RESUMO

PRINCPIOS DE BIOQUIMICA DE
LEHNINGER
Prof.: Edgard Freia!
CAPI"ULO #$
AMINO%CIDOS& PEP"IDEOS E
PRO"EINAS
3.1- AMINOCIDOS
As protenas so as macromolculas biolgicas mais abundantes, ocorrendo em todas as clulas e
em todas as partes das clulas. So os instrumentos atravs das quais a informao gentica
expressa.
As protenas so construdas a partir do mesmo conjunto onipresente de ! amino"cidos,
covalentemente ligados em sequencias lineares caractersticas.
As clulas podem produ#ir protenas com propriedades e atividades absolutamente diferentes
combinando os mesmos ! aminoacidos em muitas combina$es e sequencias diferentes.
A partir destes blocos b"sicos, diferentes organismos podem gerar produtos to diversos como
en#imas, %orm&nios, anticorpos, transportadores, fibras musculares, a protena da lente do ol%o, etc.
'entre estes produtos proteicos, as en#imas so as mais variadas e especiali#adas. (raticamente
todas as rea$es celulares so catali#adas por en#imas.
AMINOACIDOS COMPARTILHAM CARACTERISTICAS
ESTRUTURAIS COMUNS
)odos os ! amino"cidos comuns so *+amino"cidos. ,les possuem um grupo carboxil e um
grupo amino ligados aos mesmo "tomo de carbono - o carbono *..

/s grupos 0, variam em estrutura, taman%o e carga eltrica e influenciam a solubilidade dos
amino"cidos em "gua. 1" o "tomo de carbono * um centro quira -quando um "tomo de carbono
apresenta 2 substituintes diferentes considerado assimtrico.. ,m funo do arranjo tetradrico, os
quatro grupos diferentes podem ocupar dois arranjos espaciais 3nicos e, portanto, os amino"cidos
possuem possveis e!teriori!"#ero!. 4ma ve# que eles so imagens especulares um do outro, no
sobreponveis, estas duas formas representam uma classe de esterioisomeros denominados
enanti"#ero!. )odas as molculas com um centro quiral tambm so opiticamente ativas.
E!terioi!"#ero! 5 so molculas cujos "tomos so ligados numa mesma sequencia - a mesma
constituio., mas diferem no arranjo de seus "tomos no espao. (odem ser subdivididos em6
- Enanti"#ero! 5 cujas molculas so imagens especulares no superponiveis
- Dia!teroi!"#ero! 5 cujas molculas no so imagens especulares uma das outras.

