Fermentacao Alcoolica V2

Fermentacaoalcoolica v2.0.
doc 1 6/7/2011
FERMENTAO ALCOLICA .................................................................................... 9
Microbiologia Bsica .................................................................................................... 9
Leveduras ................................................................................................................. 9
Morfologia da clula ............................................................................................. 9
Forma da clula ................................................................................................ 9
Tamanho da clula ............................................................................................ 9
Estrutura da clula .............................................................................................. 10
Parede celular ................................................................................................. 10
Membrana citoplasmtica ou Plasmalema ..................................................... 10
Ncleo ............................................................................................................. 11
Vacolos ......................................................................................................... 11
Mitocndria .................................................................................................... 12
Citoplasma ...................................................................................................... 13
Cpsulas .......................................................................................................... 13
Reproduo ......................................................................................................... 13
Reproduo vegetativa ................................................................................... 13
Reproduo por esporos ................................................................................. 14
Fisso .............................................................................................................. 14
Leveduras contaminantes ou nativas .................................................................. 14
Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras....................... 17
Nutrio e crescimento das leveduras ................................................................ 19
Bactrias ................................................................................................................. 20
Morfologia das clulas bacterianas..................................................................... 20
Forma das bactrias ........................................................................................ 20
Dimenses da clula bacteriana ...................................................................... 21
Estrutura bacteriana ............................................................................................ 21
Membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ............................................... 23
Citoplasma ...................................................................................................... 23
Material celular ............................................................................................... 23
Flagelos ........................................................................................................... 24
Cpsulas .......................................................................................................... 24
Reproduo bacteriana ....................................................................................... 24
Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana ............................................ 26

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 2 6/7/2011
Caracterizao e Classificao dos Microrganismos.......................................... 27
Classificao em Nvel de Gnero.................................................................. 28
Classificao em Nvel de Espcie ................................................................. 29
Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcool ............................................ 30
Estudo do fenmeno da floculao ......................................................................... 37
Medida da Floculao ......................................................................................... 39
Monitoramento e interpretao dos dados do laboratrio industrial .......................... 40
Tabela para interpretao das anlises laboratoriais ............................................... 41
Procedimentos ........................................................................................................ 43
Fatores que afetam o desempenho fermentativo ........................................................ 47
Glicerol ................................................................................................................... 48
cido succnico ...................................................................................................... 49
cido actico .......................................................................................................... 49
Biomassa ................................................................................................................. 50
Estequiometria da fermentao .............................................................................. 50
Carboidratos de reserva .......................................................................................... 50
Espcie de levedura ................................................................................................ 51
Identificao de leveduras pela tcnica da cariotipagem .................................... 52
Permanncia de leveduras tradicionais no processo fermentativo ..................... 53
Seleo de linhagens para fermentao industrial .............................................. 53
Nutrio mineral da levedura ................................................................................. 54
Principais nutrientes e suas funes ................................................................... 55
Potssio ........................................................................................................... 55
Magnsio ........................................................................................................ 55
Clcio .............................................................................................................. 55
Zinco ............................................................................................................... 56
Mangans ........................................................................................................ 56
Ferro ............................................................................................................... 56
Cobre .............................................................................................................. 56
Molibidenio, Cobalto e Boro .......................................................................... 56
Nitrognio ....................................................................................................... 56
Fsforo ............................................................................................................ 57
Enxofre ........................................................................................................... 58

Inibidores da fermentao ...................................................................................... 58
Alumnio ............................................................................................................. 58
Sulfito ................................................................................................................. 59
Temperatura ........................................................................................................ 59
pH ....................................................................................................................... 60
Contaminao bacteriana .................................................................................... 61
MATRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAO ALCOLICA ................................. 62
Caldo: composio, pr-tratamento, controle de qualidade ....................................... 62
Composio ............................................................................................................ 62
Pr-tratamento do caldo .......................................................................................... 63
Processos de tratamento ......................................................................................... 63
Processo de tratamento do caldo para destilaria 1 ........................................... 63
Controle de qualidade do caldo .............................................................................. 65
Mel final: composio, armazenamento e controle de qualidade. .............................. 65
Composio ............................................................................................................ 65
Armazenamento ...................................................................................................... 66
Controle de qualidade ............................................................................................. 66
CONTROLE MICROBIOLGICO MICROSCOPIA ............................................... 67
Microscpio tico ....................................................................................................... 67
Microscopia de Campo Claro ................................................................................. 67
Parte mecnica .................................................................................................... 68
Parte ptica ........................................................................................................ 68
Recomendaes para uso do microscpio tico ................................................. 68
Antes de iniciar o uso. .................................................................................... 68
Ajuste da Dioptria ........................................................................................... 69
Manuteno do equipamento .............................................................................. 69
Mtodo de determinao da viabilidade celular de leveduras .................................... 70
Especificaes da cmara de NEUBAUER............................................................ 71
Preparo das solues ............................................................................................... 72
Soluo estoque de Eritrosina............................................................................. 72

Tampo Fosfato .................................................................................................. 72
Soluo de trabalho ............................................................................................ 73
Procedimento analtico ........................................................................................... 73
Clculos .................................................................................................................. 74
Viabilidade celular .............................................................................................. 74
Contagem de clulas em brotamento .................................................................. 74
Populao de Leveduras ..................................................................................... 74
Exerccios ........................................................................................................... 75
Mtodo para contagem de bactrias ao microscpio tico ......................................... 75
Soluo A - sulfato azul de nilo - 2,0% .............................................................. 77
Soluo B - azul de metileno - 0,20% ................................................................ 77
Soluo de trabalho ............................................................................................ 77
Amostras de caldos, PCTS, primrio e misto ..................................................... 78
Amostras de vinho bruto e levedo tratado .......................................................... 78
Clculos .............................................................................................................. 79
Exerccios ........................................................................................................... 79
Teste de Gram ............................................................................................................. 80
Soluo de cristal violeta .................................................................................... 80
Soluo de safranina ........................................................................................... 81
Soluo de iodo-lugol ......................................................................................... 81
Para Microrganismos em Suspenso Lquida ..................................................... 81
Para Microrganismos de Cultivos Slidos ......................................................... 82
Tcnica de Colorao ......................................................................................... 82
Interpretao ........................................................................................................... 83
Quantificao .......................................................................................................... 84
Deteco de esporos ................................................................................................... 84
Soluo de verde malaquita .................................................................................... 85
Soluo de safranina ............................................................................................... 85

Procedimento analtico ............................................................................................... 85
Interpretao/Quantificao dos Esporos ............................................................... 86
Teste de Floculao .................................................................................................... 87
Procedimento Analtico .......................................................................................... 87
Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos, atravs da variao da acidez .. 88
Soluo estoque de actidiona (inibidor de leveduras). ....................................... 89
Soluo estoque de Antimicrobianos ................................................................. 89
Determinao da acidez .......................................................................................... 90
Determinao da acidez sulfrica (inicial e final) das amostras. ...................... 90
Clculo ................................................................................................................ 91
Interpretao dos resultados ............................................................................... 91
Exemplo .................................................................................................................. 92
Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos por spectrofotometria ............... 92
Preparo das Solues Estoque ................................................................................ 92
Meios de Cultivo .................................................................................................... 93
Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer, 1961) ..................................................... 93
Meio de Cultivo ( GLT) ..................................................................................... 93
Preparo do Inculo ................................................................................................. 94
Realizao do Teste ................................................................................................ 94
Leitura da Densidade ptica ( D. O . ) ................................................................... 95
Interpretao dos Resultados .................................................................................. 95
Relao de materiais necessrios para instalao do laboratrio de controle
microbiolgico microscopia .................................................................................... 96
Equipamentos ......................................................................................................... 96
Vidraria ................................................................................................................... 96
Reagentes ................................................................................................................ 96
Outros ..................................................................................................................... 97
Pipetadores automticos ......................................................................................... 97
Modelos de boletim para o controle microbiolgico por microscopia ....................... 97
Matria-prima ......................................................................................................... 97
Moenda ................................................................................................................... 98

Fermentao ........................................................................................................... 98
CONTROLE MICROBIOLGICO PLAQUEAMENTO .......................................... 99
Introduo ................................................................................................................... 99
Esterilizao ............................................................................................................... 99
Esterilizao por Calor mido - Autoclave ........................................................... 99
Constituio da Autoclave ................................................................................ 101
Operao da autoclave .......................................................................................... 101
Esterilizao por Calor Seco ................................................................................ 102
Esterilizao por calor seco Estufa ................................................................ 103
2.1.2 Operao da estufa .............................................................................. 103
Esterilizao por Filtrao .................................................................................... 103
MEIOS de CULTIVO .................................................................................................. 104
Plate Count Agar (P C A - Agar Padro) Bactrias Aerbios Mesfilas Totais .. 104
gar- Man, Rogosa & Sharpe (MRSA) - Bactrias Lcticas Totais .................... 105
Extrato de Levedura- Peptona- Dextrose - gar (YEPD +A) Leveduras .......... 105
Meio Mayeux & Colmer Teste de Sensibilidade ............................................... 105
Meio de Cultivo G. L .T. Teste de Sensibilidade .................................................. 106
INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO Solues Estoque ............... 106
Bactrias ................................................................................................................... 106
Leveduras ................................................................................................................. 106
MTODOS PARA CONTAGEM DE CLULAS VIVEIS: LEVEDURAS E
BACTRIAS ................................................................................................................ 107
Plaqueamento por Incorporao ou Profundidade (Mtodo Pour Plate) .............. 107
Diluio em srie ...................................................................................................... 107
Tcnica de plaqueamento ......................................................................................... 108
Clculo do nmero UFC/ml. .................................................................................... 108
Plaqueamento de Superfcie (Mtodo Spread Plate) ............................................. 109
Clculo do nmero de UFC/ml ............................................................................. 110
Avaliao da Populao Microbiana por Filtrao em Membrana. ......................... 110
Procedimento analtico ......................................................................................... 112
Cultivo por Estrias .................................................................................................... 113

Cultivo em PetriFilm ............................................................................................. 114
OUTRAS ANLISES .................................................................................................. 115
Avaliao da Floculao da Levedura ...................................................................... 115
Procedimento Analtico .................................................................................... 116
FLOCULAO DAS CLULAS DE LEVEDURAS ................................................ 117
Floculao da levedura pela bactria Lactobacillus fermentum ............................... 119
Aspectos gerais ..................................................................................................... 120
Aspectos genticos ............................................................................................... 122
Ao de ons ......................................................................................................... 123
Aspectos fsico-qumicos ...................................................................................... 124
Aspectos qumicos ................................................................................................ 124
Mecanismos de floculao ................................................................................... 124
Hidrofobicidade celular .................................................................................... 124
Ligao tipo-lectina .......................................................................................... 125
Reconciliao dos dois mecanismos ................................................................ 125
Cofloculao levedura-bactria ............................................................................ 125
Ao de bactrias .................................................................................................. 126
Consideraes importantes ................................................................................... 127
CIDO LTICO .......................................................................................................... 128
Produo de cidos por microrganismos .................................................................. 128
Histrico ............................................................................................................... 128
Consideraes Gerais ........................................................................................... 129
Bactrias lticas ................................................................................................ 129
Requerimentos nutricionais .............................................................................. 130
Caractersticas da colnia ................................................................................. 130
Tolerncia acidez: .......................................................................................... 130
Padres de fermentao de carboidratos em bactrias lticas .............................. 130
Bactrias homofermentativas ........................................................................... 130
Bactrias heterofermentativas .......................................................................... 131
Principais bactrias lticas .................................................................................... 131
TIPOS DE FERMENTAO ALCOLICA .............................................................. 131

Fermentao descontnua ou batelada ...................................................................... 131
Conduo da fermentao .................................................................................... 131
Providencias preliminar para partida ................................................................ 131
Partida e sistemas de partida ............................................................................. 132
Partida com tubo de cultura pura .................................................................. 133
Partida com leite de fermento selecionado ................................................... 135
Partida com fermento prensado .................................................................... 137
Controle operacional da fermentao contnua ........................................................ 138
Introduo e estratgias ........................................................................................ 138
Interpretao dos parmetros do laboratrio ........................................................ 139
Critrios de dimensionamento da fermentao alcolica ......................................... 140
Dornas ................................................................................................................... 140
Resfriamento de dornas ........................................................................................ 142
Centrfugas de fermento ....................................................................................... 144
Tratamento do fermento p-de-cuba.................................................................. 145
PERDAS DURANTE O PROCESSO .......................................................................... 145
Qualidade da cana-de-acar .................................................................................... 146
Lavoura ................................................................................................................. 146
Carregamento, transporte e recepo .................................................................... 147
Armazenamento: ptio e barraco ........................................................................ 147
Lavagem ............................................................................................................... 148
Preparo e extrao ................................................................................................ 148
Caldo e mosto ........................................................................................................... 149
Aquecimento e decantao ................................................................................... 149
Resfriamento do mosto ......................................................................................... 151
Fermentao ............................................................................................................. 151
Centrifugao ........................................................................................................... 151
Tempo de aproveitamento ........................................................................................ 152

FERMENTAO ALCOLICA
Microbiologia Bsica
Leveduras
A palavra levedura traz imediatamente mente a idia "fermentao", pois os dois
termos tm sido muito associados atravs da histria. Entretanto, o desenvolvimento
do conceito de levedura pode ser considerado como tendo tido incio por volta de 1680
(Van Leeuwenhoek). Mas foi somente aps os estudos do gnio Pasteur, em 1876,
que se caracterizou a individualidade da levedura como um organismo vivo com
caractersticas prprias.
Morfologia da clula
Forma da clula
A clula da levedura pode apresentar vrias formas, as quais podem ser os resultados
da maneira de reproduo vegetativa bem como das condies de cultivo e idade da
cultura. As formas que mais comumente so encontradas so esfrica, globosa,
ovide e alongada, embora existam certas leveduras com formas altamente
caractersticas. Entretanto, dizer que uma determinada forma de clula caracterstica
de uma dada espcie ou gnero, no significa que em uma populao de leveduras
todas as clulas apresentaro aquela forma, mas pelo menos em um determinado
perodo do desenvolvimento celular as clulas tero uma forma caracterstica.
Tamanho da clula
O tamanho da clula de levedura tambm variado, mas numa cultura jovem o
tamanho da clula pode ser bem uniforme em algumas espcies ou extremamente
heterogneo em outras. Estas disparidades podem ser usadas para diferenciao
entre espcies e algumas vezes at mesmo entre linhagens da mesma espcie. De
uma maneira geral as leveduras industriais variam consideravelmente no que se refere
s suas dimenses, com limites desde 1 a 5 m de largura e 5 a 30 m de
comprimento.

Estrutura da clula
A maioria das investigaes feitas sobre as estruturas da clula de levedura
baseada em trabalhos feitos com Saccharomyces cerevisiae. As informaes sobre a
citologia da levedura tm sido obtidas por observaes diretas com o microscpio
ptico, tcnicas de colorao da clula para componentes especficos, microscopia
eletrnica de transmisso de cortes ultrafinos das clulas, bem como atravs da
microscopia de varredura.
As principais micro-estruturas da clula de levedura so: a parede celular, a
membrana citoplasmtica ou plasmalema, o ncleo, um ou mais vacolos e a
mitocndria.
Parede celular
A parede celular pode ser vista com um simples microscpio ptico (campo claro)
como uma linha externa da clula. Embora um pouco elstica, sua rigidez
responsvel pela forma particular que a clula apresenta. Com o microscpio
eletrnico de varredura, quando a clula ntegra observada pode-se verificar
perfeitamente a presena das cicatrizes dos brotamentos na parede celular.
A parede celular das leveduras fina nas clulas jovens, espessando-se com a idade.
Os principais constituintes da parede celular de Saccharomyces cerevisiae so os
polissardeos glicano (30 a 34%) e manano (30%).
Basicamente a parede celular do gnero Saccharomyces consiste de trs camadas: a
camada interna de glucana insolvel em alcali; a camada intermediria de glucana
solvel em alcali e a camada exterior de glicoprotena na qual o carboidrato a
manana fosforilada. Na parede celular so encontrados ainda outros compostos, como
lipdeos e heteropolissacardeos, dependendo do gnero e espcie considerados.
As protenas so constituintes constantes das paredes celulares das leveduras.
Saccharomyces cerevisiae apresenta 6 a 8% de protenas, parte das quais
provavelmente enzimas, j que invertases e outras hidrolases foram identificadas na
parede celular. As concentraes em lipdeos variam de 8,5 a 13,5%.
A quantidade de quitina tambm varia com a espcie sendo que Saccharomyces
cerevisiae apresenta entre 1 a 2% deste composto; j a glicosamina foi encontrada em
pequenas quantidades nas paredes das leveduras.
Membrana citoplasmtica ou Plasmalema

Esta estrutura localizada diretamente abaixo da parede celular e tem uma importante
funo na entrada seletiva de nutrientes do meio de crescimento. Ela protege tambm
a clula de perder compostos de baixo peso molecular por vazamento do citoplasma e
ela representa a "matriz" sobre a qual os compostos da parede celular so
depositados durante o crescimento da clula. Na composio qumica do plasmalema
encontrada uma mistura complexa de lipdeos neutros (mono, di e triglicerdeos),
esterois livres e esterificados (principalmente ergosterol), esfingolipdeos complexos,
glicerofosfatideos, neutro e cido glicolipdeos. Os cidos graxos nos vrios
componentes so de cadeia longa (C16 - C26) com o cido olico (C18:1) sendo o
cido graxo mais importante.
Ncleo
O ncleo das clulas de levedura no facilmente visto ao microscpio ptico (campo
claro) quando as clulas so preparadas para observao em suspenso aquosa. Por
outro lado, ao microscpio de contraste de fase, o ncleo pode ser observado em
leveduras desenvolvidas em meio nutritivo contendo 18-21% de gelatina.
Os exames de cortes ultrafinos mostram que o ncleo das leveduras uma organela
bem definida, circundada por uma membrana nuclear semipermevel, com funes
metablicas e reprodutivas.
O ncleo composto de uma parte opticamente densa, o nuclolo, e uma poro
menos densa que contm o material cromatnico. Alm do DNA, o ncleo contm
vrias categorias de RNA e um tipo de polifosfato com uma cadeia de 20 a 40
resduos de ortofosfato.
Durante a formao do brotamento das leveduras a diviso do ncleo acompanhada
por alongamento e constrio deste, a qual acontece naturalmente no pescoo do
broto. Ambos, nuclolo e a poro contendo cromatina se dividem e so incorporados
no ncleo das duas novas clulas.
Vacolos
Quando as clulas de levedura so vistas ao microscpio de contraste, usualmente
pode-se observar um ou mais vacolos de diferentes tamanhos (0,3 - 3,0 m de
dimetro). Eles tm geralmente aparncia (forma) esfrica e so mais transparentes a
um feixe de luz que o citoplasma que os circunda. Quando as clulas so colocadas
em meio nutritivo e comeam a emitir brotamentos os grandes vacolos se dividem
por constrio em numerosos pequenos vacolos. Durante o desenvolvimento do
broto os vacolos so distribudos entre as clulas me e filha (brotamento). Depois de

completado o processo de brotamento os pequenos vacolos podem se fundir para
formar novamente grandes vacolos.
Ao microscpio eletrnico pode-se observar que o vacolo cercado por uma simples
membrana, a qual dada a sua constituio est relacionada ao transporte de
substncias armazenadas no vacolo. Uma grande variedade de compostos de alto e
baixo peso molecular pode entrar no vacolo. Por exemplo, no vacolo podem ser
encontrados polimetafosfatos (volutina), purinas, derivados de purina de baixa
solubilidade formando cristais, os quais apresentam ativo movimento Brawniano e,
portanto conhecidos como "dancing bodies". Tambm uma grande poro dos
aminocidos livres da levedura armazenada no vacolo e tem sido sugerida inclusive
a presena de lipdeos nos vacolos.
Os vacolos servem tambm como vesculas de armazenamento para vrias enzimas
hidrolticas, incluindo proteases, ribonucleases e esterases. Quando em condies
adversas, o vacolo pode se romper e o processo de autlise da clula acontecer. A
existncia de hidrolases nos vacolos tambm sugere que estes sejam os lisossomos
celulares (compartimento onde se do a ciso e sntese de macromolculas). Os
vacolos tambm funcionam como reservatrio energtico, com os materiais acima
temporariamente no metabolizados.
Mitocndria
As mitocndrias ocorrem como organelas membranas-limitadas que, ao exame
microscpico tm a aparncia de filamentos pregueados com dimetro de 0,3 a 1 m e
comprimento de at 3 m.
Em Saccharomyces elas esto geralmente localizadas bem prximas periferia da
clula, mas em leveduras aerbias obrigadas elas esto mais distribudas atravs do
citoplasma. O nmero de mitocndria pode variar de um a vinte por clula.
Durante o brotamento celular as mitocndrias tambm se dividem e so distribudas
entre a clula me e a filha. Estas organelas so envolvidas por uma membrana
externa e outra interna as quais formam as cristas que se estendem dentro do estroma
mitocondrial.
As mitocndrias so ricas em lipdeos, fosfolipdeos e ergosterol. Elas contm tambm
DNA, RNA e protenas, incluindo RNA polimerase e um grande nmero de enzimas
respiratrias participando no ciclo do TCA e transporte de eltrons.
Uma vez que as mitocndrias contm as enzimas respiratrias, sua principal funo
a de converso aerbia de energia.
Sob condies anaerbias de fermentao de glucose ou mesmo sob condies

aerbias em altas concentraes de glucose (5-10%) as mitocndrias parecem se
degenerar, transformando-se na chamada promitocndria, com cristas pouco
desenvolvidas, o que faz com que diminua a capacidade respiratria. Por outro lado, a
respirao pode ser restabelecida facilmente pela diminuio da concentrao de
glucose e arejamento das clulas.
Citoplasma
O citoplasma a matriz na quais todas as organelas discutidas at agora esto
localizadas. Ele contm grandes quantidades de ribosoma, polifosfato e os
polissacardeos de reserva, glicognio e trealose, enzimas glicolticas, etc. De 1,0 a
5,0% de DNA da levedura podem estar presentes no citoplasma.
Cpsulas
Algumas leveduras so cobertas por um material extracelular limoso, viscoso e
aderente, que a substncia capsular. A maior parte das cpsulas de leveduras tem
composio polissacardica, incluindo heteropolissacardeos e substncias
semelhantes ao amido.
Reproduo
Reproduo vegetativa
As leveduras podem se reproduzir por esporulao, por gemulao (brotamento) ou
por fisso. O mtodo mais comum o da gemulao onde forma-se um tubo a partir
do vacolo nuclear, adjacente ao ncleo da clula-me, orientando para um ponto da
parede celular mais prxima do vacolo. Ali, forma-se uma pequena protuberncia na
superfcie mais externa da clula, produzida por um enfraquecimento local da parede
celular existente. O tubo passa para a protuberncia, que aumenta de volume e se
enche com material nuclear e citoplasmtico da clula-me. A parede do broto contm
apenas material recentemente sintetizado. Quando a gmula estiver com tamanho
aproximado ao da clula-me, o aparelho nuclear de ambas as clulas se reorienta, de
modo que os entrossomos de cada unidade sejam vistos no ponto de unio.
Completada a diviso nuclear, forma-se uma parede transversal, de modo semelhante
ao que ocorre nas leveduras em diviso. Durante sua vida uma clula madura produz,
por gemulao, uma mdia de 24 clulas-filhas. As gemulaes sucessivas so
sempre formadas em locais diferentes na superfcie celular, permanecendo cicatrizes
das gmulas como resultado deste processo de reproduo.

Reproduo por esporos
A formao de esporos sexuados em leveduras de grande importncia biolgica. A
esporulao constitui uma fase do ciclo sexual da levedura, isto , alternncia da
condio haplide (1n cromossomos) e diplide (2n cromossomos). Este ciclo permite
a levedura sofrer recombinaes genticas, mutao, hibridao e seleo; processos
esses que levam as mudanas evolucionrias (melhoramento gentico).
geralmente conhecido que condies de aerobiose so essenciais para
esporulao, uma vez que pouco ou nenhum esporo so formados sob condies
anaerbias (fermentao).
O nmero de esporos pode variar para uma espcie particular, embora a maioria das
leveduras forme um nmero mximo definido de esporos em cada asco. Em algumas
leveduras o nmero mximo oito. Mas na maioria das leveduras ascosporogenas
(Saccharomyces cerevisiae) o nmero mximo de esporos quatro por asco, embora
ascos com dois ou trs esporos sejam comuns nesta espcie.
Fisso
Durante este processo reprodutivo a levedura aumenta de tamanho ou se alonga,
o ncleo se divide e as duas clulas-filhas so formadas. Durante os perodos de
rpida multiplicao, as clulas podem se dividir sem se separarem, formando-se
cadeias de clulas. Este processo de reproduo caracterstico para o gnero
Schizosaccharomyces.
Leveduras contaminantes ou nativas
A presena de leveduras contaminantes (selvagem) tem trazido srios problemas para
a fermentao, tanto na produo de vinhos como na fabricao de cerveja, e, at
mesmo na produo de fermento prensado para panificao. Esses contaminantes
podem trazer problemas graves no que se refere ao processo fermentativo e,
principalmente a deteriorao do produto final, provocando o aparecimento de sabores
e aromas que descaracterizam totalmente a bebida.
Na produo de lcool a partir do melao e/ou do caldo de cana-de-acar a presena
de leveduras contaminantes tem sido pouco ou raramente mencionada. Entretanto,
nas safras 84/85 at 88/89, embora no se tenha feito testes especficos, em algumas
destilarias a presena de clulas de levedura com caractersticas diferentes (forma,
tamanho, tipo de colnias) daquelas da levedura alcolica foi constatada.

A proporo destas leveduras em relao levedura alcolica tem variado bastante,
desde algumas clulas at quase total dominncia. A origem destas leveduras
contaminantes (selvagem) varivel, destacando-se como principais, o melao, o
xarope, a gua de lavagem de cana e o prprio solo. Essas leveduras podem chegar
as dornas de fermentao tanto na forma vegetativa como de esporos. A
predominncia de uma ou de outra forma vai depender do tipo de processo
empregado pela indstria, ou seja, com ou sem tratamento trmico do caldo
(aquecimento, decantao, concentrao, etc.).
Os efeitos da presena de leveduras contaminantes na fermentao alcolica podem
ser sentidos pelo abaixamento do rendimento da fermentao, maior tempo de
fermentao, maior formao de espumas pelo aumento da viscosidade, etc. A maior
ou menor intensidade desses fatores vai depender das caractersticas fisiolgicas da
espcie de levedura contaminante, ou seja, se Saccharomyces ou no
Saccharomyces.
O caso encontrado por ns (Fermentec) mais impressionante, foi na fermentao
contnua da Usina Vale do Rosrio (Morro Agudo), onde a levedura selvagem
provocou srios prejuzos. Sua forma era diferente da levedura industrial (TA, no caso)
e as clulas filhas no se soltavam da clula me, formando verdadeiros cachos.
A quantidade de espuma era intensa e foi necessrio modificar todo o processo para
poder continuar produzindo lcool. Esta levedura foi identificada (Barre, Montpellier,
Frana) como sendo uma Candida krusei.
Esta levedura foi encontrada no caldo, na gua de refrigerao das dornas, e por
incrvel que parea, na vinhaa. A passagem pelo aparelho de destilao no
conseguia elimin-la completamente.
Assepsia rigorosa, monitoramento constante, controle da temperatura de aquecimento
do caldo e controle da temperatura da fermentao foram as maneiras que
conjuntamente se conseguiu contornar o problema.
Na safra 88/89, ocorreram dois casos de contaminao com levedura selvagem entre
os clientes da Fermentec, com srios problemas para o processo. Em ambas as
indstrias houve um grande aumento do tempo de fermentao e uma sensvel
diminuio do rendimento, uma vez que a levedura contaminante dominou
completamente o processo.
Um levantamento feito por plaqueamento, mostrou que esta levedura se encontrava
disseminada em todo o processo, que era oriunda da cana e que estava passando
pelo tratamento trmico uma vez que a temperatura de aquecimento era igual ou
inferior a 100C.

As caractersticas bsicas diferenciais desta levedura contaminante eram clulas
alongadas com brotamento exclusivamente unipolar (apical).
O problema foi resolvido pela troca de todo o fermento em processo e a elevao da
temperatura de aquecimento do caldo para 105 - 110C.
Testes realizados com meios diferenciais pelo setor de Microbiologia da Fermentec e
pelo Instituto National De La Recherche Agronomique da Frana (INRA) mostraram
que esta levedura no pertencia ao gnero Saccharomyces, e segundo Barre, era uma
Candida krusei de linhagem diferente da encontrada na Vale do Rosrio.
Durante as safras 91/92 a 97/98 vrias outras leveduras contaminantes foram isoladas
e caracterizadas de amostras de mosto de alimentao e vinho bruto de clientes da
Fermentec. Atravs de testes de assimilao e fermentao de carboidratos, segundo
o procedimento da taxonomia numrica descrito por GRIFFITHS (1981) foram
encontradas Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces capensis, Saccharomyces
bayanus, Candida krusei, Pichia ohmeri, Trichosporum brassicae, Torulaspora
pretoriensis e Kluyveromyces vanudenii entre outras.

FOTO - 1 e 2: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces cerevisiae

FOTO - 3 e 4: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces chevalieri


FOTO - 5 e 6: Clulas vegetativas e colnias de Kluyveromyces vanudenii

FOTO - 7 e 8: Clulas vegetativas e colnias de Candida krusei
Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras.
Em biotecnologia corrente o emprego do termo fermentao para definir reaes
microbianas. No conceito bioqumico, se o substrato for completamente oxidado diz-se
que h respirao e se o substrato for parcialmente degradado acarretando a
formao de metablitos diz-se que h fermentao.
A levedura como entidade viva independente, realiza a fermentao do acar com o
objetivo de conseguir a energia qumica necessria sua sobrevivncia, sendo o
etanol apenas e to somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende
beneficiar-se dessa habilidade metablica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe
permitam propiciar s leveduras, condies ideais para que as mesmas trabalhem a
seu favor, isto , com maior eficincia na produo de etanol. A clula de levedura
possui compartimentaes para adequao de sua atividade metablica. A
fermentao alcolica (gliclise anaerbia) ocorre no citoplasma, enquanto que a
oxidao total do acar (respirao) se d na mitocndria.
A transformao do acar (glicose) at resultar em etanol e CO
2
envolve 12 reaes
em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica. Tais
enzimas sofrem aes de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores,
substncias do prprio metabolismo, pH, temperatura, etc.), alguns que estimulam,
outros que reprimem a ao enzimtica, afetando assim o desempenho do processo.

O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o acar, gerar
uma forma de energia qumica (ATP) que ser empregada na realizao dos diversos
trabalhos fisiolgicos (absoro, excreo, etc.) e biossnteses, necessrios
manuteno da vida, crescimento e multiplicao, perpetuando assim a espcie. O
etanol e o CO
2
resultantes se constituem em produtos de excreo, sem utilidade
metablica para a clula em anaerobiose. Entretanto o etanol e outros produtos de
excreo podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas
apenas em condies de aerobiose.
Em termos energticos a respirao muito mais eficiente (produo de ATP) do que
a fermentao, motivo pelo qual, a oxigenao permite uma maior multiplicao da
levedura.
Durante a fermentao, na seqncia de reaes de produo de ATP, intrnsecas
formao de etanol, rotas metablicas alternativas aparecem para propiciar a
formao de materiais necessrios produo da biomassa (polissacardeos,
protenas, cidos nuclicos, etc.) bem como para a formao de outros produtos de
interesse metablico, relacionados direta ou indiretamente com a adaptao e
sobrevivncia, os quais desviam esqueletos carbnicos provenientes do acar,
reduzindo a produo de etanol. ele, o glicerol, os cidos orgnicos (principalmente
o succnico e o actico), que conjuntamente com a biomassa so quantitativamente os
principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilbrio do redox celular em
anaerobiose.
A fermentao alcolica um processo no oxidativo, sem a participao do oxignio
molecular (O
2
), e, portanto, para se manter o equilbrio de redox celular, todo NADH
formado (em reaes de oxidao) deve ser consumido em reaes de reduo,
acopladas produo de etanol e de glicerol.

Denise '95
RESPIRAO
CICLO
DE
KREBS
CADEIA RESPIRATRIA

Figura 3: Esquema da fermentao (em anaerobiose) e da respirao, quando a clula
est sob aerobiose e aparecem as mitocndrias ativas (no destaque).
Nutrio e crescimento das leveduras
As leveduras exigem diversos ons inorgnicos (minerais) em concentraes tanto
micro como milimolar para manifestarem timos crescimento e rendimento
fermentativo. Deficincias ou concentraes elevadas de tais minerais, ou seja, um
desequilbrio entre os nutrientes minerais, provoca alteraes metablicas
significativas. De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns so
considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo
da composio do meio no qual a levedura cresceu.

