Manual de Prácticas Del Laboratorio de Biorreactores2

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIORREACTORES
MANUAL DE PRCTICAS

M. EN C. DYNORA VZQUEZ GURROLA
M. EN C. CARLOS OROZCO LVAREZ
M. EN C. LEOBARDO ORDAZ CONTRERAS
DR. SERGIO GARCA SALAS

AGOSTO, 2007.
Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prcticas

Vzquez Gurrola, Orozco lvarez, Ordaz Contreras, Garca Salas

2
PRESENTACIN

La Biotecnologa, concebida como la aplicacin del conocimiento para la obtencin de
productos y servicios mediante el uso de seres vivos o enzimas, hace necesaria la
participacin de profesionales que posean capacidades y habilidades para la operacin
y control de biorreactores. En ellos es en donde los seres vivos o enzimas llevan a cabo
las transformaciones de materias primas a productos.

Este manual de prcticas del Laboratorio de Biorreactores se centra en el desarrollo de
habilidades de los alumnos para el manejo de equipos auxiliares e instrumentos
necesarios para la operacin y control de biorreactores, mediante la descripcin
funcional de los equipos, as como de la calibracin y uso de instrumentos. Tambin, el
manual se enfoca en que el alumno reconozca las diferencias del funcionamiento de
diversos tipos de biorreactores, mediante la determinacin experimental y comparacin
de sus parmetros hidrodinmicos, de transferencia de masa y de calor. As mismo, el
manual est diseado para que el alumno distinga el funcionamiento de cultivos en lote,
lote alimentado y continuo.

Este manual consta de diez prcticas de laboratorio. Cada prctica tiene una
introduccin, objetivos e instrucciones paso a paso para que el alumno alcance los
objetivos planteados. Tambin, tiene instrucciones para la recopilacin, anlisis y
discusin de los resultados obtenidos, as como para que el alumno haga un reporte
escrito del trabajo prctico realizado.

La prctica 1 est diseada para que los alumnos conozcan y distingan los diferentes
tipos de biorreactores que existen en la industria biotecnolgica. La prctica 2 tiene el
propsito de que los alumnos manejen sistemas de medicin y control de variables de


3
operacin de biorreactores. En la prctica 3 se revisarn los servicios auxiliares que son
necesarios para la operacin de biorreactores. En la prctica 4 se determinarn
parmetros hidrodinmicos como el tiempo de mezclado y el tiempo de circulacin en
biorreactores. La prctica 5 est diseada para que los alumnos aprendan a determinar
la velocidad de transferencia de oxgeno en biorreactores. La prctica 6 servir para
que los alumnos conozcan y aseguren la operacin asptica de biorreactores. En la
prctica 7 los alumnos llevarn a cabo un ciclo de esterilizacin de un medio de cultivo.
En las prcticas 8, 9 y 10 los alumnos realizarn diferentes formas de operar un
biorreactor con base en la alimentacin y descarga del medio de cultivo.

La apropiacin del conocimiento prctico de este curso por parte de los alumnos, les
facilitar la comprensin y el anlisis de los contenidos temticos de la asignatura de
Ingeniera de Biorreactores, situada un nivel adelante del Laboratorio de Biorreactores
en el plan de estudios de la carrera de Ingeniera Biotecnolgica.



4
CONTENIDO

Prctica 1. Presentacin de biorreactores diversos ......................................................... 5

Prctica 2. Instrumentacin para el seguimiento y control de la biorreaccin ............... 10

Prctica 3. Servicios auxiliares ...................................................................................... 26

Prctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores ......................................................... 38

Prctica 5. Transferencia de oxgeno en biorreactores agitados y neumticos ............. 48

Prctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores ................................................ 57

Prctica 7. Esterilizacin del sistema de biorreaccin ................................................... 64

Prctica 8. Produccin de biomasa en cultivo por lote .................................................. 75

Prctica 9. Produccin de biomasa en cultivo por lote alimentado ................................ 85

Prctica 10. Produccin de biomasa en cultivo continuo ............................................... 98



5
PRCTICA 1

Prctica 1. Presentacin de biorreactores diversos

Presentacin de
biorreactores
diversos

INTRODUCCIN

Cualquier proceso biotecnolgico de nivel industrial tuvo que haber pasado por las
siguientes escalas de operacin: laboratorio, planta piloto e industrial (en ese orden
temporal).

Cada escala tiene sus propias caractersticas y objetivos, mismos que sern tratados en
otra asignatura (Ingeniera de Bioprocesos), sin embargo, al hablar de biorreactores,
habr que hacer la distincin entre tamaos, forma de operacin y configuracin
geomtrica.

El biorreactor puede considerarse como el corazn de todo proceso biotecnolgico, ya
que en l se lleva a cabo la transformacin de la materia prima al producto de inters y
su operacin deber garantizar la maximizacin en la conversin, por lo que su


6
funcionamiento es de vital importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en
aquellos catalogados como de altos volmenes de produccin y bajo valor agregado.

Entre las caractersticas que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:
1. Calidad de mezclado; incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que
favorezcan tanto la distribucin de la materia prima en el biorreactor como su
conversin a producto.
2. Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con
economa aceptable.
3. Factibilidad tcnica y econmica en la construccin de unidades de gran
volumen.
4. Bajos costos de operacin y mantenimiento.
5. Operacin asptica.

Los biorreactores pueden clasificarse de la siguiente forma:

A continuacin se describe cada tipo de biorreactor.

Biorreactores agitados

Este tipo de biorreactor es muy empleado, en todas las escalas de produccin, en
laboratorios de investigacin o en la industria de fermentaciones, pueden utilizarse
incluso para fermentaciones de reologa compleja y en procesos en los que se exigen
Agitado
Columna
Biorreactores
Propelas
Airlift
J et
Circulacin


7
altas velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten de un cuerpo cilndrico
con tapas elipsoidales, semiesfricas o toriesfricas. Generalmente su relacin
altura/dimetro es menor a 3 y ms comnmente menor a 2. Cuentan con un motor al
que se acopla la flecha de transmisin que contiene a su vez los impulsores que
agitarn el lquido. Dependiendo del tamao del reactor, el motor puede colocarse en la
tapa superior o en la inferior, pero invariablemente se requiere de sellos mecnicos para
garantizar el trabajo asptico. Generalmente la aireacin se realiza a travs de tubos
(o placas) perforados, efectundose la dispersin del aire en las zonas cercanas a los
impulsores.

A pesar de su versatilidad, sus costos de construccin, operacin y mantenimiento son
muy onerosos. Por limitaciones tcnicas referentes a la transmisin de potencia y a los
problemas de sostenimiento del conjunto flecha de transmisin impulsores, no es
posible construir unidades mayores a los 300 m
3
.

Biorreactores de columna

Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisin mecnica para mezclar el
caldo de cultivo. El mezclado se realiza por la inyeccin de aire en el lquido desde el
fondo del recipiente, al dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la
turbulencia del lquido. Generalmente la relacin altura/dimetro es mayor a 3. Si las
columnas son grandes se pueden emplear platos perforados colocados en posiciones
intermedias de las mismas para redispersar las burbujas de gas.

Al carecer de partes mviles tanto la construccin, operacin y mantenimiento de este
tipo de biorreactores son ms econmicos que cualquier otro tipo. Quiz el mayor gasto
de operacin sea el de compresin de aire, en razn de los altos flujos requeridos.
Generalmente se emplean para fermentaciones de baja viscosidad.



8

Biorreactores de circulacin

La denominacin de esto tipo de reactores se debe al patrn de circulacin definido del
lquido en el reactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulacin externa o
interna. Externa si el lquido es inducido a circular por un brazo lateral conectado al
cuerpo principal del biorreactor en su parte inferior y superior, mientras que es interna si
el lquido circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor. Los primeros
solo se han empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han llegado a
utilizar a nivel industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales,
alcanzando volmenes de hasta 13,600 m
3
.

OBJETIVOS

Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniera
Biotecnolgica se relaciona con el diseo, construccin, implementacin, operacin y
mantenimiento de biorreactores industriales, en la presente prctica se propone como
objetivo que el alumno identificar y describir los diferentes tipos de biorreactores y
sus partes accesorias. As mismo, describir de que forma se operan, se controlan,
esterilizan, cargan y descargan, etc.

PROCEDIMIENTO

Para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno deber haber consultado en
todas las fuentes posibles el tipo de biorreactores que se emplean a nivel laboratorio,
planta piloto e industrial.

Se mostrarn a los alumnos los diversos tipos de biorreactores de nivel laboratorio y
planta piloto de la Unidad para el estudio de sus componentes.


9
Tambin se propone visitar la planta de tratamiento Aguas de San J uan Ixhuatepec, S.
U., o la planta de FERMIC, ambas ubicadas en la Ciudad de Mxico.

RESULTADOS Y DISCUSIN

El alumno realizar un informe detallado de los biorreactores presentados en el que
deber reportar los siguientes puntos:

Tipo de biorreactor. Capacidad. Caractersticas geomtricas (incluyendo esquema del
biorreactor). Sistema de carga y descarga. Sistema de agitacin del lquido de reaccin.
Patrones de flujo. Sistema de aireacin. Sistemas de control (incluyendo el sistema de
enfriamiento). Mtodo o forma de esterilizacin de: medios de cultivo, reactor
(incluyendo su limpieza), aire, aditivos de fermentacin (cidos, lcalis, antiespumante,
etc.). Mtodos de Cultivo (Lote, Lote Alimentado o Cultivo Continuo) que se lleva a cabo
en el biorreactor. Produccin. Dispositivo de toma de muestra y de Inoculacin.

BIBLIOGRAFA

1. Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. 1983. Bioreactors for submerged culture. Adv.
Biotech. Process. 1: 1-30.
2. Charles, M. 1985. Fermentation scale-up: problems and possibilities. Trends in
Biotech. 3: 80-84.
3. Schegerl, K. 1982. New biorreactors for aerobic processes. Int. Chem. Eng. 22:
591-610.
4. Schegerl, K. 1985. Nonmechanical agitated biorreactor systems. En:
Comprehensive Biotechnology, 2: 99-118. Ed. M. Moo-Young, Pergamon Press.
5. Sitting, W. 1983. Fermentation reactors. Chem. Tech. 13: 606-613.
6. Zlokarnik, M. 1985. Tower-shaped reactors for aerobic biological waste water
treatment. En: Biotechnology. 2: 537-569. Edited by Rehm, H. J . y G. Reed.