OS RESIDUOS DE AMINOACIDOS EM PROTEINAS S$O
ESTERIOISOMEROS L
0esiduos de amin"cidos 5' tem sido encontrado em somente poucos e, geralmente, pequenos
peptdeos, incluindo alguns peptdeos de paredes bacterianas e certos peptdeos antibiticos.
A formao de subestruturas est"veis e repetitivas em protenas geralmente requer que seus
aminoacidos constituintes sejam uma serie estereoquimica. As clulas so capa#es de sinteti#ar
especificamente os is&meros 57 de aminoacidos porque os sitos ativos das en#imas so
assimtricos, possibilitando que as rea$es catali#adas sejam estereoespecificas.
AMINACIDOS PODEM SER CLASSI%ICADOS PELO &RUPO R
So classificados em 8 classes com base nas propriedades de seu grupo 0, em particular em suas
polaridades e tend9ncias em interagir com a agua em p: biolgico - prximo ao p: ;,!.. (VER
TABELAS NO INICIO DO CAPITULO)
- &RUPO R APOLARES' ALI%ATICOS ( grupo 0 %idrofbico.
< Alanina, valina, leucina e isoleucina 5 tendem a se aglomerar entre si nas protenas,
estabili#ando as estruturas proteicas atravs das intera$es %idrofbicas.
< =licina 5 possui cadeia simples6
< >etionina 5 possui um grupo tioeter apolar em sua cadeia lateral
< (rolina 5 possui uma cadeia alifatica, com estrutura ciclica distinta
- &RUPO R AROMATICO
) ?enilalanina, tirosima, triptofano 5 so relativamente apolares -%idrofbicos..
)odos podem participar de intera$es %idrofbicas. )riptofano e tirosina e, em muito menor
extenso, a fenilalanina absorvem lu# 4.@. Asto explica a forte absorbBncia de lu#, caracterstica da
maioria das protenas em um comprimento de onda de C!nm, uma propriedade explorada por
pesquisadores na caracteri#ao das protenas.
- &RUPO R POLARES' N$O CARRE&ADOS ( /s grupos 0 so mais sol3veis em agua
-%idroflicos., quando comparados a aqueles aminoacidos apolares, pois podem formar liga$es de
%idrog9nio com a agua.
< Serina e treonina 5 possui grupo %idroxil.
< Disteina 5 grupo sufridil - fa# ligao de %idrog9nio com / e E.
< Asparagina e glutamina 5 =rupo amina. So aminas de outros dois aminoacidos
tambm encontrados nas protenas -asparato e glutamato. respectivamente gerados pela %idrolise
acida ou b"sica da asparagina e glutamina
A ci!tina ( quando a cisteina oxidade formando um amino"cido dimerico covalentemente ligado,
unidos por uma ligao dissulfeto.
- &RUPO R CARRE&ADOS POSITI*AMENTE +,SICOS- ( significa que so mais
%idroflicos, p: ;,!.
< 7isina 5 grupo amino F.
< Arginina 5 grupo guanidina carregado positivamente.
< :istidina 5 grupo arom"tico imida#ol. (or apresentar cadeias laterais ioni#"veis
com pGa prximo da neutralidade a %istidina pode estar tanto carregado positivamente - forma
protonada., quanto no carregado, em p: ;,!.
- &RUPO R CARRE&ADOS NE&ATI*AMENTE +CIDOS- ( grupo 0 com carga
negativa em p: ;,!.
< Asparato e glutamato 5 possuindo dois grupo carboxil.
AMINOACIDOS INCOMUNS POSSUEM %UN./ES IMPORTANTES
+ 2+%ridroxiprolina 5 derivado da prolina e encontrado no col"geno6
+ 8+%idroxilisina 5 derivado da lisina, encontrado no col"geno e na parede celular de plantas6
+ H+E+metil+lisina 5 constituinte da miosina6
+ I+carboxiglutamato 5 encontrado na protrombina e em determinadas protenas, se ligam ao Da
J
como parte de suas fun$es biolgicas.
+ desmosina 5 derivado de 2 residuos de 7Ks e encontrada na protena elastina.
+ selenocisteina 5 derivado da serina.
Alguns resduos de aminoacidos em uma protena podem ser modificados transientemente para
alterar a funo da protena. A adio desses grupos de aminoacidos especficos pode aumentar ou
diminuir a atividade da protena.
AMINOACIDOS PODEM ATUAR COMO ACIDOS E ,ASES
'evido ao grupo amino e carboxil, juntamente com os grupos 0 ioni#"veis. Luando um amino"cido
sem o grupo 0 ioni#"vel dissovido em agua a p: neutro, ele passa a existir numa soluo como
um on dipolar, o qual pode atuar tanto como um acido, quanto como uma base.
Substancias possuindo esta nature#a dual -acido+basica. so con%ecidas como an01tero!' sendo com
frequ9ncia c%amado de an01ito!.
O,SER*A.$O IMPORTANTE
IONIZAO DA AGUA E DE ACIDOS E BASES FRACAS.

CONSTANTE DE EQUILIBRIO - um valor que relaciona as concentraes das espcies

reagentes e do produto no momento em que ocorre o equilbrio.

da qual o produto inico da agua, o !, " o#tido$ A %&'C, () * +,
-
.+O,
-
. * &&,& /
0q* 12
-12
/
%

O p, d0 u3a 4olu56o aquo4a r070t0, 03 u3a 04cala logar8t3ica, a conc0ntra56o d0 8on4 ,

-$

Quanto 3aior a acid09, 3ai4 #ai:o " o p,$

Acido4 ;raco4 li#0ra3 ,

-
- di3inui o p,$

Ba404 ;raca4 r0c0#03 ,

-
- au30nta p,$
E44a caract0r84tica " 0:pr044a co3o u3a con4tant0 d0 di44ocia56o acida$
AMINOACIDOS POSSUEM CUR*A DE TITULA.$O CARACTERISTICA.
/ pGa a medida da tend9ncia de um grupo em fornecer um prton, e est" tend9ncia se redu# em
de# ve#es quando o pGa aumenta em uma unidade.
/ pGa de qualquer grupo funcional significativamente afetado por seu ambiente qumico, um
fen&meno algumas ve#es explorados no sitio ativo de en#imas para promover mecanismo de reao
adaptados que dependem de valores de pGa modificados para grupos doadoresMreceptores de
prtons de resduos especficos.

