro Medio 2. Daniel Ignacio Figueroa Jerez 3ro Medio 3. Eugenio Nicols Sanhueza Monsalves 3ro Medio Asesor(a) Nombre: Juana Vernica Torrejn Montenegro RUT: 8.222.544 - 7 Especialidad: Biologia Establecimiento Educacional: Colegio San Agustn Direccin Particular: Tucapel 216, Concepcion Telfono Particular:
Celular: 95980628 E-mail personal: juvetomo@yahoo.com Director del establecimiento educacional que respalda la propuesta Nombre: Mara Paulina Bellolio Olivieri RUT: 5.568.093-0 Firma:
Nombre del establecimiento educacional: Liceo San Agustn de Concepcin Dependencia: Part/Subvenc. Direccin: Tucapel 219, Concepcin Ciudad/Regin: Concepcin Telfono: 41 2954549 Fax: 41 2954549 E-mail: secretaria@csac.cl
Cientfico (a) asesor (a) Nombre: Dra. Patricia Gmez Vergara Especialidad: Biotecnologa microalgal Institucin: Universidad de Concepcin. Telfono: E-mail: Informe si se ha desarrollado parte o toda la investigacin en otras instituciones que no haya sido su establecimiento educacional. Toda la investigacin se desarroll en los laboratorios de Cultivo de Microalgas y Sistemtica Molecular del Departamento de Botnica, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanogrficas, Universidad de Concepcin. 2
INDICE .
Resumen de la Investigacin... 3 Introduccin 4 Formulacin del Problema.. 6 Materiales y metodologa de investigacin 7 Resultados Obtenidos 10 Anlisis y discusin de resultados 12 Conclusiones 13 Bibliografa 14 Participacin 15 Agradecimientos 16
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RESUMEN DE LA INVESTIGACION . La Antrtica es el continente ms fro del mundo. Las exploraciones y descubrimientos en estos territorios se encuentran en estado de desarrollo, motivando su estudio a muchos cientficos. El calentamiento global afecta en gran medida al continente blanco, ya que el aumento de temperatura de la tierra est derritiendo los hielos, acabando con el hbitat y el maravilloso paisaje de esta tierra. Las algas son los productores primarios en el ambiente marino, con un rol muy importante, sustentando a toda la trama alimenticia. Al ser fotosintticas absorben CO2 del ambiente contribuyendo a disminuir el efecto invernadero producido por la acumulacin de este gas en la atmsfera. Nuestra hiptesis se basa en que las algas antrticas son mas resistentes al estrs por frio que algas de ambientes ms clidos, contribuyendo as a la disminucin de las cantidades de CO 2 en la Antrtica, y as disminuir los efectos del calentamiento global en este ambiente extremo. En este trabajo se evalu la capacidad de dos cepas de microalgas, una aislada de Concepcin y la otra del territorio Antrtico Chileno, de recuperarse y seguir creciendo luego de ser sometidas a estrs por fro. Las cepas fueron sometidas por 24 h a 3 tratamientos de fro: 4C, -20C y -80C. Luego se evalu su crecimiento en el tiempo por medidas de la absorbancia del cultivo a 665nm (longitud de onda a la que absorbe la clorofila). Para determinar la densidad celular en clulas por ml se realizo una curva de calibracin contando las clulas en una cmara Neubauer. Con los datos obtenidos se construyeron curvas de crecimiento para las dos cepas sometidas a los distintos tratamientos de fro y se compararon los resultados. En ambas cepas el crecimiento se vio favorecido luego del tratamiento de 4C. Las microalgas crecieron en menor cantidad luego de ser incubadas a -20C en comparacin a los otros tratamientos, incluso al de -80C, tratamiento al que respondieron sorprendentemente bien. Los resultados obtenidos en la experimentacin en base al crecimiento de las microalgas fueron en general exponenciales hasta el da 12, donde los mejores resultados se observaron a variaciones de temperaturas de 20 y 4C. Se comprob que ambas cepas presentan la misma tendencia de crecimiento pero que la cepa antrtica tiene un crecimiento ms lento que la cepa de Concepcin. Se concluye que las algas verdes responden positivamente al estrs de temperatura, lo que permite su sobrevivencia en temperaturas extremas y as estaran contribuyendo en forma muy importante a la disminucin de los efectos del calentamiento global. Investigadores Chilenos camino a Patrio Hills. Foto: Inach 16 de mayo 2011 4