10
PRCTICA 2

Prctica 2. Instrumentacin para el seguimiento y control de la biorreaccin

Instrumentacin para el
seguimiento y control
de la biorreaccin

INTRODUCCIN

Los biorreactores estn equipados con distintos instrumentos. Estos se utilizan para
facilitar el registro y anlisis de variables de operacin y de parmetros especficos que
sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de
operacin de la biorreaccin con fines de maximizar la productividad y garantizar el
xito de la biorreaccin. La instrumentacin ha sido definida como una ventana al
proceso y su objetivo es mantener al mnimo la diferencia entre el valor medido y un
valor deseado. El control de un parmetro particular se lleva a cabo a travs de un
sistema que consta de un sensor (o electrodo), un medidor y un controlador: el sensor
es un dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir,
en otra que facilita su medida. El medidor recibe la medida del valor de la propiedad que
emite el sensor. El controlador compara dicha medida con un valor fijo. Del resultado de
la comparacin, el controlador toma una decisin enviando una seal (generalmente


11
elctrica) a algn dispositivo que ajustar el valor medido de la propiedad hasta el valor
predeterminado o de control (set point). La seal implica usualmente la modificacin
del estado de una vlvula, el encendido o apagado de una bomba dosificadora, la
modificacin de la velocidad de giro de un motor de algn equipo, etc. Si, por ejemplo,
se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el estado de una
vlvula, se requerir de un transductor y de un actuador. El transductor es un
dispositivo que convierte un tipo de energa en otro tipo de energa, mientras que los
actuadores son dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energa elctrica,
gaseosa o lquida. Existen tres tipos de actuadores:
1. Hidrulicos
2. Neumticos
3. Elctricos

Los actuadores elctricos son usados pera manejar aparatos electrnicos o
mecatrnicos. Los hidrulicos se usan cuando lo que se necesita es potencia, mientras
que los neumticos son simples posicionamientos.

Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo
con la masa lquida o slida de fermentacin), en cuyo caso se dice que estn en
lnea, si no estn conectados directamente al biorreactor entonces se dice que estn
fuera de lnea.

Debido a la naturaleza de la biorreaccin, se requiere que la gran mayora de los
sensores en lnea renan, entre otros, los siguientes requisitos: i) que sean capaces
de resistir el proceso trmico al que se somete el caldo de cultivo en el biorreactor
(esterilizacin con calor hmedo); ii) que sean capaces de resistir las presiones de
operacin; iii) que sean de fcil calibracin; iv) que muestren valores estables; v) que su
mantenimiento sea fcil y econmico y vi) que tengan una adecuada vida media til.
Estos sensores (en lnea), se utilizan, bsicamente, para medir propiedades fsicas o
variables de operacin tales com temperatura, presin, intensidad de agitacin o
velocidad de giro de los impulsores, velocidades de flujo de lquidos y gases, y para


12
medir ciertas propiedades qumicas como pH, concentracin de oxgeno disuelto y
gaseoso, concentracin de dixido de carbono disuelto y en el gas, concentracin de
azcares disueltos, concentracin de algunos productos celulares, etc.

Para conocer el estado de una variable de operacin o de un parmetro especfico con
sensores fuera de lnea, se deber tomar aspticamente una muestra para que en ella
se mida la propiedad.

Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos, es fcil concluir que los sensores en
lnea son mucho ms adecuados para controlar el valor de una propiedad en una
biorreaccin.

Entre las propiedades ms comunes que se miden en un biorreactor estn las
siguientes:

1. Temperatura
2. pH
3. Flujo de aire
4. Presin
5. Intensidad de agitacin
6. Nivel o Volumen de medio de cultivo
7. Espuma
8. Concentracin de oxgeno disuelto
9. Concentracin celular
10. Concentracin de sustrato
11. Concentracin de producto



13
Medicin y control de pH

El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H
+
) en una disolucin acuosa
y est definida por la siguiente ecuacin:

pH =- log
10
[H
+
] (1)

Para la medicin y control del valor de pH, se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en
forma asptica, en el biorreactor y que est directamente en contacto con el caldo de
fermentacin. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un
medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set
Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medicin.

Un electrodo de pH consiste de dos celdas: un elemento sensor del pH y un elemento
de referencia. El elemento sensor consiste de un alambre de plata cubierto con cloruro
de plata inmerso en una solucin buffer (usualmente de pH 7), en un tubo sellado que
termina con un fino bulbo de vidrio sensible al pH. El elemento de referencia consiste de
otro alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solucin buffer
saturada de cloruro de potasio y un diafragma poroso que comunica con la sustancia a
la que se medir el pH. Dicho electrodo comnmente se construye como una sola
unidad, con el sensor de referencia construido en una parte anular del elemento sensor,
tal como puede apreciarse en la figura 1.

El mtodo se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos
caras de la membrana de vidrio, expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su
valor de pH. A temperatura constante, la magnitud de esta diferencia de potencial es
directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones.



14

Figura 1. Esquema de un electrodo de pH

Debido a que el electrodo de vidrio y los electrodos de referencia comerciales tienen un
comportamiento imperfecto, es preciso calibrar el dispositivo de determinacin del pH
con dos disoluciones patrn antes de usarlos en los biorreactores. Para ello, se
sumergen los electrodos sucesivamente en dos disoluciones patrn con valor conocido
denominados P1 y P2, a la misma temperatura que la disolucin problema y
seleccionadas de forma que el valor de pH de la disolucin problema est comprendida
entre los valores de pH P1 y P2.

Como el valor del pH del caldo de fermentacin puede cambiar despus de ser
esterilizado, por causas del drstico tratamiento trmico, se recomienda recalibrar el
electrodo. Para esto, se hace necesario tomar aspticamente una muestra del caldo de
fermentacin y medirle, con un medidor y un electrodo fuera de lnea, su valor de pH.
En caso de que el valor que muestre el electrodo en lnea sea distinto del que marca
el fuera de lnea, se ajustar el valor de aqul con el equipo de medicin empleado en
el biorreactor.


15

Una vez realizado todo lo anterior, se est en posibilidades de medir y controlar el valor
del pH de una biorreaccin en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al
valor del Set Point, entonces el controlador emitir una seal elctrica con la cual se
podr activar alguna bomba para adicionar cido o lcali, dependiendo de la
diferencia entre el valor medido y el Set Point.

En la figura 2 se puede observar la disposicin de un sistema de medicin y control del
valor de una variable cualquiera de un caldo de cultivo contenido en un biorreactor.

Figura 2. Diagrama de bloques de un sistema de control

Medicin y control de temperatura

Aunque no existe un consenso para establecer cual de todas las variables de operacin
es la ms importante de mantener y controlar en una biorreaccin, la temperatura se
cuenta entre las ms importantes. El control, la medicin precisa y adecuada de la
temperatura resultan esenciales para la biorreaccin. Un sistema de medicin de la
ELEMENTO
DE CONTROL

BIORREACTOR
MEDICION
CONTROLADOR
COMPARADOR
V V
M
V
SP
E =V
M
-V
SP


16
temperatura debe presentar una precisin menor a los 0.5 C respecto a la temperatura
de medicin y en muchos casos, una variacin de 1 a 1.5 C durante la biorreaccin,
puede dar lugar a grandes prdidas econmicas en el bioproceso, por lo que se
recomienda que la diferencia entre el valor medido y el de control se encuentre entre
0.5 y 1.5 C. Generalmente, la temperatura en un bioproceso se mide con sensores
RTD (resistance temperature devices) ya que estos son los que presentan las mejores
caractersticas antes mencionadas. Consta de un elemento metlico cuya resistencia
elctrica cambia con la temperatura, hecho en el que se basa la medicin de la misma.
Generalmente se utiliza platino por sus mejores caractersticas lineales de cambio
respecto a la temperatura, aunque tambin se utiliza nquel, cobre y aleaciones de
nquel. Una desventaja es su precio moderamente alto.

La resistencia es medida con un dispositivo y convertida por un transductor a valores de
temperatura (en C o K). El valor medido de la temperatura es comparado con el de
control y de la diferencia entre los valores, el controlador emitir una seal que servir
para realizar una accin de control de la misma.

La accin puede consistir en hacer pasar agua de enfriamiento o vapor, a travs de un
serpentn inmerso en el caldo de biorreaccin o a travs de la chaqueta del
biorreactor, para ajustar la temperatura al punto de control.

Para sensores RTD la relacin entre la temperatura y la resistencia est descrita por la
siguiente ecuacin:

+ =
100
1
100
1
0
T T
T
R
R
T
(2)

Ecuacin en la que:
T
R
=resistencia a la temperatura T [=]

0
R
=resistencia a 0C [=]
=una constante (0.00382 0.00393 para Platino)



17
T
=temperatura [=] C
=una constante (1.48 1.51 para Platino)

Dicha ecuacin aplica para intervalos de temperatura comprendidos entre 0 y 630 C.

Medicin y control del oxgeno disuelto

El oxgeno disuelto es muy importante para el desarrollo de una biorreaccin aerbica,
por lo que su medicin y control es un parmetro importante para el desarrollo y
produccin econmicamente rentable de bioproductos.

El oxgeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del
caldo de biorreaccin. Una parte del oxgeno contenido en el aire se disuelve en el
caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxgeno disuelto es el que
utilizarn los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformacin de
la materia prima a producto. Por esta razn es importante distinguir entre oxgeno
disuelto y oxgeno en el gas.

La medicin del oxgeno disuelto se realiza de forma amperomtrica, por la reduccin
del oxgeno en la superficie del ctodo y la formacin de cloruro de plata en el nodo.
Una solucin electroltica une al nodo establecindose un voltaje de polarizacin entre
ellos. Cuando un fluido que contiene oxgeno disuelto se pone en contacto con el
electrodo, el oxgeno difunde a travs de una membrana semipermeable
establecindose la siguiente reaccin:

Ctodo: O
2
+2H
2
O +4e
-
4OH
-

nodo: 4Ag +4Cl
-
4AgCl +4e
-



18
El resultado es una corriente elctrica que es proporcional a la actividad del oxgeno
disuelto o presin parcial de oxgeno disuelto.

En el comercio especializado existen distintos tipos de electrodos y de medidores
controladores de oxgeno disuelto que los usuarios podrn elegir.

El control del oxgeno disuelto en una biorreaccin ocurre a travs de la modificacin
del flujo de gas (aire u oxgeno puro) o de la intensidad de agitacin del caldo de cultivo.

Medicin y control de espuma

Cuando en el caldo de cultivo existen compuestos orgnicos, como por ejemplo
protenas y carbohidratos, generalmente se forma espuma. Esto se favorece a altos
flujos de aire y alta intensidad de agitacin.