O pa 0:pr044a, 03 u3a 04cala logar8t3ica, a ;or5a r0lati<a d0 u3 acido ou d0 u3a #a40
;raca$

Quanto 3ai4 ;ort0 o acido, 3ai4 #ai:o " o <alor d0 pa
Quanto 3aior a #a40, 3aior " o <alor d0 pa
O p(a pod0 40r d0t0r3inado 0:p0ri30ntal30nt0= " o p, no ponto c0ntral da cur<a d0
titula56o para o acido ou #a40$
Calcular o p,, pO,, ,
-
0 O,
-

CUR*AS DE TITULA.$O PREDI2EM A CAR&A ELETRICA DO AMINOACIDO
/ p: caracterstico no qual a carga eltrica liquida #ero -quando se encontra em sua forma
dipolar, completamente ioni#ada, mas sem carga eltrica liquida. c%amado de 3onto i!oe4trico
ou 3H i!oeetrico.
Eo ponto isoeltrico, as foras de repulso entre as molculas e as foras de interao com o meio
aquoso >AEA>A, ocorrendo a formao de aglomerados que tendem a precipitar. /u seja,
diminui muito a solubilidade.
A funo das protenas depende do p: ao qual esto submetidas

Luanto mais distante o p: de uma soluo de amino"cido esta de seu pA, maior ser" a carga eltrica
liquida. / sinal e a magnitude da carga liquida de qualquer amino"cido em qualquer p: pode ser
predito da mesma forma.
Alguns amino"cido podem ter "tomos ioni#"veis tambm em sua cadeia lateral
AMINOACIDOS DI%EREM EM SUAS PROPRIEDADES ACIDO-,ASICA
(rimeiro, todos os aminoacidos com um 3nico grupo *+amino, um 3nico grupo *+carboxil e um
grupo 0 no ioni#"vel, possuem curvas de titulao semel%antes. ,stes aminoacidos possuem
valores de pGa muito semel%antes, embora no id9nticos. As diferenas desses valores de pGa,
refletem os efeitos dos grupos 0.
Segundo, aminoacidos com grupo 0 ioni#"veis possuem curvas de titulao mais complexas, em N
estagios, correspondendo a N possiveis est"gios de ioni#ao, possuem portanto N valores de pGa
RESUMO 3.1 AMINOACIDOS
A) Os 20 aminocidos usualmente encontrados como resduos em protenas contm
um grupo -carboxil, um grupo -amino e um grupo R distinto no tomo de
carbono . O tomo de carbono de todos os aminoacidos, com exce!o da
glicina, " assim"trico e, portanto, os aminoacidos podem existir em pelo menos
duas #ormas esterioisomericas. $omente os esterioisomeros %&, com uma
con#igura!o relacionada ' con#igura!o absoluta da mol"cula de re#erencia &-
gliceraldeido, s!o encontrados em protenas.
() Outros aminoacidos, menos comuns, tamb"m ocorrem tanto como constituintes
de protenas )atra*"s da modi#ica!o de resduos de aminoacidos comuns ap+s a
sntese proteica) ,uanto como de metabolitos li*res.
-) Aminoacidos s!o classi#icados em cinco tipos com base na polaridade e na carga
)em p. /,0) de sues grupos R.
0) Aminoacidos *ariam ,uanta as suas propriedades acido-basicas e possuem
cur*as de titula!o caractersticas. Aminoacidos monoaminicos e
monocarboxilicos ) com grupo R ioni1*el) s!o cidos diproticos
).
2
3-.)R)-OO.)em p. baixo, existindo em di*ersas #ormas i4nicas di#erentes
a medida ,ue o p. aumenta. Aminoacidos com grupo R ioni1*el possuem
esp"cies i4nicas adicionais dependendo do p. do meiio e do p5a do grupo R.
3.5 ( PEPTIDEOS E PROTEINAS
PEPTIDEOS DE CADEIAS DE AMINOACIDOS
'uas molculas de aminacidos podem ser ligadas atravs de uma ligao covalente amidica,
con%ecida como i6a78o 3e3t9:ica.
/corre perda de agua entre os grupos *+carboxil e *+amino.
A reao con%ecida como reao de condensao.