As necessidades de N, P e S so as mais facilmente justificveis por integrarem
constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. J os ons
minerais esto predominantemente implicados na atividade enzimtica. Assim o
mineral pode funcionar como o centro cataltico de uma enzima (Zn, Co, Mn e Cu),
como ativador ou estabilizador da funo enzimtica (K, NH
4
, Mg), como mantenedor
de um controle fisiolgico (pela ao antagnica exercida entre ons), e ainda do ponto
de vista estrutural, atuando como neutralizador de foras eletrostticas em diversas
unidades celulares aninicas (K, Ca, Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA,
RNA, protenas, membranas fosfolipdicas e fosfomananas da parede celular).
Embora se possam postular concentraes timas para cada elemento, existe uma
vasta gama de interaes entre os nutrientes minerais resultando que tal concentrao
tima altamente dependente da concentrao de outros minerais no meio.
Para tornar a situao mais complexa, alguns ons atuam como antagnicos
minimizando efeitos inibitrios de outras espcies inicas e por outras inter-relaes
metablicas que determinam a quantidade absorvida do on e os efeitos
conseqentes.
Igualmente, pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser
diminuda, se o mosto empregado na indstria, geralmente complexo, apresentar o
produto final de uma reao catalizada por uma metalo-enzima. Isso ocorre quando o
mosto apresenta aminocidos, bases nitrogenadas e outros compostos orgnicos e
que so utilizados pela levedura, tornando desnecessria a sntese dos mesmos.
Por outro lado, os mostos empregados na indstria podem conter agentes quelantes,
sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentrao efetiva de espcies
inicas. Assim, minerais de argila, cidos hmicos, aminocidos, protenas, cidos
orgnicos, polifenis, cido ftico, polifosfatos e outros materiais coloidais, complexam
diversos ons com diferentes afinidades. Os elementos minerais que afetam
negativamente a levedura podem ser classificados como elementos txicos, como o
caso do alumnio.
Bactrias
Morfologia das clulas bacterianas
Das caractersticas principais das clulas bacterianas destacam-se suas dimenses,
forma, estrutura e arranjo celular, os quais constituem a morfologia da clula.
Forma das bactrias

Apesar de existirem milhares de espcies bacterianas, os organismos isolados podem
apresentar uma das trs formas gerais: elipsoidal/esfrica, bastonetes e
espiralada/helicoidal.
As clulas bacterianas elipsoidal-esfricas denominadas de cocos podem apresentar
os seguintes tipos de arranjos:

As clulas bacterianas cilndricas ou em bastonetes (bacilos) no se dispem de
acordo com os padres encontrados entre os cocos, mas podem se apresentar
isolados, aos pares (diplobacilos) e em cadeias (estrepto bacilos). Em alguns casos
esses arranjos no constituem padres morfolgicos caractersticos, mas devida a
etapa de crescimento ou s condies de cultura.

De um modo geral essas duas formas de bactrias so as mais comuns entre os
contaminantes nas indstrias do acar e do lcool.
Dimenses da clula bacteriana
A unidade de medida da clula bacteriana o micro, que equivale a 10
-3
mm. As
formas esfricas (cocos) variam de tamanho de 0,5 m a 1,0 m de dimetro. J as
bactrias em forma de bastonetes (bacilos) variam de 1,0 m a 5,0 m de
comprimento de 0,3 m a 1,0 m de largura. Estas caractersticas podem ser usadas
para a caracterizao das espcies bacterianas.
Estrutura bacteriana
O exame da clula bacteriana mostra estruturas, as quais so esquematizadas abaixo.
Algumas dessas estruturas aparecem apenas em certas espcies, outras so mais
caractersticas de uma espcie de que de outra, mas a parede celular e o citoplasma
so naturalmente comuns a maioria das clulas bacterianas.

Parede celular
Esta se encontra externamente delicada membrana citoplasmtica e devido a sua
rigidez prpria mantm a forma caracterstica da clula mesmo quando esta
submetida a condies fsicas extremas (altas presses osmticas ou temperaturas
abaixo de zero). A parede celular representa uma poro significativa do peso seco
total da clula, podendo ser responsvel por 10 a 40% do peso seco do
microrganismo.
Ela parece ter uma funo importante na diviso e crescimento celulares, uma vez que
a clula bacteriana desprovida de parede celular (protoplasto) incapaz de promover
a diviso ou crescimentos normais.
Vrias substncias so encontradas na parede celular bacteriana como, por exemplo,
o cido diaminopimlico (DPA), o cido murmico e o cido teicico. Estas
substncias so tpicas das bactrias.
Outros compostos principais da parede celular das bactrias so aminocidos,
acares aminados, carboidratos e lipdeos. Todas estas substncias so reunidas
para formar substncias polimricas complexas que formam a estrutura da parede
celular, como o caso do composto polimrico conhecido como peptidoglicano,
responsvel pela rigidez da parede celular. Nas bactrias Gram negativas o
peptoglicano constitui uma frao menor do total da parede celular do que nas
bactrias Gram positivas, mas de um modo geral a parede celular das clulas Gram
negativas quimicamente mais complexa. O contedo lipdico das bactrias Gram
negativas consideravelmente maior do que a dos organismos Gram positivos.

Acredita-se que a funo da parede celular seja a de proporcionar uma moldura rgida
que suporte e proteja as entidades protoplasmticas mais sensveis.
Membrana citoplasmtica ou protoplasmtica
A membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ou simplesmente membrana
plasmtica est situada imediatamente abaixo da parede celular, separando esta do
material citoplasmtico. Trata-se de uma membrana de real importncia e sendo
semipermevel e seletiva, controla a passagem de nutrientes e de resduos para
dentro e para fora da clula, respectivamente. Nesta so encontrados tambm vrias
enzimas responsveis por diversas funes celulares, como transporte de eltrons e
fosforilao oxidativa. Desta forma qualquer modificao (leso) da membrana
citoplasmtica poder resultar em morte da clula, sem, contudo, provocar alteraes
morfolgicas que possam ser verificadas ao microscpio comum.
Citoplasma
Este representa todo o material celular contido dentro da membrana citoplasmtica.
Nele pode-se distinguir uma rea de aparncia granular rica em cido ribonucleico
(rea citoplasmtica), uma rea rica em cido desoxiribonucleico (ADN) (rea nuclear
ou cromatnica) e uma rea fluida com nutrientes dissolvidos. O cido ribonucleico
juntamente com protenas forma corpsculos ou macromolculas densamente
aglomeradas por todo o citoplasma. Estas partculas ribonucleoproteicas so
denominadas de ribossomos.
Nenhum vacolo tem sido observado no contedo citoplasmtico, mas vrias outras
incluses podem ser encontradas atravs de tcnicas microscpicas especiais. Dentre
estas se incluem grnulos de amido, de pigmentos, polmero de fsforo inorgnico,
etc. Acredita-se que geralmente os grnulos podem servir como fonte de material
nutritivo de reserva.
Material celular
Embora as bactrias no possuam o ncleo tpico das clulas de animais e
vegetais superiores, dentro do citoplasma so encontrados corpsculos que so
considerados como estrutura nuclear, onde encontrado o ADN da clula
bacteriana.
Entretanto deve-se usar o termo ncleo, uma vez que se trata de uma forma
primitiva de ncleo. O ncleo da clula bacteriana pode ser revelado pelo corante

de Feulgen, o qual especfico para ADN, ou pela microscopia eletrnica, uma
vez que menos denso que o citoplasma. No h evidncia de uma membrana
separando o ncleo do citoplasma e durante a replicao do ncleo bacteriano
no se tem observado o aparelho mittico, tpico das clulas superiores.
Flagelos
Os apndices muito finos, semelhantes a cabelos, que se exteriorizam atravs da
parede celular e se originam de uma estrutura granular imediatamente abaixo da
membrana citoplasmtica so denominados de flagelos. Nem todas as bactrias
possuem flagelos, mas pode-se generalizar que muitas espcies de bacilos o
apresentam e raramente eles ocorrem em cocos e lactobacilos.
Os flagelos so muito pequenos para serem vistos em seu estado natural, pelo
microscpio ptico. Uma vez que os flagelos so responsveis pela mobilidade das
bactrias e que nem todas as bactrias so flageladas, conclui-se que existem
espcies mveis e imveis. O mtodo exato pelo quais os flagelos movimentam a
clula bacteriana no conhecido. Uma das hipteses diz que as cadeias proticas se
contraem e se relaxam produzindo um movimento ondulatrio que puxa ou empurra o
organismo. Outra sugere um mecanismo rotatrio, a partir de uma extremidade fixa, de
uma hlice relativamente rgida.
A mobilidade pode ser facilmente observada pela microscopia com preparao em
gota pendente.
Cpsulas
Algumas bactrias esto envoltas por uma substncia viscosa que forma uma camada
de cobertura ou envelope ao redor da clula. Estas estruturas so designadas como
cpsula ou camada limosa. As cpsulas representam um envoltrio protetor e podem
servir tambm como reservatrio de alimentos armazenados e como locais de despejo
de substncias de escria. As bactrias capsuladas so responsveis pelo
aparecimento de certos prejuzos em processos industriais uma vez que este material
de natureza polissacardica pertencentes a diversos tipos como o dextrano, a
dextrina, o levano e a celulose.
Reproduo bacteriana
Durante o crescimento bacteriano o processo mais comum de diviso celular
(multiplicao) a fisso binria, onde uma nica clula se divide em duas, aps o

desenvolvimento de uma parede celular transversal. Essa diviso da clula um tipo
de reproduo assexual. O tempo necessrio para que a clula se divida ou para que
a populao duplique conhecido por tempo de gerao, o qual pode variar de 15 a
20 minutos at algumas horas. O tempo de gerao depende da espcie bacteriana e
das condies ambientais, ou seja, as bactrias so capazes de crescer numa ampla
faixa de condies fsicas, podendo utilizar alimentos muito diferentes, mas seu
crescimento timo requer condies especficas para uma dada espcie.
Entretanto a fisso binria no o nico processo de reproduo das bactrias.
Muitas espcies bacterianas pertencentes a vrios gneros (Bacillus, Clostridium) so
capazes de formar, sob certas condies, ou como meio de disseminao da espcie,
unidades celulares conhecidas como esporos. Esses esporos so formados no interior
das clulas e portanto so denominados de endosporos. Eles contm somente parte
dos constituintes celulares e a sua posio e forma na clula so importantes critrios
na classificao dos bacilos.

Nas espcies do gnero Bacillus somente um esporo formado por clula, e quando
este germina resulta uma nica clula bacteriana. A germinao dos esporos
geralmente requer a presena de um aminocido especfico e pode ocorrer somente
aps o esporo ter sofrido a ao de fatores fsicos (choque trmico).
A resistncia dos esporos bacterianos as altas temperaturas varivel de espcie
para espcie, e de um modo geral, temperaturas ao redor de 80C ou mais so
apenas suficientes para provocar a germinao dos mesmos.
importante mencionar que as bactrias capazes de formar esporos, podem crescer e
multiplicar-se por muitas geraes como clulas vegetativas, mas num determinado
momento do desenvolvimento pode ocorrer no interior do citoplasma vegetativo, a
sntese de um novo protoplasma, que dar origem ao esporo.

A composio qumica do esporo tpica e todos os esporos bacterianos contm
grandes quantidades de cido dipicolnico (5 a 10%), grandes quantidades de clcio,
peptidoglicano, os quais formam um complexo Ca- cido dipicolnico-peptoglicano que
constitui a camada cortical do esporo. Comparados com as formas vegetativas, os
esporos so extremamente resistentes aos agentes fsicos e qumicos adversos. Esta
capacidade de sobrevivncia pode ser atribuda sua parede ou capa impermevel a
qual por sua vez est associada ao complexo cido dipicolnico-clcio.
Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana
Quando se inocula um meio de cultura com certo nmero de bactrias e se observa o
nmero de clulas a intervalos regulares por mais ou menos 24 horas, verifica-se que
inicialmente parece no haver crescimento, em seguida h um rpido aumento da
populao e depois h uma diminuio do nmero de clulas. Esses perodos so
conhecidos como fases do crescimento bacteriano, e so assim denominados: lag
fase, fase logartmica ou exponencial, fase estacionria e fase de declnio ou de morte.

A - lag fase
B - fase exponencial
C - fase estacionria
D
C
B
A
Log do
nmero de
bactrias
Tempo (h)

D - fase de declnio

Fig. 8. Curva de crescimento tpica das bactrias. (A) fase lag; (B) fase log
(logartmica); (C) fase estacionria; (D) fase de morte ou de declnio.
(Pelczar, Reid, Chan - 1981, vol. 1)

Na fase lag no significa que as clulas estejam em repouso ou dormentes; ao
contrrio durante esta fase as clulas aumentam de tamanho, so fisiologicamente
ativas e esto sintetizando novo protoplasma. As bactrias no novo meio podem ser
deficientes em enzimas ou coenzimas que devem ser sintetizadas em quantidades
suficientes para o funcionamento timo da maquinaria qumica da clula. Ao final da
fase lag cada organismo se divide, no entanto como nem todos os indivduos
completaram sua etapa lag simultaneamente ocorre um aumento gradual da
populao at o trmino desta fase, quando todas as clulas passam a ter capacidade
de diviso em tempos regulares.
Na fase logartmica ou exponencial as clulas se dividem firmemente, num ritmo
constante. A populao grandemente uniforme em termos de composio qumica,
atividade metablica e outras caractersticas fisiolgicas.
Na fase estacionria a populao permanece constante durante certo tempo, talvez
como resultado da completa cessao das divises ou do equilbrio entre o ritmo de
reproduo e o equivalente ritmo da morte. A tendncia para o fim do crescimento
pode ser atribuda a uma srie de cirscuntncias, particularmente exausto de
alguns nutrientes e, com menos freqncia, a produo de produtos txicos.
Na fase de declnio ou de morte, as bactrias passam a morrer mais rapidamente do
que a produo de novas clulas. Vrias condies contribuem para a morte
bacteriana; as mais importantes so a depleo de nutrientes essenciais e o acmulo
de substncias inibidoras como os cidos.
Caracterizao e Classificao dos Microrganismos
As comparaes das caractersticas de grande nmero de microrganismos resultam
num sistema de agrupamento das espcies semelhantes. Por fim, cria-se um grupo
com caractersticas muito semelhantes, que considerado como uma espcie e
recebe um nome especfico, isto , o microrganismo adquire um nome.
Por serem individualmente to pequenos que no podem ser visualizados sem ajuda
de um microscpio, no prtico trabalhar com um nico microrganismo.

Por esta razo comum se trabalhar com culturas puras, ou seja, cultura que consiste
de uma nica espcie de microrganismos, originada do crescimento de uma nica
clula microbiana. Se dois ou mais tipos crescem juntos tem-se uma cultura mista.
Antes de se identificar e classificar um microrganismo, suas caractersticas devem ser
determinadas com detalhes adequados. As principais a serem determinadas ou
observadas, incluem as seguintes:

a) caractersticas culturas: os nutrientes exigidos para o crescimento e as condies
fsicas do ambiente que favorecem o desenvolvimento.

b) caractersticas morfolgicas: as dimenses das clulas, seus arranjos, a
diferenciao e a identificao de suas estruturas.

c) caractersticas metablicas: a maneira pela qual o microrganismo desenvolve os
processos qumicos vitais.

d) caractersticas de composio qumica: a identificao dos principais e tpicos
constituintes qumicos da clula.

e) caractersticas antignicas: a deteco de componentes especiais da clula que
fornecem evidncia de semelhana entre as espcies.

f) caractersticas genticas: a anlise da composio do cido desoxiribonucleico
(ADN), assim como a determinao das relaes entre o ADN isolado de diferentes
microrganismos.

Uma vez que as caractersticas de um microrganismo tenham sido adequadamente
determinadas e catalogadas, possvel identific-lo pela consulta a livros de
referncia que contm descries das espcies microbianas (exemplo: Bergeys
Manual of Determinative Bacteriology). Entretanto comum, mesmo hoje, descobrir
que o organismo que est sendo pesquisado muito diferente de qualquer um dos
que foram descritos anteriormente e pode, de fato, tratar-se de uma nova espcie.
Alm disso, quanto mais informaes forem coletadas sobre os microrganismos
existentes, as idias a respeito de seus agrupamentos podem sofrer modificaes.
Classificao em Nvel de Gnero

A morfologia celular ainda uma caracterstica muito importante na descrio dos
gneros de bactrias. Assim as bactrias so divididas em bastonetes e cocos. A
diviso celular em um ou dois planos importante na diferenciao dos cocos.
Uma caracterstica importante na diferenciao de bactrias em nvel de gnero o
tipo de fermentao da glicose em condies padronizadas ( suprimento ilimitado de
glicose e de fatores de crescimento como aminocidos, vitaminas e disponibilidade
limitada de oxignio). Nessas condies as bactrias so divididas em dois grupos: (1)
homofermentativo, envolvendo aquelas que convertem glicose quase exclusivamente
a cido lctico e (2) heterofermentativa, as que formam, alm de cido lctico , cido
actico, gs carbnico e etanol.
Crescimento a determinadas temperaturas usado pra distinguir cocos. Enterococcus
crescem a 10C e 45C, Lactococcus e Vagococcus a 10C, mas no a 45C e
Estreptococcus no cresce a 10C e a 45C varivel conforme a espcie. A
tolerncia a 6,5% de sal pode ser usada para distino entre Enterococcus,
Lactococcus e Estreptococcus.
A tolerncia a acidez e alcalinidade pode ser usada para distino entre os gneros.
Os Enterococcus so considerados bem tolerantes a pH extremos. A formao de
diferentes ismeros de cido lctico na fermentao da glicose pode ser usada para
distinguir Leuconostoc e Lactobacillus heterofermentativos. Os Leuconostoc produzem
apenas cido D - lctico e os Lactobacillus DL-lctico. Os Pediococcus e Aerococcus
so morfologicamente idnticos, mas os Pediococcus so mais tolerantes a cidos e
crescem em condies estritamente anaerbias.
Deve-se considerar que h superposio nos fentipos entre os diferentes gneros, e
exees as caractersticas consideradas tpicas so bastante freqentes entre as
bactrias. Assim a identificao segura destas bactrias requer mtodos sofisticados,
envolvendo um nmero grande de provas bioqumicas.
Classificao em Nvel de Espcie
As anlises das caractersticas fenotpicas so ainda importantes na classificao
preliminar e no conhecimento de algumas propriedades importantes do ponto de vista
industrial. Algumas caractersticas importantes em nvel de classificao de espcie
so: (1) tolerncia a pH e sal, (2) crescimento a determinadas temperaturas, (3)
configurao do cido lctico produzido, (4) fermentao de diferentes carboidratos,
(5) hidrlise da arginina, (6) formao de acetona (teste Voges Proskauer), (7)
tolerncia a sais de bile, (8) tipo de hemlise, (9) produo extracelular de
polissacardeos, (10) demanda de fatores de crescimento, (11) presena de certas

enzimas, (12) caractersticas de crescimento no leite e (13) tipificao sorolgica.
Outras caractersticas incluem a taxonomia molecular e quimiotaxonomia, como (1)
tipo de peptidoglicanas de cido diamnicos, (2) presena e tipo de cidos teicicos,
(3) presena e tipo de menaquinonas, (4) relao de G + C no DNA, (5) composio
de cidos graxos e (6) mobilidade eletrofortica de desidrogenase do lactato.
Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcool
Veremos a seguir a descrio de algumas espcies dos diferentes gneros de
bactrias que frequentemente so encontradas como contaminantes do processo de
produo de acar e lcool.
Espcie
Bacteriana
Caractersticas Morfolgicas
e Citolgicas
Caractersticas Fisiolgicas -
Produtos do metabolismo
Bacillus subtilis Bastonetes (2,0-3,0 m x 0,7-
0,8 m), isolados e raramente
em cadeias, esporulados,
esporo elptico central, Gram
(+) e com mobilidade.
Aerbios ou anaerbios
facultativos, catalase (+), T
tima 30-37c (mnima 5-20C).
Fermentao da glucose com
produo de 2,3 butanodiol +
acetona + CO
2
, levana
extracelularmente de sacarose,
ativo em pH 5,5 - 8,5.
Bacillus brevis Bastonetes (1,5-4,0 m x 0,8-
1,2 m), isolados e raramente
em cadeias, esporulados,
esporo elptico central ou
terminal, Gram (+) e com
mobilidade.
Aerbios, catalase (+), T tima
30-35C (mnima 10-35C e
mxima 40-60C), cido de
glucose (v).
Bacillus megaterium Bastonetes (2,0-5,0 m x 1,2-
1,5 m), tendncia formar
pequenas cadeias tranadas,
esporulados, esporos elptico
central, Gram (+) e com
mobilidade.
30C (mnima 3-20C e mxima
35-45C). cido de glucose.

Espcie
Bacteriana
e Citolgicas

Bacillus coagulans Bastonetes (2,5-5,0 m x 0,6-
1,0 m), principalmente
isolados, esporulados, esporo
elptico central ou terminal,
Gram (+) e com motilidade.
Aerbios ou anaerbios facult.,
catalase (+), T tima 35-40C
(mnima 15-25C e mxima 55-
60C, pH mnimo p/ cresc. 4,0-
5,0, c. de glucose,
fermentao de glucose com
produo de c. ltico + 2,3
butanodiol + acetona + c.
actico + etanol.
Bacillus stearothermophilus Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,5-
1,0 m) isolados e em cadeias,
esporulados, esporo oval
terminal, Gram (+) e com
motilidade.
45-50C (mnima 35C e
mxima 65C). cido de
glucose.
Lactobacillus fermentum Bastonetes (0,5-0,9 m de
largura e comprimento muito
varivel), isolados e/ou aos
pares, Gram (+), no
esporulados, raramente com
motilidade.
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T tima 30-40C
(15C (-) e 45C (+)) pH timo
5,5-5,9, heterofermentativos:
produo de c. ltico +
acetato + etanol + CO
2
de
glucose, frutose e sacarose..
Lactobacillus delbruecki Bastonetes (2,0-9,0 m x 0,5-
0,8 m), isolados e/ou em
pequenas cadeias, Gram (+)
no esporulados, raramente
com motilidade.
catalase (-), T tima 40C
(15C (-) e 45C (+)),
homofermentativos: cido ltico
de glucose, frutose e sacarose,
pH timo: 5,5-5,8.
Lactobacillus plantarum Bastonetes (3,0-8,0 m x 0,9-
1,2 m), isolados, aos pares
e/ou em pequenas cadeias,
Gram (+), no esporulados,
raramente com motilidade.
(15C (+) e 45C (-)),
heterofermentativos: cidos de
glucose, frutose e sacarose, pH
timo: 5,5-5,8.

Espcie Caractersticas Morfolgicas Caractersticas Fisiolgicas -

Bacteriana e Citolgicas Produtos do metabolismo
Lactobacillus helveticus Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,6-
1,0 m), isolados, aos pares
e/ou em pequenas cadeias,
Gram (+), no esporulados,
raramente com motilidade.
catalase (-), T. tima 30-40C
(15C (-) e 45C (+)),
heterofermentativos: cido
ltico de glucose, frutose, pH
timo: 5,5-5,8.
Lactobacillus brevis Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,7-
1,0 m), isolados e em
pequenas cadeias, Gram (+),
no esporulados, raramente
com motilidade
(15C (+) e 45C (-)),
glucose, frutose e sacarose, pH
timo: 5,5-5,8.
Lactobacillus
yamanashiensis
Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,5-
1,0 m) isolados, pares e
cadeias, Gram (+), no
esporulados e com motilidade
(10C (+) e 45C (-) ),
hemofermentativos: produo
de cido ltico de glucose,
frutose e sacarose.
Lactobacillus coryniformis Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,8-
1,1 m) isolados, pares e
cadeias, Gram (+), no
esporulados e sem motilidade
Anaerbios facultativos
(10C (+) e 45C (-) ),
heterofermentativo facultativo:
cido de glucose, sacarose,
frutose, maltose, ramnose,
manitol, galactose.
Lactobacillus vaccinostercus Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,5-
0,7 m), pares, no
esporulado, Gram (+) e sem
motilidade
(15C(-) e 45C (-)),
glucose, arabinose, maltose,
xilose, galactose, ribose,
celobiose.


Lactobacillus viridescens Bastonetes (0,7-0,9 m x 2,0-
5,0 m); com extremidades
arredondadas; isolados ou aos
pares; no esporulados; Gram
(+); sem motilidade.
Microaerfilos; catalase
(-); oxidase (-); fermentao de
glucose (+), frutose e sacarose
(+); crescimento a 15C (+);
crescimento a 45C (-);
heterofermentativas, pH 5,5-
6,2, geralmente com
crescimento em pH < 5,0.
Lactobacillus buchneri Bastonetes (0,7-1,0 m x 2,0-
4,0 m); isolados e em cadeias
curtas; Gram (+); raramente
com motilidade; no
esporulados.
Anaerbios facultativos;
heterofermentativos;
fermentao da glucose (+),
frutose (+) e sacarose (V);
crescimento a 15C (+);
crescimento a 45C
(-); pH 5,5-6,2, geralmente com
crescimento em pH < 5,0.
Lactobacillus fructivorans Bastonetes (0,5-0,8 m x 15-
4,0 m); isolados, aos pares e
em cadeias; extremidades
arredondadas; Gram (+);
raramente com motilidade; no
esporulados.
fermentao da glucose (+),
frutose (+) e sacarose (V);
crescimento a 45C
(-); acidfilo (pH favorvel 5,0);
no cresce em pH > 6,0; pode
utilizar etanol para crescimento.
Lactobacillus fructosus Bastonetes (0,5-0,8 m x 2,0-
em pequenas cadeias; Gram
(+); raramente com motilidade;
no esporulados.
fermentao de glucose (+),
frutose (+) e sacarose (-);
crescimento a 45C
(-); pH favorvel 5,5-6,0, cresce
em pH < 5,0.


Lactobacillus acidophilus Bastonetes (0,6-0,9 m x 1,5-
em pequenas cadeias; Gram
(+); raramente com motilidade;
no esporulados.
homofermentativos com
produo de DL-cido ltico;
crescimento a 15C (-);
fermentao de glucose (+),
frutose (+), sacarose (+).
Sporolactobacillus sp Bastonetes (3,0-5,0 m x 0,7-
0,8 m) isolados e pares, Gram
(+), esporulados e com
motilidade, esporos elpticos
terminais.
Microaerfilos, catalase (-)
de frutose, glucose, maltose,
rafinose, sacarose, no produz
gs.
Leuconostoc mesenteroides Clulas esfricas e
frequentemente lenticulares
(0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos
pares ou em cadeias, Gram (+),
sem motilidade, no
esporulados.
Anaerbios facultativos, T.
tima: 20-30C, (mnima 10C e
mxima 37C), catalase (-),
crescimento 10% etanol
(-), crescimento em pH 4,8 (-),
heterofermentativos: c. de
glucose, frutose e sacarose.
Formao de dextrana, pH
timo 5,5-6,5.
Leuconostoc dextranicum Clulas esfricas ou
lenticulares (0,7-1,2 m x 0,5-
0,7 m); aos pares ou cadeias;
Gram (+); sem motilidade; no
esporuladas.
fermentao de carboidratos
resultando em D (-) cido ltico
e etanol ou cido actico ao
invs de etanol; catalase
(-), oxidase (-); cido de frutose
(+), glucose (+), sacarose (+);
crescimento em pH 4,8 (-);
crescimento em 10% (-).

Espcie
Bacteriana
e Citolgicas

Leuconostoc lactis Clulas esfricas e
frequentemente lenticulares
(0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos
pares ou em cadeias, Gram (+),
sem motilidade, no
esporulados.
Anaerbios facultativos, T
tima: 25-30C, (mnima 10C e
mxima 40C), catalase (-),
crescimento 10% etanol
(-), crescimento em pH 4,8 (-),
formao de dextrana, pH
timo 5,5-6,0,
heterofermentativos: c. de
Micrococcus lylae Clulas esfricas (0,8-1,6 m
de ), predominante em
ttrades, Gram (+), sem
motilidade, no esporuladas,
sem cpsula.
Aerbios (oxidativos), catalase
(+), temperatura tima: 30-
37C, no exibe metabolismo
fermentativo.
Micrococcus halobius Clulas esfricas (0,8-1,6 m
de ) isoladas, aos pares e
ocasionalmente em ttrades e
cachos, Gram (+), sem
motilidade, no esporuladas,
sem cpsula.
Aerbios (Oxidativos), catalase
(+), Temperatura tima: 30-
35C (crescimento 37C (+)),
cido de glucose.
Pediococcus parvulus Cocos (0,6-1,0 m de ), aos
pares ou em ttrades, Gram
(+), sem motilidade, no
esporulado, sem cpsula.
tima: 30C (crescimento 35C
(+), 40C (-)), catalase (-), pH
timo 5,0-6,0 (pH 4,0 (+) e 8,5
(-)), homofermentativos: cido
ltico de glucose.
Pediococcus pentosaceus Cocos (0,8-1,0 m de ), aos
pares ou em ttrades, Gram
(+), sem motilidade, no
esporulado, sem cpsula.
Anaerbios Facultativos, T
tima: 35C (40C (+), 50C (-),
catalase (-), pH timo 5,0-6,0
(pH 4,0 (+) e 8,5 (v)),
de glucose e sacarose (v).


Pediococcus acidilactici Clulas esfricas (0,6-1,5 m
de ); aos pares ou ttrades;
isoladas so raras e nunca em
cadeias; Gram (+); sem
motilidade; no esporuladas.
Anaerbios facultativos; T
tima = 40C; crescimento a
50C (+); fermentao de
glucose com produo de DL
ou L (+) lactato; catalase (-);
oxidase (-); crescimento em pH
7,5 (+); cido de sacarose (-).
Staphylococcus xylosus Clulas esfricas (0,5-1,2 m
de ), isoladas, aos pares e
ocasionalmente em ttrades,
Gram (+), sem motilidade, no
esporuladas.
tima: 35-40C (15C (+), 45C
(v)),catalase (+), pH timo 7,0-
7,5, metabolismo oxidativo e
fermentativo: cidos de
Staphylococcus sp Clulas esfricas (0,5-1,5 m
de ); isoladas, aos pares,
ttradas e cachos; Gram (+);
sem motilidade; no
esporuladas.
catalase (+); gelatinase (+);
crescimento entre 18 e 40C
(+); tolerncia a at 10% de
NaCl; algumas espcies
crescem a 45C; colnias
negras brilhantes em Baird-
Parker Agar; colnias
amarelas/laranja em
Staphylococcus medium 110.
Lactococcus lactis Clulas ovais alongadas no
sentido das cadeias, com 0,5-
1,0 m de , aos pares ou em
cadeias, Gram (+), sem
motilidade, no esporuladas.
Aerbios ou anaerbios
facultativos, T. tima: 30C
(10C(+), 45C (-), catalase (-),
sensibilidade a penicilina, pH
timo: 6,0-7,0 (pH 9,0(+), pH
9,6 (-)), homofermentativos:
cido ltico de glucose e
sacarose (v).

Espcie
Bacteriana
e Citolgicas

Acinetobacter calcoaceticus Bastonetes curtos (1,5-2,5 m
x 1,0-1,5 m), aos pares e em
pequenas cadeias, Gram (-),
sem motilidade, no
esporulados, com ou sem
cpsula.
Metabolismo oxidativo, catalase
(+), T tima: 30-32C, pH timo:
7,0, resistente a penicilina,
resistncia a KCN (), cidos
de glucose.
Escherichia coli Bastonetes (1,1-1,5 m x 2,0-
6,0 m); isolados, aos pares;
no esporulados; Gram (-),
mteis por flagelos peritrigueos
ou sem motilidade.
fermentao cido-mista
(produo de cidos ltico,
actico e frmico, a partir de
glucose); T tima = 37C;
oxidase (-), fermentao de
lactose com produo de gs.

Estudo do fenmeno da floculao
No estudo de leveduras, o termo floculao normalmente usado para designar o
fenmeno reversvel de agrupamento celular que comumente se desenvolve no final
da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionria. Isto pode ser causado
pela ao de propriedades inerentes das clulas, por agentes qumicos ou
microbiolgicos.
Na fermentao alcolica industrial, as leveduras floculentas esto normalmente
presentes como contaminantes das leveduras normais (no floculentas). Nas usinas
alcooleiras, a presena de leveduras floculentas em concentrao superior a 12%
causa dificuldade significativa na operao de centrifugao do vinho devido ao
fenmeno de co-floculao. Nestas condies acentua-se a sedimentao das clulas
de leveduras nas dornas e interfere na operao das centrfugas contnuas.
O fator responsvel pela floculao de leveduras governado geneticamente. Alm do
fator gentico h outros que interferem ou inibem a sua ao. O meio de cultivo
tambm interfere na floculao. A anaerobiose reprime a floculao e a aerobiose
induz a formao de protena responsvel pela floculao.
A diferena da estrutura entre linhagens floculentas e no floculentas no pode ser
detectada pela anlise qumica, mas pode ser visualizada por microscopia eletrnica.
As clulas floculentas apresentam superfcie fimbriada ou ciliada e as no floculentas,
relativamente lisa.