La formacin de espuma es crtica en los biorreactores por muchas razones, las ms
destacadas son las siguientes:

1. Disminucin del volumen del lquido en el interior del biorreactor si la espuma
sale por el venteo o salida del gas agotado.
2. Contaminacin microbiolgica del bioproceso si la espuma alcanza a salir por el
venteo o salida del gas agotado.
3. Disminucin de la actividad biolgica del bioproducto si posee propiedades
tensoactivas y es sensible a fuerzas de torsin.

Por las razones anteriores, la medicin y control de la espuma es imprescindible en los
Bioprocesos.



19
El control del volumen de la espuma se logra a travs de un rompedor mecnico o
mediante la adicin controlada de un antiespumante. El rompedor de espuma es un
impulsor, colocado generalmente por encima del caldo de cultivo, que gira a altas
velocidades que al girar y estar en contacto con la espuma acta en forma semejante a
una centrfuga, impulsando a la fase pesada al fondo y dejando pasar la fase ligera (el
gas). El antiespumante rompe la espuma cambiando la tensin superficial del caldo de
cultivo.

La seleccin del sistema de control de espuma ocurrir despus de evaluar las
caractersticas tcnicas y econmicas de ambos sistemas. Un rompedor mecnico
requiere de energa adicional y de acciones costosas de mantenimiento preventivo y
correctivo, mientras que los antiespumantes, son compuestos qumicos extraos al
sistema biolgico de la biorreaccin que potencialmente pueden llegar a contaminar el
producto final, a pesar de que existan antiespumantes aprobados por instituciones
internacionales.

A pesar de lo anterior, el sistema ms comnmente empleado para controlar la
formacin de espuma es usando antiespumantes. El control de espuma se basa en la
conductividad elctrica que presentan los medios de cultivo. Cuando la espuma
asciende y hace contacto con el sensor, que es una varilla metlica colocada en la parte
superior del biorreactor, cierra un circuito elctrico que enva una seal a un controlador
que acciona la bomba de adicin de antiespumante. Una vez que la espuma se ha
destruido, deja de hacer contacto con el sensor y la bomba deja de adicionar
antiespumante.



20
OBJETIVO

El alumno manejar los sistemas de medicin y control de variables de operacin de
biorreactores de tanques agitados, a travs de las determinaciones en lnea de la
temperatura, pH, oxgeno disuelto y espuma.

MATERIALES Y MTODOS

Equipo:
Biorreactor tipo tanque agitado

Instrumentacin.
Sistema de medicin y control de temperatura
Sistema de medicin y control de pH
Sistema de medicin y control de oxgeno disuelto
Sistema de medicin y control de espuma

El sistema de medicin y control de temperatura consta de:
1. Sensor RTD
2. Cables
3. Medidor
4. Controlador
5. Recipiente de agua de enfriamiento con una resistencia elctrica de inmersin
6. Bomba de agua de enfriamiento

El sistema de medicin y control de pH consta de:
1. Electrodo de pH con su camisa presurizable y conectores para el biorreactor
2. Cables
3. Medidor


21
4. Controlador
5. Bombas de adicin de cido o lcali

El sistema de medicin y control de oxgeno disuelto consta de:
1. Electrodo polarogrfico
2. Cables
3. Medidor
4. Controlador

El sistema de medicin y control de espuma consta de:
1. Electrodo
2. Medidor
3. Controlador
4. Bomba de adicin de antiespumante

Materiales

Tanque de nitrgeno puro con vlvula de control de presin y de flujo.
Vasos de precipitados de 250 mL, 500 mL y de 2000 mL.
Probetas de 1000 mL.
Mangueras de silicn para bombas peristlticas

Reactivos

Solucin de NaOH 0.5N
Solucin de HCl 0.5N
Antiespumante Mazu al 10% v/v en agua
Solucin proteica o un detergente



22

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Actividades previas
1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
2. Consultar los manuales de operacin tanto del biorreactor como de los equipos
de medicin y control que se utilizarn.
3. Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medicin y control de temperatura,
pH, oxgeno disuelto y espuma.
4. Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solucin protica o de
detergente (su profesor se lo indicar).
5. Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxgeno disuelto.
6. Establecer las condiciones de operacin (Todo lo anterior auxiliado por sus
instructores).

Medicin y control del pH

Establecer una velocidad de agitacin del biorreactor siguiendo las indicaciones
establecidas en el manual de operacin del equipo. Encender el equipo de medicin y
control y verificar que el valor de pH que registra el mismo sea igual que el de la
muestra tomada del biorreactor y medida fuera de lnea. De no ser as, ajustar el equipo
de acuerdo a las indicaciones del manual.

Ajustar el pH a un valor de 5 con una disolucin de cido clorhdrico 0.5 N. y establecer
en el equipo un valor de Set Point de 5 (Consultar el manual del equipo).

El equipo de medicin y control debe tener acoplado el sistema de adicin de lcali que
consta de una bomba peristltica capaz de agregar al biorreactor una disolucin de
NaOH 0.5 N, de acuerdo a la seal del controlador.



23
Agregar al biorreactor 10 mL de una disolucin de cido clorhdrico 0.5 N con objeto de
simular una biorreaccin acidognica (disminuye el valor del pH conforme pasa el
tiempo). Observe como el controlador enviar una seal a la bomba peristltica para
adicionar el lcali. La bomba dejar de funcionar (de adicionar lcali) cuando el pH
alcance o sobrepase el valor del Set Point.

Repita el procedimiento hasta que quede comprendido el sistema de medicin y control.

Medicin y control de la temperatura

Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25C) y establezca
una velocidad de agitacin de 300 rpm, ayudados por su instructor. Verifique que las
vlvulas del circuito de circulacin del agua de enfriamiento a travs de la chaqueta
estn abiertas y encienda el equipo de medicin y control de la temperatura que consta
de los elementos ya descritos. Establezca en el controlador de temperatura un valor de
Set Point de 33C (ayudados por su instructor). Encienda la bomba de circulacin del
agua y espere hasta que la temperatura en el interior del biorreactor alcance la
temperatura del Set Point.

Medicin del oxgeno disuelto

Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25C) y establezca
una velocidad de agitacin de 300 rpm, ayudados por su instructor. Establezca un flujo
de aire a un valor de 0.5 vvm (verifquelo en el rotmetro). Encienda el equipo de
medicin de oxgeno disuelto y espere unos 15 minutos hasta que la lectura
permanezca estable. Con este valor, establezca en el equipo el 100% del valor de
saturacin.



24
Ayudados por sus instructores, conecte un tanque de nitrgeno puro al sistema de
introduccin de aire del biorreactor y haga pasar un valor de flujo de nitrgeno tal que
no sobrepase los 0.75 vvm totales (verifquelo en el rotmetro), con objeto de disminuir
la presin parcial de oxgeno en el aire. Esto provocar que la concentracin de
oxgeno disuelto sea menor que cuando se burbujea aire solamente.

Observe como el oxgeno disuelto baja en el equipo de medicin.

Ahora cierre completamente el flujo de nitrgeno y observe como el valor de oxgeno
disuelto volver a su valor normal (100% del de saturacin).

Medicin y control de la espuma

Agregue al biorreactor 10 litros de agua con un 2% de detergente (o de ser posible una
disolucin protica) a temperatura ambiente (25C) y establezca una velocidad de
agitacin de 250 rpm, ayudados por su instructor y un flujo de aire de 0.15 vvm
(verifquelo en el rotmetro).

A esta velocidad observe si se forma espuma. Incremente la velocidad de agitacin en
intervalos de 50 rpm, hasta llegar a 400. Mantenga las diferentes velocidades durante
10 minutos y observe lo que ocurre con la formacin de espuma (debe incrementarse
su velocidad de formacin) y anote sus observaciones. Estando a 400 rpm, incremente
el flujo de aire hasta un valor de 0.75 vvm, observe y anote lo que pasa con la
formacin de espuma.

Conecte el sistema de control de espuma. La bomba peristltica de adicin de
antiespumante debe estar conectada y la manguera debe estar inmersa en una
solucin de antiespumante Mazu al 10% en agua.



25
Elija una velocidad de agitacin y un flujo de aire que tengan la ms alta formacin de
espuma, con objeto de que el controlador enve la seal de adicin de antiespumante.
Anote y discuta sus observaciones.

RESULTADOS Y MANEJO DE DATOS

Elabore diagramas (en autocad) en los que se observen los sistemas de medicin y
control de pH, temperatura, oxgeno disuelto y espuma en un biorreactor.

Elabore un reporte por equipo en los que establezca sus conclusiones respecto a las
necesidades de instrumentacin y control en las biorreacciones.

BIBLIOGRAFA

1. Aiba, S., Humphrey, A.E., Millis N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition
Academic.
2. Harper, E.H. 2000. El ABC de la instrumentacin en el control de procesos
industriales. Limusa. 1 Edicin. Mxico.
3. Lydersen, B.K., D'Elia N. A., Kim, L. N. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. J ohn Wiley and Sons, Inc., USA.
4. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
1978. Fermentation and enzyme technology. J ohn Wiley and Sons.



26
PRCTICA 3

Prctica 3. Servicios Auxiliares

Servicios Auxiliares

INTRODUCCIN

Los servicios auxiliares necesarios en la operacin de un biorreactor incluyen aire
comprimido, diversos gases comprimidos (nitrgeno, oxgeno, etc.), agua de
enfriamiento (agua helada y agua de torre), agua para servicios varios, vapor de planta
y energa elctrica.

Aire:

El aire tiene varios usos en un biorreactor, entre ellos por orden de importancia
mencionaremos:
1. Proveer oxgeno al medio de cultivo.
2. Como fuerza motriz para la transferencia de momento y masa.
3. Como fuerza motriz para transferir lquidos de un recipiente a otro.


27
4. Para accionar instrumentacin de control de tipo neumtico.
5. Como medio de enfriamiento para los recipientes despus de la esterilizacin.

La eleccin del tipo de aire a utilizar depender del uso que se haga de l. El aire debe
ser seco y libre de aceite. Adems, cuando se requiera que el proceso o producto no se
afecte por la introduccin de microorganismos ajenos, contenidos en la corriente de
aire, ser necesario que ste sea estril.