+ /ligopeptideos 5 ligao entre alguns poucos aminoacidos6
+ (olipeptideos 5 ligao entre muitos aminoacidos.
+ Se a >> for menor do que O!.!!! 5 polipeptideos
+ Se a >> for maior do que O!.!!! 5 protenas
+ Re!9:uo a#inoter#ina +N-ter#ina- 5 um resduo de amino"cido na extremidade com um
grupo *+amino livre em um peptdeo.
+ Re!9:uo car;o<iter#ina +C-ter#ina- 5 um resduo de amino"cido na extremidade com um
grupo *+carboxil livre em um peptdeo.
Luando uma sequencia de um amino"cido de um peptdeo, polipeptideo ou protena apresentada,
a extremidade E+terminal colocada a esquerda, enquanto que a D+terminal colocada a direita. A
sequencia em lida do esquerda para a direita.
As liga$es peptdicas significativamente est"veis.
PEPTIDEOS PODEM SER DISTIN&UIDOS PELOS SEUS COMPORTAMENTOS
DE IONI2A.$O.
/s grupos *+amino e *+carboxil de todos os amino"cidos no terminais, esto covalentemente
unidos por liga$es peptdicas, que no ioni#am e, portanto, no contribuem para o comportamento
acido+basico total dos peptdeos. (ortanto o grupo 0 de alguns aminoacidos podem ioni#ar, e em
um peptdeo esses grupos contribuem para as propriedades "cidos+basicos globais de uma molcula.
Domo um amino"cido livre, os peptdeos possuem curva de titulao caracterstica e um p:
isoeltrico caracterstico, no qual eles no se deslocam em um campo eltrico. 'eve+se destacar
contudo que o valor de pGa de um grupo ioni#"vel pode se modificar quando um amino"cido se
torna um resduo de um peptdeo. A perda das cargas de seus grupo *+amino e *+carboxil, as
intera$es com os outros grupos 0 do peptdeo e outros fatores ambientais podem afetar o pGa.
PEPTIDEOS E POLIPEPTIDEOS ,IOLO&ICAMENTE ATI*OS OCORREM EM
UMA *ASTA &AMA DE TAMANHOS E COMPOSI.$O
(eptideos de ocorr9ncia natural variam em comprimento de dois a muitas centenas de resduos de
aminoacidos. >esmo os menores peptdeos podem apresnetar um importante efeito biolgico.
Algumas protenas consistem em uma 3nica cadeia polipeptdica, enquanto outras, denominadas
protenas multissubunidades, possuem ou mais polipeptideos associados no covalentemente. Se
no mnimo duas dessas cadeias forem id9nticas, a protena c%amada de oi6o#4rica' e as
subunidades id9nticas so os 3rot"#ero!.
(oucas protenas possuem duas ou mais cadeias peptdicas ligadas covalentemente. (odem ser
unidas por ligao de dissulfeto como a insulina. Eestes casos no so considerados como
subunidades e sim como cadeias.
AL&UMAS PROTEINAS CONTEM &RUPOS =UIMICOS ALEM DE
AMINOACIDOS
+ Prote9na! !i#3e! 5 so aquelas que apresentam apenas resduos de aminoacidos, sem nen%um
outros constituintes qumicos.
+ Proteina! con>u6a:a! 5 so aquelas que apresentam componentes qumicos permanentemente
associados com aminoacidos.
+ &ru3o 3ro!t4tico! 5 a parte no aminoacidica de uma protena conjugada.
,xemplos de protenas conjugadasP
+ 7ipoproteinas 5 lipdeos J protenas
+ =licoproteina 5 glicideos J protenas
+ >etaloproteina 5 metal J proteinas
RESUMO 3.2 PEPTIDEOS E PROTEINAS
A) Os aminocidos podem unir-se co*alentemente atra*"s de liga6es peptdicas
para #ormar peptdeos e protenas. A c"lula geralmente contem mil7ares de
di#erentes protenas, cada uma com uma ati*idade biol+gica di#erente.
() As protenas podem ser cadeias peptdicas muito longas, de 800 a muito
mil7ares de resduos de aminocidos. -ontudo, alguns peptdeos ,ue ocorrem
naturalmente possuem somente alguns poucos aminocidos. Algumas protenas
s!o compostas de di*ersas cadeias polipeptdicas associadas n!o co*alentes,
denominadas subunidades.
-) 9roteinas simples somente #ornecem aminocidos ,uando 7idrolisadas:
protenas con;ugadas contem algum outro componente adicional, como um metal
ou um grupo prost"tico org<nico.
3.3 ( TRA,ALHANDO COM PROTEINAS
(ara estudar uma protena em detal%es, o pesquisador precisa ser capa# de separa+las de outras
protenas em sua forma pura e precisa possuir as tcnicas para determinar suas propriedades.
PROTEINAS PODEM SER SEPARADAS E PURI%ICADAS.
4ma preparao pura essencial para que as propriedades e atividades de uma protena possam ser
determinadas.
Domo uma protena pode ser purificadaQ
Atravs de mtodos cl"ssicos que se aproveitam das propriedades dessas protenas que variam de
uma protena para outra, incluindo o taman%o, carga e propriedade de ligao.
/ OR passo lisar as clulas, liberando o extrato bruto6
/ R passo fa#er uma centrifugao para preparar fra$es subcelulares ou isolar organelas
especificas.
Eormalmente, o extrato submetido a tratamentos que separam as protenas em diferentes fra$es
-fracionamento por taman%o ou carga.
- %raciona#ento baseado na diferena de solubilidade das protenas.
- E0eito Salting out um mtodo de separao de protenas com base no princpio de que as
protenas so menos sol3veis em concentra$es elevadas de sal. A concentrao de sal necess"ria
para que a protena precipitado para fora da soluo difere da protena a protena. ,ste processo
tambm usado para concentrar solu$es diludas de protenas. A di"lise pode ser usado para
remover o sal se necess"rio. Luanto maior a concentrao salina, menor a solubilidade da protena.
/ sal de sulfato de am&nio --E:
2
.