O mecanismo exato de floculao da levedura no conhecido. Trabalhos realizados
com linhagens floculentas mostraram que a manana da parede celular participava da
floculao. A interao se estende por toda rea causando distoro da parede no
local do contato. O envolvimento da manana indicado por diversos experimentos: (1)
A floculao inibida competitivamente por manana. (2) A hidrlise de protena de
clulas no floculentas ou floculentas no altera a sua interao com clulas
floculentas intactas. Esse componente protico est associado parede celular no
podendo ser removido pelo calor ou tratamento qumico. A fora de ligao entre as
clulas floculentas pode ser dada pela ponte de hidrognio ou polissacardeos da
parede celular e on Ca
+2
, associada o grupo carboxila da protena da parede celular.
possvel que a ligao seletiva de Ca
+2
com protena seja mediada por arranjo
especfico do grupo carboxila, mas tambm pode ser que o on Ca
+2
atue como co-
fator na ativao da capacidade de ligao da protena com a manana.
A floculao dependente do Ca
+2
em quantidades mnimas (10
-6
a 10
-8
). Magnsio
pode substituir Ca
+2
, mas depende do pH, e atua somente ao redor de pH 4,0
enquanto que Ca
+2
atua a intervalo de pH maior (pH >3,0).
Na fermentao alcolica industrial freqente a contaminao por bactrias do
gnero Lactobacillus. Algumas dessas bactrias so capazes de provocar a floculao
de leveduras como, por exemplo, Lactobacillus fermentum. Esta floculao apresenta
algumas caractersticas similares s leveduras floculentas, como susceptibilidade s
altas temperaturas, proteinase e pHs extremos, necessidade de ons metlicos e
inibio por manose e excesso de ons. O stio susceptvel temperatura e proteinase
est localizado na clula bacteriana e no na levedura. Alm disso, h uma relao
numrica celular entre a bactria e a levedura onde se consegue o mximo de
floculao, indicando que existe um nmero fixo de stios na levedura para formao
do agregado.
A necessidade de ons Ca
+2
para floculao depende do pH sendo que em
concentraes elevadas (> 10
-1
M) h desfloculao das clulas.
Como no caso de leveduras floculentas, a manose causa a desfloculao. J glicose,
maltose e sacarose no produzem nenhum efeito. O tratamento trmico aplicado
sobre a clula bacteriana provoca a perda da sua capacidade floculadora.
No caso da floculao causada por Lactobacillus fermentum o fator responsvel de
natureza protica encontrado na clula bacteriana, e a sua interao com clulas de
levedura afetada com variao de pH, presena de ons e manose, termolbil e
destrudo por proteinase. Uma floculao especfica tambm pode ser causada por L.
plantarum. O fenmeno ocorre a pH entre 2,0 e 4,0 e inibido por sais neutros. O

estudo da mobilidade eletrosttica das clulas de bactrias e levedura mostrou que a
floculao era causada pela atrao eletrosttica entre as superfcies celulares de
bactrias e leveduras com cargas opostas.
A diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculao do fermento
nas dornas de fermentao, bem como o grande volume de mosto manuseado
durante a fermentao alcolica industrial, torna o controle do processo de floculao
um desafio de grande importncia e dificuldade. Com a elucidao das causas
envolvidas neste processo so provveis que se obtenham meios eficientes e
econmicos para o controle da floculao.
Medida da Floculao
Algumas tcnicas medem diretamente a floculao atravs do exame microscpico ou
reduo da turbidez da suspenso celular, mas a maioria das tcnicas encontradas
em literatura mede indiretamente, usando como parmetro a velocidade ou grau de
sedimentao dos flocos formados. Para medir a sedimentao usa-se no geral, a
tcnica da absorbncia tanto da parte no floculada (sobrenadante) como do
sedimento formado aps a ressuspenso. Nas diversas tcnicas disponveis,
essencial a padronizao das etapas para a sua medida porque a floculao afetada
por ons e outros componentes do meio, pH, temperatura, grau e forma de agitao.
O exame direto do material ao microscpio, embora fornea informaes detalhadas
como o nmero de clulas que integram cada floco e o nmero e diversidade de flocos
em relao ao total de clulas de levedura, uma tcnica trabalhosa e demorada,
alm de estar sujeita a erros individuais do observador.
Embora os flocos grandes que se formam sejam visveis a olho n, essa observao
fornece resultados apenas qualitativos. J os testes de sedimentao, mesmo os mais
simples que se baseiam na observao visual do sedimento formado, fornecem
resultados mais consistentes. Assim, as tcnicas mais comumente utilizadas para
quantificar a floculao consistem na medida da sedimentao, que uma forma
indireta de avaliar o grau de floculao. No geral, a estimativa das clulas do
sedimento formado ou remanescente na suspenso aps a sedimentao feita por
turbidimetria. A reduo da absorbncia pela formao de agregado celular pode ser
medida em espectrofotmetro.
A seguir apresentada uma das tcnicas utilizadas para se avaliar a floculao.

a) Condies de cultivo de clulas para o teste de floculao

As leveduras devem ser cultivadas em caldo YEPD por 24-48 horas a 30C, utilizando
como inculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo - YEPD.
As bactrias devem ser cultivadas em caldo MRS por 24-48 horas a 30C, utilizando
como inculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo - MRS.
Aps o crescimento, as clulas sero centrifugadas a 2000 G por 10 minutos a 4C e
lavadas duas vezes com soluo EDTA 0,025M, sendo posteriormente
ressuspendidas em tampo citrato 0,05M acrescido de EDTA 0,005M, pH 4,5 ou
tampo Tris-HCl 10
-1
M, pH 7,0 - 7,5.

b) Teste de floculao
Os testes de floculao devem ser realizados de acordo com o mtodo de Stratford &
Keenan (1988), adaptado para a utilizao de suspenses mistas de leveduras e
bactrias. Sero adicionados em tubos de ensaio (16 x 150 mm) 3 ml da suspenso
de leveduras, 3 ml da suspenso de bactrias e soluo de CaCl
2
5x10
-2
M em
quantidade suficiente para se obter uma concentrao final de 1x10
-2
M (1,5 ml). A
seguir os tubos sero agitados manualmente por 2 minutos, sendo que aps 5
minutos, com auxilio de um pipetador automtico, sero coletados 3 ml da amostra do
sobrenadante, medindo-se sua absorbncia em espectrofotmetro a 600nm.
Monitoramento e interpretao dos dados do laboratrio
industrial
O acompanhamento analtico do processo condio sine qua non para se obter alto
rendimento. O entrosamento laboratrio e gerncia do processo ou produo bsico
tambm. H dezenove anos atrs no se fazia contagem de bactrias ao microscpio,
e claro o conhecimento era muito menor, assim como o da equipe da destilaria. Em
algumas ocasies era necessrio mais de um ms para debelar uma contaminao e
neste tempo as perdas em rendimento eram enormes. Com o avano nas
metodologias e pesquisas, em dois anos, esse intervalo de tempo caiu para apenas
trs dias. E a meta ser cada vez mais rpida. O investimento em treinamento de
pessoal e criar equipe tm um retorno rpido e seguro.
Hoje, se acompanha at a linhagem da levedura que est dominando a dorna com a
ajuda da tcnica de cariotipagem do DNA cromossmico. Esta ferramenta de trabalho
foi uma nova luz na seleo de novas leveduras para a fermentao em escala
industrial. Por outro lado, tambm nos indica se estamos com leveduras no
Saccharomyces que podem ser prejudiciais ao rendimento fermentativo e produzir
muita espuma, alm de retardar a fermentao.

Para um bom acompanhamento do desempenho de destilaria, necessrio se ter uma
idia de como as anlises do laboratrio pode ajudar no julgamento do processo de
fermentao e destilao. Os nmeros apresentados na Tabela a seguir no so fixos
e no futuro, estes nmeros podero sofrer alteraes.
O entrosamento entre o laboratrio e a destilaria fundamental. Devem-se
estabelecer regras rgidas para que o chefe do laboratrio no ultrapasse a linha de
atuao do controle, e o chefe da destilaria no "domine" o laboratrio. O bom senso
deve sempre prevalecer.
Tabela para interpretao das anlises laboratoriais
Amostra Anlise Observao
cana PCTS
caldo do 1 terno e
caldo misto
bactrias n bast/ml < 10
4
= timo
1,0 - 5,0 x 10
5
= bom
6,0 - 9,0 x 10
5
= regular
> 10
6
= mau
relao contagem bactrias caldo misto/caldo 1
terno
acima de 2 significa moenda suja
caldo decantado bactrias n bast/ml < 10
2
= timo
10
2
- 10
3
= bom
10
3
- 10
4
= regular
10
4
- 10
5
= regular para mau
> 10
5
= mau
mosto acidez at 2,0g H
2
SO
4
/litro = normal
bactrias bast/ml idem caldo decantado
temperatura 27 - 29C = normal
SO
2
acima 100 mg/l afeta fermentao
Ca/Mg deve ser menor que 2
Ca quanto menor, melhor
Mg
+
200 ppm
NH
4
40-60 ppm
K 1000-1500 ppm
P 50-150 ppm
levedo tratado

ou
% levedo

bactrias bast/ml
at 25% = baixo
26% - 35% = normal
um pouco acima das contagens das


levedo pronto
dornas normal.

Amostra Anlise Observao
vinho dornas % levedo 10 - 13% = timo
acima de 14% = cuidado
abaixo de 10% = baixo
acidez 2,5 vezes acidez do mosto = normal,
e acima, indica contaminao
brotamento 5% a 15% ideal (depende da
manuteno do fermento na dorna)
viabilidade levedura < 80% = alta temperatura ou muito
cido
80 - 90% = normal
> 90% = cuidado com perdas de
levedura
bactria: bast/ml < 10
6
= timo
1,0 - 9,0 x 10
6
= bom
1,0 - 5,0 x 10
7
= regular
> 6,0 - 10
7
= mau
fermentao

temperatura manter a temperatura o mais
constante possvel durante toda a
fermentao, 33-35C.
rendimento % fermentao 91 - 92 ou maior = timo
90 - 91% = bom
88 - 90% = regular
abaixo de 88% = mau
geral da destilaria dem fermentao
(no se deve perder mais que 0,5%
na destilao)
global da indstria 83% e acima = excelente
81 a 83% = bom
80 - 81% = regular
abaixo de 80 = mau

Procedimentos
Contaminao:

Bactrias no caldo primrio e misto

Relao entre as contagens do caldo misto/caldo primrio maior que dois, significa
que a moenda est suja, precisa ser lavada, ou h problemas nas canalizaes (ponto
morto) ou gua de embebio.
Bastonetes: mais que 1,0 x 10
6
= usar biocida.

Bactrias na gua de diluio do fermento

Bastonetes + cocos: mais que 5,0 x 10
5
= verificar sanidade da torre de recuperao
do lcool.

Bactrias no vinho

Fazer teste com os antibiticos toda semana (HJ, VM e penicilina ou outro que
aparecer).
Bastonetes: mais que 5,0 x 10
6
= diminuir pH da cuba de tratamento para pH = 2,2.
Se no baixar os bastonetes, baixar mais o pH da cuba, para 2,0.
Usar cido e antibitico alternados. Dosagem de antibitico deve ser de 2 a 3 ppm
considerando o volume da dorna.
Obs.: Em caso de contaminao, o tempo que o fermento ficar na cuba de tratamento,
tem muita importncia pois o tratamento se torna mais eficiente. O tempo mnimo ao
redor de uma hora e o mximo de trs horas. Depois de quatro horas, o cido tambm
vai afetar significativamente a viabilidade e o desempenho da levedura. Nas paradas
usar antibitico na cuba e no aplicar cido algum. Se estiver floculando muito aplicar
o cido duas horas antes de alimentar a dorna. Nas paradas s aplicar cido na cuba
pois na dorna no tem agitao.
O uso de antibitico essencial quando a viabilidade est abaixo de 70%.

Brotamento e viabilidade da levedura

No incio da safra, e at se atingir cerca de 6% de fermento na dorna, quanto maior o
brotamento, melhor, pois vai-se atingir o numero ideal de clulas em menor tempo.
Entretanto, quando a quantidade de fermento est estabilizada, a porcentagem de
brotamento deve ser a menor possvel, desde que se mantenha a porcentagem de
fermento estvel na dorna.
Acima de 15% de brotamento: verificar temperatura mxima da fermentao (dornas).
Geralmente temperatura alta, diminuir ou eliminar o sal sulfato de amnia ou uria
e outros (menos o zinco, se estiver usando e for necessrio). Pode ser tambm muita
perda de fermento na centrfuga ou no fundo de dorna.
Abaixo de 5%: verificar contagem de bactrias, se estiver alto, faa o combate
indicado. Verificar temperatura da fermentao, s vezes est muito baixa (abaixo de
30C), ou alta de mais ( 38C).
Verificar o pH da cuba de tratamento, s vezes pode estar abaixo de 2,0 (elevar o pH
para 2,2 ou mais, dependendo se h ou no contaminao). Verificar acidez do mel
(se for o caso), pode estar muito alta.
A viabilidade deve estar entre 80 a 90%, o que indica uma boa recirculao de
fermento e pouca perda. Viabilidades acima de 90% freqentemente indicam perda de
fermento na centrfuga ou no fundo de dorna. Pode-se ter perda com viabilidade baixa,
para isto basta termos alto teor alcolico junto com alta temperatura.

Acidez:

Mosto: mosto de melao, acidez at no mximo 1,5 a 2,0g H
2
SO
4
/litro pode ser
normal. Se for maior procure averiguar, pois deve estar havendo
caramelizao, isto , queima de acar no vcuo, cristalizador ou
bombeamento. Brix do mel muito alto e pureza baixa favorecem acidez alta e
caramelizao. Mosto de caldo, a acidez gira em torno de 0,5 a 1,0g
H
2
SO
4
/litro. Se for maior, indica contaminao no caldo ou mosto.

Vinho: Se for maior que 2,5 vezes a acidez do mosto, porque est havendo
contaminao. Baixar o pH da cuba, dependendo do tipo de contaminao:
bastonetes pode-se usar penicilina, virginiamicina ou kamoran HJ. Fazer
teste em espectrofotmetro ou acidez para verificar qual o melhor
antibitico.

Levedura (fermento):

Dorna: Quanto maior a quantidade de fermento na dorna, melhor, at 13%,
se tiver centrfuga suficiente. Entretanto cuidado dobrado quando estiver
trabalhando com teores altos, pois as perdas so mais freqentes. O ideal
trabalhar com concentraes entre 10% e 13%. Use bicos nas centrfugas
compatveis com o teor de fermento na dorna.

Creme ou leite: Teores de 70 a 80% so ideais para a fermentao. Acima de 75%
cuidado para no perder muito no vinho centrifugado (turbinado).

Vinho: centrifugado (turbinado). Teores acima de 0,5% indicam apreenso. Acima de
1,0% pode parar a centrfuga para a lavagem, pois deve estar suja, e a perda
alta. Caso use caldo no decantado, tolera-se perdas at 2%, do contrrio
os bicos vo entupir com facilidade e a fica difcil operar.

Floculao: Tanto na dorna como na cuba, baixar o pH do fermento na cuba para
2,5. Se estiver a 2,5, baixar para 2,2, e se estiver a 2,2, baixar para 2,0.
Baixar o Brix do mosto um ou dois pontos se o Brix for at 20. Se estiver
trabalhando com Brix acima de 20, baixar, quatro pontos:
Exemplo: Estamos trabalhando com 26 de Brix no mosto, reduzir para 22
Brix se comear a flocular.
Verificar contagens, principalmente de bastonetes.
Se for contaminao aplicar os antimicrobianos indicados. Verificar
temperatura mxima das dornas em fermentao. Se no for
contaminao comunicar os superiores e solicitar que entrem em contato
a Fermentec. Dextrana pode fazer flocular o fermento, mesmo com baixa
contaminao (nvel de 10
6
).

Fermentao:

Temperatura: Procurar manter as temperaturas mximas indicadas na Tabela, j
vista e se no conseguir, alimentar a dorna mais devagar para que a
temperatura no se eleve demais, pois a cada grau centgrado acima
de 33C o rendimento fermentativo decresce de 0,8% a 1,2%. Se a

temperatura for baixa, alimentar com mosto mais quente, ou se no for
possvel, alimentar mais rpido.

Fermento que no quer pegar:

- Verificar o pH do p de cuba. Se o pH for menor que 2,0 fazer uma "injeo" de uma
outra dorna que j esteja cheia e fermentando, at o pH desta dorna se elevar pelo
menos a 3,0.

- Verificar a porcentagem de clulas vivas (viabilidade), se for menor que 50%, injetar
ar na dorna, aplicar 20 kg de sulfato de amnia ou uria mais Quinfz (10 kg) para
cada 100 m
3
de dorna. importante saber porque a viabilidade caiu. Checar todos os
outros parmetros.

- Verificar a temperatura da dorna. Se estiver abaixo de 29C, alimentar com mosto a
40C at a temperatura subir para 33C. Se no houver possibilidade de enviar mosto
quente, fazer uma "injeo" de uma dorna que esteja fermentando bem e com uma
temperatura acima de 32C.

Paradas:

- Se a moenda parar e no houver mel ou xarope suficiente para trabalhar com mel ou
xarope e gua, refrigerar mais as dornas, para baixar a temperatura destas e atrasar a
fermentao (paradas at de 3 horas).

- Se houver mel, trabalhar com um Brix maior. Exemplo: o Brix estava em 18, com mel
mais caldo, agora, com mel mais gua, suba o Brix para 22 e espere o resultado do
laboratrio para ver se preciso subir mais, baixar um pouco ou deixar a mesmo.

- Se a parada for maior que seis horas, centrifugar todo o vinho das dornas e destilar
todo este vinho (se no houver bagao, gaste lenha). O fermento centrifugado
colocado na cuba e recebe um tratamento igual ao normal, mas apenas com uma
diferena: no colocar cido, e aplicar antibitico (com o teste da Fermentec, verificar
qual o melhor antibitico para esta ocasio).
Diluir o fermento com gua o mais que puder, arejar o tempo todo de tratamento (2 a 3
horas, no mais) e voltar este fermento para a dorna (no arejar na dorna) at que

haja mosto para reiniciar a fermentao novamente. O fermento assim tratado
agentar muitos dias. Se o cido j tiver sido aplicado em alguma cuba, adicionar
soda at pH 3,5, para depois "arrear" o fermento na dorna. Deixar o maior volume de
fermento que puder, nas cubas. mais fcil de iniciar a fermentao se o fermento
estiver na cuba. Na dorna, ele se acumula no fundo, e na cuba temos agitao.

- Devem-se deixar umas dornas cheias de vinho centrifugado prontas para destilar nas
paradas para acertar o balano de vapor quando reiniciar a fermentao e destilao.
Fatores que afetam o desempenho fermentativo
A levedura como entidade viva independente, realiza a fermentao do acar com o
objetivo de conseguir energia qumica necessria sua sobrevivncia, sendo o etanol
apenas e to somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende
beneficiar-se dessa habilidade metablica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe
permitam propiciar as leveduras, condies ideais para que as mesmas trabalhem a
seu favor, isto , com maior eficincia na produo de etanol. A clula de levedura
possui compartimentaes para adequao de sua atividade metablica. A
fermentao alcolica (gliclise anaerbica) ocorre no citoplasma, enquanto que a
oxidao total de acar (respirao) se d na mitocndria.
A transformao do acar (glicose) at resultar em etanol e gs carbnico envolve 12
reaes em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica.
Tais enzimas sofrem aes de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitamina,
inibidores, substancias do prprio metabolismo, pH, temperatura, etc.), alguns que
estimulam outros que reprimem a ao enzimtica, afetando assim, o desempenho do
processo.
O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o acar, gerar
uma forma de energia qumica (ATP) que ser empregada na realizao dos diversos
trabalhos fisiolgicos (absoro, excreo, etc.) e biossnteses, necessrios
manuteno da vida, crescimento e multiplicao, perpetuando assim a espcie. O
etanol e o gs carbnicos resultantes se constituem em produtos de excreo, sem
utilidade metablica para a clula em anaerobiose. Entretanto o etanol e outros
produtos de excreo podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e
biomassa, mas apenas em condies de aerobiose.
Em termos energticos a respirao muito mais eficiente (produo de ATP) do que
a fermentao, motivo pelo qual, a oxigenao permite uma maior multiplicao da
levedura.

Durante a fermentao, na seqncia de reaes de produo de ATP, intrnsecas
formao de etanol, rotas metablicas alternativas aparecem para propiciar a
formao de materiais necessrios produo de biomassa (polissacardeos,
protenas, cidos nuclicos, etc.) bem como para a formao de outros produtos de
interesse metablico relacionados direta ou indiretamente com a adaptao e
sobrevivncia, os quais desviam esqueletos carbnicos provenientes do acar,
reduzindo a produo de etanol. ele, o glicerol, os cidos orgnicos (principalmente
o succnico e o actico), que conjuntamente com a biomassa so quantitativamente os
principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilbrio do redox celular em
anaerobiose.
A fermentao alcolica um processo no oxidativo, sem a participao do oxignio
molecular (O
2
), e, portanto, para se manter o equilbrio de redox celular, todo NADH
formado (em reaes de oxidao) deve ser consumido (em reaes de reduo)
estas acopladas produo de etanol e glicerol.
Glicerol
O glicerol o composto secundrio formado em maior quantidade. Forma-se na
mesma via de sntese do etanol, como um desvio, competindo com este pela utilizao
do poder redutor (NADH), motivo pela qual sua produo inversamente a do etanol,
causando queda na eficincia fermentativa.
A formao de glicerol funo do tipo de levedura; da presso osmtica do meio; da
formao de cidos orgnicos (succnico e actico) e do crescimento da levedura.
Tipo de levedura influencia na produo de glicerol, na medida em que esta uma
caracterstica gentica. A espcie Debaryomyces hansenii, por exemplo, acumula o
glicerol que produz, enquanto que a Saccharomyces cerevisiae o excreta. A
quantidade de acar desviado para a formao de glicerol varia at mesmo em nvel
de linhagens. De maneira que as leveduras Fleischmann e TA, que tm
comportamentos muito parecidos, desviam de 3 a 8% do acar para formar glicerol,
uma quantidade muito grande se comparada a algumas linhagens industriais
(leveduras que aparecem e persistem no processo).
O glicerol considerado um metablito osmorregulador, pois sua formao
aumentada em meios com baixa atividade de gua (alta presso osmtica)
determinada pela presena de solutos tais como acar ou sais. Dados de laboratrio
demonstram que incrementos no teor de K
+
de 1.000 para 10.000 mg/litro aumentam
significativamente a produo de glicerol, e a literatura descreve valores de 56.000
mg/litro de potssio aumentando em 10 vezes o glicerol formado.

Em nvel bioqumico, parte do glicerol formado est acoplada manuteno do
equilbrio de redox intracelular. Como a biossntese do glicerol utiliza o poder redutor
(NADH), a produo do mesmo aumentada quando h excesso de NADH na clula.
Isto ocorre quando processos oxidativos se desenvolvem, sejam decorrentes da
produo de biomassa (crescimento) ou formao de cidos orgnicos (succnico e
actico).
cido succnico
Este o principal cido produzido pela levedura. Sua formao ocorre pela atividade
residual de enzimas respiratrias, quando a mitocndria est reprimida em
anaerobiose, correspondendo a um processo oxidativo. A produo de cido succnico
ocorre em maior velocidade que a do etanol at a 1 hora de fermentao, quando
60% do total so produzidos.
Observa-se que para a formao de um mol de succinato, h conseqente formao
de cinco moles de NADH (poder redutor). Para se estabelecer o equilbrio de redox da
clula, necessrio o consumo desse poder redutor, que feito atravs da produo
de glicerol. Como a produo de um mol de glicerol consome um mol de NADH, cinco
moles de glicerol sero produzidos quando ocorrer a formao de um mol de
succinato, que como visto, produz 5 NADH. Convertendo-se os valores molares em
gramas, tem-se que 4g de glicerol sero produzidos para cada grama de cido
succnico formado.
As razes fisiolgicas que levam a levedura a produzir e excretar o cido succnico
(depois do glicerol o produto secundrio mais abundante na fermentao) ainda
discutvel. A formao de cido succnico pouco varivel de acordo com as
condies do ambiente fermentativo, mas quando um inibidor de crescimento, o cido
benzico foi adicionado em meio fermentativo, causou drstica reduo da formao
de cido succnico, que foi acompanhada por alta contaminao bacteriana.
cido actico
O cido actico aparece na fermentao por ao principal do metabolismo
bacteriano. No entanto, a levedura capaz de sintetiz-lo, processo este, oxidativo.
Observa-se que para formao de um mol de cido actico ocorre a produo de dois
moles de NADH. Este poder redutor (analogamente ao descrito para o cido
succnico) utilizado para a formao de dois moles de glicerol necessrios
manuteno do equilbrio de redox.

Convertendo-se em gramas, tem-se que para cada grama de cido actico produzido,
3 gramas de glicerol devem ser formados.
Biomassa
Havendo incrementos de leveduras (crescimento), ocorre desvio de esqueletos
carbnicos atravs do piruvato, para formao de aminocidos que iro compor as
protenas.
O crescimento um processo oxidativo, portanto com produo de NADH (0,6 moles
de NADH por 100 gramas de matria seca de levedura). Consequentemente, o poder
redutor gerado ser utilizado na formao de glicerol para manter o equilbrio de
redox. O valor exato que correlaciona glicerol para manter o equilbrio de redox. O
valor exato que correlaciona glicerol com biomassa ainda no est definido na
literatura, mas o que parece chegar mais prximo da realidade seria de 0,6 gramas de
glicerol por cada grama de biomassa seca, sem considerar o acar integrando os
constituintes celulares, que, supe-se seja de 1:1, totalizando 1,6 gramas de acar
por cada grama de biomassa seca produzida.
Estequiometria da fermentao
Com base nas relaes molares descritas anteriormente, pode-se estabelecer uma
estequiometria da fermentao, com dados mdios obtidos no laboratrio, calculando
o acar desviado da sntese de etanol, para a formao de tais produtos secundrios
da fermentao, inclusive a biomassa, encampando os carboidratos de reserva,
trealose e glicognio. Os dados abaixo mostram a proporo dos diversos produtos da
fermentao alcolica (em gramas/100 gramas de glicose metabolizada).
- para rendimento entre 90 95%: etanol= 45 49; gs carbnico= 43 47; glicerol= 2
5; cido succnico= 0,5 1,5; cido actico= 0 1,4; biomassa (massa seca)= 0,7
1,7; leo fsel= 0,2 0,6; butileno glicol= 0,2 0,6.
Carboidratos de reserva
Os carboidratos de reserva, trealose e glicognio, podem representar parte
significativa da composio da levedura (at 30% da matria seca). Tais carboidratos
sofrem oscilaes em seus teores durante a fermentao, podendo terminar o
processo com teores diferentes (maiores ou menores) daqueles do incio, sendo em
parte responsveis pelas oscilaes no rendimento fermentativo de um ciclo para
outro. Nos primeiros 30 minutos de fermentao ocorre intensa degradao da

trealose, mas na 1 hora a ressntese torna-se evidente, sendo que no final da
fermentao, o teor de trealose pode suplantar o teor inicial.
Terminada a fermentao, tais reservas podem ser metabolizadas produzindo mais
etanol e consequentemente enriquecendo a levedura com nitrognio. Tais alteraes
so de grande significado na remoo de parte da levedura do processo para
produo de rao.
A trealose, um dissacardeo constitudo por duas molculas de glicose de uma
importncia tecnolgica relevante, pois alm da funo bsica de carboidrato de
reserva, exerce uma funo protetora contra estresses, responsvel pela manuteno
das clulas vegetativas e esporos viveis. A funo protetora da trealose resultado
da inter-relao entre sua localizao e mobilizao na clula. Sua presena no
citoplasma, onde acumulada, exerce uma influncia na atividade de gua do citossol
contribuindo para desacelerao do metabolismo (latncia), aumentando a resistncia
ao estresse hdrico. Em condies de baixa atividade de gua, a trealose na
membrana (nos dois lados da camada fosfolipdica) substitui as molculas de gua,
mantendo a integridade da membrana.
interessante ressaltar, que o desenvolvimento de resistncia a agentes estressantes
permitido pelo acmulo de trealose como divulgado pela literatura, desencadeado
por flashes do agente, ou seja, um perodo curto de exposio, quando a levedura
ento induzida a acumular trealose, tornando-se menos vulnervel. Por exemplo, o
choque trmico desencadeia a termotolerncia, havendo uma correlao direta entre
os teores do carboidrato e a resistncia ao estresse trmico.
Enquanto a levedura capaz de manter seus nveis de trealose, a viabilidade
mantida.
Numa fermentao industrial, a levedura encontra-se exposta continuamente a um
conjunto de situaes estressantes, que de acordo com a intensidade pode acarretar a
exausto do seu contedo de trealose acompanhada pela queda da viabilidade.
Muitas dessas situaes constituem os fatores fsico-qumicos e microbiolgicos que
afetam o desempenho fermentativo como um todo.
Espcie de levedura
O desempenho do processo fermentativo enormemente afetado pelo tipo de
levedura que o desenvolve.
uma prtica muito freqente nas destilarias se iniciar o processo fermentativo com
uma determinada levedura, seja pela tradio de seu uso, como Saccharomyces
cerevisiae, pela facilidade de obteno em grandes quantidades, como as leveduras

de panificao, ou seja, pelo fato da mesma ser obtida atravs de melhoramento
gentico para se melhor adequar s necessidades do processo industrial.
Identificao de leveduras pela tcnica da cariotipagem
A permanncia das leveduras tradicionais ao longo da safra nunca pde ser
sistematicamente avaliada devido falta de um procedimento analtico confivel, pois
que as caractersticas macromorfolgicas de colnias bem como os aspectos das
clulas ao microscpio nem sempre fornecem dados seguros para se discriminar
diferentes linhagens de leveduras, acrescidos o fato de que uma mesma linhagem
pode apresentar alteraes morfolgicas das colnias e das clulas em funo das
condies do meio. Os testes de assimilao e fermentao de diferentes carboidratos
se mostram de grande valia, mas o tempo exigido inviabiliza tal procedimento para
uma rpida identificao de leveduras.
A tcnica da cariotipagem, baseada na separao eletrofortica do DNA
cromossmico intacto (molculas que se diferenciam tanto em nmero como em
tamanho, contidas no ncleo da levedura e primordialmente relacionadas com suas
caractersticas genticas), tem se mostrado como uma excelente ferramenta na
diferenciao de gneros, espcies, bem como de diferentes linhagens de uma
mesma espcie.
Tal tcnica, que j foi utilizada na tipificao de leveduras nas indstrias de vinho e
cerveja, foi adaptada para as necessidades da indstria alcooleira e nos permitiu
acompanhar a permanncia das leveduras tradicionais ao longo de vrias safras.
Tem sido documentado que no processo industrial leveduras contaminantes de
diferentes origens (do campo, da cana, do mel, das prprias instalaes industriais) se
instalam na dorna e acabam competindo com as leveduras tradicionalmente
empregadas. Em algumas ocasies e especificamente quando ocorrem srios
problemas na conduo da fermentao industrial, tais leveduras contaminantes foram
identificadas (inclusive pelas tcnicas clssicas mencionadas anteriormente) e
responsabilizadas por tais transtornos (baixo rendimento, floculao, excesso de
espuma, etc.). Neste particular a contaminao com Candida krusei tem sido
detectada especialmente quando ocorrem condies de aerobiose suficiente para o
crescimento desta espcie, que acarreta grande proporo de espuma com queda do
rendimento e aumento do tempo da fermentao.