En la actualidad, para la esterilizacin del aire que se introducir al biorreactor se
utilizan prefiltros y filtros absolutos. Los prefiltros son casi obligatorios para compresores
lubricados con aceite, para eliminar partculas de este lubricante, sin embargo,
actualmente los compresores libres de aceite van ganando terreno, por lo que en estos
casos los prefiltros sirven para aumentar la eficiencia y la vida media de servicio de los
filtros absolutos. Estos ltimos debern tener un 100% de retencin de partculas de
hasta 0.01 m en el aire de servicio. Los filtros constan de dos elementos principales: el
cartucho que contiene el elemento filtrante y la camisa en la que se coloca el cartucho.
En el comercio especializado, se encuentran varios tipos de filtros absolutos. Algunos
de los materiales utilizados para los cartuchos son: steres de celulosa, polisulfonas,
fluoruro de polivinilo y politetrafluoroetileno, mientras que el material ms utilizado para
la camisa es el acero inoxidable (304, 316 o 316L) con mecanismos de sellado rpido y
hermtico. El dimetro de los cartuchos es de 2 a 2, con longitudes variables que
van desde 10 (0.25 m) hasta 40 (1m). Se recomienda que los filtros a emplear en los
biorreactores sean del tipo de membrana hidrofbica. La naturaleza hidrofbica (que
repele el agua) de estas membranas pueden alcanzar 100% de remocin de bacterias y
bacterifagos en condiciones de operacin hmedas o secas. La esterilizacin de los
filtros se realiza con vapor saturado que circula en el sentido de la introduccin del aire
al biorreactor.

Los sistemas de compresin de aire constan de los siguientes componentes:
compresor, filtro de admisin de aire, sistema de enfriamiento (si lo tiene), depsito de


28
almacenamiento y sistema de control de presin. En varios puntos del sistema de
distribucin se deben colocar trampas o purgas para eliminar condensados.

Los compresores de aire para plantas biotecnolgicas son generalmente de dos tipos:
rotatorios y reciprocantes de accionamiento positivo. Tambin existen los compresores
de tipo centrfugo para grandes volmenes de aire a bajas presiones. El aire es tomado
directamente de la atmsfera. Independientemente del tipo, preferentemente debern
ser especificados como libres de aceite.

La tubera de distribucin puede ser especificada en diferentes materiales dependiendo
del servicio: desde acero al carbn para aire de equipos y motores hasta acero
inoxidable 304 316 acabado sanitario para el aire proveniente del filtro absoluto hacia
el punto de suministro al biorreactor o para lneas de distribucin instaladas en un
cuarto limpio.

Adems del aire comprimido algunos gases comprimidos tambin tienen aplicaciones
en biorreactores. Los ms comunes son nitrgeno y oxgeno puros: el nitrgeno para la
formacin de atmsferas inertes, mientras que el oxgeno se usa para enriquecer el aire
y alcanzar una mayor velocidad de transferencia de oxgeno en el biorreactor. Estos
gases son generalmente suministrados en cilindros a una presin mayor que la
atmosfrica de tal manera que se pueden transportar al lugar de uso. La tubera de
distribucin y suministro debe cumplir con las mismas caractersticas que la del aire.

Vapor:

El vapor de planta es utilizado como el medio principal de calentamiento en miles de
industrias, y para la generacin de energa elctrica como uso secundario. Adems, el
vapor limpio o puro se utiliza en el procesamiento de alimentos y medicinas, en la
esterilizacin de productos y equipos, etc. Su uso generalizado se debe a las
siguientes razones:


29
1. La generacin de vapor es una de las formas ms econmicas de generacin de
energa.
2. El vapor puede controlarse de manera relativamente sencilla debido a que circula
de una zona de alta presin a una de menor presin sin necesidad de otro
equipo.
3. El vapor es fcil de producir ya que se obtiene del agua que adems puede ser
reutilizable.

Un generador de vapor o caldera es aquel equipo que transforma el agua en vapor
aprovechando el calor generado por la combustin de un material combustible, teniendo
como caracterstica principal que es un recipiente cerrado sujeto a una presin mayor a
la atmosfrica.

Existen dos tipos de generadores de vapor:

1. Generadores de Tubos de Agua.- En stos el agua circula al interior de una serie
de tubos (serpentn), mientras que el calor se transfiere de la cmara de
combustin hacia el interior de los tubos, as el agua contenida dentro de los
tubos comienza a elevar su temperatura hasta evaporarse. Este es el tipo ms
comn y con el que cuenta la UPIBI.
2. Generadores de Tubos de Humo.- En forma totalmente opuesta, en este tipo de
generadores los gases de combustin circulan por los tubos, mientras que el
agua se encuentra almacenada en la cmara exterior. As el calor se transfiere
del interior de los tubos hacia el agua almacenada alrededor de stos.

La capacidad de un generador de vapor se mide bajo un estndar internacional llamado
Caballo Caldera el cual es equivalente a generar 15.65 kg/h de vapor con una
temperatura de 100 C a presin atmosfrica y que es alimentado con agua a 100 C.
Otra definicin nos dice que con estos 15.65 kg/h de vapor es posible obtener 8,430
kcal/h de calor aprovechable en un proceso. As un generador de vapor que tenga una
capacidad de 100 caballos caldera ser capaz de generar 1565 kg/h de vapor.


30

Las calderas generalmente vienen como paquetes en tamaos estandarizados que
incluyen:
1. El tanque de condensados que se instala generalmente 2 m arriba de la bomba de
alimentacin de agua al generador.
2. La bomba de agua que enva el agua a presin hacia el serpentn del generador.
3. El generador de vapor de tubos de agua por donde circulan en sentido contrario el
agua y los gases de combustin, de tal manera que a medida que el agua avanza en
su recorrido encuentra temperaturas ms altas, por lo que incrementa su temperatura
hasta convertirse en vapor. Los componentes bsicos del generador son:
o Serpentn
o Quemador-ventilador
o Cmara de combustin
4. El separador de vapor en donde por medios mecnicos se provoca el
desprendimiento de pequeas partculas de agua (humedad) que arrastra el vapor.
5. La trampa de vapor que desaloja los condensados removidos del vapor y los enva
de regreso al tanque de condensados para repetir nuevamente el ciclo.
6. Sistema de control y de seguridad, entre los que destacan: vlvulas de alivio y de
seguridad, manmetros, control principal de temperatura con termopar, interruptores
del termostato, interruptor de presin de vapor e interruptor del nivel de aceite.

El agua que entra a una caldera requiere de un acondicionamiento previo (ver tabla 1)
para proteger los equipos contra la incrustacin, la corrosin y otras complicaciones.
Por eso es necesario acoplar a sta un sistema de acondicionamiento previo del agua
que generalmente incluye un suavizador y un tanque de salmuera.

El suavizador consiste en una columna empacada con una resina catinica depositada
sobre un lecho de grava que le sirve de soporte y a la vez de filtro. En la resina se lleva
a cabo el intercambio de los iones calcio y magnesio que son los responsables de la
dureza del agua por iones sodio que contiene la resina. El tanque de salmuera tiene


31
como funcin regenerar la resina a fin de que recupere su capacidad de intercambio
inico.

Tabla 1. Caractersticas del agua de alimentacin a una
caldera.
Dureza cero
Oxgeno disuelto, CO
2
cero
Sulfitos 50 100 ppm
pH 10.5 a 11.5
Slidos en suspensin cero
Slidos disueltos <6000 ppm

El sistema de distribucin de vapor se realiza por medio de tuberas, generalmente de
acero al carbn cdula 40, cuidando que las velocidades y cadas de presin estn
comprendidas en los intervalos recomendados para el dimensionamiento de las
mismas. El vapor puro requerir de tuberas de acero inoxidable con acabado sanitario.

En adicin al sistema de distribucin de vapor debern preverse los sistemas de manejo
de condensados, ya que stos pueden reutilizarse con un importante ahorro en el
acondicionamiento del agua de alimentacin a la caldera y en la energa requerida para
el calentamiento de la misma hasta el punto de ebullicin.

Agua de enfriamiento:

El agua como servicio auxiliar se utiliza como fluido de enfriamiento para el control de la
temperatura del caldo de fermentacin en los biorreactores. Esta agua, a diferencia del
agua de proceso, nunca entra en contacto con las materias primas o productos de la


32
biorreaccin, ni con las superficies en contacto con stos; sino que circula a travs de
las chaquetas o serpentines segn el diseo del biorreactor.

En la prctica el agua es un servicio escaso y es necesario recircularla, enfriarla y
reutilizarla. Dependiendo de la temperatura requerida para el agua de enfriamiento sta
puede ser:
o Agua de torre.- Con una temperatura de entre 10 C y 25 C dependiendo del
diseo de la torre y de las condiciones ambientales del lugar. Los equipos ms
utilizados en la industria biotecnolgica por su tamao compacto son las torres
de enfriamiento por evaporacin. Otros sistemas para mayores capacidades son
las torres atmosfricas y los estanques de enfriamiento, los cuales requieren
grandes espacios para su instalacin. El agua de torre es susceptible de
degradacin debido al crecimiento de organismos o bien al aumento en la
concentracin de sales que favorecen la incrustacin. Por lo tanto las torres de
enfriamiento requieren un mantenimiento constante que implica: tratamiento con
algunos qumicos para impedir la incrustacin de sales, cloracin para impedir la
formacin de microorganismos y purgas frecuentes para impedir la acumulacin
de slidos.

o Agua helada.- Con una temperatura de entre 5C y 10 C: Los componentes
principales de un sistema de agua helada son los mismos que los de un ciclo de
refrigeracin: el compresor, el condensador, la vlvula de expansin, el
evaporador, la bomba de recirculacin, y el tanque de expansin. El evaporador
es simplemente un intercambiador de calor donde el refrigerante se vaporiza a
expensas de la energa que toma del agua, que como resultado de este proceso
se enfra. Esta agua helada se dirige a los puntos donde se necesita y de ah se
retorna al evaporador por medio de la bomba de recirculacin. Por otro lado el
gas refrigerante se comprime, se enfra en el condensador y se dirige
nuevamente al evaporador pasando por una vlvula de expansin donde se
vaporiza parcialmente disminuyendo an ms su temperatura.



33
Para dimensionar un sistema de enfriamiento ser necesario conocer la demanda de
agua (flujo) y el intervalo de temperaturas entre el agua que sale hacia el proceso y la
que regresa al sistema. Las tuberas de transporte y suministro del agua de
enfriamiento son por lo general de acero al carbn y cobre en un dimetro adecuado
para los flujos que se manejen.

Agua para servicios varios:

Este tipo de agua se utiliza para las operaciones de lavado y limpieza del biorreactor y
del rea de proceso. Esta agua puede ser potable, debe estar libre de sedimentos, pero
no requiere ningn tratamiento adicional.

Energa elctrica:

La instalacin elctrica tiene como propsito proporcionar la energa para accionar
bombas, compresores, motores elctricos y otros equipos mecnicos, instrumentos,
tableros de control y alumbrado. El sistema se debe adecuar para entregar en el punto
que se requiera la energa necesaria sin causar sobrecalentamiento o cambios de
voltaje innecesarios.