INTRODUCCION . La antrtica es una masa continental que ocupa el polo sur de nuestro planeta, es el continente ms fro y ventoso, y est cubierto por una espesa capa de hielo. Este territorio se encuentra a 66.5 de latitud Sur, con unos catorce millones de kilmetros de tierra aproximadamente. Su temperatura media es cercana a los -17C. Cerca del 90% del agua dulce del planeta se encuentra en este continente, lo que la convierte en la mayor reserva hdrica del mundo. El continente antrtico es un lugar nico, donde la ciencia ocupa un espacio privilegiado, asemejndose a un inmenso laboratorio cientfico. Hoy en da, el principal problema que afecta a nuestro planeta es el calentamiento global, provocado por el aumento de CO 2 , causante de los cambios de temperatura y acidificacin de las aguas, situacin que se ve reflejada mayoritariamente en el continente blanco. Segn un estudio de la revista Science, este fenmeno natural ha sido probablemente el principal causante del aumento de las precipitaciones y disminucin de la masa de hielos al interior de la antrtica. En los ltimos cincuenta aos la temperatura atmosfrica de la pennsula aumento ms de 2,5C. Los investigadores encontraron que entre abril de 2002 y agosto de 2005, la placa de hielo antrtica decreci anualmente 152 kilmetros cbicos de hielo. Si este llegara a derretirse en su mayora, el nivel del mar subira en todo el mundo unos 55 metros. El aumento del deshielo podra tener un impacto a mayor escala si es grave y se mantiene en el tiempo. (Steffen. K, 2007) La temperatura normal de la Antrtica ha ascendido en los ltimos aos por accin del fenmeno actual, dejando los -17C. El continente antrtico presenta una escasa vegetacin de musgos, algas y lquenes. Dentro de la escasa diversidad de algas, se encuentran las clorfitas, algas verdes que presentan clulas con un ncleo bien definido, pared celular y se caracteriza por presencia de clorofila a y b, y la acumulacin de almidn en el interior del cloroplasto. Existen en la Tierra hace ms de 540 millones de aos, siendo uno de los organismos ms primitivos, sorpresivamente se han conservado de forma casi inalterada hasta nuestros das, gracias a su extraordinaria capacidad de supervivencia. La mayor parte de las algas habitan en agua dulce, suelos hmedos o epifitas. Las clorofilas son cosmopolitas, es decir, presentan una amplia distribucin por todo el mundo, variando en sus ambientes. Las algas verdes son organismos fotosintticos, es decir, realizan el proceso de captacin de dixido de carbono ambiental y lo transforman en oxgeno. Esta flora puede verse afectada por el calentamiento global de manera positiva o negativa, ya que cada especie reacciona de distinta manera a los cambios de temperatura en el ambiente. Por medio de fotosntesis, estas algas al captar el CO 2 que existe en la atmsfera de manera excesiva, lo disminuiran, y por consiguiente aportaran a minimizar la 5
temperatura existente que est aumentando por accin del fenmeno anteriormente nombrado. Dentro de los ambientes acuticos, el fitoplancton aporta de la misma forma a mitigar el efecto de calentamiento global que los organismos vegetales terrestres, los organismos vegetales marinos cumplen una tremenda funcin, produciendo la mitad del oxgeno que se respira, absorbiendo el dixido de carbono y manteniendo a los peces del ocano. La importancia del fitoplancton en los ocanos reside tambin en su labor como primer eslabn de la red trfica o alimentaria marina. Sera el equivalente a la vegetacin terrestre, ya que transforma elementos inorgnicos en energa y materia orgnica para que el resto pueda alimentarse. (Huertas. E, 2011) Al conocer estas caractersticas del continente blanco y saber cmo le est afectando el calentamiento global, nos lleva a pensar en cmo poder aportar a que este maravilloso espacio para la ciencia contine por un largo tiempo y nos deslumbre con sus hallazgos. Un medio para conseguir esto son las algas verdes, mediante su estudio y experimentacin podemos obtener los datos necesarios para responder a los problemas que le afectan. Como el calentamiento global causa una variacin de temperatura aparte de las variaciones estacinales, las algas verdes deberan recuperarse de estos cambios y si es as, a temperatura alta responder de manera adecuada. En este trabajo de experimentacin se presenta una posible respuesta a nuestra pregunta, mediante el trabajo en laboratorio con algas verdes, anlisis e interpretacin de datos de cada muestra de algas y conclusiones que nos llevarn a lograrlo. Para esto, a las microalgas las someteremos a distintos grados de estrs, provocados por la variacin de temperatura, y observaremos como se recupera en cada situacin. Todo esto con el objetivo de simular los cambios de temperatura en la antrtica, tanto los estacionales como los provocados por el calentamiento global, y ver cmo afecta en el crecimiento de las algas verdes, y as comprobar si disminuira o aumentara su ayuda a contrarrestar este cambio climtico.