S/
2
., bastante utili#ado para solubili#ar protenas.
As protenas que ento precipitam so removidas daquelas que permanecem em soluo por
centrifugao a baixa velocidade.
- Di?i!e A di"lise consiste na separao de partculas coloidais, de taman%o relativamente
grande, de outras partculas menores como os ons ou molculas pequenas, atravs de membranas
semi+perme"veis, isto , membranas perme"veis aos ons Ss molculas pequenas com as da "gua,
mas imperme"veis aos colides. Atravs de processos de di"lise possvel, por exemplo, separar
protenas de amino"cidos e de electrlitos. T um processo que separa protenas de pequenos solutos
se aprovetando do maior taman%o das protenas.
- Cro#ato6ra0ia e# couna A coluna de Dromatografia um dos mtodos mais comuns de
purificao de protenas. ,sta tcnica consiste na passagem da protena atravs de uma coluna -fase
estacion"ria. que desen%ada para reter ou diminuir a velocidade da passagem da fase mvel onde
esto as macromolculas -protenas. e a tcnica baseia+se numa propriedade particular, como o
taman%o, carga ou afinidade qumica. A soluo a analisar deve conter a protena concentrada e o
mtodo deve ser r"pido para evitar a degradao da mesma, devendo no entanto, utili#ar+se
inibidores de proteases.