Permanncia de leveduras tradicionais no processo fermentativo
A tcnica da cariotipagem possibilitou acompanhar a permanncia, no s de
leveduras tradicionalmente empregadas pela indstria, tais como, Fleischmann,
Itaiquara, IZ-1904, como tambm de uma linhagem de Saccharomyces no floculante
oriunda do Canad. Os resultados obtidos ao longo de 4 safras demonstram que tais
leveduras no permanecem no processo por mais do que 30 40 dias, sendo que em
algumas ocasies tais leveduras desaparecem por completo em at 15 dias.
Demonstrou-se ainda que as leveduras tradicionais sejam substitudas por linhagens
contaminantes, e que a queda da viabilidade na indstria durante o incio de safra,
conhecida at ento por fase de adaptao da levedura, pode ser considerada uma
fase de substituio. As leveduras substituintes, dependendo da destilaria e das
condies do processo, podem tanto congregar um grande nmero de diferentes
Saccharomyces que se alternam durante a safra, ou serem representadas por um
pequeno nmero de leveduras com dominncia e persistncia no processo industrial.
Tais resultados sugerem que as leveduras contaminantes com caractersticas de
dominncia (representando poro significativa da biomassa da dorna) e persistncia
(capacidade da levedura de sobreviver as condies estressantes da fermentao
industrial) renem importantes atributos para uma leveduras alcolica industrial,
conquanto se mostre altamente competitivas no ambiente da dorna.
Seleo de linhagens para fermentao industrial
Leveduras dominantes e persistentes no processo industrial foram identificadas e
isoladas com o auxlio da tcnica de cariotipagem. Tais leveduras foram avaliadas, em
escala laboratorial confrontando-as com as tradicionais quanto as suas habilidades
fermentativas (rendimento de fermentao, formao de glicerol, crescimento em
biomassa, viabilidade durante reciclos, contaminao bacteriana e contedo de
trealose) e tolerncia a alguns agentes estressantes (etanol, salinidade, osmolaridade,
sulfito, altas temperaturas e contaminao bacteriana). Foram selecionas aquelas com
caractersticas fermentativas desejveis e que igualmente se apresentaram com maior
tolerncia aos fatores estressantes testados.
Algumas dessas leveduras foram reintroduzidas no processo industrial, monitorada a
sua permanncia ao longo da safra, ao mesmo tempo em que se avaliaram os
diversos parmetros da fermentao.

Nutrio mineral da levedura
As leveduras exigem diversos ons inorgnicos (minerais) em concentraes tanto
micro como milimolar para manifestarem timos crescimento e rendimento
fermentativo. Deficincias ou concentraes de tais minerais, ou seja, um desequilbrio
entre os nutrientes minerais, provoca alteraes metablicas significativas. De todos
os elementos encontrados na levedura apenas alguns so considerados essenciais
sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo da composio do meio
no qual a levedura cresceu.
As necessidades de N, P e S so as mais facilmente justificveis por integrarem
constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. J os ons
minerais esto predominantemente implicados na atividade enzimtica. Assim o
mineral pode funcionar como o centro cataltico de uma enzima (conforme o Zn, Mn,
Co e Cu), como ativador ou estabilizador da funo enzimtica (K, NH
4
, Mg), como
mantenedor de um controle fisiolgico (pela ao antagnica exercida entre ons), e
ainda do ponto de vista estrutural, atuando como neutralizador de foras eletrostticas
em diversas unidades celulares aninicas (K, Ca, Mg e Zn neutralizando cargas
negativas do DNA, RNA, protenas, membranas fosfolipdicas e fosfomananas da
parede celular).
Embora se possam postular concentraes timas para cada elemento, existe uma
vasta gama de interaes entre os nutrientes minerais resultando que tal concentrao
tima altamente dependente da concentrao de outros minerais no meio.
Para tornar a situao mais complexa, alguns ons atuam como antagnicos
minimizando efeitos inibitrios de outras espcies inicas e por outras inter-relaes
metablicas que determinam quantidade absorvida do on e os efeitos
conseqentes.
Igualmente, pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser
diminuda, se o mosto empregado na indstria, geralmente complexo, apresentar o
produto final de uma reao catalizada por uma metalo-enzima. Isso ocorre quando o
mosto apresenta aminocidos, bases nitrogenadas e outros compostos orgnicos e
que so utilizados pela levedura, tornando desnecessria a sntese dos mesmos.
Por outro lado, os mostos empregados na indstria podem conter agentes quelantes,
sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentrao efetiva de espcies
inicas.
Assim, minerais de argila, cidos hmicos, aminocidos, protenas, cidos orgnicos,
polifenis, cido ftico, polifosfatos e outros materiais coloidais, complexam diversos

ons com diferentes afinidades. Os elementos minerais que afetam negativamente a
levedura podem ser classificados como elementos txicos, como o caso do alumnio.

Principais nutrientes e suas funes
Potssio
Ativador enzimtico inclusive de reaes da gliclise;
Estabilizador de membranas;
Necessrio para a absoro do H
2
PO
4
-
;
Aumenta a tolerncia para ons txicos, inclusive H
-
, controlando o pH intracelular;
Participa da absoro, por troca, de ctions bivalentes (Zn e Co).
A necessidade desse nutriente para a clula gira ao redor de 700 ppm, mas na prtica,
com mostos base de melao, a levedura encontra-se exposta s concentraes de
K
+
que podem atingir 6.000 ppm. Nestas condies, pode-se assumir a necessidade
de uma levedura industrial que seja tolerante s altas concentraes salinas.
O potssio necessrio ao crescimento e fermentao e sua absoro facilitada
pela absoro da glicose. Na deficincia de potssio o H
2
PO
4
-
no absorvido e a
absoro de magnsio dependente do fosfato. Por outro lado a absoro de
nitrognio proporcional concentrao de fosfato. Resulta dessas observaes que
as concentraes timas de Magnsio, potssio e H
2
PO
4
-
so interrelacionadas.

Magnsio
Ativador enzimtico no processo glicoltico de transferases e carboxilases;
Estimula a absoro de H
2
PO
4
-
incrementando a fermentao;
Mantm a integridade e permeabilidade das membranas e regula o transporte de
ctions bivalentes;
Sofre ao antagnica do clcio.
Clcio
Parece no ser importante para fermentaes e multiplicao;
Mantm integridade da membrana plasmtica em condies adversas;
Ativa ATPase em concentrao 1mM, mas se mostra inibidor a 10mM;
Inibe absoro de aminocidos em concentrao de 1mM e inibe o crescimento em
concentraes de 25 mM.

Zinco
Participa da gliclise e da sntese de vitaminas, sendo essencial ao crescimento e a
fermentao;
No substitudo por nenhum outro on em suas funes;
integrante de desidrogenases, aldolases e desulfidrases;
A absoro reduzida, em pH abaixo de 5 e efetuada mediante troca com 2 ons
Potssio.
Mangans
Estimula a sntese de protenas e tiamina;
Aumenta o teor de desidrogenase alcolica;
Na concentrao de 7 M estimula os efeitos do zinco.
Ferro
Participa do stio ativo de diversas enzimas (hemoenzimas);
Requerido para multiplicao na concentrao de 1 a 3 M;
Concentraes de 10 a 15 M inibem crescimento e fermentao.
Cobre
Integrante de algumas enzimas;
Em concentraes de 1 a 1,5 M estimula fermentao e crescimento, j em
concentraes de 10 M inibe o crescimento.
Molibidenio, Cobalto e Boro
Estimulam crescimento e fermentao em baixas concentraes (1 M);
Inibio com concentraes acima de 5 M.
Nitrognio
O teor de nitrognio na levedura est ao redor de 8% (com base na matria seca),
porm nas leveduras da fermentao alcolica este teor mais baixo (5 6%),
constituindo as molculas de aminocidos, protenas, enzimas, cidos nuclicos,
purinas, piridimidimas, pigmentos respiratrios (citocromos), vitaminas, lecitina,
cefalinas, etc. O nitrognio se mostra essencial no apenas para o crescimento como
para uma fermentao adequada.

A levedura capaz de utilizar uma ampla gama de compostos nitrogenados tais como
aminocidos, bases nitrogenadas, uria e amnio, utilizando-se de vrios sistemas de
transporte para as diferentes fontes.
A absoro de amnio (NH
4
+
) ocorre custa da sada de ons H
+
, com gasto de
energia e acidificao do meio externo. A uria pode ser absorvida por difuso
facilitada, ou seja, entra naturalmente na clula entra naturalmente na clula quando
os teores no meio so altos, sem ser acionado o sistema dependente de energia. A
permease geral de aminocidos garante a absoro dos mesmos na ausncia de ons
amnio, que inibem tal transporte, o que pode ser desejvel, uma vez que certos
aminocidos so precursores dos lcoois superiores.
O nitrognio na forma amoniacal (NH
4
+
) encontrado no mosto proveniente do caldo
da cana e o brotamento, da levedura, na taxa de multiplicao, e a % de levedo no
vinho esto diretamente relacionados com a concentrao de (NH
4
+
). Esta forma de
nitrognio na cana intermediria, pois o nitrato (NO
3
-
) absorvido do solo pela planta,
reduzido a N amoniacal e este transformado em aminocidos, protenas, cidos
nuclicos e demais compostos nitrogenados.
Destilarias com (NH
4
+
) maior de 70 ppm no mosto, com temperatura controlada e sem
perdas na centrfuga, apresentam problemas com excesso de levedura na dorna.
Teores abaixo de 40 ppm ocasionam fermentao lente, baixo brotamento e baixo
rendimento fermentativo, pois em detrimento da produo de etanol, a levedura
acumula trealose; o teor ideal encontra-se entre 40 e 70 ppm de (NH
4
+
) por litro de
mosto.
Fato que distingue a uria e o amnio como fonte nitrogenada e decorrente do modo
de absoro, o pH do meio exterior, que pouco afetado quando se utiliza uria,
mas nitidamente menor na presena de sulfato de amnio.
Fsforo
O fsforo alm de integrar as molculas informacionais DNA e RNA, estruturais
membranas fosfolipdicas, participa ativamente nos processos de transformao e
transferncia de energia qumica (gliclise, fermentao, respirao, biossntese, etc.).
O fsforo , portanto necessrio a multiplicao do fermento bem como
fermentao. Existe correlao positiva entre o teor de fsforo da levedura e o
rendimento da fermentao.
A levedura absorve o fsforo na forma do on H
2
PO
4
-
, forma predominante no pH=4,5.
As outras formas inicas no so absorvidas. O fosfato absorvido, contra um gradiente
de concentrao se necessrio, pode participar de imediato nas fosforilaes ou ser

armazenado como metafosfatos em elevadas concentraes. Os ons fosfatos so
mais intensamente absorvidos em presena do on K
+
do que de Na
+
. steres
fosfricos orgnicos tambm podem se constituir em fonte de P, aps a ao da
fosfatase localizada na parede celular, liberando fosfato que absorvido.
O excesso de cal, durante o tratamento do caldo, faz precipitar o fsforo, assim como
o zinco, o cobre e o mangans. Porm a precipitao significativa, se o pH for acima
de 6,0.
Enxofre
O sulfato uma fonte de enxofre para a levedura e a absoro do mesmo requer
gasto de energia, sendo que glucose e nitrognio assimilvel devem estar presentes
no meio.
Sulfito e o tiossulfato podem substituir o sulfato, mas os aminocidos cistena e cistina
no se constituem em fonte de S para a levedura. Em algumas ocasies o sulfato
origina SO
2
e H
2
S.
O enxofre utilizado na sulfitao bem como o oriundo do cido sulfrico empregado no
tratamento cido do fermento, parece fornecer quantidade suficiente do elemento para
fermentao, visto que a quantidade de enxofre necessria relativamente baixa. Mas
frequentemente o que ocorre quando se usa melao sulfitado na fermentao o
efeito txico do sulfito.
Inibidores da fermentao
Muitos minerais s vezes encontrados no meio se mostram deletrios multiplicao
e fermentao, quer inibindo enzimas quer alterando a permeabilidade de
membranas. Tais efeitos txicos podem ser minimizados pela presena de agentes
precipitantes e complexantes nos mostos industriais, principalmente de melao.
Alumnio
Txico ao nvel das membranas;
Concentraes de 2 M diminuem o crescimento.
Anlises de mostos industriais demonstram a existncia de quantidades txicas de
alumnio o qual, j a partir de 10 ppm acarreta efeito estressante sobre a levedura em
mosto de caldo e xarope.
O alumnio bloqueia o crescimento do fermento e a formao de trealose, reduzindo a
velocidade de fermentao. Em conseqncia se observa aumento na eficincia
fermentativa e diminuio na formao de glicerol. Entretanto tais aspectos benficos

observados nos primeiros ciclos fermentativos desaparecem com a queda na
viabilidade do fermento nos ciclos subseqentes. Existem cepas de leveduras com
menor capacidade de armazenar trealose, onde menos tolerante ao alumnio.
Concluindo, as quedas acentuadas na viabilidade e nos teores de trealose do fermento
quando em presena do alumnio, demonstram de maneira inequvoca os efeitos
deletrio de tal elemento, no permitindo beneficiar-se dos efeitos aparentemente
benficos, como redues do crescimento e da formao de glicerol, com incrementos
nos teores alcolicos.
Por outro lado, a acidificao equivalente presena do alumnio, causou discretas
redues nos teores de trealose e na viabilidade, sem, contudo comprometer o
processo fermentativo, alis, resultando apenas em benefcios fermentao.
Em condies industriais, em uma destilaria, foi detectado abaixamento no
rendimento, aumento do tempo de fermentao e diminuio da viabilidade quando se
moeu uma cana que no havia sido calcareada e adubada. O teor de Al chegou a 150
ppm nestes dias crticos, depois abaixou para 30 ppm e o problema desapareceu.
Entretanto, quando se emprega mostos base de melao, os efeitos txicos do Al so
atenuados ou quase desaparecem muito possivelmente pela presena de maiores
teores de substancias complexantes (cidos orgnicos, aminocidos, etc.)
Sulfito
A sulfitao do caldo de cana como clarificante resulta em melaos com teores de
sulfito (SO
2
) que podem atingir 1.000 ppm, fornecendo mostos com at 300 ppm de
SO
2
/litro. O mosto sulfitado pode comprometer seriamente o desenvolvimento da
fermentao alcolica, devido sua ao no metabolismo da levedura, e tanto mais
txico, quanto menor o pH do meio. O sulfito faz a levedura produzir mais aldedo
actico, que na coluna A, com o aquecimento se oxida a cido actico, e ir aumentar
a acidez do lcool. Alm disso, propicia maior formao de glicerol, comprometendo a
eficincia fermentativa. Porm, quando a contaminao alta, pode-se at apontar um
efeito benfico do sulfito, reduzindo a infeco, favorecendo assim a fermentao.
Temperatura
Na indstria, a temperatura do mosto um fator crtico no processo fermentativo. Se a
temperatura for baixa (menor que 26 27C), a fermentao no desenvolve devido
ao choque trmico, o que resolvido alimentando-se a dorna com mosto mais quente.
Uma outra soluo cortar uma dorna em fermentao para dorna problema at que a
referida dorna reaja. J o mosto quente, acima de 30C, pode acarretar um

superaquecimento nas dornas em fermentao, propiciando um aumento da
temperatura do vinho e consequentemente uma diminuio do rendimento.
Mas o mosto quente no o nico responsvel pela elevao da temperatura. A
prpria fermentao de 1 kg de acar (ART) pela levedura para produzir lcool, leva
a produo de 160 Kcal.
Um fator extremamente importante, correlacionando positivamente com a temperatura
do mosto a contaminao bacteriana, principalmente entre 30 40C. Portanto, se a
temperatura do mosto for acima de 30C, o nmero de bactrias aumentar
proporcionalmente com o aumento da temperatura, at 40C.
As leveduras de destilaria crescem bem em temperatura de 30 33C e as
fermentaes podem ocorrer com altas velocidades em temperatura at mais
elevadas. Entretanto com o aumento da temperatura a levedura se torna mais
vulnervel a toxidez exercida pelo etanol produzido, ocorrendo queda na viabilidade.
Alguns efeitos podem ser atribudos s alteraes na composio da membrana a fim
de preservar a integridade das mesmas. Assim, as leveduras podem aumentar as
propores de cidos graxos saturados, bem como o comprimento de suas cadeias.
Os cidos graxos saturados conferem rigidez, enquanto que os insaturados fluidez s
membranas, por isso, em temperatura mais elevadas os cidos graxos saturados
conferem fluidez necessria clula.
O efeito prejudicial da elevada temperatura, especialmente quando se desconsidera
outros parmetros na fermentao, pode ser mascarada, quando h aumento no
rendimento, diminuio do crescimento e da formao de glicerol. Entretanto tais
aspectos benficos so custa da biomassa (incluindo trealose) que est sendo
consumida, e com progredir dos ciclos fermentativos ocorrer o desaparecimento da
levedura no processo.
O papel da trealose como mantenedora da viabilidade tambm notado em
temperaturas elevadas, porm no tem sido apontada pela literatura como o nico
fator determinante na aquisio de termotolerncia.
pH
O pH um fator significativo para as fermentaes industriais devido sua
importncia tanto no controle de algumas bactrias contaminantes quanto ao seu
efeito sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentao e formao de
subprodutos.
Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-se na faixa de 4,5 a
5,5 com uma boa capacidade tamponante, mas as leveduras mantm sua homeostase

de forma quase independente dos valores de pH do meio, por isso toleram o
tratamento cido, de sorte que a fermentao industrial se inicia com pH muito baixo,
correspondendo ao pH da cuba de tratamento. O tratamento cido tambm provoca
lixiviao de nutrientes tais como N, P e K da levedura que acaba por elevar o pH.
Na indstria quando se utiliza muito melao esgotado, o pH no final da fermentao se
eleva acima de 4,0 e aumenta a floculao do fermento alm de propiciar um aumento
significativo na infeco. A acidez muito elevada do vinho devida atividade
bacteriana, pela presena de cido ltico.
Contaminao bacteriana
A contaminao bacteriana um dos fatores preponderantes dentre aqueles que
afetam a fermentao alcolica, posto que em o mais freqente agente estressante
presente. Trabalhos efetuados em laboratrio e os dados da indstria so coincidentes
quanto ao prejuzo que a contaminao pode exercer no rendimento fermentativo.
Fatores como as altas temperaturas so duplamente prejudiciais, pois alm do efeito
deletrio sobre a levedura, propiciam maior contaminao bacteriana. Onde h
presena aumentada de bactrias, via de regra, h aumentos significativos na
formao dos cidos ltico e s vezes de actico. Como o cido ltico um produto
bacteriano, ele pode ser considerado um indicador mais preciso da contaminao, pois
reflete a atividade metablica dessas bactrias, mesmo que a toxidez bacteriana seja
exercida por componentes outros, mais complexos que o referido cido. O cido
actico, como sendo tambm um produto da levedura, pode at ter sua formao
diminuda, mesmo com o aumento da contaminao bacteriana.
Os mecanismos atravs dos quais as bactrias exercem efeito direto sobre as
leveduras, so pouco conhecidos. As relaes antagnicas so travadas pela
produo de uma ampla gama de substancias txicas, compreendendo cidos
orgnicos, lcoois e at complexos compostos do metabolismo secundrio. A
coexistncia das leveduras com as bactrias lticas requer uma habilidade por parte
das leveduras em resistirem ao ambiente proporcionado pelas bactrias, ou mesmo
por serem capazes de controlar a contaminao num estado basal.

MATRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAO ALCOLICA
Caldo: composio, pr-tratamento, controle de qualidade
Composio
A composio qumica da cana-de-acar muito varivel em funo das condies
climticas, das propriedades fsicas, qumicas e microbiolgicas do solo, do tipo de
cultivo, da variedade, da idade, do estgio de maturao, do estado sanitrio, entre
outros fatores. Da sua composio, 99% so devido aos elementos hidrognio,
oxignio e carbono. A distribuio destes elementos no colmo, em mdia de 74,5%
em gua, 25% de matria orgnica e 0,5% de matria mineral.
As duas fraes principais da cana-de-acar para processamento so a fibra e o
caldo, sendo este a rigor, em nosso caso, a matria-prima para a indstria do lcool.
O caldo, definido como uma soluo impura e diluda de sacarose, glicose e frutose,
constitudo de gua (+/- 82%) e slidos solveis ou Brix (+/- 18%), sendo estes
agrupados em acares orgnicos, no acares e inorganicos.
Os acares so representados pela sacarose, glicose e frutose. A sacarose, como o
componente mais importante, tem um valor mdio de 14%, enquanto os demais,
dependendo do estado de maturao, 0,2 a 0,4%, respectivamente para a frutose e
glicose. Estes carboidratos que constituem o acar total, quando expressos em
glicose ou acar invertido, apresentam um teor de cerca de 15 16%.
Os acares redutores glicose e frutose quando em teores elevados mostram um
estgio pouco adiantado de maturao da cana, alm da presena de outras
substancias indesejveis ao processamento. No entanto, em canas maduras, os
acares redutores contribuem embora com uma pequena percentagem, para o
aumento do teor de acar total.
Os compostos orgnicos no acares so constitudos de substancias nitrogenadas
(protenas, aminocidos, etc.), gorduras, ceras, pectinas, cidos (mlico, succnico,
acontico, etc.) e de matrias corantes (clorofila, sacaretina e antocianina).
As substancias inorgnicas, representadas pelas cinzas, tem como componentes
principais: slica, potssio, fsforo, clcio, sdio, magnsio, enxofre, ferro e alumnio.
Para a fabricao de lcool, alguns componentes das cinzas so considerados
importantes para o processo fermentativo, como tambm a nutrio da levedura.

Pr-tratamento do caldo
Para uma boa evoluo do processo de fermentao-destilao deve ser requerida da
matria-prima a ser processada, em nosso caso o caldo de cana, uma qualidade que
no comprometa o desenvolvimento normal de uma fermentao e nem cause
problemas na centrifugao do vinho ou na destilao. Para que isto acontea, devem
ser exigidos os seguintes requisitos no tratamento:
- Eliminao de impurezas grosseiras (bagacilho, areia, etc.);
- Mxima eliminao de partculas coloidais;
- Preservao de nutrientes: vitaminas, acares, fosfatos, traos de metais,
aminocidos essenciais e,
- Minimizao de contaminantes microbianos.
Processos de tratamento
Todos os processos de tratamento que vamos referir esto esquematizados em
anexo, sendo que as vantagens, desvantagens e comentrios adicionais sero
tambm citados.
No consideraremos em nenhum processo citado a hiptese da no retirada das
impurezas grosseiras, (bagacilho, areia, etc.) como ocorre em algumas usinas, j que
entendemos esta como uma condio primordial no tratamento do caldo para
destilaria.
Deve-se salientar que em todos os processos a serem ilustrados, na separao
dessas impurezas, considerou-se a utilizao de peneiras DSM.
Processo de tratamento do caldo para destilaria 1
Conforme a Figura 1, este processo consiste basicamente em eliminar as partculas
leves (bagacilhos) nas peneiras DSM e as partculas pesadas (areia, terra, etc.) nos
hidrociclones.
Neste caso, devido ao fato de no existir um choque trmico e, consequentemente,
no havendo a degradao das protenas, com certeza a formao de espuma ser
acentuada. Este problema dever ser contornado com razovel adio de
antiespumantes.
Parece que a no eliminao de colides poder causar a adsoro dos mesmos na
parede celular, provocando, ao longo do tempo, uma inibio na fermentao, alm de
favorecer tambm a formao de espuma.

Nota-se que este tratamento atende apenas 2 dos 4 requisitos bsicos do tratamento
do caldo para destilaria; no entanto o melhor processo no que se refere ao
investimento inicial, ou seja, de baixo custo.
Neste processo, Figura 2, alm da retirada das partculas leves e pesadas, realizado
tambm uma pasteurizao do caldo, ou seja, um aquecimento com posterior
resfriamento.
Atravs de alguns testes realizados notou-se que a contaminao bacteriana era a
mesma antes do aquecimento e aps o resfriamento. Isto implica que o tratamento
trmico em si no resolve os problemas de contaminao. No entanto j ficou provado
que com este tratamento a formao de espuma minimizada.
Para minimizar os problemas de infeco a tubulao dever ter o mnimo nmero de
flanges e outros pontos possveis de acmulo de resduos, como tambm o
resfriamento dever ser instalado o mais prximo possvel da fermentao.
Este processo atende apenas os requisitos 1 e 3, com a vantagem em relao ao
processo de tratamento 1, de diminuir a formao de espuma.
Este processo, Fig 3, se diferencia do anterior, somente pela introduo do trocador de
calor regenerativo. As vantagens deste processo em relao ao tratamento 2 o
menor consumo de vapor para aquecimento e menor consumo de gua para
resfriamento, alm da necessidade de menor superfcie global de transferncia de
calor (aquecimento e resfriamento). No entanto possui a desvantagem de ser enviado
o caldo a 50C para destilaria, contra 100C do tratamento 2, j que a temperatura
mnima para no se desenvolverem bactrias termfilas da ordem de 80C,
contribuindo para o acrscimo da infeco em relao ao tratamento 2.
Este processo, conforme a Fig 4, o que mais se aproxima do tratamento ideal de
acordo com os cinco requisitos citados anteriormente, porm com a desvantagem de
eliminar parte dos nutrientes (N e P) e micro nutrientes (Mg, Mn, Zn, na forma de
sulfatos) presentes no caldo que so floculados pela ao da cal polieletrlitos
calor.
Cuidados especiais devem ser tomados no que se refere a dosagem de cal no caldo.
O pH do caldo dosado dever ser mantido na faixa de 6.3, pois o excesso de cal pode

prejudicar o bom andamento da fermentao (o excesso de cal afeta o crescimento da
cultura), alm de causar incrustaes na coluna de destilao e trocadores.
A complementao de fsforo (na forma de P
2
O
5
) e adio de polieletrlitos tambm
deve ser realizada neste caso.
Controle de qualidade do caldo
O controle de qualidade do caldo em qualquer dos processos apresentados de
fundamental importncia para o bom andamento dos processos de
fermentao/destilao.
Os controles mnimos a serem adotados so:
- anlise de pH do caldo do primeiro terno;
- controle de infeco na moenda e cush-cush, com lavagem com vapor ou gua
quente a cada 4 -5 horas;
- adio de bactericida por choque e continuamente conforme a dosagem a ser
determinada de acordo com o produto utilizado;
- clarificao (quando existir)
- controle de pH em torno de 6.3 pela adio do leite de cal 5B
- dosagem de polmeros na faixa de 1 a 3 ppm
- controle de temperatura na entrada do balo de flash de 110C 113C
- anlise de Brix, pol e ART do caldo
Mel final: composio, armazenamento e controle de qualidade.
Composio
Vrios so os fatores que influem na composio do melao ou mel final, destacando-
se entre eles a natureza da matria-prima, a qualidade da cana processada, os
mtodos de fabricao, o sistema e o tempo de armazenamento e as regies
aucareiras. Segundo alguns autores, com tantas variveis agindo individualmente ou
conjuntamente, no h possibilidades de aplicao de nmeros mdios de aplicao
geral que sejam comparveis entre si. Mesmo considerando-se uma s variedade de
cana e um s mtodo de fabricao numa dada regio, a composio do mel final
varia com a poca do ano e com o ano agrcola.
Como ilustrao da composio do mel final citaremos na tabela abaixo a mdia dos
valores de Brix, Pol, sacarose, acares redutores e cinzas gravimtricas, obtidos em
4 pocas em 5 usinas diferentes, na regio de Ja, estado de So Paulo.


Brix Pol Sacarose AR ART Cinzas
1 90,85 39,30 39,87 9,67 51,5 8,04
2 91,42 36,01 38,59 9,16 49,7 8,31
3 91,53 38,79 39,27 9,49 50,7 7,96
4 89,66 37,54 38,72 9,52 51,1 7,83
mdia 90,87 37,91 39,11 9,46 50,8 8,04
Sabe-se que a composio do mel final das usinas muito diferente da tabela acima
no que se refere ao Brix, Pol e sacarose, devido ao esgotamento do mesmo. No
entanto quanto aos AR e cinzas acredita-se que a diferena percentual no seja muito
significativa.
Armazenamento
Devido a problemas de decomposio da sacarose e dos acares redutores do mel
final durante o armazenamento por ao de fungos, leveduras e bactrias
(dependendo da concentrao e temperatura de armazenamento) e
consequentemente desprendimento de gases inflamveis, principalmente metano e
hidrognio, alguns critrios devem ser seguidos durante a armazenagem:
- posicionamento do tanque no interior de uma bacia de conteno com volume igual
ao volume armazenado, com altura do talude no mximo 1,8 mt
- devido a possibilidade de formao de espuma e aumento da velocidade de
degradao trmica dos acares em temperaturas acima de 45C, dever ser
instalada uma tubulao retornando do sistema de recalque ao topo do tanque, de
forma a possibilitar a recirculao e conseqente movimentao e resfriamento do
mel.
Controle de qualidade
Para o perfeito conhecimento da matria-prima empregada na fabricao do lcool,
alguns controles de qualidade do mel so desejveis. As principais anlises rotineiras
que podem ser empregadas so: Brix, ART, cinzas, SO
2
.
A maior parte dos controles na realidade feita aps a mistura do mel com o caldo, no
tanque de mosto. Estes controles so: nitrognio amoniacal, P
2
O
5
, pH, acidez, Brix,
temperatura, cinzas, contaminao bacteriana.

CONTROLE MICROBIOLGICO MICROSCOPIA
Microscpio tico
Para se observar imagens ampliadas dezenas, ou centenas, de vezes recorre-se ao
microscpio, o qual formado basicamente por dois conjuntos de lentes. Um destes, as
objetivas (4X, 10X, 40X e 100X), amplia a imagem real do objeto que, por sua vez,
ampliada novamente pelo segundo conjunto, as oculares (10 a 15X). Basicamente existem
dois tipos de microscpio, os de campo claro, que so os mais comuns e mais utilizados e
os microscpios de campo escuro.
Microscopia de Campo Claro (usado em biologia: bactrias,
leveduras)
Consideram-se no microscpio as seguintes partes essenciais e que podem ser vistas na
Fig. 1.

1 oculares
2 tubo binocular
3 parafuso de fixao
4 revlver
5 cabeote
6 estativo
7 platina ou mesa
8 condensador
9 diafragma do condensador
10 manipulador da lente do condensador
11 parafuso de centralizao do condensador
12 porta filtro
13 suporte para lente auxiliar
14 controle de focalizao macro e micro
15 suporte para lmpada
16 diafragma de iluminao
17 base

Parte mecnica
Base ou p.
Estativo ou coluna.
Mesa ou platina.
Tubo ou canho.
Revlver ou mecanismo para cmbio da lente objetiva.
Parafusos de focalizao macro e micro.

Parte ptica
Sistema de iluminao.
Condensador e diafragma.
Lentes objetivas.
Lentes oculares.

Campo escuro: usado para contraste
Recomendaes para uso do microscpio tico
Antes de iniciar o uso.

Posicionar a objetiva de menor aumento no eixo ptico do aparelho cuidando
para no bater com as objetivas na platina ou no carrinho;
Colocar a preparao microscpica sobre a platina, entre as garras do carrinho
(charriot), certificando-se de que est com a lamnula para cima;
Ligar a iluminao do aparelho;
Mover o carrinho para aproximar o material montado na lmina para o foco de
luz que emerge do orifcio da platina (OLHANDO POR FORA);
Levantar a preparao, utilizando o parafuso de ajuste grosseiro (macro), at
que a preparao fique bem prxima da lente objetiva (OLHANDO POR FORA);
Olhar pela ocular;
Levantar lentamente a platina com o parafuso de focalizao grosseira at que
a imagem fique ntida no campo visual.;

Posicionar uma borda da lamnula ou algo que deva estar no mesmo nvel de
focalizao do objeto, quando o material muito transparente;
Com objetos muito transparentes, aps focalizar a borda da lamnula, procura-
se ento metodicamente esses objetos, percorrendo a rea coberta pela lamnula,
faixa por faixa;
Ajustar a imagem utilizando o parafuso de focalizao precisa (micro);
Ajustar a iluminao regulando o diafragma ris do condensador, que deve
estar em posio alta;
Desejando-se ampliao maior, aps conseguir-se boa nitidez da imagem com
a objetiva de menor aumento e estando o objeto bem no centro do campo, trazer a
objetiva seguinte para o eixo ptico do aparelho;
Focalizar, movendo o parafuso de focalizao precisa;
Proceder nova regulagem do diafragma ris, abrindo-o convenientemente, at
conseguir uma boa nitidez de imagem.

Observaes:
Ao mudar de objetiva e trabalhando a seco, nunca passe a objetiva de imerso
sobre a preparao microscpica;
Mudana de objetiva e/ou de preparao exigem novo controle do diafragma;
Para focalizar uma preparao, inicie com a objetiva de menor aumento;
Ajuste da Dioptria

Dioptria a unidade de medida do poder refrativo de uma lente. Este ajuste
necessrio para uma melhor observao do campo visual;
Como freqentemente os dois olhos de uma pessoa tm capacidade de
focalizao diferente, conveniente proceder-se ao ajuste da dioptria quando se
trabalha em um aparelho binocular;
Assim, de incio focaliza-se nitidamente uma estrutura olhando apenas com o
olho direito;
A seguir, olhando apenas com o olho esquerdo, vira-se o anel de ajuste da
dioptria (que existe apenas no encaixe da ocular esquerda) at obter foco tambm
nesse olho.
Manuteno do equipamento

Conservar o microscpio sempre limpo;
Limpar as lentes do microscpio, somente com papel apropriado;
No esfregue os dedos nas lentes;
Aps o uso, limpar a objetiva de imerso com lcool;
Cobrir para que no se empoeire ou guardar em lugar fechado e seco;
Transportar segurando-o pelo estativo ou pelo corpo do microscpio.
No desmontar as oculares, objetivas ou qualquer outra parte do aparelho;
Colocar com cuidado o microscpio sobre a mesa em posio tal que possa
trabalhar comodamente;
Da por diante no mais altere a posio do instrumento. JAMAIS O ARRASTE!
Mtodo de determinao da viabilidade celular de leveduras
No existe um mtodo absoluto para determinao da viabilidade celular de uma
populao de clulas de levedura. Para estimar a proporo de clulas viveis em
uma cultura ou processo fermentativo, mtodos baseados no plaqueamento ou na
observao microscpica tm sido usados. Entretanto, at o momento no existe um
mtodo que fornea resultados totalmente seguros na determinao da viabilidade
celular.
No controle da viabilidade celular nos processos de produo de levedura (fermento
prensado) e fermentao alcolica, a colorao das clulas da levedura com azul de
metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento so os mais empregados. Devido
s facilidades e a rapidez da anlise, nas indstrias de produo de lcool o emprego
de eritrosina o mais indicado.
Na determinao da viabilidade atravs do uso de eritrosina a porcentagem ou o
nmero de clulas viveis/ml determinado transferindo-se uma amostra j colorida
para a cmara de Neubauer. Nesta so contadas as clulas incolores e as coloridas
de rosa (Fig. 2), utilizando-se a objetiva de imerso (100x).
Devem ser contadas entre 300 a 500 clulas por cmara, o que regulado pela
diluio adequada da amostra. Para maior preciso da anlise, a diluio da amostra
deve ser tal que no se tenha mais que 1250 clulas por cmara, e, no menos que
100 retculos da cmara (os retculos centrais de cada quadrculo) sejam contados.