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FORMULACION DEL PROBLEMA .
Pregunta:Podrn las algas verdes antrticas resistir a una variacin de temperatura y luego seguir con un crecimiento eficiente?
Hiptesis: Las algas verdes antrticas respondern mejor que las algas de ambientes ms clidos al estrs por frio, por lo que estaran adaptadas para contribuir a disminuir el CO2 atmosfrico y por ende el calentamiento global en la Antrtica.
Objetivos: Motivar al estudio de las microalgas y su rol en el calentamiento global ya que no se les ha dado el grado de importancia en su aporte a contrarrestar este fenmeno. Establecer una comparacin de la resistencia al fro entre una microalga verde antrtica y una aislada de la Octava Regin.
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MATERIALES Y METODOLOGIA DE INVESTIGACION . Tratamiento a algas verdes locales y antrticas: Se somete a las algas verdes a ciertos grados de estrs provocados por la variacin de temperatura en 24 horas y luego se deja en una sala de cultivo para comprobar su viabilidad das despus. 1.- rea de estudio: Ficologa. 2.-Materiales: Cepa antrtica (Aff.Chlorella), Cepa local (Aislada de la Laguna Grande de San Pedro, Octava Regin), Espectrofotmetro con Cubetas de cuarzo, Maquinas refrigerantes (refrigerador, freezer y congelador), Tubos Eppendorf, Tubos de ensayo, Pipeta con rodillo, Pipetas plsticas, Micropipetas de 500-1000L con los tips correspondientes, Timer, Medio de cultivo Bristol, Matraz, Gradilla, Microscopio binocular, Cmara de Neubauer.
3.- Metodologa 3.1.-Preparacion de la Muestra: Jueves 15 de Septiembre de 2011
La preparacin de las muestras consiste en igualar la densidad celular en ambas cepas para que comiencen con la misma cantidad de clulas por mL. Para lograr esto, debimos tomar la absorbancia a 750 nm (Turbidez) y a 665 nm (Clorofila) de ambas cepas en el espectrofotmetro, ya que la absorbancia es directamente proporcional con la densidad celular: Primero, debemos tomar 4 mL de medio de cultivo Bristol, con una pipeta, y vertirlo en la Cubeta de cuarzo, especial para el espectrofotmetro, luego se debe ubicar esta cubeta en la primera celda de la mquina. Segundo, extraer 4 mL de cultivo del alga antrtica con una pipeta de plstico, y vaciarlo en una segunda cubeta de cuarzo, poner esto en la celda dos del espectrofotmetro. Medir absorbancia a 750 nm y 665 nm. Tercero, retirar la cubeta con muestra de la mquina, y vaciarla en el frasco de desechos lquidos. Lavar el recipiente con agua para eliminar los residuos de la cepa. Cuarto, extraer 4mL de cultivo del alga local, con una pipeta de plstico diferente a la primera, y echarlo en la cubeta de cuarzo lavada. Poner esto en la segunda celda de la mquina. Medir Absorbancia a 750nm y 665 nm Resultados:
Para igualar las absorbancias debemos diluir cierta cantidad de cepa local en un determinado volumen de Bristol. Queremos obtener 20 mL de solucin Cepa Local + Bristol con una turbidez de 0.020 nm. Utilizamos una proporcin Inversa como la siguiente: 750 nm 665 nm Cepa antrtica: 0,020 0,021 Cepa Local: 0,800 0,856 8
20 mL x 0,020 = V x 0,8 Siendo V la cantidad de mL de cepa local. Despejamos V y nos da como resultado que es 0,5 mL de cepa local. Por lo tanto debemos agregar 19,5 mL de medio Bristol para completar los 20 mL de solucin. Finalmente a un matraz esterilizado agregamos, con una pipeta, 19,5 mL de Bristol y, con otra pipeta, agregamos 0,5 mL de cepa local. As nuestras dos cepas poseen la misma absorbancia, por lo tanto, la misma densidad celular. 3.2.- Procedimiento del experimento