Esto se logra a travs de lneas de alambrado que unen el generador con el punto
donde se necesita la energa conectando todos los componentes y que se dividen en
secciones segn el servicio y el rea dando lugar a los circuitos.

El sistema elctrico bsico est constituido por la fuente, el equipo de transformacin,
los dispositivos de proteccin, las lneas de distribucin y los puntos de uso.

Voltajes de distribucin.- La energa comprada o generada se suministra a voltajes
muy altos y para usarse en la planta debe ser reducida al voltaje de utilizacin, para


34
esto se requiere el uso de subestaciones reductoras o transformadores. El voltaje de
operacin recomendado por los fabricantes de motores y dems equipo elctrico
aparece en la placa o en las instrucciones de operacin de dicho equipo. La
especificacin tpica para motores elctricos y dems equipos accionados
elctricamente es de 120 V, 240 V y en algunos casos hasta 480 V, los instrumentos
generalmente necesitan voltajes de 12-24 V.

Corriente.- La corriente puede ser de dos tipos: la corriente alterna (AC) que es
peridica con pequeas oscilaciones, desde un valor mximo en un sentido hasta el
mismo valor pero en sentido contrario, de tal manera que su intensidad media es nula; y
la corriente continua o directa (DC CC) que proporciona un valor constante todo el
tiempo, como la producida por dnamos, pilas y acumuladores.

Dispositivos de Proteccin.- Los circuitos y equipos deben ser protegidos por
dispositivos que abran los circuitos para que la corriente no fluya en condiciones de
sobrecarga o falla. Esto se hace por medio de interruptores. Mediante los
transformadores se obtienen voltajes reducidos que alimentan los diferentes circuitos,
cada uno de los cuales debe tener su interruptor de desconexin.

Equipo elctrico para reas peligrosas.- Cuando las materias primas o productos de
la biorreaccin son potencialmente peligrosos, es decir que emiten a la atmsfera
grandes cantidades de partculas muy pequeas que pueden penetrar hacia los
circuitos elctricos e iniciar una chispa (p.ej. polvos, solventes, etc), tanto el equipo
elctrico como los transformadores, mecanismos de distribucin y motores deben ser
especificados a prueba de explosin.



35
Conductores.- Del punto de suministro al punto de utilizacin (equipo, compresores,
bombas, etc.) la corriente elctrica se distribuye por medio de conductores que pueden
ser alambres, cordones o cables, los cuales pueden ser vistos como las arterias y venas
por donde viaja la corriente.
o Hilo o alambre: Es un conductor constituido por un nico alambre macizo,
generalmente de cobre.
o Cordn: Es un conductor constituido por varios hilos unidos elctricamente
enrrollados helicoidalmente alrededor de uno o varios hilos centrales.
o Cable: Es un conductor formado por uno o varios hilos o cordones aislados
elctricamente entre s. Segn el nmero hilos o cordones que lleva un cable se
denomina unipolar, bipolar, tripolar, etc.
Los cables son canalizados en las instalaciones dentro de tuberas metlicas o canales
para protegerlos de agentes externos como la humedad, la corrosin los golpes, etc.,
que se sujetan al techo o paredes por medio de soportes. En algunos lugares se
entierran dichas tuberas bajo el piso, aunque esto lo hace de difcil acceso y
mantenimiento.

OBJETIVOS

El alumno identificar los servicios auxiliares necesarios para la operacin de un
biorreactor, describir sus componentes y explicar su funcionamiento.

PROCEDIMIENTO

Para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno buscar, en todas las fuentes
posibles, informacin sobre los tipos de sistemas de compresin de aire, generacin de


36
vapor y agua de enfriamiento que se emplean en la industria biotecnolgica. Tambin
investigar los elementos bsicos de una instalacin elctrica industrial.

Para la sesin experimental:
1. Se mostrar a los alumnos el cuarto de calderas, se les pedir que identifiquen
todos sus componentes y que elaboren el diagrama de flujo de este sistema.
2. Se mostrar a los alumnos los diversos compresores con que cuenta la planta
piloto y los laboratorios, se les pedir que identifiquen y describan sus
componentes y los clasifiquen de acuerdo con los tipos encontrados en la
literatura.
3. El profesor y el tcnico a cargo describirn los procedimientos de arranque y paro
de la caldera y los compresores, as como una breve descripcin de su
funcionamiento.
4. Los alumnos identificarn las lneas de agua, vapor, aire y electricidad de la planta
piloto, observando su ruta y registrando sus caractersticas: (materiales,
aislamiento, dimetros, color, etc.), se har lo mismo en el laboratorio de
biorreactores indicando la clasificacin de colores en caso que la haya. Los
alumnos realizarn un esquema tipo lay-out de la planta piloto indicando las rutas
de estos servicios hasta los biorreactores que se utilizarn en prcticas
posteriores.
5. Se mostrar a los alumnos el biorreactor New Brunswick Scientific para que
identifiquen en ste las lneas de suministro de agua, aire, vapor y condensados,
as como sus accesorios (filtros, trampas de vapor, reguladores de presin,
vlvulas, etc.). Se har especial nfasis en los filtros para aire y vapor, y en el
sistema de esterilizacin para las lneas de agua y aire. Los alumnos observarn
el cambio de materiales en las tuberas de entrada al biorreactor.
En cada actividad los alumnos debern anotar sus observaciones en la bitcora,
acompandolas de esquemas, dibujos, etc.



37

RESULTADOS Y DISCUSIN

El alumno realizar un informe de las actividades desarrolladas que deber contener los
siguientes puntos:
Introduccin, objetivo, tipo y descripcin de caldera, tipo y descripcin de compresores,
diagrama de flujo de servicios, diagrama de ruta de servicios, observaciones sobre cada
una de las actividades realizadas, conclusiones generales sobre el desarrollo de la
prctica y bibliografa.

BIBLIOGRAFA

1. Clayton, A. 2000. Curso de operacin y mantenimiento preventivo a generadores de
vapor.
2. Lydersen, B.K., D'Elia N. A., Kim, L. N. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. J ohn Wiley and Sons, Inc., USA.
3. Perry, R.H., Green, D.W. 2004. Manual del Ingeniero Qumico. McGraw-Hill.
4. Rase, H.F., Barrow, M.H. 1981. Ingeniera de proyectos para plantas de proceso.
CECSA.


38
PRCTICA 4

Prctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores

Tiempo de mezclado en
biorreactores

INTRODUCCIN

Tanque agitado

La agitacin y aireacin en un biorreactor se realiza para alcanzar los siguientes
propsitos:
1. Suministrar el oxgeno necesario a los microorganismos para que se realicen
apropiadamente sus actividades metablicas.
2. Mantener en suspensin a los microorganismos.

En los biorreactores de tanque agitado, la agitacin del caldo de cultivo se lleva a cabo
mediante las dos formas siguientes:
1. Por el movimiento de dispositivos mecnicos tales como impulsores de tipo
turbina o de propelas.


39
2. Por el movimiento ascendente de burbujas de aire.

Por lo tanto, la intensidad de agitacin depende de la velocidad de movimiento de los
impulsores y de la velocidad de aireacin.

La agitacin puede describirse mediante el tiempo de mezclado, el cual se define como
el tiempo que transcurre despus de la adicin de un trazador para alcanzar un
determinado grado de homogeneidad, generalmente del 95%, del lquido contenido en
el biorreactor.

Un mezclado insuficiente puede causar regiones en las que haya altas concentraciones
de inhibidores de crecimiento, deficiencia de oxgeno o de algn otro nutriente,
gradientes importantes de temperatura y pH, que se pueden reflejar en lo obtencin de
bajas productividades y bajos rendimientos. Por ello, es importante estudiar el efecto de
las variables de operacin sobre el grado de mezclado que se pueda alcanzar en el
biorreactor.

Columna

En los biorreactores de columna la agitacin del caldo de cultivo se lleva a cabo
mediante el movimiento ascendente de las burbujas de aire. El nmero y tamao de las
burbujas de aire dependen de la velocidad de aireacin, de las propiedades fsicas del
caldo de cultivo, del tipo de dispersor, de la altura de la columna y de la presencia de
dispersores colocados a lo largo de la columna. Un aumento en la velocidad de
aireacin, aumentar la fraccin de gas retenido y las velocidades locales del lquido.
J unto con esto, se hacen ms pronunciados los perfiles parablicos de la fraccin de
gas retenido a travs de la seccin transversal de la columna con su mximo en el
centro.



40
El elemento estructural a travs del cual tiene lugar la dispersin del gas se llama
dispositivo de dispersin primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser
redispersado. Esto se lleva a cabo por dispositivos de dispersin secundaria. En las
columnas de burbujas de una etapa y en las columnas de burbujas multietapa, el aire se
introduce a travs de dispositivo de dispersin primaria, tal como un tubo perforado, un
plato perforado o un plato sinterizado, en donde es dispersado finamente. Tambin, las
burbujas de aire que aumentan de tamao debido a la coalescencia pueden ser
redispersadas al pasar a travs de dispositivos de dispersin secundaria, tales como
mallas o bandejas perforadas colocados a lo largo de la columna. En los biorreactores
de columna de burbujas multietapa, la dispersin de aire se lleva a cabo
predominantemente en los dispositivos de dispersin primaria

Airlift

Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos
dos zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del
lquido se debe a que en dichas zonas la densidad de la dispersin gas-lquido es
diferente porque hay mayor cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la
de flujo descendente. La diferencia de las fracciones de gas retenido, es una medida de
la diferencia de densidades entre las dispersiones gas-lquido en dichas zonas, la cual
es la fuerza motriz para la circulacin del lquido en el biorreactor.

Debido al movimiento del lquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente
subirn ms rpido, disminuyendo la fraccin de gas retenido y la diferencia de presin
hidrosttica. En contraste con las condiciones de una columna de burbujas, los
biorreactores airlift se caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por
una distribucin ms uniforme de la fase gaseosa a travs de la seccin transversal de
la zona de flujo ascendente, con un mximo de la fraccin de gas retenido local cerca
de la pared de la zona de flujo ascendente. Tambin, en contraste con las columnas de
burbujas, los airlift muestran velocidades de lquido mucho ms altas. La velocidad del


41
lquido afecta decisivamente todos los parmetros que caracterizan el desempeo del
biorreactor, tales como la fraccin de gas retenido, el tiempo de mezclado y el
desempeo en cuanto a transferencia de masa y calor. En general, la velocidad del
lquido en los biorreactores airlift se determina por la velocidad de aireacin, la
geometra del biorreactor y las propiedades fsicas de la fase lquida.