Fig. 2: Soluo Eritrosina Uso da Cmara de Neubauer.

Fig. 3: Preparo da cmara de Neubauer e imagem ao microscpio tico de clulas
no coradas e de clulas coradas com eritrosina.
Especificaes da cmara de NEUBAUER

Profundidade: 0,1 mm
Nmero de quadrculos: 25
Nmero de retculos em cada quadrculo: 16
Nmero de retculos em cada cmara: 400
rea do retculo: 0,0025 mm2
Volume de lquido em cada retculo: 0,00025 mm3
Volume total da cmara: 0,1 mm3


Fig. 4: Esquema de uma Cmara de Neubauer.
Preparo das solues
Soluo estoque de Eritrosina
Pesar 0,1 g de eritrosina.
Dissolver em 10,0 ml de gua destilada esterilizada.
Conservar a soluo estoque em frasco mbar fora do alcance da luz e em
refrigerador.
Validade: 8 meses desde que armazenada protegida da luz e sob refrigerao.
Tampo Fosfato
Pesar 17,90 g de Na2HPO4 ;
Dissolver em 250,0 ml de gua destilada esterilizada (soluo A);.
Pesar 6,89 g de NaH2PO4 ;
Dissolver em 250,0 ml de gua destilada esterilizada (soluo B);
Misturar as solues A e B;
Transferir a soluo para um frasco plstico e conservar sob refrigerao;
Validade: 8 meses desde que armazenada sob refrigerao.

Observao:

Para o uso da soluo tampo deve-se retirar o frasco do refrigerador e aguardar at
que o mesmo atinja a temperatura ambiente.
Soluo de trabalho
Misturar 0,1 ml da soluo estoque de eritrosina para cada 5,0 ml do tampo
fosfato;
Preparar um volume da soluo de trabalho o suficiente para uso durante uma
semana e conserv-la fora do alcance da luz;
Recomenda-se que uma poro dessa soluo, suficiente para um dia de
trabalho, seja transferida para um tubo de ensaio;
Caso ao final da jornada, no se utilizar todo o volume preparado, o restante
dever ser descartado para evitar contaminaes;

Observao:
Solues que apresentem contaminaes devem ser imediatamente descartadas.
Procedimento analtico
Aps a coleta da amostra de vinho bruto e/ou creme de levedura, proceder da
seguinte maneira:
Homogeneizar a amostra;
Transferir uma alquota da amostra (3 - 5 ml) para um tubo de ensaio;
Adicionar papana na amostra;
Homogeneizar em agitador para tubos;
Deixar em repouso durante 5 min;
Diluir a amostra com gua destilada (a diluio realizada para que o nmero
de clulas seja adequado para a faixa de maior preciso da metodologia);
Transferir 1 ml da amostra diluda para outro tubo de ensaio;
Transferir 1 ml da soluo de trabalho de eritrosina para o tubo de ensaio que
contm 1 ml da amostra diluda;
Preparar a cmara de Neubauer, cobrindo a superfcie espelhada com uma
lmnula 24x24 mm
Transferir um volume suficiente da soluo (amostra + corante) para cobrir a
rea da cmara de Neubauer.

Contar, utilizando a objetiva de imerso (100X), as clulas presentes nos
quatro retculos centrais dos 25 quadrculos;

Observao:
A contagem utilizando a objetiva de imerso (100X) permite uma observao
mais precisa das clulas da levedura quanto a sua estrutura celular.
Clculos
Viabilidade celular

A viabilidade celular indica a porcentagem de clulas em atividade na populao de
leveduras da amostra considerada.

Total de clulas viveis
% Cel. viveis = -------------------------------- x 100
Total cel. viveis + no viveis

Contagem de clulas em brotamento

Indica a porcentagem de leveduras em atividade que esto se multiplicando

Total de cel. viveis em brotamento
% Brotamento = ------------------------------------------- x 100
Total de clulas viveis

Populao de Leveduras

Total de cel. viveis x 4000
Populao leved./ml = --------------------------------- ----- x 1000 x D
Total de retculos contados
Onde: D = diluio final

Exerccios

Calcular a viabilidade celular, a porcentagem de brotamento e a populao de
leveduras:

a) Total de clulas viveis: 199
Total de clulas no viveis: 27
Total de clulas em brotamento: 21
Diluio: 1:40

b) Total de clulas viveis: 270
Total de clulas no viveis: 60
Total de clulas em brotamento: 16
Diluio: 1:30

Mtodo para contagem de bactrias ao microscpio tico
Esta tcnica mais adequada para a contagem de bacilos (bastonetes), embora
outros tipos de bactria (cocos) possam ser contados, e para populao bacteriana
acima de 104/ml. Maior preciso e repetibilidade so conseguidas quando o nmero
de bastonetes/ml da amostra est entre 106 e 107.

A contagem direta ao microscpio tem, portanto sua maior aplicabilidade para
quantificao de bastonetes em amostras de caldos primrio e misto e vinho (em
fermentao ou final de fermentao). Para caldo clarificado e mosto onde a
populao normalmente inferior a 104 - 105 bast./ml, esta tcnica apresenta menor
preciso. No recomendamos realizar contagem em levedo tratado.

Nesta preparao as clulas viveis aparecero incolores enquanto as no viveis
estaro coloridas de azul (Fig. 6). Deve-se diluir conveniente a amostra para que no
mais que 3 a 5 bastonetes sejam encontrados por campo do microscpio.

Fig. 5: Corante sulfato azul de Nilo + azul de metileno, para contagem de bactrias e
preparao de uma lmina.


Fig. 6: Lmina preparada para a contagem e uma amostra de vinho com a presena
de bastonetes corados e no corados.
Preparo das solues
Soluo A - sulfato azul de nilo - 2,0%
Pesar 2,0 g de sulfato azul de Nilo;

Soluo B - azul de metileno - 0,20%

Pesar 0,2 g de azul de metileno;

Soluo de trabalho

Misturar partes iguais das solues A e B;
Deixar em repouso durante 24 h;
Filtrar em papel de filtro.
Validade: 12 meses desde que armazenada em frasco fechado.

Observao:

Checar semanalmente a soluo de trabalho para verificar a presena de
microrganismos contaminantes; caso seja detectada contaminao a soluo deve ser
imediatamente descartada.
Amostras de caldos, PCTS, primrio e misto

Filtrar a amostra em algodo para eliminar as impurezas slidas em
suspenso;
Transferir 1 ml de amostra filtrada para um tubo de ensaio;
Transferir 1 ml da soluo corante para o tubo de ensaio que contm 1 ml da
amostra filtrada;
Transferir 2,0 L (lamnula de 20 x 20mm) ou 3,0 L (lamnula de 22 x 22mm)
da amostra corada para uma lmina de vidro (26x76 mm);
Colocar uma lamnula sobre a preparao, tomando o cuidado para no formar
bolhas;
Realizar a contagem de bastonetes no corados presentes em 70 campos,
uniformemente distribudos em toda a rea da lamnula, utilizando a objetiva de
imerso (100x).
Amostras de vinho bruto e levedo tratado
Transferir uma alquota da amostra (3 5 ml) para um tubo de ensaio;
Adicionar papana na amostra;
Deixar em repouso durante 5 min;
Diluir a amostra com gua destilada (a diluio realizada para que o nmero
de clulas bacterianas seja adequado para a faixa de maior preciso da metodologia);
Transferir 1 ml da amostra diluda para outro tubo de ensaio;
Transferir 1 ml da soluo corante para o tubo de ensaio que contm a amostra
diluda;

Transferir 2,0 L (lamnula de 20 x 20mm) ou 3,0 L (lamnula de 22 x 22mm)
da amostra corada para uma lmina de vidro (26x76 mm);
Colocar uma lamnula sobre a preparao, tomando o cuidado para no formar
bolhas;
Proceder a contagem de bastonetes no corados presentes em 50 campos,
uniformemente distribudos em toda a rea da lamnula, utilizando a objetiva para
imerso (100x).

Observao:
O volume de amostra transferida para a lmina depende do tamanho da lamnula
utilizada.

Volume (ml) Lamnula (mm)
0,002 20 x 20
0,003 22 x 22
0,004 24 x 24
Clculos
1
Populao bastonetes/ml = FM x --------------------- x M x D
Vol. amostra

onde: FM = fator do microscpio
M = mdia total de bastonetes no corados / nmero campos contados
D = diluio final

Exerccios

a) Calcular a populao de bastonetes/ml das amostras.

Caldo: no de campos contados = 70
diluio final = 1:2
FM = 15406,2
Vol. amostra = 0,003 ml
no de bastonetes contados = 3


Vinho: no de campos contados = 50
diluio da amostra = 1:4
FM = 15406,2
Vol. amostra = 0,003 ml
no de bastonetes contados = 158

Teste de Gram
A colorao de Gram realizada para diferenciar microrganismos (Gram + e Gram -)
tanto de suspenses lquidas como de colnias de cultivos slidos. A colorao no
deve ser executada rotineiramente, mas quando forem detectados problemas de
contaminao.
Preparo das solues

Soluo de cristal violeta

Soluo A
Dissolver 2,0 g de cristal violeta em 20,0 ml de lcool 95,0%.

Soluo B
Dissolver 0,8 g de oxalato de amnia em 80,0 ml de gua destilada
esterilizada.

Soluo de trabalho
Misturar as solues A e B
Filtrar.
Validade: 12 meses.

Soluo de safranina

Soluo estoque
Dissolver 2,5 g de safranina em 100,0 ml de lcool 95,0 %.

Soluo de trabalho:
Diluir 10,0 ml da soluo estoque para 100,0 ml, com gua destilada
esterilizada.
Validade: 12 meses.

Soluo de iodo-lugol

Diluir 10 ml da soluo de iodo-lugol (lugol forte) para 100,0 ml com gua
destilada esterilizada.
Validade: 12 meses.


Para Microrganismos em Suspenso Lquida

Transferir uma alquota da suspenso para uma lmina (26x76mm) bem limpa,
utilizando uma ala de platina esterilizada;
Espalhar a amostra sobre a lmina, com a ala da platina, at formar um filme;
Aguardar secar o filme formado;
Fixar, atravs de aquecimento na chama de um bico de Bunsen, passando a
lmina sobre chama baixa;
Evitar que a lmina aquea demasiadamente;
Aguardar a lmina esfriar;
Proceder a colorao da preparao fixada.

Para Microrganismos de Cultivos Slidos

Transferir uma gota de gua destilada esterilizada para uma lmina
(26x76mm), limpa e seca;
Remover uma pequena poro da colnia do microrganismo usando uma ala
de platina esterilizada;
Transferir a amostra para a gotcula de gua na lmina;
Homogeneizar, com a ala de platina, at obter uma suspenso uniforme;
Espalhar a suspenso com a ala de platina at se formar um filme;
Aguardar a preparao secar a temperatura ambiente;
Fixar por aquecimento, chama do bico de Bunsen, evitando que a lmina
aquea demasiadamente;
Aguardar a lmina esfriar;
Proceder a colorao da preparao fixada.

Tcnica de Colorao

Cobrir o filme fixado com algumas gotas da soluo de cristal violeta;
Aguardar 2 minutos;
Lavar cuidadosamente o excesso de corante com gua fria;
Cobrir o filme com soluo de iodo-iodeto de potssio (lugol);
Aguardar 1,5 minuto;
Remover o corante, lavando a lmina com gua fria;
Descolorir com soluo de lcool a 95% durante 30 a 60 segundos at que
esta escorra da lmina sem nenhuma colorao;
Lavar cuidadosamente com gua fria;
Cobrir o filme com soluo de safranina;
Aguardar 1 minuto;
Remover cuidadosamente o excesso de corante com gua fria;

Aguardar a preparao secar temperatura ambiente, ou secar
cuidadosamente (sem esfregar)a lmina entre duas folhas de papel absorvente (papel
de filtro);
Examinar ao microscpio utilizando a objetiva para imerso (100X).

Fig. 7: Corantes utilizados e alguns procedimentos durante a realizao da colorao
de Gram.
Interpretao
As clulas de bactrias Gram positivas (+) se colorem de azul-violeta forte e
aquelas Gram negativas (-) se colorem de vermelho (Fig 8).


Fig. 8: Exemplo de bactrias Gram positivas (+) e Gram negativas (-)
Observaes:
indicado utilizar-se de cultivos de 18 a 24 horas para se obter melhores
resultados, pois as clulas jovens tm maior afinidade para os corantes do que as
clulas velhas. Isto mais comum com as bactrias formadoras de esporos.
Microrganismos que sofreram danos fsicos na membrana (ao do calor, ao
qumica)podem apresentar resultados falsos.
Em alguns casos as bactrias podem apresentar reao de Gram varivel,
dependendo do seu estgio de desenvolvimento.
Quantificao
Aps realizar a contagem das bactrias Gram + e Gram - , fazer em seguida a
porcentagem de cada uma delas em relao ao total de bactrias contadas atravs da
seguinte frmula:
Total de bactrias Gram (+)
% Gram + = ------------------------------------------------ x 100
Total de bactrias Gram(+) e Gram(-)
Deteco de esporos
Muitos gneros de bactrias apresentam a capacidade de produzir certas formaes
ou corpos de parede espessa, que nada mais so que estruturas altamente resistente.
Estas formaes so denominadas "endosporos" ou mais comumente "esporos". De
modo geral todas as espcies dos gneros Bacillus e Clostridium so capazes de
produzir endosporos sendo algumas termfilas e a maioria mesfila. A natureza
resistente de seus esporos lhes confere uma caracterstica especial de sobrevivncia
por longos perodos de tempo, mesmo em condies adversas e/ou resistncia ao
aquecimento a temperaturas superiores a 100C.

A presena de esporos nos caldos e outros materiais se revestem de grande
importncia para o processo fermentativo, uma vez que com a germinao destes a
carga bacteriana pode elevar-se rapidamente prejudicando todo o processo.
Pesquisas mais recente (Fermentec) tm detectado a presena de bactrias em forma
de bacilos esporulados em caldo clarificado ( 100C), os quais so capazes de utilizar
glucose, sacarose e outros acares, produzindo por outro lado cidos orgnicos
(cido lctico e, outros).
A determinao do nmero de esporos pode ser feita ou por cultivo em placas, aps
ativao dos mesmos, ou por contagem direta ao microscpio com ou sem colorao,
dependendo do meio onde esto suspensos. A colorao normalmente empregada
quando se pretende diferenciar os esporos das clulas vegetativas. Os esporos
aparecero coloridos de verde e as clulas vegetativas coradas de vermelho (Fig. 9).
Preparo das solues
Soluo de verde malaquita
Pesar 5,0 g de verde malaquita, dissolver com gua destilada esterilizada;
Transferir o corante para balo volumtrico de 100,0 ml;
Completar o volume com gua destilada esterilizada
Validade: 12 meses.

Soluo de safranina
Pesar 0,5 g de safranina e dissolver com gua destilada esterilizada;
Transferir para balo volumtrico de 100,0 ml;
Completar o volume com gua destilada esterilizada.
Validade: 12 meses.
Preparar um esfregao da cultura sobre uma lmina de vidro (26x76mm);
Fixar a preparao, por aquecimento chama do bico de Bunsen;
Cobrir a preparao com algumas gotas de soluo de verde malaquita 5,0%;
Aquecer a lmina, por um minuto, com emisso de vapores por quatro vezes;
importante no deixar o corante na lmina entrar em ebulio;
Deixar a lmina esfriar temperatura ambiente;
Lavar o excesso de corante com gua cuidadosamente;

Contra corar a preparao com safranina a 0,5%
Aguardar 15 a 20 segundos;
Lavar o excesso de corante com gua fria;
Aguardar a lmina secar;
Examinar ao microscpio usando a objetiva para imerso (100x);
Os esporos se apresentaro corados de verde enquanto as clulas vegetativas
apareceram coradas de vermelho.

Fig. 9: Corantes utilizados e alguns procedimentos durante a realizao da colorao
de esporos. Exemplo ilustrativo de esporos (colorao verde) e clulas vegetativas
(colorao vermelha).
Interpretao/Quantificao dos Esporos
Normalmente verificada apenas a presena ou no de esporos, contudo possvel
que se faa a quantificao, considerando a quantidade de esporos encontrados, em
relao ao total de bastonetes contados.

Total bactrias com esporos
% bactrias com esporos = ----------------------------------- x 100
Total bactrias contadas

Teste de Floculao
A floculao da levedura um dos mais graves problemas e um importante parmetro
para o controle do processo de fermentao alcolica, especialmente pela reduo de
produtividade e de dificuldades ocasionadas na centrifugao da levedura.
A floculao pode ser causada pela prpria linhagem da levedura e pelas condies
da fermentao, principalmente o aumento da contaminao bacteriana, excesso de
clcio e elevados nveis de temperatura.
O teste realizado com amostra de vinho bruto em final de fermentao

Procedimento Analtico

Transferir para uma proveta de 100 ml;
Ajustar o menisco para 100 ml;
Cronometrar 15 minutos;
Fazer a leitura quantificando de cima para baixo o espao existente entre o
volume total (100 ml) e incio da separao do levedo;


Fig. 12: Ilustrao do teste de floculao

Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos, atravs da
variao da acidez
Este tem como objetivo avaliar a sensibilidade de bactrias contaminantes da
fermentao alcolica, em relao antimicrobianos, atravs da variao da acidez do
meio onde se desenvolvem os microrganismos contaminantes.

Esta metodologia relativamente simples de ser realizada e permite, de certa forma,
avaliar o efeito de antimicrobianos sobre a microbiota contaminante presente,
indicando o melhor produto a ser empregado, dentro de um perodo relativamente
curto (6 a 8 horas), o que torna a utilizao de antimicrobianos mais racional,
econmica e eficaz.
% FLOCULAO = 79 %

Preparo das solues
Soluo estoque de actidiona (inibidor de leveduras).

Pesar 0,1 g de actidiona;
Transferir para balo volumtrico de 100 ml;
Dissolver com gua destilada esterilizada;
Completar o volume para 100 ml com gua destilada esterilizada.
Soluo estoque de Antimicrobianos

Pesar 0,01 g do antimicrobiano;
Solubilizar em algumas gotas de lcool, se necessrio ( imprescindvel
seguir as recomendaes do fabricante para a solubilizao do produto);
Completar a dissoluo com gua destilada esterilizada;
Completar o volume para 100 ml;

Observao:
Recomenda-se que as solues de antibiticos sejam preparadas no mesmo dia do
seu uso..

Preparar 4 erlenmeyers (para testar 3 antimicrobianos + 1 testemunha), com
capacidade para 250 ml cada, como descrito a seguir:
.
Erlenmeyer 1: colocar 70 ml de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da
sol. estoque de actidiona. Este o tratamento testemunha.

sol. estoque de actidiona + 3 ml da sol. estoque do antibitico A (= 3 ppm). Este o
tratamento A

sol. estoque de actidiona + 3 ml da sol. estoque do antibitico B (= 3 ppm). Este o
tratamento B.

Erlenmeyer 4: colocar 70 ml de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml
da sol. estoque de actidiona + 5 ml da sol. estoque do antibitico C (= 5 ppm). Este o
tratamento C.

Assim, tem-se:
Erlenmeyer 1: Testemunha
Erlenmeyer 2: Tratamento antibitico A (3 ppm)
Erlenmeyer 3: Tratamento antibitico B (3 ppm)
Erlenmeyer 4: Tratamento antibitico C (5 ppm)

Homogeneizar;
Transferir 20,0 ml de cada tratamento, usando pipeta volumtrica, para
frasco Erlenmeyer de 250 ml separados;
Determinar a acidez inicial de cada tratamento;
Incubar os Erlenmeyers em estufa a 35,0C 1,0C durante 6 h;
Retirar os Erlenmeyers da estufa;
Homogeneizar;
frascos separados;
Determinar a acidez final de cada tratamento.
Determinao da acidez

Determinao da acidez sulfrica (inicial e final) das amostras.

Procedimentos:
frascos separados;
Adicionar 50 ml de gua destilada;
Homogeneizar;
Aquecer at atingir ebulio e manter em refluxo durante 5 minutos.

Resfriar
Titular com NaOH 0,1 N, at pH = 8,5.
Anotar o volume gasto para cada amostra;
Calcular acidez.

Acidez (g H2SO4) = Volume de NaOH gasto x 0,245 x fator do NaOH.

Clculo
Delta Acidez (g H2SO4/L) = Acidez final Acidez inicial

Observao:
Na ausncia de refluxo deve-se manter a amostra em ebulio durante 2 minutos.

Fig. 13: Ilustrao da incubao e refluxo da amostra para avaliao de delta acidez.

Interpretao dos resultados

Calcular a variao da acidez (acidez final - acidez inicial) para todos os tratamentos.
O tratamento que apresentar a menor variao da acidez, corresponde ao
antimicrobiano mais recomendado para ser dosado na fermentao.

Exemplo
Testemunha
Antibitico A
(3 ppm)
Antibitico B
(3 ppm)
Antibitico C
(5 ppm)
acidez inicial 0,82 0,84 0,84 0,83
acidez final 1,31 0,88 0,91 0,98
acidez 0,49 0,04 0,07 0,15
Neste exemplo, o antibitico A foi o produto que apresentou melhor eficincia, seguido
do antibitico B, e por ltimo, o antibitico C.
Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos por
espectrofotometria
Este teste tem como objetivo avaliar em laboratrio, o efeito de antimicrobianos sobre
bactrias contaminantes da fermentao alcolica. O teste consiste em avaliar a ao
dos antimicrobianos, como antibiticos e outros compostos, atravs da leitura
espectrofotomtrica da densidade tica (absorbncia) de uma suspenso microbiana,
incubada com ou sem o produto em teste. uma metodologia relativamente simples
de ser realizada e permite, de certa forma, indicar o produto mais eficaz e/ou dosagem
a ser empregada, dentro de um perodo relativamente curto (6 a 8 horas), o que torna
a utilizao dos antimicrobianos mais econmica e racional.
Apesar de simples, para o emprego desta metodologia, o laboratrio dever estar
aparelhado com um bom espectrofotmetro, bem como, todo o material necessrio,
para o cultivo de microrganismos.

Preparo das Solues Estoque
Solues estoque de inibidores de leveduras:
Soluo de Actidiona - inibidor do desenvolvimento de leveduras
Pesar 0,1 g de actidiona;
Dissolver com gua destilada esterilizada;
Completar o volume para 100 ml com gua destilada esterilizada

Validade e conservao At um ms armazenado sob refrigerao.

Solues estoque dos antimicrobianos a serem testados :

Exemplo: antimicrobiano A, dosagem de 3.0 ppm.
Pesar 0,01 g do antimicrobiano;
Solubilizar em algumas gotas de lcool, se necessrio ( imprescindvel
seguir as recomendaes do fabricante para a solubilizao do produto);
Completar a dissoluo com gua destilada esterilizada;
Completar o volume para 100 ml;

Validade e conservao Preparar a soluo no dia que realizar o teste ou no mximo
um dia antes e armazenar sob refrigerao. Aps o uso, descartar a soluo. Repetir o
procedimento a cada teste realizado.

Observao
A concentrao de antimicrobiano para a realizao do teste a mesma recomendada
para a aplicao na dorna. Neste exemplo, para se conseguir a concentrao de 3
ppm, necessrio transferir 0,45 ml da soluo estoque do antimicrobiano para cada
tubo contendo 15,0 ml de meio de cultivo.
Meios de Cultivo
Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer, 1961)
Extrato de levedura........................................20,0g
Proteose peptona ..........................................5,0g
Dextrose .........................................................10,0g
Fosfato monobsico de potssio ( K H2 PO4).... 2,0g
gua destilada ...............................................1000,0 ml

Dissolver os componentes do meio por aquecimento em bico de Bunsen;
Transferir com pipeta 15 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca
autoclavvel;
Colocar os tubos na Autoclave e esterilizar por 15 min. a 121C ;
Retirar os tubos da Autoclave e deixar esfriar.

Meio de Cultivo ( GLT)
Extrato de Levedura ................. 2,5g

Triptona ....................................... 5,0g
Glucose (Dextrose) .................... 1,0g
gua destilada ..............................1000,0 ml

Dissolver os componentes do meio por aquecimento em bico de Bunsen;
Transferir com pipeta 15 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca
autoclavvel;
Colocar os tubos na Autoclave e esterilizar por 15 min. a 121C ;
Retirar os tubos da Autoclave e deixar esfriar.

Preparo do Inculo

Coletar uma amostra de vinho bruto (dornas em final de fermentao);
Transferir 5,0 ml da amostra para tubo de cultivo;
Adicionar papana ( 5 mg);
Homogeneizar em agitador de tubos;
Aguardar 5 min.;
Transferir 1,0 ml da amostra de vinho bruto para tubo de ensaio contendo 15 ml de
meio de cultivo esterilizado;
Incubar a 35 C por 12 horas;
Adicionar papana e homogeneizar em agitador de tubos;
Este ser o inculo para a realizao do teste.

Realizao do Teste
Transferir com pipeta 0,15 ml da soluo estoque de actidiona para cada
tubo com 15 ml do meio de cultivo esterilizado;
Transferir com pipeta o volume necessrio de antimicrobiano a ser testado
para atingir a concentrao desejada;
Transferir com pipeta 0,15 ml do inculo preparado (amostra de vinho ou
pr inculo j contendo papana)
Homogeneizar em agitador de tubos;
Fazer a leitura (inicial) da absorbncia da amostra testemunha e dos
tratamentos no aparelho de espectrofotmetro a 520 nm logo aps a homogeneizao;

Transferir os tubos com as amostras testemunha e tratamentos para estufa
a 35 C +/- 1 C;
Incubar por 6 horas;
Retirar os tubos da estufa e homogeneizar em agitador de tubos;
Fazer a leitura (final) da absorbncia nos tubos testemunha e tratamentos
logo aps a homogeneizao.

Importante
Inocular apenas dois tubos por vez e, novamente homogeneizar o inculo. Em seguida
inocular mais dois tubos e assim sucessivamente at inocular todos os tubos.

Leitura da Densidade ptica ( D. O . )

Ajustar o comprimento de onda do espectrofotmetro para 520 nm;
Calibrar o espectrofotmetro para zero absorbncia com gua destilada;
Lavar a cubeta do espectrofotmetro com a amostra a ser lida;
Realizar a leitura da absorbncia.

Interpretao dos Resultados
Quanto maior o desenvolvimento bacteriano, maior a turbidez do meio e,
consequentemente maior ser a leitura da absorbncia. Assim sendo, quanto maior for
o efeito antimicrobiano do produto, menor ser a turbidez e menor a leitura da
absorbncia.

A eficincia do produto testado, por esta metodologia, dada pela diferena entre a
absorbncia final menos a absorbncia inicial. Assim tem-se:

Delta ABS = ( ABS final ABS inicial ) x 100.

Quanto menor for a variao da absorbncia, mais eficiente ser o produto, no
controle da microbiota presente na amostra testada.

A tabela abaixo uma sugesto de como tabular os dados das leituras
espectrofotomtricas:

Tempo Testemunha Produto A Produto B
Inicial (0h)
Final (6h)
ABS x 100
Relao de materiais necessrios para instalao do
laboratrio de controle microbiolgico microscopia
Equipamentos
Microscpio ptico (campo claro).
Agitador automtico para tubos de ensaio (marca Phoenix, modelo AT-56).
Contador para clulas.
Cmara de Neubauer.

Vidraria
Tubos de ensaio 16x150mm.
Erlenmeyers de 500ml.
Funil 0.
Pipetas graduadas de 1,0ml (1/10).
Pipetas graduadas de 0,1ml (1/10).
Pipetas graduadas de 10ml (1/10).
Lminas 26x76mm.
Lamnulas 22x22mm
Pipetas graduadas de 0,1 ml (1/1000)
Seringas de capacidade 5 L

Reagentes
Azul de metileno.
Sulfato azul de nilo.
Eritrosina.

Citrato de sdio.
Cristal violeta.
Safranina.
Lugol forte.
Verde malaquita.
Oxalato de amnia.

Observao:
Os reagentes para as anlises por microscopia devem ser da marca Merck.
Outros
Algodo hidrfilo.
leo para imerso (Marca Merck).

Pipetadores automticos
Para maior segurana no trabalho sugere-se o uso de pipetadores automticos com
volume varivel de;
1000 uL;
200 uL.

Modelos de boletim para o controle microbiolgico por
microscopia
Matria-prima
Data Bast./ml % lcool Acidez pH


Mdia

* Os valores de % lcool, acidez e pH devem ser fornecidos pelo controle qumico.
Moenda
Data
Caldo primrio Caldo secundrio
TAXA
MULTI.
Bast./ml % lcool Brix Bast./ml % lcool Brix

Mdia

Fermentao
Data
Viabil.
%
Brotam.
%
Bast./ml
Flocul.
%
Temp.
mxima
Fermento
%
lcool
%

Mdia

CONTROLE MICROBIOLGICO PLAQUEAMENTO
Introduo
O plaqueamento ou cultivo uma das tcnicas mais antigas para se avaliar a
populao microbiana, no ar, gua, solo, alimentos, etc. Tambm pode ser utilizada
quando se pretende isolar e caracterizar os diferentes grupos de microrganismos de
seu habitat natural. Para tal, deve-se esterilizar todo o material a ser utilizado.
Esterilizao
Esterilizao, em termos absolutos, significa completa destruio de qualquer forma
de vida. Para se conseguir a esterilizao, pode-se usar:
meios fsicos: calor, radiaes ionizantes e no ionizantes, filtrao, etc.
agentes qumicos, como gases (dixido de etileno), ou compostos
qumicos, como glutaraldedo 2%, etc., que possam inibir qualquer atividade
microbiana.

Para se controlar a contaminao microbiana nos processos industriais e, para a
esterilizao dos meios de cultivo, usados para avaliao das populaes microbianas
e/ou, isolamento de microrganismos, emprega-se normalmente o calor mido,
enquanto, as vidrarias e peas ou equipamentos metlicos, o calor seco o mais
empregado.
Na esterilizao empregando-se o calor mido, os microrganismos so inativados por
desnaturao das protenas, enquanto, com calor seco as protenas so desidratadas,
tornando o microrganismo mais resistente e, portanto necessita-se de temperaturas
mais elevadas e maior tempo de esterilizao. Desta forma, os microrganismos
submetidos esterilizao no sero capazes de se multiplicarem formando colnias,
sendo, portanto, considerados inativos (mortos).
De um modo geral, os microrganismos (bactrias e leveduras) na forma vegetativa
so menos resistentes ao calor do que na forma de esporos. De uma forma ou de
outra, a inativao completa (esterilizao) vai depender do binmio
tempo/temperatura empregado.
Esterilizao por Calor mido - Autoclave
Na esterilizao de meios de cultivo, por calor mido emprega-se vapor saturado sob
presso (1 atmosfera /121 C), por tempo varivel de 15 a 30 minutos, dependendo do

material a ser esterilizado, em equipamentos denominados Autoclaves. So
encontrados dois tipos de Autoclaves: vertical e horizontal.