Jueves 15 de Septiembre de 2011 En primer lugar, con una micropipeta extraemos 1,5 mL de cepa local para cada tubo Eppendorf rotulado con nmeros del 1 al 4, luego cambiamos la punta del instrumento y repetimos el mismo procedimiento con la cepa antrtica, con otros 4 tubos Eppendorf rotulados del 5 al 8. Pondremos a diferentes temperaturas cada tubo, por 24 horas, como se indica a continuacin: Tubo eppendorf 1: Cepa Local a 20C en laboratorio con temperatura controlada Tubo eppendorf 2: Cepa Local a 4C en la parte baja de un refrigerador Tubo eppendorf 3: Cepa local a -20C en el freezer de un refrigerador Tubo eppendorf 4: Cepa local a -80C en un congelador (deep freezer) Tubo eppendorf 5: Cepa Antrtica a 20C en laboratorio con temperatura controlada Tubo eppendorf 6: Cepa Antrtica a 4C en la parte baja de un refrigerador Tubo eppendorf 7: Cepa Antrtica a -20C en el freezer de un refrigerador Tubo eppendorf 4: Cepa local a -80C en un congelador (deep freezer)
Viernes 16 de Septiembre de 2011 24 horas despus sacamos nuestras muestras de sus respectivos lugares y esperamos a que se descongelen por 20 min aprox. Mientras tanto, con una pipeta, vertimos 3 mL de medio Bristol en los 8 tubos de ensayo, cada uno rotulado para cada muestra. Una vez descongeladas las muestras, las homogenizamos agitndolas suavemente, tomamos 1 mL con una micropipeta y lo ponemos en los tubos de ensayo, cambiando la punta del instrumento por cada cepa. Estos 4 mL (cepa + medio de cultivo), se llevan a una sala de cultivo, con temperatura 18C 1C e intensidad luminosa de 17 mol / m 2 seg, para iniciar con su crecimiento.
Jueves 22 de Septiembre de 2011. Para saber la cantidad de clulas por mL, podemos crear una relacin entre la absorbancia a 665 nm y la densidad celular, ya que son directamente proporcionales. Para ello debemos crear una curva de calibracin, que servir para extrapolar los datos MUESTRAS 9
que obtendremos, tanto como de la cepa antrtica como local porque son ms o menos del mismo tamao. La forma en que creamos la curva fue: Primero debemos hacer una disolucin seriada de la cepa local, colocando 3 mL de Bristol en un tubo de ensayo rotulado con la letra A y agregando 2 mL de cepa local. Lo homogenizamos y luego extraemos 2 mL de solucin del tubo A y lo vaciamos en un tubo de ensayo rotulado con la letra B. Se repiten los pasos con los tubos C y D. Teniendo los 4 tubos de ensayos A, B, C y D listos, procedemos a contar el nmero de celular en el microscopio ptico binocular a magnificacin 40X con ayuda de una cmara de Neubauer. En esta cmara podemos contar el nmero de celular en un volumen de 0.004mm 3 , ya que de largo y ancho tiene 0.2 mm y alto 0.1 mm por celda. Los resultados son 121; 35; 30 y 20 de los tubos A; B; C y D respectivamente. Una vez contadas las 4 muestras, calcularemos el nmero de clulas en 1 mL con una proporcin directa. Por ejemplo si en 0,004 mm 3 hay 20 clulas, en 1000 mm 3 habra 5x10 6 clulas. As calculamos las restantes. Luego las llevaremos al espectrofotmetro y mediremos su absorbancia a 665 nm. Hasta el momento los datos que tenemos son los siguientes:
Tendiendo estos datos, crearemos un grfico con la absorbancia a 665nm en el eje de las abscisas y el nmero de clulas en el eje de las ordenadas. A los puntos que se crean, le crearemos la ecuacin de la recta (lnea de tendencia) que los delimita, pasando a ser esta la curva de calibracin. Esta ecuacin es y=30.000.000x + 3.000.000. Por lo tanto, sabiendo la absorbancia de nuestra muestra, podemos ingresarla a la ecuacin y saber cuntas clulas por mL hay en el cultivo. Despus de 6 das de crecimiento, se realiza la primera medicin de absorbancia a 665 nm de todas las muestras. Devolver las muestras a sus respectivos tubos y volver a ponerlos en la sala de cultivo. Tambin se repite el paso anterior a los 10 y 12 das de crecimiento. Los datos obtenidos de las mediciones se ingresan a la formula hecha a partir de la curva de calibracin y se extrapolan en un grfico que tiene el nmero de das en el eje de las abscisas y el nmero de clulas por ml en el eje de las ordenadas. A partir de lo anterior, tenemos el nmero de clulas por mL de cada da, tratamiento de temperatura y cepa para crear grficos comparativos entre estas. A665 Cels/ml A 0.988 30500000 B 0.384 8750000 C 0.116 7500000 D 0,025 5000000 10
Grafico 1: Curva de Crecimiento cepa Local
Segn el grafico 1: Ninguno de los cuatro tratamientos mata en su totalidad a los cultivos. Posterior al tratamiento trmico, el crecimiento de las algas verdes locales fue exponencial (en el tratamiento de 20, 4 y -80C), a diferencia del tratamiento a -20C que comienza a disminuir su velocidad de crecimiento entre el da diez y doce de cultivo. La temperatura de tratamiento no es directamente proporcional con el nmero de clulas, ya que el tratamiento de -80C obtuvo un mayor nmero de clulas en todas las mediciones que el tratamiento de -20C. Al tratamiento de 4C obtuvo la mayor densidad celular en menor tiempo, que fue de 41400000 cels/mL. 0 6 10 12 Local 20C 907500 cels/mL 8460000 cels/mL 22200000 cels/mL 37020000 cels/mL Local 4C 907500 cels/mL 8940000 cels/mL 25620000 cels/mL 41400000 cels/mL Local -20C 907500 cels/mL 4500000 cels/mL 12870000 cels/mL 18120000 cels/mL Local - 80C 907500 cels/mL 7380000 cels/mL 18090000 cels/mL 22020000 cels/mL 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 35000000 40000000 45000000 0 2 4 6 8 10 12 14 C e l s / m l
Dias Local 20C Local 4C Local -20C Local - 80C RESULTADOS OBTENIDOS . Das de Crecimiento Das de Crecimiento 11
Grafico 2: Curva de Crecimiento cepa Antrtica
Segn el grafico 2: Ninguno de los cuatro tratamientos mata en su totalidad a los cultivos El crecimiento posterior a los cuatro tratamientos fue exponencial. La temperatura de tratamiento no es directamente proporcional con el nmero de clulas, ya que el tratamiento de -80C obtuvo un mayor nmero de clulas en todas las mediciones que el tratamiento de -20C La muestra del tratamiento a 20C a los seis das es muy similar en densidad celular al tratamiento de -80C, y luego a los doce das es muy cercano al nmero de clulas de la cepa del tratamiento a 4C. La densidad ms alta se dio en el tratamiento a 20C con 22470000 cells/mL
Comparacin entre cepa antrtica y local: En todas las mediciones, la cepa que mayor crecimiento celular present, fue la cepa local. En ambos casos, la muestra del tratamiento de -80C supero en densidad celular a la cepa del tratamiento de -20C.