'ependendo da escol%a da coluna, as protenas podem ser separadas de acordo com a sua carga
-A,U 5 cromatografia de troca inica., sua %idrofobicidade -:AD 5 cromatografia de interaco
%idrofbica., seu taman%o -=? 5 filtrao em gel. ou pela sua capacidade de se ligar a grupos
qumicos particulares.
- Cro#ato6ra0ia :e troca ionica Vaseia+se na carga da protena que estamos a tentar isolar.
Se esta possuir carga positiva, a soluo deve passar por uma coluna com carga negativa
-impedindo a passagem das protenas com carga positiva.. 'epois de fa#er passar a soluo pela
coluna recorre+se ao procedimento Wsalting outX para separar a protena, com carga positiva, da
coluna com carga negativa -este tipo de coluna denominado Wcoluna de troca de c"tionsX e possui
ons de sulfato, imobili#ados na fase estacion"rio.. (ara impedir a passagem de uma protena com
carga negativa utili#a+se uma coluna de carga positiva designada por Wcoluna de troca de BniosX
que, geralmente, possui ons de amnio.
- Cro#ato6ra0ia :e e<cu!8o ou :e 0itra78o e# 6e
A cro3atogra>a d0 >ltra56o 03 g0l 40para a4
prot08na4 co3 #a40 no 40u ta3an?o$ A coluna "
con4titu8da por u3a 3atri9 d0 p0qu0na4 04;0ra4
poro4a4 03pacotada4$ Ao ;a90r pa44ar a 4olu56o d0
prot08na4 p0la 3atri9 da coluna, a4 3ol"cula4
p0qu0na4 0ntra3 no4 poro4 da4 04;0ra4 d03orando
a atra<044@-lo4, 0nquanto qu0 a4 grand04 pa44a3 0ntr0 a4 04;0ra4 40ndo
40parada4 pri30iro$
- Cro#atro6ra0ia 3or A0ini:a:e A cro3atogra>a d0 a>nidad0 #a40ia-40 na4
;un5A04 #iolBgica4 da prot08na qu0 40 liga C coluna$ O tipo 3ai4 co3u3
0n<ol<0 u3 ligando Dp0qu0na #io3ol"cula 04p0c8>ca, por 0:03plo, anticorpoE,
qu0 " i3o#ili9ado 0 ligado a u3a 3atri9 da coluna, co3o a c0lulo40 ou
poliacrila3ida$ A prot08na a anali4ar pa44a d0poi4 atra<"4 da coluna 0 liga-40 a
0la p0lo 40u ligando, 0nquanto qu0 outra4 prot08na4 40r6o li#0rtada4$ A
40para56o da prot08na al<o " nor3al30nt0 ;0ita, pa44ando atra<"4 da coluna
u3a 4olu56o qu0 cont0n?a u3a 0l0<ada conc0ntra56o d0 ligando li<r0$ I4to "
u3 3"todo 3uito 0>ci0nt0 d0 puri>ca56o, u3a <09 qu0 40 #a40ia nu3a
04p0ci>cidad0 #iolBgica da prot08na qu0 40 pr0t0nd0 anali4ar, tal co3o a a>nidad0 d0
u3a 0n9i3a a u3 4u#4trato ou a liga56o 0ntr0 antig"nio 0 anticorpo$ Contudo,
ap04ar da4 inF30ra4 <antag0n4 qu0 a cro3atogra>a con<0ncional o;0r0c0,
04ta 04t@ li3itada p0la n6o ?o3og0n0idad0 na4 3atri904 Dco3o c0lulo40E, qu0
cau4a u3a d04igual 7uid09 do 4ol<0nt0 atra<"4 da coluna$ Co3 o o#G0ti<o d0
col3atar 04ta ;al?a ;oi d040n<ol<ida u3a no<a cro3atogra>a, o ,HLC (High
Performance Liquid CromatographyE$ Hara al"3 di44o ta3#"3 p0r3it0 qu0 a4
prot08na4 40Ga3 40parada4 3ai4 rapida30nt0 do
qu0 p0lo4 3"todo4 con<0ncionai4 0 40parar
3ol"cula4 co3 04trutura4 0 ta3an?o4 3uito
4030l?ant04$
- Cro#atro6ra0ia Liqui:a :e Ata E0ici@ncia +HPLC- High Performance/Pressure Liquide
Chromatography, :(7D. uma tcnica cromatogr"fica. Se distingue por usar a fase mvel S alta
presso -da o YpressureY da sigla em ingl9s.. A :(7D utili#a bombas de alta presso que aceleram
os movimentos das molculas de protenas atravs da coluna, assim como materiais
cromatogr"ficos de alta qualidade que podem lidar com a grande fora do fluxo pressuri#ado. Ao
redu#ir o tempo de transito da coluna, a :(7D pode limitar o espal%amento difusional das bandas
de protenas e assim aumentar significativamente a resoluo.
PROTEINAS PODEM SER SEPARADAS E CARACTERI2ADAS POR
ELETRO%ORESE.
A eletroforese uma tcnica de separao de molculas que consiste na migrao de molculas
com carga, numa soluo, em funo da aplicao de um campo eltrico. A velocidade da migrao
depende da fora do campo aplicado, da carga, do taman%o e da forma das molculas e tambm da
fora i&nica, viscosidade e temperatura do meio, onde estas se movem.
T uma tcnica que pode ser usada para an"lise de protenas. As protenas so molculas
anfotricas, cuja carga determinada pelo p: do meio onde esto suspensas. Euma soluo com
p: acima do ponto isoelctrico, a protena negativamente carregada migra para o Bnodo do campo
elctrico. Abaixo do ponto isoelctrico, a protena positivamente carregada e migra para o c"todo.
4m mtodo eletroforetico comumente utili#ado para a estimativa da pure#a e a massa
molecular fa# o uso do detergente :o:ecia !u0ato :e !1:io ( SDS.
- SDS-PA&E +Sodium Dodecyl Sulate Polyc!ylamide "el Elect!o#$o!e!i! Lae##i' 1ABC- /
objectivo do SDS desnaturar a protena, isto , converter a protena numa estrutura linear -a sua
forma nativa , geralmente, globular. e conferir+l%e densidade de carga uniforme, de forma a
poderem ser separadas por electroforese, somente, em funo do taman%o -massa molecular.. /
SDS tem uma alta carga negativa e p: ; e tem uma cauda %idrofbica que interactua com as cadeias
das protenas -polipeptdeos.. / n3mero de molculas de SDS que se ligam Ss protenas
proporcional ao n3mero de amino"cidos que constituem as mesmas, pois liga+se na ra#o de uma
molcula por ligao peptdica.Se as protenas desnaturadas so postas num campo elctrico, todas
elas se movero para o plo positivo, na mesma proporo, sem possibilidade de avaliar a distBncia
migrada. ,nto, necess"rio coloc"+las num ambiente que permita que protenas de variados
taman%os se desloquem a velocidades diferentes, sendo o meio adequado o gel de poliacrilamida
-polmero de monmeros de acrilamida.. 'e seguida, aplica+se uma corrente elctrica e, como
tal, as molculas movem+se ao longo do gel de poliacrilamida -a todo este processo c%ama+se
,lectroforese em =el de (oliacrilamida., migrando mais rapidamente as de menores dimens$es.
Aps as protenas terem WcorridoX o gel, preciso fix"+las, para evitar que difundam quando se
procede S colorao do mesmo. / "cido actico a 8Z em :