Fig. 1: Aparelho de Autoclave de laboratrio
Constituio da Autoclave
A Autoclave comum de laboratrio um equipamento constitudo de uma cmara
metlica vertical, uma tampa metlica resistente, que fecha hermeticamente a cmara,
por uma borracha de vedao. Nesta tampa so encontrados uma vlvula de descarga
(sada de vapor e ar), uma vlvula de segurana, termmetro e manmetro. O
aquecimento pode ser feito eletricamente, atravs de resistncia eltrica, por
serpentina de vapor ou diretamente com bico de gs.
Operao da autoclave
Verificar se h gua suficiente na cmara de aquecimento, ou seja,
cobrindo as serpentinas;
Carregar a Autoclave com o material a ser esterilizado;
Fechar a tampa e apertar os parafusos para vedar a sada de gases (vapor
+ ar );
Abrir a vlvula de descarga de gases;
Ajustar a vlvula de segurana para a presso de trabalho;
Iniciar o aquecimento, colocando todas as serpentinas para funcionar (
posio mxima do termostato);
Deixar a vlvula de descarga aberta at que todo o ar tenha sido removido;
Fechar a vlvula de descarga. A presso aumentar na cmara at atingir a
presso de trabalho e, a vlvula de segurana emitir pequena quantidade de vapor;
Nestas condies a temperatura ter atingido 121,0oC;
Manter esta temperatura durante todo o tempo de esterilizao (20 / 30
min);

Desligar o aquecimento (termostato), depois de completado o tempo de
esterilizao, e esperar baixar presso a zero;
Abrir a vlvula de descarga bem lentamente;
Esperar at que todo o vapor tenha sado (3 a 5 min) e abrir a tampa da
Autoclave;
Depois de alguns minutos (+/- 3,0) o material poder ser retirado da
Autoclave;

Cuidados
No abrir a vlvula de descarga de vapor e de ar, antes que a presso
tenha chegado a zero, pois provocar ebulio violenta do lquido contido nos
recipientes (frascos) e estes podero at mesmo explodir
No remover o material da Autoclave imediatamente aps abri-la.
Mudanas bruscas de temperatura podero provocar a quebra da vidraria.
Esterilizao por Calor Seco
No caso do calor seco, a esterilizao pode ser feita por:
Aquecimento ao rubro: mantendo-se a pea na chama de um bico de
Bunsen, at que se torne vermelho rubro (alas de platina, agulhas, etc).
Flambagem: para a descontaminao de bocas de frascos, tubos de cultivo,
lminas, etc., usam-se a tcnica de flambagem, passando-se com cuidado estes
matrias pela chama do bico de Bunsen vrias vezes, sem, contudo deixar que os
mesmos se tornem vermelho rubro.
Em Estufas: a esterilizao feita em estufas esterilizadoras, com calor
seco, em temperatura a 180oC por duas horas. Deve-se esterilizar em estufas: placas
de Petri, frascos de vidro, pipetas, instrumentos metlicos, seringas de vidro, agulhas,
etc. O material a ser esterilizado dever ser acondicionado em papel especial (papel
manilha ou alumnio) ou recipiente metlico.

Esterilizao por calor seco Estufa
Fig. 2: Aparelho de Estufa
2.1.2 Operao da estufa
Acondicionar o material a ser esterilizado em recipiente metlico ou papel Kraft
Colocar todo o material na estufa
Ligar a estufa e esperar a temperatura atingir 180C
Monitorar a temperatura por duas horas (Tempo de esterilizao)
Desligar e esperar a estufa esfriar
Retirar o material da estufa e mant-lo em local apropriado
Observaes
No abrir a estufa antes de decorrido o tempo total de esterilizao.
Somente abrir os recipientes no momento de uso do material e prximo chama
do bico de Bunsen.
Esterilizao por Filtrao
Feita em membranas de acetato de celulose, com poros de dimetros adequados para
reteno de microrganismos (bactrias ou leveduras). utilizada para esterilizao de
meios de cultivo que no podem ser esterilizados por aquecimento s altas temperaturas,
solues de antibiticos, etc.
ANLISES de CONTROLE MICROBIOLGICO por PLAQUEAMENTO

A tcnica de plaqueamento praticamente pode ser aplicada em todas as etapas dos
processos de produo de acar e de lcool . Entretanto, sua aplicao se faz necessria
principalmente nas etapas em que os nveis de contaminao so relativamente baixos e,
a tcnica de contagem por Microscopia no a mais indicada. Assim, em amostras em
que os nveis de contaminao sejam inferiores a 1,0 x 105 , o plaqueamento fornecer
resultados mais precisos e confiveis, embora o tempo para se obter os resultados seja
maior.
O controle microbiolgico por plaqueamento deve ser feito para as seguintes amostras:
Matria-prima : caldo da prensa leveduras
Caldo misto (amostra antes do aquecimento)- bactrias e leveduras
Aps tratamento trmico (caldo decantado ou pr-evaporado): leveduras e
bactrias
Mosto (antes e aps trocadores de calor e alimentao das dornas) : bactrias
principalmente.
Mel final (fbrica, sada turbinas e tanque depsito): bactrias e leveduras
guas para diluio do fermento e do mosto

Observao
Para um rastreamento e deteco de pontos mortos na fbrica de acar, o plaqueamento
a tcnica mais adequada.
MEIOS de CULTIVO
So usados diferentes meios de cultivo, de acordo com a finalidade do plaqueamento.
Plate Count Agar (P C A - Agar Padro) Bactrias Aerbios
Mesfilas Totais

Triptona ..................................... 5,0g
Dextrose .................................... . 1,0g
Agar ...........................................15,0g
gua destilada ........................1000,0 ml

gar- Man, Rogosa & Sharpe (MRSA) - Bactrias Lcticas
Totais

Peptona ..................................... 10,0g
Extrato de carne ............................5,0g
Extrato de levedura .......................5,0g
Dextrose ......................................20,0g
Tween 80 .......................................1,0 ml
Fosfato bibsico de potssio ..........2,0g
Acetato de sdio .............................5,0g
Citrato bibsico de amnio ............2,0g
Sulfato de magnsio ........................0,1g
Sulfato de mangans .......................0,05g
gar ...............................................15,0g
gua destilada .............................1000,0 ml

Extrato de Levedura- Peptona- Dextrose - gar (YEPD + A)
Leveduras

Extrato de Levedura ....................10,0g
Peptona .......................................20,0g
Dextrose .......................................20,0g
gar ..............................................15,0g
gua destilada ............................1000,0g

Meio Mayeux & Colmer Teste de Sensibilidade

Extrato de levedura........................................20,0g
Proteose peptona ..........................................5,0g
Dextrose .........................................................10,0g

Fosfato monobsico de potssio ( K H2 PO4.... 2,0g
gua destilada ...............................................1000,0 ml

Meio de Cultivo G. L .T. Teste de Sensibilidade

Triptona ....................................... 5,0g
Glucose (Dextrose) .................... 1,0g
gua destilada ..............................1000,0 ml

Observao
Todos os meios de cultivo devem ser usados somente dentro do prazo de validade.
INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO
Solues Estoque
Dependendo do plaqueamento/isolamento a ser feita, necessrio que se use inibidores
de crescimento de leveduras ou bactrias.
Bactrias
Cloranfenicol:
Dissolver 250 mg de cloranfenicol em 25 ml de gua destilada esterilizada
Dosagem recomendada - 100 ppm.

Tetraciclina :
Dissolver 250 mg de tetraciclina em 25 ml de gua destilada esterilizada
Dosagem recomendada 100 ppm.
Leveduras
Actidiona (ciclohexemide) :

Dissolver 100 mg de actidiona em 100 ml de gua destilada esterilizada.
Dosagem recomendada 10 ppm.
MTODOS PARA CONTAGEM DE CLULAS VIVEIS:
LEVEDURAS E BACTRIAS

A semeadura em placas ou plaqueamento revela o nmero de leveduras e/ou bactrias
capazes de se multiplicarem e formarem colnias em meios de cultivo apropriados e sob
condies de incubao adequadas. Cada colnia desenvolvida supostamente
originada a partir de uma unidade vivel.
Como para uma maior preciso da anlise somente devem ser contadas as placas com
nmero de colnias >que 30 e <300, uma diluio da amostra deve ser feita antes de se
proceder a sua mistura com meio de cultivo.
Plaqueamento por Incorporao ou Profundidade (Mtodo
Pour Plate )

Como a populao microbiana presente no material pode ser varivel, antes de se
realizar o plaqueamento, deve-se fazer uma diluio da amostra para evitar que as
colnias se desenvolvam aglomeradas e dificulte a contagem. Este procedimento
conhecido como diluio em srie ou diluies sucessivas.
Diluio em srie

Transferir 1 ml da amostra para um tubo de ensaio contendo 9,0 ml de gua
esterilizada;
Agitar em agitador para tubos, para homogeneizao. Diluio, 1:10 (101);
Pipetar 1,0 ml da diluio (101) para tubo de ensaio contendo 9,0 ml de gua
esterilizada;
Agitar em agitador de tubos, para homogeneizao. Diluio , 1:100 (102).

Para diluies maiores basta transferir 1,0 ml de cada diluio para tubos de
ensaio com 9,0 ml gua esterilizada, at conseguir-se a diluio desejada, como
mostrado no esquema a seguir.
10
6
10
1
10
2
10
3
10
4
1mL DA AMOSTRA
9 mL de H
2
O DESTI LADA ESTERI LIZADA
10
5
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
10
6
10
1
10
2
10
3
10
4
1mL DA AMOSTRA
9 mL de H
2
O DESTI LADA ESTERI LIZADA
10
5
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Tcnica de plaqueamento

Conseguida a diluio mais conveniente;
Transferir 1 ml desta para a placa de Petri, previamente esterilizada;
Adicionar o meio de cultivo lquido, a uma temperatura de 45 C/46 C;
Agitar a placa com movimentos rotativos para direita e para a esquerda para
misturar a amostra e o meio de cultivo, distribuindo os microrganismos presentes
uniformemente no meio;
Aguardar esfriar (solidificar) o meio e inverter as placas antes de incubar;
Em seguida incubar as placas em estufa 35.0 1 C, por 24 a 48 horas;
Aps este tempo, fazer a contagem das colnias formadas em contador de
colnias (Aumento 30/50 x).

Clculo do nmero UFC/ml.

Para se calcular o nmero de UFC / ml, da amostra deve-se multiplicar o nmero de
colnias contadas pela diluio.

Ex: Nmero de colnias contadas =120
Diluio 1:1000 (103)
120x1000 =120.000 =1.2x105 UFC/ml


Observao
Para amostras que no se pode pipetar, como o mel por exemplo, esta ser pesada para
se fazer as diluies e o resultado dever ser expresso em UFC / g. Multiplicar o
resultado final pela diluio realizada.

Fig. 3: Plaqueamento por Incorporao ou Profundidade.
Plaqueamento de Superfcie (Mtodo Spread Plate )

Fundir o meio de cultivo, em autoclave ou forno microondas;
Distribuir o meio de cultivo fundido (lquido) na placa de Petri;
Deixar solidificar;
Transferir com pipeta, 0,1ml da amostra, diluda ou no para a placa;
Com auxlio de uma ala de Drigalsky, tambm esterilizada, espalhar a amostra
sobre a superfcie do meio solidificado;
Levar a placa de Petri, inoculada para a estufa com temperatura regulada, de
acordo com o microrganismo (bactria ou levedura);
Incubar at o completo desenvolvimento das colnias (48 / 72 h );

Observao
Fazer a contagem das colnias formadas em contador de colnias (Aumento 30/50X);

Clculo do nmero de UFC/ml
Para se calcular o nmero de UFC/ml da amostra, deve-se multiplicar o nmero de
colnias contadas pela diluio e por 10.
Ex: Nmero de colnias contadas =31
Diluio: 1: 100 (102)
Tem-se: 31 x 100 x 10 =31000 =3,1 x104 UFC/ml.
Observaes
importante que a superfcie do meio de cultivo na placa de Petri esteja bem
seca, antes de transferir a amostra para a placa.
Volumes maiores que 0,1 ml devem ser evitados, pois excesso de lquido poder
causar o agrupamento das colnias, tornando difcil a contagem.

Fig. 4: Plaqueamento de Superfcie
Avaliao da Populao Microbiana por Filtrao em
Membrana.

uma opo para se avaliar a populao microbiana, alm do plaqueamento e,
se baseia na filtrao sob vcuo, da amostra a ser analisada, atravs de membranas
especficas com porosidade de dimetro uniforme capaz de reter os microrganismos.
Assim, tm-se membranas para reteno de bactrias (poro 0,22 micra) e para reteno
de leveduras (poro 0,45 micra) e com dimetros de filtro variveis. As membranas para
uso em contagens Microbiolgicas j vm esterilizadas e embaladas individualmente.
Esta tcnica bastante til quando se tm amostras com pequeno nmero de clulas
viveis, porque se podem filtrar volumes maiores, porm, pode tambm ser usada para
amostras com altas contaminaes, fazendo-se diluies sucessivas da amostra. Neste
caso podem-se filtrar volumes menores.


Fig. 5: Membrana, conjunto de filtrao.

Verter 15 a 20 ml de meio de cultivo em placa de Petri;
Deixar em repouso para solidificar;
Esterilizar o conjunto de filtrao
Montar em condies asspticas (cmara de fluxo) o conjunto de filtrao com a
membrana apropriada;
Ligar a bomba ou trompa de vcuo;
Em condies asspticas filtrar a amostra;
Retirar a membrana com pina metlica esterilizada;
Coloc-la na placa previamente preparada, contendo meio de cultivo apropriado;
Levar para a estufa, temperatura adequada para o microrganismo que se
pretende avaliar (bactria ou levedura);
Incubar por 24 / 48 horas;
Fazer a contagem das colnias que se desenvolveram na superfcie da
membrana, da mesma forma que se faz no plaqueamento convencional.
Para o clculo do nmero de UFC/ml, deve-se multiplicar o nmero de colnias
contadas pela diluio
Ex: Nmero de colnias contadas = 75
Diluio 1:10 (101)
Volume de amostra filtrada =100 ml
75 x 10 / 100 =750 / 100 =7,5 / 8,0 UFC/ml
Observaes
Qualquer que seja o volume de amostra filtrado, para se expressar em UFC/ml,
deve-se dividir por este volume. Caso contrrio deve-se expressar como UFC/volume de
amostra filtrada.
Em caso de amostras slidas, deve-se expressar em UFC/g, multiplica-se pela
diluio e dividi-se pelo peso da amostra.

Cultivo por Estrias
Este no um mtodo de contagem propriamente dito, e sim uma tcnica muito usada
no isolamento de microrganismos, para posterior caracterizao e classificao.

Fundir o meio de cultivo apropriado (bactrias ou leveduras), em Autoclave ou
microondas;
Distribuir 15/20 ml do meio previamente fundido em placas de Petri
esterilizadas;
Esperar solidificar;
Flambar a ala de platina ao rubro (bico de Bunsen) ;
Esfri-la em gua esterilizada;
Mergulhar a ala de platina na amostra, diluda ou no;
Fazer estrias na superfcie do meio de cultivo, em vrios sentidos;
Incubar em estufa por 48/72 h temperatura adequada, de acordo com o
microrganismo a ser cultivado (bactria ou levedura) ;
Considerar para anlises posteriores somente as colnias bem isoladas.

Observao
Este procedimento vai propiciar o desenvolvimento de colnias separado as quais sero
depois transferidas para meio de cultivo lquido, para posterior aplicao dos testes
bioqumicos especficos ou tcnicas moleculares.


Fig 6: Placa de Petri com cultivo por Estrias
Cultivo em PetriFilm
Esta tcnica pode ser aplicada para contagem de mesfilos aerbios totais, bolores e
leveduras, em praticamente todas as etapas do processamento de acar e lcool. uma
modificao da tcnica convencional de contagem de clulas viveis por plaqueamento.
A placa Petrifilm composta por dois filmes estreis, reidratveis, impregnados pelo
meio de cultivo e por substncias geleificantes solveis em gua fria e, tambm com
corantes prprios (compostos cromognicos), que aps a incubao, revelaro o
desenvolvimento microbiano, de acordo com o microrganismo sendo avaliado.
Fazer diluies em srie da amostra a ser avaliada;
Sob condies asspticas (cmara de fluxo laminar), erguer o filme superior de
celofane da placa Petrifilm com pina metlica esterilizada;
Inocular o filme inferior (meio de cultivo), com 1ml das diluies a serem
plaqueadas;
Retornar o filme superior posio original;
Fazer a distribuio da amostra com o espalhador especfico, por leve presso
manual;
Levar as placas Petrifilm para a estufa;
Incubar temperatura e tempo variveis com o tipo de microrganismo em
avaliao;
Fazer a contagem das colnias formadas (pontos coloridos);
Expressar o resultado, com UFC/ml .

Para calcular o nmero de UFC/ml, deve-se multiplicar o nmero de colnias contadas
pela diluio.
Exemplo: Nmero de colnias contadas =99
Diluio =1: 1000 (103)
99 x 1000 =99.000 =9,9 x 104 UFC/ml
Observaes
Este mtodo considerado equivalente ao convencional, com grande economia
de tempo de trabalho
Em caso de amostras slidas, deve-se expressar em UFC/g , tomando-se por
base o peso da amostra usado para se fazer as diluies.

Fig 7 e 8: Plaqueamento em Petrifilm
OUTRAS ANLISES
Avaliao da Floculao da Levedura
A floculao da levedura um dos mais graves problemas no processo de
fermentao alcolica, especialmente pela reduo de produtividade e aumento nas
dificuldades de centrifugao da levedura, para sua reutilizao no processo
(reciclagem).

O fenmeno de floculao pode ser de duas categorias: reversvel e irreversvel. A
floculao reversvel se caracteriza pelo agrupamento de clulas no final da fase
exponencial de crescimento ou na fase
estacionria, como resultado principalmente
de contaminaes bacterianas, dos gneros
Lactobacillus e Bacillus e tambm de agentes
qumicos (Ca++). J a floculao irreversvel
pode ser o resultado de caractersticas
prprias da levedura (levedura floculante) ou
como resultado de falhas no desprendimento
do broto (clula filha), ou se induzida pela
deficincia de minerais como nitrognio e
magnsio.

Fig. 9: Flocos de leveduras.
Procedimento Analtico
Transferir para uma proveta de
100 mL;
Ajustar o menisco para 100 mL;
Cronometrar 15 minutos;
Fazer a leitura quantificando de
cima para baixo o espao existente
entre o volume total (100 mL) e incio da separao do levedo;

% FLOCULAO = 79 %


Fig. 10: Ilustrao do teste de floculao
FLOCULAO DAS CLULAS DE LEVEDURAS
A floculao segue sendo um dos principais problemas de fermentao, pois de
difcil previso e de difcil controle.
O agrupamento das leveduras diminui a rea especfica das leveduras expostas ao
meio externo, o que diminui a velocidade de retirada de acar e nutrientes e torna
mais difcil a liberao do lcool e do CO
2
, o que causa diminuio na velocidade de
fermentao e de reproduo e aumento na taxa de morte.
Alm disso, como o floco tem um dimetro muito maior que o de uma clula isolada,
ele se torna muito mais pesado, havendo separao de fases assim que a agitao
causada pela liberao de CO
2
diminuir.
A alta concentrao de fermento que se acumula no fundo das dornas no incio da
centrifugao, em conjunto com o grande dimetro dos flocos, torna a operao da
centrfuga extremamente crtica e pouco produtiva, qualquer manobra errada
significando grandes perdas de fermento e/ou reduo de produo.
O tratamento cido tambm auxilia no controle da floculao, quebrando os flocos e
permitindo que as bactrias em seu interior percam a proteo do floco e sejam
agredidas pelos antibiticos. H, porm, outros problemas que complicam o
tratamento, relacionado tanto as condies de centrifugao como a presena dos
flocos.
Quando um floco (formado por milhares de leveduras) acelerado dento da
centrfuga, em vista de sua grande rea e voluma, carrega consigo no apenas as
bactrias aderidas as leveduras como aquelas que originalmente no estavam
aderidas, e mais, carregando slidos em suspenso e colides (argila, protenas e
polissacardeos extracelulares).

Todo este material orgnico ir reagir com o cido sulfrico competindo pela ao
desfloculante dos ons [H
+
] e reduzindo a eficincia do tratamento, j que haver
grande aumento no nmero de bactrias no leite. O maior consumo de cido e em
conseqncia maior acidez torna o tratamento mais agressivo, diminuindo a
viabilidade do fermento.
A rea por unidade do volume sendo tanto menor quanto maior o dimetro do floco
reduz ainda mais a eficincia de tratamento cido, resultando tudo isso em uma lenta
recuperao do processo, com grande consumo de cido, diminuio da viabilidade,
diminuio do teor de fermento, aumento no tempo de fermentao, reduo na
produo, desgaste acelerado nas centrfugas e perdas de rendimento por sobra de
acares, por produo de cidos e glicerol.
A maior parte dos problemas de floculao nas destilarias envolve a presena de um
contaminante especial, um tipo de bactria do gnero Lactobacillus que tem a
capacidade de sintetizar um tipo de protena (associada a sua parte externa) que se
adere firmemente a uma frao de carboidrato da parede celular da levedura, a
manana.
A bactria pelo seu pequeno tamanho e grande rea, tem a capacidade de aderir a
diversas leveduras simultaneamente formando os flocos.
Para complicar esta situao, algumas leveduras contaminantes, que so
naturalmente floculantes (como as utilizadas em cervejarias, por exemplo), tambm
tm a capacidade de co-flocular com a levedura normal, bastando 20 a 30% do
nmero total de leveduras nesta forma para promover a total aglomerao da
populao.
A nica diferena entre estes dois tipos de floculao a faixa de pH necessrio para
desflocular, ou seja, para alterar a estrutura da protena que estabiliza o floco. Quando
existem principalmente leveduras contaminantes, o pH de desfloculao estar abaixo
de 2,2 e quando existirem principalmente bactrias, este pH fica na faixa de 2,5.
Os principais controles para evitar uma grave floculao bacteriana no processo so:
- controle da assepsia do mosto (monitorada pelo delta-pH ou delta-acidez): deve ser
minimizada a entrada de bactrias no mosto atravs de limpezas freqentes de todas
as linhas e os equipamentos em contato com o acar, preferencialmente passando
caldo na temperatura de ebulio por pelo menos 15 minutos, quatro vezes por dia.
Nas paradas, as linhas devem ser esgotadas e limpas com gua e depois com gua e
biocida.

O valor do delta-pH deve estar abaixo de 0,6, cuidando-se principalmente do estado
do trocador de calor, que deve ser mantido limpo, por exemplo, pela inverso do lado
de fluxo (caldo/gua), antes que o delta-pH suba.
Floculao da levedura pela bactria Lactobacillus fermentum
No estudo de leveduras, o termo floculao normalmente usado para designar o
fenmeno reversvel de agrupamento celular que comumente se desenvolve no final
da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionria. Isto pode ser causado
pela ao de propriedades inerentes das clulas, por agentes qumicos ou
microbiolgicos.
Na fermentao alcolica industrial, as leveduras floculentas esto normalmente
presentes como contaminantes das leveduras normais (no floculentas). Nas usinas
alcooleiras, a presena de leveduras floculentas em concentrao superior a 12%
causa dificuldade significativa na operao de centrifugao do vinho devido ao
fenmeno de co-floculao. Nestas condies acentua-se a sedimentao das clulas
de leveduras nas dornas e interfere na operao das centrfugas contnuas.
O fator responsvel pela floculao de leveduras governado geneticamente. Alm do
fator gentico h outros que interferem ou inibem a sua ao. O meio de cultivo
tambm interfere na floculao. A anaerobiose reprime a floculao e a aerobiose
induz a formao de protena responsvel pela floculao.
A diferena da estrutura entre linhagens floculentas e no floculentas no pode ser
detectada pela anlise qumica mas pode ser visualizada por microscopia eletrnica.
As clulas floculentas apresentam superficie fimbriada ou ciliada e as no floculentas,
relativamente lisa.
O mecanismo exato de floculao da levedura no conhecido. Trabalhos realizados
com linhagens floculentas mostraram que a manana da parede celular participava da
floculao. A interao se estende por toda rea causando distoro da parede no
local do contato. O envolvimento da manana indicado por diversos experimentos: (1)
A floculao inibida competitivamente por manana. (2) A hidrlise de proteina de
clulas no floculentas ou floculentas no altera a sua interao com clulas
floculentas intactas. Esse componente proteico est associado parede celular no
podendo ser removido pelo calor ou tratamento qumico. A fora de ligao entre as
clulas floculentas pode ser dada pela ponte de hidrognio ou polissacardeos da
parede celular e on Ca
+2
, associada a grupo carboxila da proteina da parede celular.
possvel que a ligao seletiva de Ca
+2
com proteina seja mediada por arranjo

especfico do grupo carboxila, mas tambm pode ser que o on Ca
+2
atue como co-
fator na ativao da capacidade de ligao da proteina com a manana.
A floculao dependente do Ca
+2
em quantidades mnimas (10
-6
a 10
-8
). Magnsio
pode substituir Ca
+2
, mas depende do pH, e atua somente ao redor de pH 4,0
enquanto que Ca
+2
atua a intervalo de pH maior (pH >3,0).
Na fermentao alcolica industrial frequente a contaminao por bactrias do
gnero Lactobacillus. Algumas dessas bactrias so capazes de provocar a floculao
de leveduras como por exemplo Lactobacillus fermentum. Esta floculao apresenta
algumas caractersticas similares s leveduras floculentas, como susceptibilidade s
altas temperaturas, proteinase e pHs extremos, necessidade de ons metlicos e
inibio por manose e excesso de ons. O stio susceptvel temperatura e proteinase
est localizado na clula bacteriana e no na levedura. Alm disso h uma relao
numrica celular entre a bactria e a levedura onde se consegue o mximo de
floculao, indicando que existe um nmero fixo de stios na levedura para formao
do agregado.
A necessidade de ons Ca
+2
para floculao depende do pH sendo que em
concentraes elevadas (> 10
-1
M) h desfloculao das clulas.
Como no caso de leveduras floculentas, a manose causa a desfloculao. J glicose,
maltose e sacarose no produzem nenhum efeito. O tratamento trmico aplicado
sobre a clula bacteriana provoca a perda da sua capacidade floculadora.
No caso da floculao causada por Lactobacillus fermentum o fator responsvel de
natureza proteica encontrado na clula bacteriana, e a sua interao com clulas de
levedura afetada com variao de pH, presena de ons e manose, termolbil e
destruido por proteinase. Uma floculao especfica tambm pode ser causada por L.
plantarum. O fenmeno ocorre a pH entre 2,0 e 4,0 e inibido por sais neutros. O
estudo da mobilidade eletrosttica das clulas de bactrias e levedura mostrou que a
floculao era causada pela atrao eletrosttica entre as superfcies celulares de
bactrias e leveduras com cargas opostas.
A diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculao do fermento
nas dornas de fermentao, bem como o grande volume de mosto manuseado
durante a fermentao alcolica industrial, tornam o controle do processo de
floculao um desafio de grande importncia e dificuldade.
Aspectos gerais
Quando se estuda floculao, importante fazer a distino entre a (no reversvel)
formao da cadeia, onde clulas mes e filhas no se soltam umas das outras, e a

real, floculao induzida e reversvel. A formao de cadeias est relacionada com o
crescimento e comea no incio da fermentao. A floculao comea com a exausto
do meio. A floculao real pode ser considerada como uma reao de estresse, como
uma resposta de um baixo nvel de nutrientes ou um mecanismo de defesa contra
altas concentraes de etanol. Na verdade, a regulao da floculao mostra uma
evoluo paralela com outras respostas de estresse, tal como o acmulo de trealose,
a produo de protenas por choque trmico e formao de pseudomiclio.
Provavelmente, a floculao pode ser considerada como uma estratgia de
sobrevivncia. As clulas localizadas na periferia do floco protegeriam as clulas que
esto no centro contra as condies desfavorveis do meio.
A floculao um fenmeno muito comum observado em suspenso de
microrganismos. Consiste na agregao de clulas fazendo com que elas
sedimentem. Estes flocos podem sedimentar ou, devido incluso de CO2, podem
flutuar para a superfcie. Entretanto o termo floculao mais usado para descrever
apenas o fenmeno de sedimentao, ignorando que a agregao de clulas no
apenas pr-requisito para sedimentao, mas tambm para flotao.
A floculao classicamente descrita como um fenmeno reversvel em que clulas
de leveduras aderem-se em flocos e sedimentam-se rapidamente do meio em que
esto em suspenso. Durante a seleo de uma cepa de levedura para propsitos
fermentativos, sua habilidade de floculao considerada ser maior de importncia.
Aps o trmino de seu papel metablico numa fermentao, a levedura deve ser
removida do meio por floculao, centrifugao e/ou filtrao. Entretanto de um ponto
de vista prtico os dois ltimos procedimentos podem criar srios problemas. Por isso,
uma compreenso dos mecanismos de floculao e os fatores que a afetam so de
grande importncia para a fermentao e indstria relacionadas.
Especialmente em procedimentos contnuos a separao das clulas do meio pode
ser obtida sem centrifugao, desta forma compreensvel que os vrios ensaios de
floculao (ou precisamente de sedimentao) so baseados nas medidas visuais ou
fotomtricas da velocidade de sedimentao do depsito de clulas.
Comparativamente poucos estudos foram enfocados na floculao de leveduras
induzida por bactrias. Tem sido relatado que a agregao de leveduras por
Lactobacillus devido a fora eletrosttica entre as superfcies das paredes celulares
de bactrias e leveduras; alm disso, a agregao mostrou ser dependente do pH.
Mais recentemente, a floculao foi demonstrada ocorrer entre a bactria Gram-
positiva Lactobacillus fermentum e a levedura que no inteiramente dependente do
clcio.