El mezclado del lquido es predominantemente producido por la circulacin del lquido y
en menor grado por la dispersin axial debida al ascenso de las burbujas de aire. El
mezclado ocurre predominantemente en las zonas de deflexin superior e inferior,
debido a las diferencias de velocidad ah existentes. Para una geometra definida, la
rapidez del mezclado puede expresarse en trminos del tiempo de circulacin, el cual
se define como el tiempo requerido para que el lquido circule una vez dentro del
biorreactor. Por ello, el conocimiento del tiempo de circulacin y de los factores que lo
afectan es necesario para el diseo, modelado y operacin de un biorreactor airlift.

OBJETIVOS

Tanque agitado
El alumno determinar el tiempo de mezclado en un biorreactor de tanque agitado bajo
diferentes condiciones de aireacin y agitacin.

Columna
El alumno determinar el tiempo de mezclado en un biorreactor de columna de burbujas
bajo diferentes condiciones de aireacin, utilizando dos diferentes tipos de dispersores.

Airlift
El alumno determinar el tiempo de circulacin, el tiempo de mezclado y las fracciones
de gas retenido global, en la zona de flujo ascendente y en la zona de flujo descendente
en un biorreactor airlift bajo diferentes condiciones de aireacin.


42

MATERIALES Y MTODOS

Biorreactores
1. Biorreactor de tanque agitado.
2. Biorreactor de columna de burbujas
3. Biorreactor airlift

Instrumentacion
1. Cronmetros.
2. Rotmetros.
3. Manmetros.
4. Termmetros.
5. Medidor de pH con adquisicin de datos en lnea.
6. Computadora y software para la adquisicin de datos en lnea.

Reactivos
1. Solucin de NaOH 6N.
2. Solucin de HCl 6N.
3. Solucin de azul de bromocresol.
4. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.

Determinacin del tiempo de mezclado en los biorreactores:

Tanque agitado y columna
El mtodo que se utilizar es del de adicin de trazadores tales como cidos y bases.

Airlift
a) Determinacin del tiempo de circulacin y del tiempo de mezcla


43
El mtodo que se utilizar es el de adicin de trazadores tales como cidos y
bases.
b) Determinacin de la fraccin de gas retenido local
Utilizando el mtodo manomtrico.
c) Determinacin de la fraccin de gas retenido global
Midiendo el volumen del lquido aireado y el volumen del lquido sin airear.


Actividades previas
1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
2. Llenar el biorreactor con agua de la llave.
3. Agregar al biorreactor 0.2 ml de la solucin de indicador.
4. Una vez conectado el sistema de medicin de pH a la computadora, calibrar el
electrodo y colocarlo en el biorreactor.

Condiciones de operacin

Tanque agitado
o Las velocidades de agitacin sern: 300, 500 y 700 rpm.
o Para cada velocidad de agitacin, se probarn las siguientes velocidades de
aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

Columna
o Velocidades de aireacin: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm
o Tipos de dispersores: tubo perforado y plato poroso.



44
Airlift
o Velocidades de aireacin: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm
o Tipos de tubos de arrastre: 2 dimetros diferentes.

Medicin del tiempo de mezclado
Mtodo de adicin de pulsos.
1. La adicin de pulsos se realizar a travs de la boquilla inferior de los
biorreactores.
2. Al momento de adicionar un pulso de cido o base, registrar el tiempo que
transcurre hasta lo obtencin de la homogenizacin del color del lquido en el
biorreactor. Simultneamente a la adicin del pulso, ejecutar el programa de
adquisicin de datos de pH de manera que registre el valor de pH cada 0.16 seg.
3. Ajustar el pH a un valor entre 8.5 y 9.0.
4. Adicionar 1 mL de la solucin de HCl 6N, el indicador virar a azul.
5. Adicionar 1 mL de la solucin de NaOH 6N, el indicador virar a amarillo.
6. Medir el nivel del lquido aireado.
7. Cambiar las condiciones de operacin y una vez alcanzado el estado estacio-
nario, de nuevo agregar pulsos y medir el nivel del lquido aireado.

Medicin de la fraccin de gas retenido local para el biorreactor airlift

1. Medir la diferencia de alturas del agua contenida en los manmetros de presin
diferencial de cada zona del biorreactor.
2. Medir la distancia entre las tomas de presin esttica de la zona de flujo
ascendente y las de la zona de flujo descendente.

Medicin de la fraccin de gas retenido global
1. Medir el nivel del lquido sin airear en el biorreactor.
2. Medir el nivel del lquido aireado para cada condicin de operacin.



45
RESULTADOS Y MANEJO DE DATOS

Tanque agitado
1. Elaborar grficas de pH en funcin del tiempo.
2. Calcular el tiempo de mezclado.
3. Construir grficas del tiempo de mezcla en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
4. Calcular la potencia de agitacin sin aireacin y con aireacin.
5. Calcular la potencia de aireacin.
6. Obtener las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado
con las variables de operacin empleadas.

Columna
2. Calcular el tiempo de mezclado.
3. Construir grficas del tiempo de mezcla en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
con la velocidad de aireacin (expresada como vvm y vs).

Airlift
2. Calcular el tiempo de circulacin y el tiempo de mezclado.
3. Construir grficas del tiempo de circulacin en funcin de la velocidad de
aireacin (expresada como vvm y vs) y del
4. Elaborar grficas de tiempo de mezclado en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs) para cada tipo de tubo de arrastre.
5. Calcular las fracciones de gas retenido en la zona de flujo ascendente y en la
zona de flujo descendente.
6. Calcular la fraccin de gas retenido global.


46
8. Construir grficas del tiempo de circulacin en funcin de las fracciones de gas
retenido y del tiempo de mezclado en funcin de las fracciones de gas retenido.
con la velocidad de aireacin (expresada como vvm y vs).

DISCUSIN Y CONCLUSIONES

La discusin deber incluir al menos lo siguiente:
1. Comparacin de los tiempos de mezclado obtenidos en cada condicin de
operacin.
2. Comparacin de las potencias de aireacin y de agitacin.
3. Comentarios sobre el aspecto de la dispersin gas-lquido.

Airlift
La discusin deber incluir al menos lo siguiente:
1. Comparacin de los tiempos de circulacin y de mezclado obtenidos en cada
velocidad de aireacin.
2. Comparacin de las fracciones de gas retenido.
3. Comentarios sobre el aspecto de la dispersin gas-lquido.
4. Investigacin sobre la relacin de dimetros entre el tubo de arrastre y el del
biorreactor que ofrece la mnima resistencia al flujo.



47
BIBLIOGRAFA

Tanque agitado
1. Aiba, S., Humphrey A.E., Millis, N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition
Academic.
2. Hicks, R.W., Gates, L.E. 1976. How to select turbine agitators for dispersing gas into
liquids. Chem. Eng. J uly 19: 141-148.
3. Moser, A. 1988. Bioprocess technology. Kinetics and reactors. Ed. Springer - Verlag.
4. Wang, D.I. C., Cooney, C L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.

Columna
1. Miyahara, T., Matsuba, Y., Takahashi, T. 1983. The size of bubbles generated from
perforated plates. Int. Chem. Engng. 23. 3: 517-523.
2. Schegerl, K. 1982. New bioreactors for aerobic processes. Int. Chem. Engng. 22. 4:
591-610.
3. Schegerl, K., Lucke, J ., Oels, U. 1980. Bubble column biorreactors. Adv. In
Biochem. Engng. 45. 7: 1-84.

Airlift
1. Blenke, H. 1985. Biochemical loop reactors. Biotechnology 2, Ed. by Rehm, H. J ., y
G. Reed.
2. J oep, J .M. 1988. Gas hold up measurements in bioreactors. Trends in
Biotechnology. 6: 19-22.
3. Weiland, P., Onken, V. 1981. Differences in the behaviour of bubble columns and
airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.


48
PRCTICA 5

Prctica 5. Transferencia de oxgeno en biorreactores agitados y neumticos

Transferencia de oxgeno en
biorreactores agitados y neumticos

INTRODUCCIN

Tanque agitado

Las conversiones microbianas aerbicas son reacciones de oxidacin que requieren
oxgeno molecular disuelto. Una gran diferencia del oxgeno con respecto a otros
nutrientes, es su extremadamente baja solubilidad en agua. Consecuentemente, la
transferencia de oxgeno puede llegar a ser uno de los principales factores limitantes de
la productividad celular y/o de metabolitos, debido a la influencia de la concentracin del
oxgeno disuelto sobre las actividades metablicas de las clulas.

La velocidad de transferencia de oxgeno de un biorreactor de tanque agitado depende
de las condiciones de aireacin y agitacin y de las propiedades fsicas del caldo de
cultivo. La ecuacin que describe la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) es:


49

( ) C * C a k VTO
L
= (1)

donde:
k
L
a : coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno, h
-1
.
C* - C : fuerza impulsora de la transferencia de oxgeno, mMoles/L.

El k
L
a es un parmetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere
oxgeno del aire al lquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes mtodos para
determinar la velocidad de transferencia de oxgeno. En esta prctica se combinan dos
de ellos, el de balance de oxgeno o medida directa con el del sulfito. Por lo tanto, se
emplear un sistema fsico aire-agua y no uno biolgico. Un balance de oxgeno del aire
considerando la entrada y la salida del biorreactor es:

=
0
5
10 32 7
T
y P Q
T
y P Q
V
x .
VTO
o o o
i
i i i
L
(2)

donde:
V
L
: volumen de lquido en el biorreactor, litros.
Q : flujo volumtrico de aire, litros/min.
P : presin total absoluta, atm.
T : temperatura del aire,
0
K.
y : fraccin mol de oxgeno.
7.32 x 10
5
: factor de conversin.
i =a la entrada del biorreactor.
o =a la salida del biorreactor.

En esta prctica para que haya una transferencia neta de oxgeno debe haber consumo
del mismo, por lo que como consumidor de oxgeno se emplea sulfito de sodio. En
este caso la reaccin de oxidacin es tan rpida que la concentracin de oxgeno
disuelto en el lquido es cero. La reaccin que se efecta es:


50

2 Na
2
SO
3
+O
2
2Na
2
SO
4

Otro parmetro importante que determina la velocidad de transferencia de oxgeno de
un biorreactor es la fraccin de gas retenido o "gas holdup", definido como la fraccin
de la unidad de volumen de la mezcla gas-lquido que es ocupada por la fase gaseosa.
Cuando el tamao promedio de las burbujas es constante, una mayor fraccin de gas
retenido, implica una mayor rea interfacial gas-lquido y en consecuencia una mayor
transferencia de oxgeno.