/ um bom fixador, alm de que

mantm as protenas desnaturadas. / gel , tipicamente, corado com a#ul de Doomasie -a fixao e
colorao podem ser preparadas na mesma soluo, usando como solvente o metanol ou sais de prata. e
depois descorado$
- %ocaiDa78o i!oe4trica ,sta tcnica baseia+se nas diferenas dos pontos isoelctricos das
protenas para as separar. As protenas possuem uma carga nativa que pode ser positiva, negativa ou
nula dependendo do p: do meio e para cada protena existe um valor de p: do meio para o qual a
carga da mesma ! -pA, ponto isoelctrico., que geralmente se situa entre N 5 O. Luando uma
protena colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual o gradiente de p:
estabelecido pela mistura de solu$es tampo especiais e sujeita a um campo elctrico ir"
inicialmente mover+se em direco ao elctrodo com carga oposta. 'urante a migrao atravs do
gradiente de p:, a protena ir" captar ou perder prot$es. ,nquanto a protena migra a sua velocidade
vai diminuindo at c%egar ao ponto em que o valor de p: ser" igual ao seu pA. Eeste ponto a
protena ter" carga total neutra e como consequ9ncia deixa de migrar. Se a protena se difundir para
uma regio fora do seu pA, ir" adquirir carga e consequentemente move+se novamente para a
posio onde globalmente neutra. (ode ter grupos ioni#ados, mas globalmente neutra. (roteinas
com diferentes pontos isoeltricos so ento distribudas ao longo do gel.
- Eetro0ore!e ,i:i#en!iona A combinao sequencial da focali#ao isoeltrica com a
eletroforese em S'S demonimado de eletroforese bidimensional. A electroforese de um gel
bidimensional, ao combinar dois processos de separao distintos, pode ser usado para separar mais
de O!!! protenas. Euma primeira etapa as protenas so separadas em funo da sua carga nativa.
As cadeias polipeptdicas so, ento, separadas por um processo de focagem isoelctrica. Euma
etapa posterior o gel de poliacrilamida com forma de cilindro que contm as protenas separadas por
focagem isoelctrica sujeito, novamente, a electroforese mas numa direco em Bngulo recto
Squela usada na primeira etapa. / gel original mergul%ado em S'S e depois colocado numa
extremidade de um WslabX de gel de poliacrilamida S'S, atravs do qual cada cadeia polipeptdica
migra em funo do seu taman%o observando+se no resultado final como um ponto WsptotX. As
3nicas protenas que no so separadas sero aquelas que tero id9ntico taman%o e ponto
isoelctrico, uma situao relativamente rara. At quantidades vestigiais de cada cadeia
polipeptdica pode ser detectada no gel por v"rios processos de colorao 5 ou por autorradiografia
se a amostra da protena tiver sido previamente marcada por um radioistopo. / poder de separao
to grande que duas protenas que diferem em apenas um amino"cido carregado podem ser
prontamente distinguidas.
- Ee!tern ,ottin6 / [estern blotting permite detectar uma protena numa mistura de protenas
dando tambm informao acerca do seu taman%o. Anicialmente as protenas so separadas por
S'S+(A=, e, posteriormente, so transferidas para uma membrana de nitrocelulose -do mesmo
modo que foram separadas no S'S+(A=,.. / polo negativo 5 c"todo, fica do lado do gel e o
positivo + Bnodo no lado da membrana de nitrocelulose para condu#ir as protenas carregadas
negativamente em direco S membrana -carregada positivamente.. A ra#o para a transfer9ncia das
bandas de protenas para uma membrana de nitrocelulose permitir a c%egada dos anticorpos Ss
bandas com maior facilidade e efic"cia, j" que o gel de poliacrilamida no permite a difuso de
grandes molculas. A membrana de nitrocelulose incubada com o anticorpo prim"rio que se liga S
protena que se pretende detectar, formando um complexo anticorpo+protena. Seguidamente +l%e
adicionado o anticorpo secund"rio conjugado, anticorpo+en#ima, que se vai ligar ao anticorpo
prim"rio. A en#ima -ex. fosfat"se alcalina ou peroxidase. funciona como um sinali#ador molecular
que permite a visuali#ao do local da protena detectada. Eo entanto, para que a en#ima seja