Primeiramente para se produzir uma cerveja de alta qualidade essencial que as
clulas de leveduras sejam removidas do mosto fermentado quando elas terminam
seu trabalho. Um importante estgio desta remoo a agregao espontnea de
clulas de leveduras em flocos, que chamada de autofloculao. O mecanismo
desta agregao um assunto de considervel controvrsia que mencionada em
vrias literaturas.
Uma outra razo para a diversidade de explicaes de floculao de leveduras
encontra-se na diversidade de metodologias usadas em investigaes experimentais.
A floculao de leveduras quase que exclusivamente estudada por medida direta ou
indireta da velocidade de deposio de flocos de leveduras. Estas velocidades so
muito dependentes das condies usadas, tanto quanto a concentrao das clulas,
geometria do recipiente, composio da soluo e agitao. Tais medidas tambm
resultam em um grau de confuso entre floculao, a populao inicial de clulas de
leveduras, e sedimentao, a deposio subseqente das clulas agregadas
restantes. No dada uma medida direta do tamanho do resultado da agregao.
Igualmente, tais medidas so freqentemente levadas a cabo externamente na
fermentao do mosto com a presena de substncias conhecidas para induzirem a
floculao. Elas no fornecem informao direta no estado de agregao de clulas de
leveduras como elas passam pela fermentao.
Aspectos genticos
A velocidade de floculao em levedura depende de parmetros genticos e
ambientais, tanto quanto a concentrao de clulas, temperatura e concentrao de
ons bivalentes.
A caracterstica da floculao estimada primeiramente como uma manifestao da
parede celular externa da levedura, especificamente, a manose - componente de
protenas. Muitos fatores exercem uma influncia na floculao de leveduras. Dentre
estes so componentes genticos (por exemplo, Genes FLO), funo mitocondrial,
protenas e peptdios, agitao e estresse, produtos da fermentao, por exemplo
etanol, pH, e ctions, especialmente Clcio.
Existem trs razes possveis para as clulas de leveduras agregarem-se, todas com
mecanismos distintos de adeso. O primeiro e melhor entendido, diz respeito a
combinao de clulas de leveduras sexuadas. Cepas haplides de dois tipos de
leveduras sexuadas no caso de Saccharomyces cerevisiae trocam poucos feromnios
peptdeos, fatores a e que causam um nmero de mudanas fisiolgicas. Depois
destas modificaes, as clulas agregam-se antes da fuso celular para formarem

diplides. A adeso entre clulas por ligao protena/protena entre aglutininas a e
fixadas nas paredes celulares complementares.
A floculao, em contraste, no parece envolver combinao sexuada. A floculao
geralmente ocorre entre clulas de apenas uma cepa de levedura. Independente do
tipo de combinao ou ploidia. A ligao parece ser protena/carboidrato e requer a
presena de ons de clcio. A floculao, no como uma agregao por combinao,
reversvel, inibida por agentes quelantes ou por acares especficos. A floculao tem
sido usada pela indstria cervejeira, provavelmente por muitos sculos, para separar a
levedura da cerveja no final da fermentao. A floculao foi relatada por Pasteur em
1876 e desde aquela poca, muito da pesquisa em floculao tem sido orientada para
o papel da floculao nas cervejarias.
H duas tradies bsicas no uso de leveduras floculentas; cepas que fermentam no
fundo da dorna para um tipo de cerveja leve e clara (lager) e as cepas que fermentam
na parte superior da dorna para a produo de uma cerveja mais incorpada (ale).
Cepas de baixa fermentao so tradicionalmente mais floculentas e decantam para o
fundo da dorna de fermentao, ao contrrio da cepa ale, menos floculentas cujos
flocos so carregados para cima para formar uma grossa espuma de leveduras no
topo da dorna de fermentao.
A terceira razo para encontrarem-se agregados de leveduras o fracasso dos brotos
em separar-se das clulas mes durante a multiplicao da levedura. As clulas, me
e filha, continuam a formar novos brotos, eventualmente crescendo em agregados de
mais de 100 clulas. O fracasso dos brotos em separar-se pode dar-se pelo baixo
nvel de nutrientes, a cepa da levedura ou mutao em um gene. Isto comum em
cepas Saccharomyces cerevisiae de cervejaria, e conhecido como uma formao de
uma ramificao. Estudos apontam que isto no estritamente uma forma de
agregao j que as clulas nunca estiveram isoladas, e agregao envolve um
ajuntamento de clulas isoladas para formao de um floco. A formao desta
ramificao envolve o crescimento de leveduras em agregados multicelulares, talvez
uma tentativa de um crescimento micelial e adoo de um tipo de vida multicelular.
Seja como for, a formao de ramificao um fenmeno inteiramente separado da
floculao ou agregao por combinao, mas parece superficialmente similar.
Ao de ons
A floculao de leveduras depende da presena de ons bivalentes como, por
exemplo, Ca
++
causando agregao das clulas. Pela ligao de Ca
++
com EDTA esta
agregao pode ser inibida. A quantidade de EDTA para se evitar a agregao

especfica para diferentes cepas de leveduras. chamado de taxa de floculao e
expressa em *mol de EDTA. A taxa de floculao pode ser usada para caracterizar
tanto leveduras sedimentares quanto leveduras floculantes.
Estudos mostram que a floculao de leveduras realizada por algumas linhagens de
Lactobacillus, observando que ons clcio intensificavam a agregao e que a agitao
da mistura de clulas era essencial para o incio da floculao, como no caso das
leveduras floculantes.
Aspectos fsico-qumicos
Recentemente, foram feitos muitos estudos no mecanismo e aspectos fsico-qumicos
do fenmeno da floculao. Estudos mostraram que a determinao de caractersticas
de leveduras floculantes com respeito ao clcio, pH, etanol e sensibilidade a acares
podem ser concomitantemente avaliadas.
Aspectos qumicos
Existe uma grande concordncia que a estabilidade da suspenso de leveduras
devida em grande parte negativamente encarregado pela parede celular. Anlises
qumicas da parede celular mostram que aproximadamente 80% do peso seco so
compostos por *-glucana e *-manana. A estrutura da parede complexa, mas sabe-se
que a camada externa composta geralmente de fosfomanana, que produz uma
carga lquida negativa para seus grupos de fosfatos. O restante da parede
constitudo de protena, quitina e lipdios. A protena da parede uma fonte de grupos
negativos de carboxilas, e grupos positivos de amino. A quitina no utilizada e o
lipdio no encontrado na superfcie externa da clula.
Mecanismos de floculao
Vrios mecanismos so propostos para explicar a floculao. Nenhum destes
mecanismos foi provado ser uma forma equivocada. Os modelos mais interessantes
so aqueles que esto baseados em um aumento da hidrofobicidade celular durante a
fermentao ou em uma ligao tipo-lectina de interao.
Hidrofobicidade celular
Vrios autores enfatizaram a importncia da hidrofobicidade celular na agregao
celular. Estes trabalhos mostram que a limitao de nutrientes est induzindo a
mudana nas caractersticas fisico-qumica da parede celular da levedura. Esta
mudana leva a um forte aumento na hidrofobicidade da levedura. O aumento da

hidrofobicidade coincide com a floculao. Alm de que o aumento na hidrofobicidade
causado pela sntese de uma glicoprotena muito hidrofbica que pode ser a maior
causa da floculao de leveduras.
Ligao tipo-lectina
Lectinas so protenas que so hbeis em ligar resduos de acar. Por um
mecanismo similar, algumas protenas da parede celular das leveduras podem ligar-se
os resduos de acares das glicoprotenas desta mesma parede celular e em outras
clulas de leveduras. Esta ligao induziria a floculao.. A protena tipo-lectina seria
sintetizada durante a fermentao e o clcio seria necessrio para a ativao da
protena. O clcio que ativou a protena hbil em unir as cadeias de manose das
glicoprotenas das leveduras. Esta ligao resultaria na formao de flocos e por
seqncia a floculao de protenas.
Estudos sustentam que h pelo menos duas famlias de lectinas de leveduras: grupo
FLO1 (inclusive as cepas que carregam o gene FLO1, mas tambm aquelas com os
genes FLO5 e FLO8 e presumariamente aquelas com o gene floculante) e o grupo
NewFlo. Muitas cepas de laboratrio pertencem ao grupo FLO1. Neste grupo, a
ligao de lectina primariamente inibida por manose e a ligao sem dvida
independente do pH do meio. Cepas de cervejarias, entretanto, frequentemente
pertencem ao grupo NewFlo em que a floculao no apenas inibida pela manose,
mas tambm por sacarose, maltose e glucose. Alm disso, a dependncia do pH na
floculao est muito distante no grupo FLO1.
Reconciliao dos dois mecanismos
Frequentemente a teoria da hidrofobicidade e a teoria da ligao tipo-lectina so
tratadas como dois mecanismos independentes. Isto no necessariamente o caso.
As protenas da parede celular do grupo FLO1 so fortemente hidrofbicas; este
tambm o caso para outras protenas glicosiladas da parede celular que podem agir
como acar ligante na ligao tipo-lectina. As snteses destas protenas resultaro
em um grande aumento na hidrofobicidade da clula de levedura. Portanto,
hidrofobicidade e ligao tipo-lectina deveriam ser consideradas como dois aspectos
do mesmo mecanismo, mais do que como dois mecanismos.
Cofloculao levedura-bactria
Um caso especial da ligao tipo-lectina de floculao a cofloculao levedura-
bactria. Bactrias lticas, mas tambm outros tipos de bactrias (Escherichia coli,

Hafinia protea) podem aderir-se a levedura por induo de clcio, ligao tipo-lectina e
inibio de acar so comparveis com o mecanismo da floculao lectina-levedura.
Esta interao pode ser positiva, como o caso na produo de cervejas cidas ou
cervejas claras naturalmente acidificadas. Na maioria dos casos, de qualquer maneira,
a ligao leva a contaminaes indesejveis. Comparvel com a floculao de
leveduras, a ligao levedura-bactria depende fortemente da cepa. Foi mostrado que
algumas cepas de leveduras tm uma afinidade melhor com o cido ltico produzido
por bactrias do que outras. A sensibilidade contaminao da levedura pode no ser
deduzida do comportamento da floculao da prpria levedura: floculao de
leveduras e cofloculao levedura-bactria so determinadas por outra protena da
parede celular. Tambm neste caso, uma caracterizao cuidadosa da cepa da
levedura pode ajudar a prevenir problemas.
Ao de bactrias
Vrios estudos sobre os efeitos da contaminao microbiana na fermentao alcolica
tm sido relatados na literatura. No entanto apesar da floculao do fermento ser
citada como um dos possveis efeitos da contaminao, este aspecto no foi
investigado com maior profundidade.
O efeito do contaminante sobre a levedura ainda pouco conhecido, porm sabe-se
que um nvel elevado de contaminao pode causar: (1) reduo da produtividade e
no rendimento fermentativo pela competio pelo substrato; (2) reduo da vitalidade
das clulas de leveduras pela intoxicao por metablitos do agente contaminante; e
(3) floculao das leveduras pela ao das clulas bacterianas.
A floculao da suspenso de leveduras pode ter pelo menos duas causas: (1)
presena de linhagem floculante de levedura; (2) presena de bactria que causa a
floculao de leveduras.
A floculao da levedura nas dornas de fermentao alcolica causada por bactrias
conhecida pela maioria dos tcnicos de usina. Em alguns casos, o transtorno
grande, dificultando principalmente a separao das leveduras nas centrfugas e
afetando a produtividade na fermentao.
Estudos mostraram a relao entre a contaminao bacteriana presente nas dornas
com o problema da floculao, identificando uma espcie de Sporolactobacillus como
responsvel pela floculao do fermento. O principal efeito dessa infeco, de acordo
com estes autores, consistiria no aumento progressivo de tempo de fermentao,
como conseqncia da diminuio da superfcie til das clulas de levedura e reduo
de aproximadamente 15% no rendimento.

Estudos de contaminao microbiana na indstria do lcool no estado de So Paulo
indicaram que provavelmente as espcies de Leuconostoc, bactrias sabidamente
produtoras de goma no estariam implicadas na floculao, uma vez que no so
capazes de sobreviver por longos perodos nas condies de fermentao do lcool.
Ao contrrio, as bactrias pertencentes ao gnero Lactobacillus sobreviveriam sob tais
condies e constituiriam aproximadamente 60% das espcies de bactrias
encontradas na dorna de fermentao, sendo que a espcie L. fermentum apresentou-
se como a bactria predominante entre os Lactobacillus.
Outros estudos indicaram uma linhagem de Lactobacillus fermentum como
responsvel pela floculao. No entanto, para que houvesse floculao, o nmero de
clulas de bactrias deveria atingir um valor crtico com relao ao nmero de clulas
de leveduras. Assim para 84 mg/50ml de suspenso bacteriana, a floculao mxima
foi observada com 1380mg de leveduras, ou seja, uma relao em massa seca de
0,061 e na contagem microscpica uma razo de 5:1 clula de bactria/clula de
levedura.
A floculao causada por L. fermentum ocorre numa faixa mais ampla de pH entre 2,0
e 12,0 se comparada com a floculao provocada por leveduras floculentas.
Verificou-se que o problema da floculao de leveduras por contaminantes bacterianos
tem sido intensificado pelo reciclo de clulas que consiste na reutilizao do chamado
leite de leveduras. Essa prtica provocaria o acmulo dos agentes da floculao
limitando o nmero de reciclos e diminuindo a eficincia da fermentao.
Estudos observaram que a adio de cido provocou a separao das clulas,
desfazendo os flocos. A desfloculao com a acidificao da suspenso de levedura
(leite) tem sido comumente observada nas destilarias de lcool. Este efeito mostrou-
se reversvel, uma vez que a floculao era restabelecida quando o pH era ajustado a
valores superiores a 2,5.
Consideraes importantes
Sugere-se que a floculao de Saccharomyces cerevisiae causada por bactrias do
gnero Lactobacillus envolva um mecanismo intercelular em nvel da parede celular
destes microrganismos. Este processo deve envolver componentes proticos da
superfcie celular das bactrias, mais especificamente, os grupos funcionais feno e
indol, e carboidratos da parede celular da levedura. Os ons de Ca
++
, por sua vez,
tambm atuam diretamente neste sistema. Desta forma, embora o sistema de
floculao de Saccharomyces cerevisiae causado por bactrias do gnero
Lactobacillus, tenha sido classificado de acordo com o modelo simbitico, este pode

ser enquadrado no modelo das lectinas, devido ao envolvimento de um componente
protico da parede celular do microrganismo floculante, o qual possui caractersticas
de uma lectina e apresenta afinidade por stios receptores constitudos por
carboidratos, sendo que, a presena de ons se mostrou importante para a
manuteno deste processo.
CIDO LTICO
Produo de cidos por microrganismos
Os fungos e as bactrias podem ser usados pelo homem para obteno de produtos
com grande valor econmico.
As bactrias utilizadas industrialmente so as anaerbias e microaerfilas, para a
produo de cido actico, ltico, glucnico, propinico e outros, ou para a produo
de alimentos como queijos, picles, chucrutes, vinagres, leites fermentados e outros.
Os fungos tambm so usados na produo de cidos por via fermentativa. Os
principais cidos so: ctrico, glucnico, itacnico, kgico, giberlico, fumrico, ltico,
glico, cidos graxos e outros.
As bactrias envolvidas nos processos para obteno de cidos so principalmente as
do gnero Acetobacter e Lactobacillus. As bactrias podem formar inmeros cidos
diferentes. So, no entanto, de maior interesse econmico algumas das bactrias
produtoras de cido ltico, cido actico e de cido propinico.
Os cidos so provenientes da degradao anaerbica de glicdeos por oxidao
incompleta.
Histrico
- O cido ltico o nome comum do cido 2-OH propinico (CH3-CHOH-COOH),
conhecido como um componente dos leites cidos.
- O farmacutico Schelle, em 1780, descobriu sua estrutura, isolou-o e identificou-o
como sendo o principal constituinte do leite cido.
- O pesquisador Blandeau, em 1847, identificou-o como um produto de fermentao.
- Para Pasteur, o cido ltico foi um dos primeiros problemas microbiolgicos.
- O primeiro a isolar os microrganismos, como cultura pura, foi Lister, em 1877, e a
cepa isolada foi de Streptococcus lactis.
- Nesta poca, Delbruek verificou que temperaturas relativamente altas eram
favorveis produo do cido.
- A produo industrial do cido ltico passou a ter maior importncia aps 1881.

- Atualmente, produzido, principalmente, a partir de glicose de milho, melaos e soro
de queijos.
- O cido ltico, obtido por fermentao, normalmente sob forma racmica, existindo,
no entanto Lactobacillus que produzem formas opticamente ativa.
Consideraes Gerais
Bactrias lticas
As bactrias lticas so organismos sem mobilidade, em forma de bastonetes ou
cocos, no esporulados, G
+
.
A denominao bactrias lticas vem do fato que a energia na forma de ATP obtida
atravs da fermentao de carboidratos, produzindo cido ltico como principal
produto final.
As bactrias lticas so todas anaerbias aerotolerante que crescem prontamente na
superfcie de um meio slido exposto ao ar.
Entretanto, elas so incapazes de sintetizar ATP por meio respiratrio, um reflexo de
sua incapacidade de sintetizar citocromos e enzimas contendo o grupo heme (a
porfirina que o grupo prosttico de algumas enzimas e protenas).
Uma conseqncia da incapacidade de sintetizar hemeprotenas que as bactrias
lticas so catalase-negativas e, portanto no pode mediar a decomposio de H
2
O
2

de acordo com a seguinte reao: 2 H
2
O
2
---2 H
2
O + O
2

A ausncia de atividade de catalase, demonstrada pela ausncia de formao de O
2

quando as clulas so misturadas com uma gota de H
2
O
2
diludo, um dos mais teis
testes para o reconhecimento destes organismos, j que eles so virtualmente as
nicas bactrias despojadas de catalase que podem crescer na presena de ar.
Certas bactrias lticas adquirem atividade de catalase quando desenvolvidas na
presena de uma fonte de heme (ex., em meio contendo hemcias).
Tais espcies sintetizam uma protena denominada pseudocatalase, que pode
combinar-se com heme suprida exogeneamente para produzir uma enzima com as
propriedades da catalase.
Pseudocatalase uma enzima contendo mangans que apresenta fraca atividade de
catalase mesmo na ausncia de heme. Tem sido demonstrado que essa enzima
prolonga a viabilidade das clulas em fase estacionria incubadas sob condies
aerbias, mas parece no ser importante para as clulas em crescimento ativo.

Requerimentos nutricionais
Estes organismos possuem requerimentos complexos de fatores de crescimento:
requer vitaminas do complexo B, um considervel nmero de aminocidos e bases
purnicas e pirimidnicas.
Como resultado desses requerimentos, as bactrias lticas so normalmente
cultivadas em meios contendo peptona, extrato de levedura ou outros materiais
vegetais ou animais digeridos. Estes devem ser suplementados com um carboidrato
fermentvel para prover uma fonte de energia.
Caractersticas da colnia
Mesmo crescendo em meios muito ricos, as colnias de bactrias lticas sempre
permanecem relativamente pequenas. Raramente so pigmentadas, como resultado
da ausncia de citocromos.
O tamanho reduzido das colnias atribudo principalmente ao baixo rendimento de
crescimento, uma conseqncia do seu metabolismo exclusivamente fermentativo.
Tolerncia acidez:
Uma caracterstica fisiolgica diferenciadora das bactrias lticas sua alta tolerncia
acidez.
Embora as bactrias lticas na forma de cocos possam iniciar o crescimento em meios
com pH neutros ou alcalinos, a maioria das formas bastonetes no podem crescer em
meios com um pH inicial maior que 6.
O crescimento de todas as bactrias lticas continua atravs da fermentao, at que
o pH tenha reduzido-se a um valor menor ou igual a 5.
A capacidade das bactrias de produzir e tolerar uma concentrao relativamente alta
de cido ltico de grande valor seletivo, j que as capacita a eliminar a competio
da maioria das outras bactrias em ambientes ricos em nutrientes.
Padres de fermentao de carboidratos em bactrias lticas
As bactrias lticas podem ser divididas em dois subgrupos bioqumicos de acordo
com os produtos formados a partir de glicose.
Bactrias homofermentativas
So muito importantes e tem grande interesse na fabricao do cido ltico.

Os primeiros estgios da via metablica da fermentao ltica so os mesmos da
fermentao alcolica, ou mais especificamente a via de Embden-Meyerhof ou via
glicolticas.
O intermedirio importante para a formao do cido ltico o cido pirvico. No final
da via glicolticas, o cido pirvico, sob a ao da enzima lactato desidrogenase d
origem ao cido ltico.
Bactrias heterofermentativas
As fermentaes da glicose por essas bactrias resultam em vrios produtos.
Enquanto as bactrias homofermentativas degradam a glicose atravs da via
glicolticas, as heterofermentativas degradam a glicose atravs da via oxidativa das
pentoses fosfato.
Os compostos intermedirios importantes na via heterofermentativa so o cido
piruvico e o aldedo actico.
O rendimento lquido em ATP: 2 moles / mol de glicose pela via homofermentativa e
apenas 1 mol / mol de glicose pela via heterofermentativa.
Principais bactrias lticas
Para a produo do cido ltico, so as bactrias homolticas do gnero Lactobacillus
e Streptococcus.
A espcie escolhida depende do carboidrato disponvel e da temperatura a ser
empregada:
- Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus: temperatura na faixa de 45 - 50C;
- L. casei e Streptococcus lactis: temperatura ao redor de 30c;
- L. pentosis, L. leishmanii: temperatura acima de 30C.
TIPOS DE FERMENTAO ALCOLICA
Fermentao descontnua ou batelada
Conduo da fermentao
Providencias preliminar para partida
O sucesso da fermentao depende basicamente do nmero e do estado fisiolgico
da populao inicial de leveduras, devendo-se trabalhar com muito critrio na fase de
partida.

O trabalho deve iniciar pela limpeza e teste geral da instalao de fermentao,
devendo-se verificar os seguintes pontos:
- tubulao e caixas de caldo, de mosto, p-de-cuba e vinho limpos com gua quente;
- vlvulas e conexes da tubulao sem vazamentos e pontos estagnantes;
- dornas e ps-de-cuba limpa e com acessrios verificados, particularmente agitador
da cuba, sistema de gerao e asperso de ar comprimido, serpentinas, trocadores de
calor, etc.;
- centrfugas e sistemas de proteo filtros e hidrociclones testados e em
condies de uso;
- verificar estoque de boquilhas de diversos tamanhos 0,85 at 1,6 mm;
- instrumentao e controladores em condies de uso;
- linhas de fornecimento verificadas: tubulaes, bombas e peneiras de caldo; tanques
e bombas de mis; sistema de recalque de gua de resfriamento e diluio;
compressores e tubulao de ar; tubulao de vapor de baixa presso; tanques e
tubulaes de cido sulfrico;
Em paralelo deve-se atualizar o estoque de produtos qumicos nutrientes,
antibiticos e cido sulfrico etc.
O laboratrio de controle qumico deve estar em condies de uso, verificados o
funcionamento e a aferio dos seus equipamentos, padronizado o mtodo de anlise
e atualizado os boletins e outros impressos necessrios. particularmente importante
verificar a limpeza do microscpio, o nmero e o estado de laminas e lamnulas,
preparados os corantes, alm de estar atualizada toda a vidraria e reagentes,
preparadas as solues padres e reagentes necessrios para toda a safra.
A data do incio da propagao do fermento deve ser consensualmente decidida em
funo da data do incio da moagem, do estoque de mis e do avano da manuteno
da instalao como um todo moendas, gerao de vapor e energia eltrica, bem
como da expectativa de paradas em perodo prximo do incio da propagao, que
devem ser minimizadas. particularmente importante contabilizar a moagem com o
consumo inicial de acar na fermentao.
O pessoal da operao e de controle deve estar suficientemente treinado e motivado.
Partida e sistemas de partida
Existem atualmente trs opes para a partida da fermentao:
- fermento selecionado, partindo de tubo de cultura pura;
- fermento selecionado, partindo de leite de leveduras e,
- fermento prensado.

Cada uma das opes tem suas vantagens e desvantagens, entre elas:
- alta flexibilidade para suportar as variaes normais na composio e vazo das
matrias-primas e insumos;
- compatibilidade do fermento com a instalao, em termos de nmero de dornas, da
capacidade de resfriamento e capacidade de centrfugas;
- baixa tendncia floculao e/ou decantao;
- temperatura tima para reproduo e fermentao compatveis com o sistema de
resfriamento e de recuperao do lcool evaporado;
- pH e acidez timos compatveis com o processo normal de controle pH da
fermentao varivel de 2,0 a 4,5;
- baixos requisitos nutricionais e alta afinidade com o meio em termos da habilidade de
fermentar os acares presentes no mosto, no ambiente normal de trabalho;
- alta estabilidade no comportamento fermentativo;
- controle eficaz da contaminao bacteriana com o uso de antibiticos de alto
espectro de atuao Kamoran, Kamoran WP, Corstan, HJ Gold e KG.
Infelizmente no existe um nico fermento que atenda satisfatoriamente a todos os
requisitos acima; considerando-se ainda que cada instalao tem particularidades,
como por exemplo, diferentes variedades, produtividades e graus de maturao da
cana, que afetam a performance da levedura.
importante ressaltar que j existe uma tecnologia perfeitamente dominada na
indstria de produo de fermento para panificao e outras indstrias que se utilizam
do microrganismo para garantir a estabilidade gentica e fenotpicas de
microrganismos selecionados.
Partida com tubo de cultura pura
A primeira desvantagem a dvida se, de fato, o tubo de cultura contm o
microrganismo com as habilidades requeridas. bastante provvel que haja
variaes, devido ao mtodo de manuteno utilizado: repliques (subculturas).
Este mtodo baseia-se no semeamento peridico da superfcie de meios de cultura,
solidificados com Agar, com quantidades muito pequenas de leveduras, seguindo-se
incubao temperatura ambiente (ou a 30 32 C). A principal desvantagem deste
mtodo que o microrganismo tem um perodo de viabilidade pequeno devido perda
de gua, ao acmulo de produtos metablicos e outros fatores, os quais levam
necessidade de repliques (transferncia) freqentes. Isso pode levar facilmente
contaminao externa, ao risco de seleo e principalmente variao de
crescimento.

O mtodo ideal de manuteno seria aquele que paralisasse de forma no seletiva
toda atividade metablica de uma populao crescida em condies que preservem as
habilidades especficas. Isso poderia ser conseguido por congelamento profundo em
nitrognio lquido, tratando-se, porm, de uma tcnica cara e que exige precaues
especiais de manipulao e de segurana.
A segunda desvantagem a necessidade de assepsia completa nas fases iniciais de
propagao, pois a concentrao inicial de leveduras muito baixa, tornando
desfavorvel qualquer competio com outras leveduras, inicialmente presentes no
mosto (ou vidraria) no estril. A baixa concentrao inicial leva tambm a um tempo
excessivamente longo de propagao, aumentando o nmero de transferncias de
volumes e em conseqncia, aumentando a probabilidade de infeco com bactrias e
outras leveduras.
Chegando-se finalmente a fase industrial, provavelmente teremos um volume de vinho
em fermentao ainda com uma pequena concentrao de leveduras (em geral em
torno de 1 2% vol./vol, ou menos de 3x10
7
leveduras/ml) que ser alimentado com
um mosto no estril, que costumeiramente tem leveduras j adaptadas (da ordem de
10
5
lev./ml), levando assim a uma competio desfavorvel, pois o volume de mosto
adicionado ser muitas vezes maior que o volume de vinho inicial.
Ainda com relao a propagao na fase industrial, seria altamente recomendvel que
se fizesse em meio fracamente aerbio e com controle de concentrao de acares
no meio em fermentao, que deve ser suficientemente baixa (< 0,5% ART) para
garantir a converso da maior parte dos acares em leveduras com alta atividade
enzimtica. fato conhecido que mesmo em meio aerbio, se a concentrao de
acares for acima de um valor mximo, valor este dependente da cepa e da
velocidade especfica de reproduo (em geral menor que 0,5% ART), haver
produo de lcool em detrimento da produo de leveduras. Em condies aerbias,
entretanto, a velocidade especfica de consumo de acares mais baixa que em
condies anaerbias, o que levar a um tempo longo de propagao, pois a
concentrao celular inicial baixa. H a necessidade tambm de complementao do
mosto com quantidades compatveis de nutrientes e da capacidade adequada de
resfriamento, principalmente nas cubas.
O controle da contaminao bacteriana dever ser mantido desde o incio da
propagao em laboratrio sempre em dosagem de no mnimo 5,0 ppm em relao ao
volume de mosto a ser adicionado.
Assim, de acordo com o exposto, a propagao realizada a partir de tubo de cultura
pura s tem sentido em laboratrios de microbiologia e fermentao bem aparelhados,

mesmo assim, se for garantida a presena de material gentico adequado e ainda se o
produto final da propagao resultar em alta concentrao celular (>10
8
lev/ml). A
nica vantagem da partida com o tubo de cultura que haver um grande aumento na
massa celular e, portanto, as leveduras passaro por vrias geraes no meio de
cultura (mosto-vinho) e assim resultaro bem adaptadas a este meio.
Partida com leite de fermento selecionado
Se for admitida a hiptese de que o leite de leveduras recebido pela destilaria contm
uma grande proporo de leveduras com habilidades especficas, possvel ento
propaga-lo de forma otimizada.
O objetivo da propagao a produo da maior quantidade possvel de fermento
com a maior atividade enzimtica; isto pode ser conseguido facilitando as atividades
construtivas (anabolismo) da levedura. Para tanto, h a necessidade de aerao
intensa para que exista oxignio dissolvido no meio e, alm disso, que exista muito
pouco acar em soluo para evitar o efeito inibidor da reproduo, citado acima.
Desde o incio da propagao, a concentrao de leveduras deve ser suficientemente
alta para evitar competio com as leveduras e bactrias do meio, recomendando-se
mais de 10
8
leveduras/ml, ou mais de 6% (vol./vol.). O controle da temperatura nesta
fase essencial, recomendando-se entre 25 a 28C, pois temperaturas maiores
tenderiam a desviar o metabolismo para produo de lcool. O pH deve ser controlado
na faixa de 3,5 a 4,2, podendo chegar mais prximo de 3,5. Com respeito a esse
controle, o uso de mostos diludos (digamos caldo ou mis diludos a 8
Brix), facilita o trabalho por no tamponar excessivamente o meio em fermentao.
A aplicao de antibiticos com alto espectro fundamental para o controle efetivo da
populao de bactrias, minimizando assim, a competio pelos acares. A dosagem
deve ser em torno de 5,0 ppm, sempre em relao ao volume de mosto a ser utilizado
durante a propagao do fermento.
O mosto deve ser complementado com todos os elementos que fazem parte da
composio da levedura. Assim, se foram produzidas, em aerobiose 0,35 kg de
levedura seca por quilograma de ART convertido e, se a levedura contm 7% de
nitrognio em relao matria seca e, ainda se for controlada a adio de acar a
partir de um mosto a 8 Brix (65 g ART/lt), para que se mantenha sempre um teor
baixo de ART, o mosto dever conter:
0,35kg mat. Seca/kg ART x 0,07 kg N/kg mt. seca x 65 kg ART/m
3
= 1,59 kg N/m
3

mosto = 1,5%N.

Por exemplo, se for determinado que o mosto a 8Brix contm 0,12% de nitrognio
assimilvel, dever ser adicionado ao mosto 0,3g de nitrognio por litro, ou cerca de
1,5 g de sulfato de amnia ou DAP.
Com relao ao fsforo, recomenda-se usa-lo na complementao do mosto na forma
de H
2
PO
4
-
ou HPO
4
=
para que se atenda ao requisito de 0,6mM/g clula seca, ou:
0,35kg mat.seca/Kg ART x 0,6 x 97g H
2
PO
4
-
/kg mat.seca x 65 kg ART/m
3
mosto =
1,32 kg H
2
PO
4
-
/m
3
mosto
Se o mosto a 8Brix contiver 100 ppm P
2
O
5
, isto representa 0,14 kg H
2
PO
4
-
/m
3
,
devendo-se complementar, portanto, com aproximadamente 1,5 g de MAP (ou DAP)
por litro de mosto. , portanto, perfeitamente possvel utilizar somente DAP na
proporo de 1,5g/lt para atender os requisitos de nitrognio e fsforo, devendo-se,
neste caso, verificar se os requisitos de enxofre esto atendidos, pois seriam
necessrios:
0,0004kg S/kg mat.seca x 0,35 kg mat.seca/kg ART x 65 kg ART/m
3
0,1 kg S/m
3

mosto = 0,3 kg SO
4
=
/m
3
mosto
A adio de 0,35g de H
2
SO
4
por litro de mosto supre as necessidades de enxofre, no
havendo contra-indicao de se colocar mais que o suficiente para controle do pH na
faixa de 3,5 a 4,5.
Deve ser ressaltado que a complementao necessria principalmente na fase inicial
da propagao, pois os nutrientes adicionados e no convertidos sero conservados
em soluo, uma vez que aps a propagao sero feitos cortes com menor adio de
nutrientes e os mostos mais concentrados contero maior proporo de nitrognio e
fsforo.
Toda a fase de propagao, ou seja, alimentao, cortes, etc., exigem um alto nvel de
controle microbiolgico medindo-se a viabilidade celular, a contaminao bacteriana, o
teor de fermento, o teor alcolico, a acidez produzida, etc., devendo-se tomar medidas
urgentes caso sejam detectados problemas. Em relao infeco, a melhor
estratgia a preveno, atravs da aplicao de antibitico com alto espectro,
sempre em dosagem em 5,0 ppm do mosto a ser fermentado.
O teor de acar do mosto deve ser aumentado gradativamente (10 20% por ciclo),
observando-se a resposta do fermento em tempos do tempo de fermentao,
viabilidade e produo de leveduras. Aps a fase de cortes, j se deve usar o
tratamento cido do fermento, recomendando-se inicialmente pH=3 para um teor de
fermento at 5%; pH=2,8 de 5 7%; pH=2,5 a 2,2 para teores superiores a 7%. Aps
o tratamento cido dever ser alimentado mosto na proporo de 2 5 % do volume

de cuba (teor de acares na cuba inferior a 0,5%) e junto com o mosto todos os
nutrientes, devendo-se deixar por mais 1,5 a 2,0h com agitao e aerao.
Caso haja reduo de viabilidade, baixar o teor de acares do mosto em 20 30%.
Partida com fermento prensado
Com relao ao uso do fermento prensado na partida da fermentao, alguns
esclarecimentos so importantes: o primeiro o fato de que este fermento produzido
em condies particulares, com abundante aerao e com muita complementao
nitrogenada, resultando em uma populao muito ativa, porm, pouco adaptada ao
meio ambiente da fermentao. Um outro ponto importante que o fermento prensado
destina-se basicamente para panificao, ou seja, seu processo de fabricao
rigorosamente controlado para a produo de leveduras com habilidade de fazer
crescer rapidamente a massa de po que, embora seja um processo fermentativo, tem
caractersticas totalmente diversas da produo industrial de lcool.
Assim, deve ficar claro que, ao contrrio das outras opes onde a adaptao
gradual, haver uma mudana brusca do ponto de vista do fermento.
Apesar destas restries, a partida com este fermento talvez a melhor opo para
mdias e grandes instalaes, pois minimiza o tempo de partida.
A quantidade inicial de fermento a ser adquirida depende de uma srie de fatores,
principalmente da velocidade desejada com que se pretende atingir a produo
mxima.
Uma sugesto para aquisio de fermento prensado exemplificada abaixo:
- instalao de fermentao: 14 dornas de 300 m
3
cada;
- teor de fermento desejado: 10%;
- massa de fermento prensado em processo (aps partida): 14 x 300 x 0,1 = 420 tons
- massa a ser adquirida (partida em 2 semanas): 420/100=4,2 tons
- massa a ser adquirida (partida em 4 semanas): 420/1.000=420 kg
Recomenda-se, portanto, um inoculo de 1:100 at 1:1.000 em relao massa de
fermento aps partida. No perodo inicial (mnimo de 2 semanas), a produo de lcool
(e o teor alcolico do vinho) dever ser proporcional ao teor de fermento vivo nas
dornas, ou seja, o aumento de produo deve seguir o aumento da massa de
leveduras ativas, at que seja atingida a concentrao desejada (6 a 12% vol/vol),
quando o aumento adicional do teor alcolico (atravs do aumento do teor de
acares do mosto), tender a limitar a reproduo.