Columna

La velocidad de transferencia de oxgeno es determinada de manera importante por el
rea superficial de las burbujas de aire, de aqu que el aire se disperse en forma de
burbujas pequeas para proveer una gran rea de contacto entre las fases lquida y
gaseosa. Sin embargo, en algunos caldos de fermentacin, las burbujas pequeas
tienden a unirse formando burbujas ms grandes. As que an con una dispersin
primaria muy fina y dependiendo de las propiedades fsicas del caldo de cultivo y de la
intensidad de la turbulencia dentro del biorreactor, las burbujas pueden crecer hasta
aproximadamente 6 mm de dimetro despus de dejar la zona de dispersin.

Este fenmeno conocido como coalescencia de las burbujas, es causado por el hecho
de que una pelcula lquida entre dos burbujas de aire adyacentes se hace cada vez
ms delgada hasta que eventualmente se rompe.

En una dispersin gas-lquido cuyo comportamiento es 100% coalescente, el lquido es
un lquido puro. Al ir aumentando la concentracin de electrolitos disueltos en dicho
lquido, se va inhibiendo la coalescencia de las burbujas. Tambin la presencia de
protenas, alcoholes y substancias surfactantes, afecta el grado de coalescencia de las
burbujas.
Cu
2+



51

La coalescencia de las burbujas afecta entonces el dimetro de las burbujas. ste junto
con la fraccin de gas retenido determinan el rea superficial de contacto entre las
fases lquida y gaseosa, de acuerdo a la siguiente ecuacin:

( ) ( )
=
1
6
b
d
a (3)

donde:
a: rea interfacial gas-lquido.
: fraccin de gas retenido.
d
b
: dimetro de las burbujas.

Airlift

Si el oxgeno molecular no fuera continuamente transferido del aire al caldo de cultivo
de microorganismos, el oxgeno disuelto sera consumido en pocos segundos bajo
condiciones normales de fermentacin, debido a la baja solubilidad del oxgeno en los
caldos de cultivo. El suministro del oxgeno al caldo de cultivo de microorganismos, es
por lo tanto, un aspecto muy importante en el diseo de biorreactores para procesos
aerbicos. En el transporte de oxgeno de la fase gaseosa al caldo de cultivo de
microorganismos, la resistencia de la pelcula lquida en la interfase gas-lquido es, en la
mayora de los casos, el paso limitante de la velocidad de suministro de oxgeno.

El k
L
a es un parmetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere
oxgeno del aire al lquido contenido en un biorreactor. Este coeficiente depende del
grado de coalescencia de las burbujas. Por ejemplo, el k
L
a empleando una solucin
acuosa con una fuerza inica de I=0.4, es ms grande, por un factor de seis, que el
obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del rea interfacial.



52
Un efecto importante de la circulacin del lquido es que disminuye la frecuencia de la
coalescencia al aumentar la velocidad del lquido. Esto es resultado de que las
distancias entre las burbujas de gas son ms grandes debido a que las fracciones de
gas retenido son menores y a que la distribucin de gas es ms uniforme. Adems,
porque disminuye el movimiento transversal de las burbujas de gas.

En general, en los biorreactores de columna de burbujas se obtienen fracciones de gas
retenido ms grandes, mientras que el los biorreactores airlift, la fraccin de gas
retenido disminuye al aumentar la velocidad de circulacin del lquido. La velocidad del
lquido representa por lo tanto, un parmetro muy importante para adaptar la fraccin de
gas retenido y el tiempo de residencia promedio de las burbujas a los requerimientos de
proceso.

En los biorreactores airlift de gran altura, la velocidad de transferencia de masa cambia
a lo largo de la ruta de flujo de una manera complicada, debido a que el rea interfacial
y la diferencia de concentracin de oxgeno cambian de un punto a otro debido a la
expansin o compresin, al consumo de oxgeno y a cambios en la presin hidrosttica
y en la velocidad local del lquido.

OBJETIVO

El alumno determinar la velocidad de transferencia de oxgeno, el coeficiente
volumtrico de transferencia de oxgeno y la fraccin de gas retenido global en
diferentes tipos de biorreactores



53
MATERIALES Y MTODOS

Biorreactor
1. Biorreactor de tanque agitado.
2. Biorreactor de columna de burbujeo.
3. Biorreactor airlift

Instrumentos
1. Rotmetros.
2. Analizador de oxgeno en fase gaseosa.
3. Manmetros.
4. Termmetros.
5. Medidor de pH.

Reactivos
1. Na
2
SO
3

2. Almidn en solucin al 1%.
3. HCL 3N
4. NaOH 3N
5. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.

Mtodos
o Determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno: mediante el mtodo
combinado del balance de oxgeno con el del sulfito.
o Determinacin del k
L
a usando la siguiente ecuacin:
k
L
a =VTO / C*
o C* se calcula con la ecuacin de la ley de Henry.
o Determinacin de la fraccin de gas retenido global: mtodo de expansin de
gas.



54

Actividades previas
1. Preparar en el biorreactor una solucin de Na
2
SO
3
0.6N.
2. Adicionar Cu
2
SO
4
a la solucin de sulfito, para tener una concentracin final de
0.25 g/L.
3. Ajustar el pH a 7.6 y mantenerlo constante durante la experimentacin.

Condiciones de operacin

Tanque agitado
o Las velocidades de agitacin sern: 300, 500 y 700 rpm.
o Para cada velocidad de agitacin, se probarn las siguientes velocidades de
aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

Columna
o Velocidad de aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

Airlift
o Velocidad de aireacin: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm.
o Tipos de tubos de arrastre: de 2 dimetros diferentes.

Medicin de la concentracin de oxgeno gaseoso.
1. Una vez establecidas las condiciones de operacin, medir la concentracin del
oxgeno del aire que sale del biorreactor, utilizando el analizador de oxgeno
previamente calibrado.



55
Medicin de la fraccin de gas retenido global.

1. Medir el nivel del lquido sin airear y el nivel del lquido aireado para cada
condicin de operacin.

Airlift
1. Medir la diferencia de alturas del agua contenida en los manmetros de presin
diferencial de cada zona del biorreactor,
2. Medir la distancia entre las tomas de presin esttica de la zona de flujo
ascendente y entre las de la zona de flujo descendente.

RESULTADOS

1. Calcular la VTO, el k
L
a y la fraccin de gas retenido global, para cada condicin
de operacin.
2. Calcular C*.
3. Obtener la correlacin del k
L
a con la velocidad de aireacin, sta expresada en
vvm y en m/s.
4. Obtener la correlacin del k
L
a con la fraccin de gas retenido.


La discusin deber contener al menos la siguiente informacin:
1. Comparacin de las diferentes condiciones de operacin y fracciones de gas
retenido con respecto a los valores del k
L
a.
2. Comparacin de los valores de k
L
a que obtuvo para cada uno de los biorreactores
empleados y explique el porqu de las diferencias.


56
3. Cul es el aspecto de la dispersin gas-lquido para cada condicin de operacin.
4. Explicacin de los valores de k
L
a de los lquidos que promueven la coalescencia y
de los lquidos que la inhiben.

BIBLIOGRAFA

1. Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis, N. F. 1973. Biochemical engineering. Academic
Press.
2. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
3. Wang, D .I .C., Cooney, C. L, Demain, A. D., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.

Airlift
1. Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. Elsevier Applied Science. England.
2. Merchuk, J . C. 1990. Why use airlift reactors. TiBTech. 8. 66-71.
3. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
4. Weiland, P., Onken, U. 1981.Differences in the behaviour of bubble columns and
airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.


57
PRCTICA 6

Prctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores

Mantenimiento de asepsia en
biorreactores

INTRODUCCIN

En esta prctica la asepsia se considera como el conjunto de procedimientos
destinados a eliminar o retirar microorganismos de un biorreactor y de todas las
tuberas conectadas a l, con el propsito de asegurar que nicamente estn presentes
el o los biocatalizadores, microorganismos o enzimas, responsables de efectuar la
bioconversin de materias primas a un producto especificado. En consecuencia, la
asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, garantizan que los procesos de
bioconversin se lleven a cabo sin contaminaciones por microorganismos extraos.

Los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado
por el substrato o pueden desplazarlo al tener una velocidad de crecimiento mayor,
incluso pueden producir substancias que daen al microorganismo cultivado o inactiven
a las enzimas. Por lo tanto, la presencia de microorganismos contaminantes ocasionan


58
que los rendimientos y productividades de produccin establecidos no se puedan
alcanzar, ocasionando prdidas econmicas.

Para poder lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, se deben
proponer desde la etapa de diseo, una geometra interna y arreglos de tuberas, que
eviten la acumulacin de substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las
substancias acumuladas pueden propiciar una contaminacin. Tambin, la asepsia se
facilita mediante una limpieza efectiva del biorreactor y tuberas, lo que se alcanza al
especificar materiales de construccin con un acabado que evite el atrapamiento de
partculas slidas con microorganismos. Las partculas slidas eventualmente limitan la
transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la
temperatura de esterilizacin y por lo tanto, dejndolos viables para generar una
contaminacin.

Una vez lavado el biorreactor y las tuberas, el biorreactor se llena con medio de cultivo
para proceder a la esterilizacin. Despus de la esterilizacin, el biorreactor debe
operar aspticamente. Para lograrlo, es necesario el buen funcionamiento del sello
mecnico para mantener una presin positiva que evite la entrada de microorganismos.
Tambin, se requiere el ms alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de
remocin del filtro para la esterilizacin del aire.

Existen diferentes mtodos para probar la integridad de filtros. Uno de ellos es la prueba
de la intrusin del agua. Es una prueba prctica y validada, que se puede considerar
para probar la integridad in situ de los filtros hidrofbicos para la esterilizacin del aire.
Otra prueba es la de mantenimiento de la presin.



59
OBJETIVO

El alumno aplicar las pruebas de intrusin de agua y de mantenimiento de la presin
para probar la integridad de filtros de aire, con los que se garantice la operacin
asptica en biorreactores.

MATERIALES Y MTODOS

Biorreactor.
1. Biorreactor agitado de 30 L, equipado con prefiltros y filtros hidrofbicos para la
esterilizacin de aire.

Instrumentacin.
1. Cronmetro.
2. Rotmetro.
3. Manmetro.
4. Termmetro.

