Trabajo Prctico de Biologa

Celular



Objetivo General:

Reconocimiento de estructuras subcelulares
mediante transfeccin de protenas
fluorescentes e inmunocitoqumica

Inmunocitoqumica: se emplean anticuerpos
para detectar y localizar antgenos especficos
en clulas tejidos (Inmunohistoqumica).
Transfeccin: proceso por el cual un gen de
inters es introducido dentro de la clula
eucariota por mtodos qumicos fsicos.

GFP-PTP 1B DA
VINCULINA
Manipulacin de clulas en cultivo:
Aporte Requerimientos
MEDIO DE CULTIVO
Nutrientes

SUERO
Estimulo proliferativo y
adhesivo
ANTIBIOTICO Prevencin de contaminaciones,
seleccin
SUPLEMENTO Estimulo especifico
*hormonas
*Factores de crec.
*penicilina
*estreptomicina
*gentamicina
*glucosa (fuente de C)
*aminocidos (fuente de N)
*cofactores enzimticos
*vitaminas
*sales
*Transferrina
*Albumina,
*Factores de crec.
*Factores de anclaje
Composicin
1) MEDIO DE CULTIVO
BUFFER
Mantiene el PH
*Bicarbonato
*Indicador: Rojo Fenol
2) FACTORES FISICOQUIMICOS
PH: 7.2-7.5
OSMOLARIDAD : 280-320mOsmol/kG
CO
2
: 2-5 %
TEMPERATURA: 35-37 C
3) ESTERILIDAD
1) Manipulacin de clulas en flujo laminar
2) Exposicin de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15 antes de empezar a
trabajar
3) Todo el material usado debe estar estril
* por autoclavado (120 C, 1 atm, 20) en el caso de tips, frascos,
eppendorfs, pipetas, etc.
* por filtracin (poro de 0,2M) en el caso de medio (antes del
agregado de SFB y antibiticos), buffers, agua, etc.
4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol
70%

Inmunocitoqumica
- Fijacin

- Permeabilizacin

- Bloqueo

- Tincin con anticuerpos
- Inmunocitoqumica directa
- Indirecta
Fijacin
Preserva la morfologa celular y la localizacin y estructura de los antigenos.
Glutaraldhedo Paraformaldhedo Metanol/Acetona
Modo de accin
Por puentes entre grupos
aminos de las protenas
Por puentes entre grupos
aminos de las protenas
Por precipitacin de
protenas y carbohidratos
Uso mas frecuente
Microscopia electrnica
y algunos estudios de
fluorescencia
Ampliamente usado para
estudios de fluorescencia e
inmunocitoqumicos
Gran variedad de estudios

ventajas/
desventajas
*provee la mayor
preservacin de la estructura
fina
*es el mas severo de los
fijadores
*en gral. Altera los
epitopes
*provoca fluorescencia
inespecifica
*produce menor
autofluorescencia que el
gluteraldhedo
*menor cantidad de puentes
que el glutaraldhedo
*penetra mas rpidamente
dentro de la clula.
*fijacin mas rpida que el
aldhedo
*frecuentemente altera el
patrn de localizacin de
antgenos
*Fija y permeabiliza
* antgenos solubles pueden
perderse
*contraccin de la muestra
Inmunocitoqumica
- Fijacin

- Permeabilizacin

- Bloqueo

- Tincin con anticuerpos
- Inmunocitoqumica directa
- Indirecta
Permeabilizacin
Produce poros en las membranas celulares
Permite la entrada de los anticuerpos a la clula
No es necesario si se quiere detectar antgenos
expuestos en la cara exoplsmica de la
membrana plasmtica o de matriz extracelular
Se utilizan generalmente detergentes no inicos
Permeabilizacin
Micela de detergente en agua
Ruptura de la membrana por detergente
Inmunocitoqumica
- Fijacin

- Permeabilizacin

- Bloqueo

- Tincin con anticuerpos
- Inmunocitoqumica directa
- Indirecta
Bloqueo
En general se utiliza BSA (Sero-albmina bovina)
Su funcin es evitar interacciones
inespecficas de los anticuerpos
Inmunocitoqumica
- Fijacin

- Permeabilizacin

- Bloqueo

- Tincin con anticuerpos
- Inmunocitoqumica directa
- Indirecta
Tincin con Anticuerpos

Los anticuerpos son protenas que tienen la
capacidad reconocer y unirse especficamente y
con alta afinidad a otras protenas .

La molcula que induce la produccin de
anticuerpos y a la stos se unen se denomina
antgeno.

Cada antgeno suele presentar varios
determinantes antignicos o epitopes.
Anticuerpos
Anticuerpos producidos por
diferentes clones de linfocitos
Mezcla heterognea de anticuerpos,
reconocen distintos epitopes de
un mismo antgeno.
Policlonales
Monoclonales
Anticuerpos producidos por
un nico clon de linfocitos
Poblacin de anticuerpos homogneos,
reconoce un nico epitope del anticuerpo

Anticuerpos policlonales
Separar el
suero
Purificacin
de
anticuerpos
Conejo, cabra, oveja, etc.
Anticuerpos monoclonales

Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por
fusin con clulas de mieloma de ratn.

Las clulas fusionadas (hibridomas) producirn
inmunoglobulinas idnticas a las que produca el
linfocito B normal parental y es inmortal como el
mieloma que le dio origen.
Anticuerpos monoclonales
Clulas productoras de
anticuerpos
Fusin
Hibridomas
Produccin de anticuerpos monoclonales
Anticuerpos monoclonales

Alta especificidad, reconocen un nico epitope.

Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con
las mismas caractersticas.

Mayor costo que los sueros policlonales.


Csar Milstein (Baha Blanca, 8/10/1927 Cambridge, 24/3/2002)
Premio Nobel de Qumica 1984
Inmunocitoqumica
- Fijacin

- Permeabilizacin

- Bloqueo

- Tincin con anticuerpos
- Inmunocitoqumica directa
- Indirecta
Clulas fijadas, permeabilizadas y bloqueadas
Inmunofluorescencia directa
Anticuerpo fusionado
a un fluorforo
Inmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo primario (IgG)
anti-tubulina (producido en conejo)
anti-vinculina (producido en conejo)
Inmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo secundario
(anti IgG de conejo)
Anticuerpo primario (IgG)
anti-tubulina
anti-vinculina
Fluorforo
Clulas fijadas, permeabilizadas y bloqueadas
Inmunofluorescencia indirecta

Microscopio de
fluorescencia
Inmunofluorescencia
DIRECTA INDIRECTA
Anticuerpo marcado
con fluorforo
primario secundario
Ventajas
Mayor sensibilidad
El anticuerpo secundario puede ser
usado para localizar cualquier
anticuerpo primario producido en el
mismo animal para el cual fue hecho
el secundario
Acorta tiempos de
incubacin
ANTICUERPO PRIMARIO
CLULAS EN MONOCAPA
TRANSFECCIN
FIJACIN
(paraformaldehdo )
PERMEABILIZACIN
ANTICUERPO SECUNDARIO
LAVADOS
BLOQUEO
ANALISIS POR
MICROSCOPIA
DE FLUORESCENCIA
TP INMUNOCITOQUMICA
ACTINA
ACTINA/NUCLEO/RETICULO
VINCULINA/NUCLEO/RETICULO
MICROTUBULOS/NUCLEO/VESICULAS