Dias Antrtica 20C Antrtica 4C Antrtica -20C Antrtica -80C Das de Crecimiento 12
ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS . A partir de los grficos anteriores podemos deducir que: - El alga Antrtica responde favorablemente al tratamiento de temperatura extrema, esto nos comprueba su adaptabilidad a medios extremos - Las algas estudiadas tienen una amplia resistencia a diversas variaciones de temperaturas. - En el grfico de la cepa local, se aprecia una disminucin en la velocidad de crecimiento a temperatura de -80C (entre el da 10 y da 12) a diferencia de la antrtica que continua exponencialmente hasta el da 12. Esto podra deberse a que la poblacin est llegando a su capacidad carga, ya que al haber estado sometidas a un estrs necesito ms nutrientes para sobrellevar este cambio. - Las cepas del gnero Chlorella, podran tener una caracterstica que les permita adaptarse a temperaturas extremas. - Se valida que estas algas verdes tambin aportaran a frenar el calentamiento global, ya que a temperaturas altas (20 y 4C) el nmero de clulas por mL es mayor, lo que se traduce como una mayor actividad fotosinttica, captando ms CO 2.
- Los cambios de temperatura a 20 y 4C provocaron que las microalgas verdes del gnero Chlorella sobrevivieran y continuaran creciendo exponencialmente, lo que valida nuestra hiptesis diciendo que el microalga verde antrtica crece favorablemente a las variaciones de temperaturas altas. -Los datos obtenidos en el tratamiento de -80C fueron ms positivos que los del tratamiento de -20C, lo que nos permitira afirmar, que estas algas incluso pueden resisitir temperaturas inferiores a la temperatura media de la antrtica (-17C). -La proyeccin de nuestra investigacin es la interrogante de qu manera utilizan los nutrientes las algas para poder sobrellevar el estrs causado por la variacin de temperatura?
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CONCLUSIONES .
Las cepas de Chlorella son capaces de reactivarse luego de una variacin drstica de temperatura, continuando con su crecimiento a una temperatura estndar (20C). La microalga antrtica puede crecer luego de un tratamiento de 4C, por lo tanto se deduce que sobreviviran al cambio de temperatura causado por el calentamiento global, e incluso mejorara en comparacin al tratamiento de 20C. Se infiere que la cepa local se podra adaptar exitosamente en el continente antrtico a pesar de las bajas temperaturas que este presenta. Las microalgas fotosintticas disminuyen el CO 2 presente en el agua, regulando el pH y con ello favoreciendo la vida acutica. El calentamiento global produce un aumento de temperatura, por lo que las microalgas de gnero Chlorella resistiran temperaturas extremas y continuaran con un crecimiento ptimo, ayudando a que la concentracin de CO 2 disminuya y as no afecte mayormente al continente antrtico 14
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PARTICIPACION .
Mara Paz Soto Vergara: Experimentacin, introduccin, resultados obtenidos y respectivo anlisis. Objetivos, hiptesis y conclusin. Desarrollo y redaccin del proyecto en general. Daniel Figueroa Jerez: Experimentacin. Metodologa, introduccin, anlisis de resultados y conclusin. Desarrollo y redaccin del proyecto en general. Eugenio Nicols Sanhueza Monsalves: Experimentacin. Metodologa, Anlisis de resultados, registro fotogrfico. Desarrollo y redaccin del proyecto en general. Profesora Juana Vernica Torrejn: Ayuda y explicaciones antes y durante el proyecto. Dra. Patricia Gmez: Ayuda y gua en realizacin del experimento. Indicaciones previas y durante el experimento.
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AGRADECIMIENTOS .
Como finalizacin de este trabajo, queremos agradecer especialmente a la Doctora Patricia Gmez, Bioqumico, Doctora en Ciencias Biolgicas rea Botnica, quien nos ayud y gui en este experimento, por su tiempo y paciencia, siendo un gran apoyo en nuestro proyecto. Tambin, agradecer a nuestra Profesora Vernica Torrejn, quien nos motiv y alent para seguir con el proyecto, cuidndonos y apoyndonos en todo momento. Agradecemos a nuestro colegio, que nos apoy y nos facilit materiales, uso del laboratorio, y nos permiti salir en horario escolar. Agradecer a la Universidad de Concepcin, por facilitar sus dependencias para la realizacin de este proyecto. Finalmente, un agradecimiento a las familias de cada uno de los participantes, por el apoyo incondicional.