visuali#ada necess"rio coloc"+la na presena de uma mistura reactiva especfica. T adicionado um
substrato cromognico, que ao ser degradado pela en#ima conjugada com o anticorpo dar" origem a
um precipitado insol3vel colocali#ado com o anticorpo prim"rio que por sua ve# se ligou S protena.
(odem tambm ser utili#ados outros tipos de marcadores como os fluorescentes ou os radioistopos
-que podem ser detectados por tcnicas de autorradiografia..
PROTEINAS N$O SEPARADAS PODEM SER =UANTI%ICADAS.
(ara protenas que so en#imas, a sua quantidade em uma dada soluo ou extrato de tecidos pode,
ser medida ou testada em termos do efeito cataltico que a en#ima produ# 5 isto , o aumento na
velocidade pela qual o substrato convertido a produtos de reao quando a en#ima esta presente.
(ara isto preciso saberP +1- a equao global da equao globali#ada, +5- um processo analtico
para a determinao do desaparecimento do substrato ou a aparecimento de um produto da reao,
+3- se a en#ima requer cofatores como ons met"licos ou coen#imas, +F- a depend9ncia da atividade
en#im"tica na concentrao de substrato, +G- o p: timo e +H- a faixa de temperatura na qual a
en#ima est"vel e possui atividade mais alta.
/ termo atiIi:a:e refere+se ao total de unidades da en#ima em uma soluo. A atividade especifica
o numero de unidades de en#imas por miligrama de protena total. A atiIi:a:e e!3eci0ica uma
medida da pure#a da en#imaP aumenta durante a purificao de uma en#ima e torna+se m"xima e
constante quando a en#ima esta pura.
4ma protena geralmente considerada pura quando etapas de purificao adicionais no levam ao
aumento da atividade especifica e quando somente uma 3nica espcie proteica pode ser
determinada.
(ara protenas que no so en#imas so necess"rios outros mtodos de quantificao. (rotenas de
transporte podem ser detectadas por suas liga$es as molculas que elas transportam, enquanto
%orm&nios e toxinas podem ser testados pelos efeitos biolgicos que produ#em
R=$>?O @.@ % ARA(A&.A30O -O? O$ 9ROA=B3A$
A) 9rotenas s!o separadas e puri#icadas com base em di#erenas nas suas
propriedades as protenas podem ser precipitadas seleti*amente pela adi!o de
certos sais. >ma ampla gama de processos cromatogr#icos utili1a di#erenas
no taman7o, a#inidade de liga!o, carga e outras propriedades. =stas incluem
troca i4nica, exclus!o por taman7o, a#inidade e cromatogra#ia li,uida de alta
per#ormance.
() A eletro#orese separa as protenas com base em suas massas e cargas. A
eletro#orese de gel de poliacrilamida-$0$ e a #ocali1a!o isoel"trica podem
ser usadas separadamente ou em combina!o para uma maior resolu!o.
-) Aodos os processos de puri#ica!o re,uerem um m"todo para a ,uanti#ica!o ou
a a*alia!o da protena de interesse na presena de outras protenas. A
puri#ica!o pode ser monitorada pela a*alia!o da ati*idade especi#ica.
3.F ( ESTRUTURA DAS PROTEINASJ ESTRUTURA PRIMRIA
As distin$es mais bvias entre as protenas so as estruturais. Luatro nveis de estrutura de
protenas costumam ser definidas. 4ma descrio de todas as liga$es covalentes -principalmente
liga$es peptdicas e liga$es dissulfetos. que conectam os resduos de amino"cidos em uma cadeia
polipeptdica esta em sua e!trutura 3ri#?ria. / elemento mais importante de sua estrutura
primaria a sequencia de resduos de amino"cidos. A e!trutura !ecun:?ria refere+se a arranjos de
amino"cidos particularmente est"veis, dando oriegm a padr$es estruturais decorrentes. A e!trutura
terci?ria descreve todos os aspectos do dobramento tridimensional de um polipeptdeo. Luando
uma protena possui duas ou mais cadeias polipeptdicas sua organi#ao espacial denominada de
e!trutura quatern?ria.
As diferenas na estrutura primaria podem ser particularmente informativas. Dada protena possui
um numero e uma sequencia de amino"cidos distintos. A estrutura primaria determina como ela se
enovela em uma estrutura tridimensional 3nica e esta, por sua ve#, determina a funo da protena.