Todas as recomendaes em relao ao pH, nutrientes, aeraes constantes e
dosagem de antibitico so igualmente vlidas para os itens anteriores e importantes
para o fermento prensado.
Controle operacional da fermentao contnua
Introduo e estratgias
O objetivo bsico do controle fornecer os parmetros necessrios para a tomada de
decises que levem concomitantemente maximizao do rendimento e da
produtividade do processo com custos mnimos (insumos, mo-de-obra, energia e
perdas).
Os principais instrumentos do controle operacional so os boletins e grficos de
controle, de onde so obtidos os parmetros. Os boletins devem no apenas
colecionar informaes sobre as condies reais de operao, mas tambm permitir a
identificao da sua tendncia de evoluo (degenerao ou recuperao), o que se
pode conseguir com a realizao de grficos de controle.
Uma fase posterior do controle envolve o tratamento estatstico dos dados, para
identificar a existncia de correlaes entre os parmetros, facilitando a tomada de
decises.
Dentre as diversas estratgias que podem ser seguidas para cumprir o objetivo do
controle, uma delas parece ser a mais eficiente: trata-se de dirigir a ateno ao agente
da fermentao que a populao de leveduras, que deve ser maximizada, no s
quantitativamente como tambm qualitativamente. Para exemplificar o que significa o
controle da populao de leveduras, anteriormente foi citado que a temperatura de
fermentao afeta tanto a velocidade de fermentao e de crescimento das leveduras
como tambm afeta a velocidade de crescimento das bactrias contaminantes; foi
tambm dito que um aumento da temperatura eleva a taxa de morte de leveduras e
aumenta as perdas por evaporao e arraste de lcool nas dornas.
Assim, em uma determinada instalao de fermentao que esteja funcionando no
mximo de sua capacidade de resfriamento, o controle deve identificar qual o limite de
temperatura em que o sistema pode operar de forma estvel para que o rendimento
no cais. Ultrapassado este valor crtico, as decises possveis so:
- reduzir o teor de acares no mosto: porque reduz a carga trmica horria;
- reduzir a velocidade de alimentao das dornas: pelo mesmo motivo;

- aumentar a diluio do p-de-cuba: rebaixar o nvel inicial de temperatura pelo uso
de mais gua fria e diminuir a concentrao inicial de leveduras, reduzindo a carga
trmica horria;
- aumentar a dosagem de antibitico: tornar mais seletivas as condies de
tratamento, aumentando a taxa de morte de bactrias e selecionando a populao de
leveduras;
- aumentar a aerao nas cubas e dornas: regenerar os danos causados pelo
tratamento cido intenso.
Seguindo esta estratgia, as decises que se seguem s diversas perturbaes que
ocorrem no processo em geral devem se dirigir a manuteno da maior e melhor
populao de leveduras que for possvel, dentro de restries impostas pela instalao
de fermentao de principalmente pela necessidade de integrao com a fabricao
de acar.
Torna-se claro, portanto, que no possvel estabelecer qualquer controle operacional
se no houver condies para obter estimativas razoveis dos parmetros do
processo, ou seja, se os mtodos de medida no so confiveis. Assim, deve-se
investir prioritariamente em recursos laboratoriais (equipamento e principalmente mo-
de-obra) para a implantao do controle.
Interpretao dos parmetros do laboratrio
Uma vez atingida a capacidade adequada de produo de lcool, ou seja,
estabelecido o nvel desejado de produtividade, h necessidade de maximizar o
rendimento fermentativo.
Da experincia prtica temos verificado que:
- quando aumentar o ndice de acidez produzida, o rendimento cai. Normalmente este
aumento est associado infeco;
- das anlises microscpicas, o parmetro mais importante o ndice de viabilidade,
porm, o mais til o teor de leveduras vivas (que se encontra multiplicando a
viabilidade pelo teor de levedura). H evidencia de que quando o teor de levedura viva
diminui, aumenta o tempo de fermentao. A queda neste ndice (teor de levedura
viva) est associada nutrio (carncia de nitrognio), temperatura elevada (esta
reduz a velocidade de reproduo e aumenta a taxa de morte) e principalmente ao
teor alcolico, pois altos teores elevam inibio e morte de leveduras,
principalmente, se associados a temperatura elevada. O ndice de produo de
leveduras tambm se correlaciona com o tempo de fermentao e o rendimento,

sendo que quedas substanciais podem estar associadas tambm a produtos inibidores
no mosto ou nos nutrientes.
- em fermentaes contnuas bastante raro ndices de converso de acares
inferiores a 95%. Assim, caso seja constatado sobra de acar inferior a 5%, deve-se
procurar srias falhas de operao, por exemplo, turbinagem de dornas vivas,
viabilidade muito baixa, pH de tratamento cido muito varivel, etc.;
- perdas de fermento superiores a 10% em geral causam reduo de produtividade e
rendimento embora sejam menos importantes que a queda de viabilidade;
- as anlises microscpicas, realizadas, podem detectar alguma tendncia floculao
e neste caso deve-se agir rapidamente para o seu controle com algumas medidas:
reduo do pH do tratamento cido para 2 2,2 ou at 1,8; regenerao aerbia do
fermento; substituio da fonte nitrogenada por nitrognio orgnico; reduo do Brix
do mosto, em 20 30%; reduo das perdas de fermento atravs de homogeneizao
das dornas com aerao antes da turbinagem e controle eficiente da centrifugao;
- sempre que possvel, deve ser estimada a carga trmica que est sendo
efetivamente retirada, o que se pode fazer conhecendo-se a vazo de gua e as
temperaturas de entrada e sada. A reduo na carga trmica para uma mesma
produo, implica obrigatoriamente em aumento da temperatura de fermentao e em
reduo do rendimento. Em geral a reduo na carga trmica est associada
formao de incrustao (orgnica) do lado da gua;
- aumentos no consumo de antiespumantes em geral, refletem variaes no teor de
polissacardeos e/ou protenas no mosto, devidos prpria cana ou ao pr-tratamento
do caldo. Muita ateno deve ser prestada ao ponto de aplicao do produto
antiespumante.
A flotao de leveduras na espuma em geral est associada floculao. A presena
de slidos insolveis como argila e bagacilho tendem a estabilizar a espuma,
aumentando o consumo de antiespumantes.
Critrios de dimensionamento da fermentao alcolica
Dornas
O volume total de dornas deve ser suficiente para atender mxima produo de
lcool projetada, considerando o tempo do ciclo, que a soma do tempo de
fermentao (a includo o tempo de alimentao), do tempo de ps-fermentao
(tempo de espera para incio da turbinagem), do tempo de turbinagem (descarga), do
tempo de limpeza, do tempo de tratamento cido (que pode ser reduzido a um mnimo,

com o uso de fermentos adicionais ou do tratamento cido contnuo) e do tempo d
descarga do p-de-cuba.
No volume das dornas, deve estar previsto tambm espao para o gs preso (hold
up), espao para controle da espuma e considerado o espao ocupado por eventuais
acessrios como serpentinas de resfriamento. Pode-se considerar 95% de
aproveitamento do volume da dorna como um bom valor.
Se considerarmos um teor alcolico mnimo de 8GL (onde a produo mxima) ter
para a produo de 1m
3
de lcool (a 100%, 20C):
3
5 , 12
08 , 0
1 1
. . . m
GL
turbinado vinho de volume
VT
o
= = =
Supondo que na produo mxima teremos um teor de fermento no vinho de 10%, um
teor de fermento de 1% no vinho turbinado e 50% de fermento no leite, o volume de
vinho (antes das turbinas) necessrio ser:
VT VT VT turbinado vinho X
F F
F F
vinho
VT L
VT L
225 , 1
40
49
0 , 10 50
1 50
. . = =
=
Portanto, para produzir 1m
3
de lcool (100%, 20C), ser necessrio um volume de
vinho de:
3
31 , 15 5 , 12 225 , 1 m x vinho = =
Se o tempo de um ciclo for de 10,5 horas, cada dorna funcionar:
dia
vezes
286 , 2
5 , 10
24
=
Portanto, o volume necessrio de dornas ser:
dia lcool m
dornas
m
x
dornas de volume
/
05 , 7
95 , 0 286 , 2
31 , 15
. .
3
3
= =
Para uma fermentao no otimizada, o tempo do ciclo pode chegar a 14,0 horas, que
necessitaria de um volume de dornas de:
dia lcool m
dornas
m
x
dornas de volume
/
4 , 9
95 , 0
14
24
31 , 15
. .
3
3
= =
No caso geral:
dorna ocupao
x
ciclo tempo
x
F F
F F
x
GL
dornas de volume
V L
VT L
V
o
.
100
24
. 100
. .
=
Onde:
tempo ciclo= tempo fermentao + tempo ps-fermentao + tempo turbinagem +
tempo espera e,

tempo espera= tempo tratamento + tempo de descarga p-cuba e,
ocupao dorna= 92 98%.

Este volume, como calculado acima, no inclui a dorna volante e deve ser dividido em
um nmero mnimo de dornas, evitando-se dornas muito grandes, que levam a um
tempo de turbinagem muito longo e dificuldades de homogeneizao, nem dornas
muito pequenas que aumentam muito o nmero de operaes manuais ou
automticas, sujeitas a erro como: alimentao, descarga, controle de adio de
antiespumantes, limpeza, controle de presso, etc.
No caso acima, se esta instalao pretendesse produzir 350 m
3
lcool anidro/dia
(mximo) teramos:
3
468 . 2 05 , 7 350 . . . m x dornas de total volume = =
3
411
6
468 . 2
. m individual volume = =
Considerando mais uma dorna como volante, deveriam ser instaladas 7 dornas de
volume em torno de 400 m
3
. O tempo de turbinagem ser aproximadamente 1 hora e
50 minutos, que um valor razovel.
Resfriamento de dornas
Os equipamentos de troca de calor tm que ser acoplados s dornas tendo em vista
que o processo altamente exotrmico.
O balano entlpico em torno de uma dorna mostra que a entalpia a ser retirada a
diferena entre a gerada e a absorvida pelo mosto e pelo p-de-cuba, subtrada a
entalpia retirada pela evaporao de gua e lcool. Assim, o dimensionamento do
sistema de resfriamento passa obrigatoriamente pelo conhecimento das temperaturas
do mosto, p-de-cuba e evidentemente da gua de resfriamento.
Quanto maior forem as temperaturas do mosto e do p-de-cuba, maior ser a
temperatura mxima a ser atingida na fermentao para um dado trocador e uma dada
vazo de gua fria ou maior ter de ser a vazo de gua para manter a temperatura
mxima constante.
O calor total desprendido igual massa de ART fornecida multiplicada pela entalpia
lquida da reao, que pode ser aproximadamente a 150 Kcal/kg ART. Deste total
aproximadamente 8% perdido como evaporao de gua e lcool, o restante elevar
a temperatura do mosto e p-de-cuba at o valor de controle e ento o trocador de
calor manter a temperatura neste valor.
Por exemplo, no caso acima temos:

- 400 m
3
de vinho, dos quais: 140 m
3
so p-de-cuba e 260 m
3
de mosto;
- temperatura do p-de-cuba: 27C;
- temperatura do mosto: 30C.
Neste caso, cada dorna receber 45,9 tons ART, que corresponder uma carga
trmica liberada de:
kcal x x T C 200 . 334 . 6 92 , 0 000 . 150 9 , 45 . . = =
O mosto absorver:
kcal x x mosto 000 . 417 . 1 ) 30 35 ( 09 , 1 000 . 260 = =
O p-de-cuba absorver:
kcal x x cuba de p 600 . 153 . 1 ) 27 35 ( 3 , 1 000 . 140 = =
Resultando em uma carga trmica total a retirar de:
kcal R C 600 . 763 . 3 600 . 153 . 1 000 . 417 . 1 . . = + =
Se 2/3 desta carga liberada no perodo de enchimento, que neste caso prximo de
2 horas, o trocador dever retirar:
kcal
x
x
533 . 254 . 1
2 3
600 . 763 . 1 2
=
Um trocador, instalado nesta dorna e que pode ser compartilhado com outro, teria uma
equao de funcionamento como a seguir:
T UxAx ou T UxAx Q = = 533 . 254 . 1 . ,
Para U=3.500 kcal/m
2
x h x C e T =3,5C (trocador a placas),
2
4 , 102
5 , 3 500 . 3
533 . 254 . 1
m
x
A = =
Como so seis dornas poderia ser comprados 3 trocadores de calor com uma rea
total de 307,2 m
2
.
Neste caso a relao rea de trocador/produo lcool fica em 307,2/350=0,88 m
2
/m
3

de lcool por dia.
Neste mesmo caso, seria impossvel manter a mesma temperatura mxima com
serpentinas, pois teria de ser instalada uma rea de:
2
1 , 896
5 , 3 400
533 . 254 . 1
m
x
= , ou,
2
24 , 2
400
1 , 896
m = serpentinas/m
3
dorna. A mxima rea
instalada de serpentinas ( em dornas de at 300 m
3
) de 1,0 m
2
/m
3
, que j causa
problema na limpeza. Ainda neste caso (por absurdo) seria necessrio adquirir
6x896,1m
2
=5.376,6m
2
de serpentinas (15,4 m
2
/m
3
lcool por dia), que custaria muito
mais que o conjunto de 3 trocadores de calor a placas.

Centrfugas de fermento
Para produzir 1 m
3
de lcool (100GL, 20C) necessrio processar um volume de
vinho de:
VT L
VT L
F F
F F
vinho
=
Este volume, acrescido da reserva de vazo necessria para permitir limpezas
freqentes, a capacidade operacional das centrfugas que devem ser instaladas,
sempre considerando a mxima produo, no mnimo teor alcolico.
Para definir o nmero de unidades a serem adquiridas, considerar o mximo teor de
fermento no vinho, pois quanto maior este teor, menor a capacidade individual de cada
mquina, mantida a eficincia.
Vazo centrfugas (m
3
/h)=produo horria x
utilizao
x
GL
x
F F
F F
vinho
o
VT L
VT L
%
100 100
=
A porcentagem de utilizao situa-se entre 90 a 95%, dependendo do tipo de
centrfuga, do teor de slidos insolveis, no leveduras no vinho, ou seja do tempo e
da freqncia de limpeza.
Para o exemplo acima, correspondendo a uma produo mxima de 350 m
3
/dia
(14,58m
3
lcool/h) e um teor alcolico correspondente de 8GL, com uma ocupao de
92,5%, a vazo a ser instalada de:
h m x x x / 3 , 241
5 , 92
100
8
100
10 50
1 50
58 , 14
3
=

Se o teor de fermento no vinho for maior, digamos 20%, mantido 50% no leite,
teramos uma capacidade de:
h m x x x / 8 , 321
5 , 92
100
8
100
20 50
1 50
58 , 14
3
=

Por outro lado se for possvel manter um teor de fermento no leite substancialmente
maior, por exemplo, 70%, ficaramos com:
h m x x x / 9 , 271
5 , 92
100
8
100
20 70
1 70
58 , 14
3
=

Finalmente, dependendo da flexibilidade desejada e das condies do vinho (slidos
no leveduras) devem ser instaladas entre 240 e 320 m
3
/h ou entre 3 a 4 mquinas
com capacidade efetiva de 80 m
3
/h cada uma.

Tratamento do fermento p-de-cuba
O volume necessrio de p-de-cuba, depende do volume de leite gerado, da diluio
desejada, do nmero de dornas processadas por dia e finalmente, do tempo de
tratamento desejado.
Para o tratamento convencional (batelada) so necessrias 1,75m
3
cubas/m
3
lcool
por dia, divididos em 4 cubas. No exemplo, para a produo de 350m
3
lcool por dia, o
volume total de cubas seria de 612,5m
3
ou 153,0m
3
em cada cuba. Se o volume
ocupado for de 150m
3
, seria possvel uma diluio de 1:1. Diluies maiores exigiriam
matrias-primas concentradas e evidentemente maiores cubas.
O uso do tratamento cido contnuo permite operar com 1,3m
3
cubas/m
3
lcool por dia
(economia de 25% no volume) podendo-se dividir o volume total em 3 cubas.
PERDAS DURANTE O PROCESSO
Desde o preparo do solo para o plantio da cana at o carregamento do caminho de
lcool pode-se perder acar e/ou lcool. A otimizao de cada etapa do processo de
produo de lcool condio prioritria para se obter altos rendimentos em litros de
lcool por hectare. A origem das perdas pode ser de natureza no microbiolgica, mas
via de regra, microbiolgica.
De todas as etapas da produo de lcool, existem duas onde as variaes no
rendimento so bem maiores que as outras: ART (acar total) por hectare e
fermentao alcolica. Encontramos locais onde a produo de cana por hectare de
40 tons e em outros, 120 tons/h. Por outro lado a variao mdia anual do AART na
cana de destilaria para destilaria pode variar de 13.5 ART% cana 18,0 ART% cana
(30% de variao). Na fermentao, caso semelhante pode ocorrer, pois fermentaes
infeccionadas ou com muita perda de fermento podem chegar a rendimentos de 70%
ou menos, enquanto que se houverem bons equipamentos, e a operao for bem
conduzida, este rendimento pode ir alm dos 90% (22% de variao). Nas outras
fases do processo de produo de lcool, como corte, transporte, ptio, barraco,
extrao, filtro rotativo, destilao e indeterminadas, muito difcil chegar nesta
variao que encontramos com certa facilidade em acar/h e rendimento
fermentativo.
Sem dvida, muito importante para se avaliar as perdas, mtodos acurados no
laboratrio industrial, e claro, a partir de amostragens bem feitas na indstria.

Qualidade da cana-de-acar
A produo de acar por hectare de responsabilidade do setor agrcola, portanto,
qualidade da cana para a fermentao significa nvel microbiolgico ou sanidade da
cana, pois este aspecto pode afetar significativamente o rendimento fermentativo e a
produo e qualidade do acar. Por outro lado, terra na cana, alm de desgastes de
equipamentos por corroso, traz para a indstria mais bactrias.
Lavoura
A indstria pode se preparar da melhor maneira possvel com todo o equipamento, o
mais moderno, e com todo o biocida que quiser, mas tudo isso vaia penas diminuir
percentualmente a contaminao que a cana est trazendo. Eliminar a infeco,
esterilizar o caldo, impossvel com as atuais tecnologias disponveis; nota-se ento a
importncia da qualidade da matria prima. Cana brocada, cana com terra e cana
plantada em solo que recebeu vinhaa, traz mais bactrias para a indstria. A broca
alm de trazer infeco diminui o teor de acar na cana, portanto o prejuzo
dobrado.
A cana picada deve ser moda diretamente assim que chega indstria, pois devido
grande superfcie em contato com o ambiente, terra, etc., esta cana se infecciona com
mais facilidade e a destruio de acar grande. Uma parte do acar
transformada em lcool e cido ltico que saem no caldo e parte do lcool
evaporado.
A tabela abaixo mostra a evoluo de bactrias, leveduras e seus produtos em uma
cana cortada e deixada na lavoura.
Tempo (horas) Levedura
contaminante
Bactrias
(bastonetes)
Pol (%) Acidez lcool (%)
NQ 1,4X10
5
16,5 0,45 0
NQ 2,7X10
7
7,1X10
5
16,2 0,42 0
12 8,9X10
7
5,7X10
5
16,0 0,67 0,01
24 1,4X10
8
5,7X10
5
17,3 0,85 0,04
36 5,4X10
7
1,3X10
6
16,4 0,80 0,04
48 5,7X10
7
3,6X10
5
16,2 0,86 0,08
60 1,0X10
8
8,6X10
5
16,6 0,78 0,11
72 1,2X10
8
1,4X10
6
17,6 0,78 0,11
NQ=no queimada

bom notar que neste ensaio no choveu, pois a infeco seria maior se a umidade
tambm fosse maior. Como se pode observar, a determinao do teor alcolico no
caldo um parmetro importante na determinao da deteriorizao da cana.
Portanto, quanto mais rpido moer a cana depois do ateamento do fogo no canavial,
menos se perde em acar.
O aumento da POL no significa que a cana no perdeu acar, pois perdeu, e
tambm perdeu gua. Na realidade o acar total decresceu embora a concentrao
tenha se elevado devido perda de gua por evaporao.
Pode-se notar tambm que a cana queimada j inicia com uma contagem
microbiolgica bem maior que a no queimada.
No campo, o desenvolvimento dos agentes contaminantes pode ser controlado atravs
de um bom programa fitossanitrio da cultura, bem como atravs de uma adequao
das operaes de queima, corte e transporte, e as condies operacionais da
indstria. Um bom manejo dos barraces e ptios de cana tambm so fatores
importantes no controle do aumento da populao bacteriana. Por outro lado, na
indstria, o desenvolvimento dos agentes contaminantes pode ser controlado atravs
de meios que impeam a sua multiplicao ou que provoquem a destruio dos
mesmos. Isto pode ser conseguido por ao de meios fsicos, qumicos ou de ambos.
Carregamento, transporte e recepo
O carregamento da cana pode trazer muita terra, e esta terra tem um efeito grande na
indstria, pois traz infeco e aumenta a corroso nas moendas, bombas, exaustores
das chamins, etc. No caminho, a terra se localiza principalmente na parte de baixo,
pois com a trepidao, ela desce.
Nos Hilos, no descarregamento dos caminhes, as canas que caem devem ser
imediatamente retiradas, pois seu amassamento provoca uma multiplicao bacteriana
significativa, fora a perda de acar por esmagamento.
Armazenamento: ptio e barraco
Os dois tipos de armazenamento da cana tm suas vantagens e desvantagens, mas
em termos de perda de acar e aumento de infeco, o ptio mais susceptvel.
No ptio se amassa mais cana, esta cana amassada, alm de perder acar, ela se
infecciona e leva esta infeco para a moenda e para toda a fbrica. Dados da Usina
da Pedra, detalharam bem as perdas de ART. Com base em 20,78% da cana
desviada para o ptio e 35,3% lavada direta na mesa, as concluses foram que as
mquinas no ptio destroem 1,21% do acar correspondente da cana que passa pelo

ptio, ou 0,25% do total que entrou na Usina; a gua de lavagem arrasta 1,21% do
acar que passa no ptio e 1,29% na mesa, totalizando 0,70% do total que entrou na
Usina; como a cana chega com amassamento transversais e longitudinais da lavoura,
h uma perda de acar a mais na lavagem dessa cana. No ptio e na mesa
representam 0,47% e do acar total entrado, 0,26%.
Resumindo, as mquinas contribuem com 0,26%, a lavagem 0,70%, a lavoura 0,26%
da perda do acar total que entrou na Usina da balana at a esteira alimentadora,
totalizando 1,21%.
Lavagem
Na maior parte das usinas e destilarias, se a cana no for lavada, o desgaste da
moenda, tubulaes, bombas, quebra de decantador, qualidade do produto so
fortemente afetados. Entretanto, se um bom trabalho for feito na parte agrcola,
acreditamos que se possa moer a cana sem lavar. Algumas usinas tm trabalhado
assim. Se o investimento que tem que ser feito nas indstrias se paga, no sabido.
Cada caso um caso, pois o tipo de solo vai influenciar muito.
A quantidade de acar que se perde na cana quando esta lavada, varia de acordo
com o tipo de corte da cana, e tambm da maneira que a cana estocada, ptio ou
barraco. A quantidade de gua que lava a cana no parece afetar significativamente
a perda (acima de 3m
3
/ton) pois a quase totalidade do acar que lavado o que
est na superfcie da cana ou do corte. A cana inteira de ptio perde cerca de 25%
mais acar na lavagem do que a cana de barraco pois aquela mais esmagada. A
cana inteira perde cerca de 0,8 a 1,7% do acar que ela contm. Em mdia, perde
cerca de 1,25%. A cana picada perde de 1,0 a 3,0%, dependendo do tamanho do
tolete. Quanto maior, menor a perda. A cana amassada pode perder at 15% do ART
original da cana.
Preparo e extrao
No preparo da cana (facas e desfibrador), o objetivo extrair mais acar na moenda.
Entretanto, se no tomarmos cuidado, pode-se perder mais acar neste preparo e na
extrao do que imaginamos.
No preparo, se as facas no estiverem bem amoladas e no desfibrador os martelos
no estiverem tambm acertados, h um amassamento grande da cana e o caldo
desta cana cai na esteira que lavada posteriormente. Esta gua geralmente vai se
juntar gua de lavagem da cana. Por outro lado, a cana desfibrada que fica aderente
esteira, retirada por ventiladores ou escovas, e assim caem novamente na esteira

rpida e so levados moenda. A quantidade de cana desfibrada que fica na estira, e
o caldo de cana amassada pelas facas e desfibrador pode ser significativo,
dependendo das condies dos mesmos. Medies efetuadas em cinco usinas e
destilarias evidenciaram que esta perda variou de 0,1 a 0,5% do ART da cana. Houve
um caso, durante um dia, onde o ventilador da esteira parou por defeito no motor, o
arraste de cana desfibrada elevou a perda na gua de lavagem da cana de 1,3 para
2,5%, portanto cerca de 1,0% do acar da cana foi perdido somente na esteira.
A moenda um dos grandes focos de infeco da indstria quando esta no tratada
convenientemente, e necessrio lavagem de 3 em 3 horas com jato de gua quente.
Pode-se controlar a infeco na moenda com uma boa assepsia com gua e biocida,
apenas quando a cana j vem infeccionada (acima de 5x10
6
bastonetes/ml) ou quando
a contagem do caldo misto acima do dobro da contagem do caldo primrio, e no se
conseguir diminuir a infeco somente com gua. Os biocidas aconselhados para
moenda, so os baseados em amnia quaternria, que devem ser usados em
dosagem por um perodo de 15 minutos com concentrao em torno de 100 ppm,
portanto dosa-se 15 minutos (tempo de residncia do caldo nas moendas), parando
pelo restante da hora; reiniciando na hora seguinte, durante todo o dia.
Caldo e mosto
Aquecimento e decantao
Polmico por muitos anos, o tratamento do caldo por decantao tem conseguido mais
adeptos a cada ano que passa. O medo de se perder elementos importantes para a
fermentao no processo de decantao, a perda de ART no filtro, o custo do
decantador e filtro, fizeram que muitas destilarias fossem montadas sem este sistema.
Atualmente no h dvida que o decantador e filtro se pagam rapidamente. A
diferena em rendimento significativa. Entretanto, algumas dvidas ainda persistem
em algumas destilarias, devido ao fato de que ter decantador e filtro no significam a
priori alto rendimento na fermentao, pois se o sistema de refrigerao das dornas e
do mosto no forem adequados, ou por falta de rea de troca trmica ou por
deficincia de gua, ou ainda se a decantao for mal feita, o rendimento da
fermentao no poder ser bom. Portanto, uma destilaria sem decantador pode at
ter rendimento maior do que uma com decantador, pois alm do equipamento ainda
vai depender da operao. Entretanto, a decantao bem feita elimina terra, bagacilho
e diminui a infeco bacteriana e de leveduras contaminantes. O gasto com

antiespumantes bem menor, assim como o gasto com cido sulfrico quando o caldo
decantado.
A terra e o bagacilho do um desgaste grande nos bicos das centrfugas, que no
conseguem concentrar o fermento. Com isto, h um maior retorno de vinho para a
cuba, se gasta mais cido para manter o pH desejado, a viabilidade do fermento
diminui e o tempo de fermentao aumenta.
Ao contrrio dos desgastes dos bicos, existe o entupimento, que faz perder fermento
pois h que parar as centrfugas com muita freqncia para limpeza, e se quiser
manter a produo, tem que se forar as outras mquinas, com as conseqncias
desagradveis que todos sabem: o creme no concentra, h maior gasto de cido, etc.
A maior diferena em rendimento entre uma destilaria com e sem decantador, na
poca que chove, pois a terra que acompanha a cana realmente afeta toda a
fermentao.
Uma conseqncia do no aquecimento do caldo, e que j foi constatado foi a
infeco com levedura contaminante (no Saccharomyces). Sem aquecimento do
caldo, impossvel evitar.
Quanto a precipitao de nutrientes, na decantao realmente h, mas s que para
fermentao no necessrio fazer calagem muito forte como para o acar. Um pH
de no mximo 5,8 suficiente para decantar bem na maior parte do tempo. Em vrias
destilarias no se usa cal 90% do tempo. O fsforo vai se precipitar significativamente
somente a pH acima de 6,0, assim como o zinco. Se for necessrio, entretanto, fica
mais barato colocar um pouco de fsforo e zinco do que no ter decantao.
O uso excessivo da cal e enxofre na clarificao do caldo para acar pode afetar
negativamente a fermentao. O excesso de cal faz diminuir a absoro de magnsio
e na clarificao, precipita o fsforo e o zinco principalmente, e o cobre e o mangans
tambm, a aumentam a produo de glicerol, abaixando o rendimento fermentativo. O
enxofre que vai produzir o sulfito com a combinao com o oxignio, tanto mais
txico para a levedura, quanto menor o pH. O sulfito faz a levedura produzir mais
aldedo actico, que na coluna A, com o aquecimento se oxida a cido actico, e ir
aumentar a acidez do lcool.
Quanto a perda de ART na torta de filtro das destilarias autnomas, a mdia foi de
0,42% do ART da cana, enquanto algumas boas operaram com 0,20%. preciso ter
cuidado para interpretar esta perda quanto ao real prejuzo para a indstria, pois as
vezes uma perda baixa na torta devido a m decantao, e a sujeira vai toda para a
destilaria. Impureza no mosto afeta negativamente o rendimento da fermentao.

A perda de ART no aquecimento do melao ocorre principalmente nos dias frios, no
preparo do mosto. A degradao do acar produz cidos orgnicos, o que promove o
aumento da acidez, melanoidinas, que conferem cor escura, alm de outros produtos,
que alm de refletir em perdas de acar, so txicos para a levedura.
Resfriamento do mosto
Um soa fatores crticos para o rendimento fermentativo a temperatura da
fermentao. A temperatura do mosto afeta diretamente a temperatura mxima da
fermentao, que por sua vez afeta negativamente o rendimento da fermentao,
quando se eleva alm do timo.
O rendimento afetado por dois motivos. Se a temperatura for acima de 35C, h um
efeito direto em aumentar a toxidez exercida pelo lcool levedura, e o outro motivo
indireto, propiciando a proliferao bacteriana. Fundamental, , portanto, resfriar o
mosto para se controlar a temperatura da dorna ao redor de 33 35C, o que s vezes
pode no ocorrer. As causas do descontrole da temperatura na fermentao so
devidas principalmente a erros de projeto no sistema de refrigerao das dornas.
Usam-se taxas de fermentao de vinte anos atrs, onde o tempo de fermentao era
de 18 a 20 horas. Hoje, temos que considerar tempo de fermentao de 4 a 6 horas
para que possamos calcular a demanda de gua e superfcie de troca.
Fermentao
A fermentao a fase da produo de lcool mais importante e h que ser
monitorada com muita preciso e bom senso, pois pode ser afetada pelos fatores
fsico-qumicos do meio, bem como pelos microbiolgicos, no tocante s leveduras e
bactrias.
Quanto as perdas de lcool por evaporao na fermentao, estas podem variar de
0,4 a 2,0% do lcool produzido dependendo do teor alcolico da dorna e da
temperatura. O fechamento das dornas e a recuperao do lcool se pagam em
menos de uma safra, se o projeto for bem feito e executado.
Centrifugao
A introduo das centrfugas na fermentao foi um marco histrico em termos de
rendimento, pois elas permitem usar o mesmo fermento para vrias fermentaes, e
se a centrifugao for eficiente, a concentrao de fermento na dorna se eleva e a
fermentao fica mais rpida, e menos sujeita infeco. A economia com o volume
de dornas de fermentao tambm grande.

O desempenho das centrfugas fator primordial para se obter altos rendimentos.
Um bom desempenho significa concentrar o leite ou creme o mais que puder (70
80%) e perder no vinho centrifugado o mnimo que puder (0,05 0,1% de
concentrao de levedo) ou cerca de 5% do fermento da dorna. Se a temperatura
mxima da fermentao no ultrapassar os limites j citados, e no houver problemas
de infeco, em poucos dias, dependendo da composio mineral do mosto, haver
excesso de fermento na dorna. Da ser necessrio sangrar.
Tempo de aproveitamento
Nas paradas longas, muitas horas ou dias, h lixiviao de sais da levedura para o
meio, e as reservas so queimadas. Quando se inicia a fermentao, o acar
desviado principalmente para refazer as reservas da levedura, produz mais glicerol e
depois vai fazer lcool.
O tempo mdio de espera na cuba de tratamento pode afetar o rendimento da
fermentao. Quanto maior o tempo, menor o rendimento. Acontece, porm, que se h
infeco, necessrio pelo menos duas horas de tratamento para que o cido faa o
efeito desejado. Hoje, com antibiticos de alto espectro, como o Kamoran, se deixa o
fermento at 4 5 dias (sempre sem cido) em condies adequadas conservao.
As paradas de um ou dois dias por chuva ou falta de cana afetam significativamente o
rendimento da fermentao. As paradas afetam at a extrao. A variao na queda
do rendimento nas pararas vai depender do preparo e conhecimento da equipe.

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