Reactivos
1. Agua desionizada
2. Isopropanol

Prueba de intrusin de agua

El principio de esta prueba es que si el lado corriente arriba de un filtro hidrofbico seco
se llena de agua y se presuriza, la naturaleza hidrofbica de la membrana porosa
prevendr el flujo del lquido a travs del filtro hasta que se alcanza la presin de la
intrusin. A presiones por debajo de la presin de intrusin ocurre un flujo pequeo pero


60
medible del agua a travs de la membrana. La presencia de poros ms grandes en el
filtro ser detectada por un flujo creciente debido al agua que atraviesa estos poros. La
figura 1 muestra el principio de esta prueba.

Figura 1. Principio de la prueba de intrusin de agua. Si el tamao de los poros es como
el tamao del poro B, el flujo de agua ser menor que el flujo correspondiente a poros
del tamao del poro A.

La tabla 1 muestra el resultado de una prueba de intrusin de agua para un filtro de
membrana de la marca Pall. Los parmetros de la prueba son especficos para cada
filtro y deben ser proporcionados por el fabricante.

Carcasa
Aire
Agua
Filtro:
Membrana
hidrofbica
Aire
Agua
Membrana
hidrofbica
Presin
Poro A
Poro B
Unidad de filtracin


61
Tabla 1. Parmetros de la prueba de intrusin de agua para un filtro de cartucho
EMFLON PFR de Pall.
Nmero de catalogo AB1PFR7PVH4
Presin de prueba 2500 mbar
Flujo mximo permisible 0.33 mL/min
Usando agua desionizada a una temperatura de 20 2C.

Prueba de mantenimiento de la presin

La prueba de mantenimiento de la presin es una forma modificada de una prueba de
flujo difusivo, que es la prueba de flujo hacia delante corriente arriba del filtro. sta
puede llevarse a cabo despus de la esterilizacin del filtro, antes de la filtracin y
despus de la filtracin estril, puesto que las conexiones estriles corriente abajo no se
desconectan. Una ventaja de la prueba de mantenimiento de la presin es que tambin
confirma la integridad de la unidad de filtracin, incluyendo los sellos de la carcasa.


Prueba de intrusin de agua

1. Instalar el filtro seco.
2. Llenar con agua desionizada el lado corriente arriba del filtro.
3. Aplicar una presin predeterminada, utilizando aire. Esto causa una disminucin
del nivel de agua dentro de la carcasa del filtro, debido a la compresin de los
pliegues del filtro y al paso de aire atrapado a travs de la membrana. Es
importante que los cambios de volumen corriente arriba del filtro debido a estos


62
efectos se haya estabilizado, para que se puedan medir los flujos de agua muy
pequeos que pasan a travs de la membrana.
4. Dejar pasar 10 minutos para que ocurra la estabilizacin tanto del flujo como de
la temperatura.
5. Despus de la estabilizacin, medir el flujo de agua. Esto se puede hacer,
determinando el flujo de aire corriente arriba que es requerido para mantener la
presin constante.
6. Al terminar la prueba, drenar el agua del filtro y de las tubera.
7. Secar el filtro y la tubera.
8. Comparar los resultados de la prueba con los lmites especificados.
9. Si los resultados estn dentro de los lmites especificados, entonces el filtro est
listo para usarse.

Prueba de mantenimiento de la presin

1. Mojar la membrana del filtro con una mezcla de isopropanol agua 60:40 (v/v).
2. Instalar el filtro en la carcasa.
3. Presurizar la unidad de filtracin a una determinada presin.
4. Aislar la unidad de filtracin de la fuente de presin y de la tubera corriente bajo.
5. La difusin del gas a travs de la membrana mojada se mide cuantitativamente
como un descenso de la presin despus de un periodo de tiempo especificado.
6. Medir el volumen corriente abajo de la carcasa.
7. Mantener constante la temperatura en el volumen corriente abajo de la carcasa.
8. Verificar que no haya fugas en el sistema de tuberas corriente abajo.
9. Comparar los resultados con los valores publicados de la disminucin de la
presin, los cuales se basan en carcasas estndares con vlvulas corriente
arriba localizadas tan cerca como sea posible de la carcasa del filtro.
10. Si los resultados estn dentro de los lmites especificados, entonces el filtro est
listo para usarse.


63
RESULTADOS

1. Elabore el isomtrico de tuberas que muestre la instalacin del filtro.
2. Dibuje un diagrama de bloques de los procedimientos experimentales realizados
en esta prctica.
3. Construya una grafica del flujo de agua en funcin del tiempo.
4. Realice una grafica de la presin en funcin del tiempo.


La discusin versar al menos sobre lo siguiente:
1. Las especificaciones de los lquidos que se requieren para mojar la membrana de
filtros hidrofbicos en las pruebas de integridad de flujo difusivo.
2. La razn de que las pruebas de integridad de filtros deban ser correlacionados
con la prueba de la carga bacteriana lquida, la cual es un indicador del
desempeo de los filtros.
3. Tres pruebas que se han utilizado comnmente en filtros para la esterilizacin de
gas, as como sus ventajas y desventajas.

BIBLIOGRAFA

1. Lydersen B.K., Delia N.A., Nelson, K.M.L. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. J ohn Wiley and Sons, Inc. New York.
2. J ohnston P.R. 2004. Fluid sterilization by filtration. Interpharm, CRC Press LLC.
3. J ornitz. M.W. 2006. Sterile filtration. Springer-Verlag, Berlin.


64
PRCTICA 7

Prctica 7. Esterilizacin del sistema de biorreaccin

Esterilizacin del sistema de
biorreaccin

INTRODUCCIN

Una esterilizacin adecuada del medio de cultivo es importante para garantizar el xito
de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propsito, se emplea cualquier
mtodo capaz de destruir o separar a los microorganismos contaminantes indeseables.
La tcnica ms comn es la destruccin de los microorganismos contaminantes. El
trmino destruccin, en este caso, significa la prdida de viabilidad del microorganismo.

La destruccin de microorganismos se puede llevar a cabo por varios mtodos:
1. Calor, ya sea seco o hmedo
2. Agentes qumicos
3. Radiaciones
4. Vibraciones snicas



65
El mtodo ms comnmente utilizado para medios lquidos es el de calor hmedo ya
que es simple, confiable y econmico.

Cintica de muerte trmica de microorganismos

Generalmente se clasifica la velocidad de muerte de los microorganismos en: velocidad
de muerte logartmica y velocidad de muerte no logartmica.

Velocidad de muerte logartmica

La velocidad de muerte logartmica se puede expresar matemticamente mediante la
ecuacin:

-
dN
dt
kN = (1)

Separando variables e integrando.

ln
N
No
kt = (2)
N
No
kt = exp( ) (3)

La ecuacin (3) describe apropiadamente la cintica de muerte trmica de clulas
vegetativas.



66
Velocidad de muerte no logartmica

Este tipo de comportamiento de muerte trmica se encuentra a menudo en esporas
bacterianas. Se proponen varias explicaciones para esta conducta: germinacin de
esporas, tcnicas experimentales deficientes, impactos mltiples para la inactivacin y
eventos secuenciales en la induccin de muerte.

El modelo de eventos secuenciales propone que la muerte ocurre de la siguiente
manera:

N N N
R
k
S
k
D
R S
(4)

Se propone que una espora resistente N
R
sufre inactivacin o muerte a un estado final
N
D
a travs de un intermediario sensible N
S
.

Se establecen las ecuaciones diferenciales:

dN
dt
k N
R
R R
= (5)

dN
dt
k N k N
S
R R S S
= (6)

La solucin a estas ecuaciones diferenciales simultneas es:

( ) ( )
= t k exp
k
k
t k exp
k k
k
N
N
R
R
S
S
S R
R
0
(7)



67
Efecto de la temperatura sobre la cintica de muerte

Considerando la muerte trmica de los microorganismos de manera similar a las
reacciones qumicas, la relacin entre las constantes cinticas y la temperatura
presenta un comportamiento anlogo. La teora ms frecuentemente empleada es la
teora de Arrhenius.

Esta relacin se expresa matemticamente como:

k A
E
RT
=

exp (8)

Esterilizacin por lote

En el proceso de esterilizacin por lote, el medio se coloca en el fermentador y el
contenido se calienta a la temperatura de esterilizacin asignada. Para establecer la
relacin entre tiempo y temperatura se puede utilizar la ecuacin (1). Sin embargo, k
durante la esterilizacin por lote no es constante ya que la temperatura durante el
calentamiento y enfriamiento varan. Incorporando el efecto de la temperatura
establecido por la ecuacin de Arrhenius la ecuacin queda:

= =

TOTAL
t
No
N
A
E
RT
dt ln exp
0
(9)

El smbolo representa el grado de destruccin en todo el proceso.

El ciclo de esterilizacin est formado por tres perodos:
1. Elevacin de temperatura o calentamiento.


68
2. Mantenimiento de temperatura
3. Descenso de temperatura o enfriamiento.
El perfil temperatura - tiempo durante la fase de calentamiento es funcin de varios
factores, por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calentamiento, ya sea
inyeccin directa de vapor, calentamiento indirecto a la chaqueta, mediante serpentines
o elctricamente. La tabla 1 muestra las relaciones tiempo temperatura de acuerdo a
la forma de transferencia de calor.



69

TIPO DE
TRANSFERENCIA DE
CALOR
RELACION
TEMPERATURA-
TIEMPO

a y b
Adicin de vapor al
medio
T To
at
bt
= +
+
1
1

(Hiperblica )
a
hs
MToC
=

b
s
M
=

Calentamiento con
dispositivo elctrico

( ) T To at = + 1

( lineal )

a
q
MToC
=
Calentamiento con vapor
(intercambiador de calor)

( )
T T be
H
at
= +

1

( exponencial )

a
Ua
MC
=

b
To T
T
H
H
=

Enfriamiento
(Intercambiador de calor)

( )
T T be
at
= +

1
a
WC
MC
e
Ua
MC
=

1

b
To T
T
=

Tabla 1. Relaciones tiempo temperatura de acuerdo a la forma de transferencia de
calor



70
OBJETIVO

El alumno disear el ciclo de esterilizacin para un medio de cultivo en un biorreactor.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Material y equipo
1. Fermentador de 12 litros.
2. Cronmetro
3. Cajas de Petri estriles.
4. Pipetas estriles.
5. Frascos de dilucin con agua estril.
6. Agar nutritivo
7. Mechero.
8. Esporas de Bacillus subtilis.

Trabajo experimental

1. Una vez montado el vaso conteniendo 12 litros de agua inocular con esporas de
Bacillus subtilis.
2. Establecer la temperatura de esterilizacin.
3. Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de esterilizacin,
en intervalos de un minuto.
4. Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos: al principio del ciclo de esterilizacin
(N
o
), al final del perodo de calentamiento (N
1
), al final del perodo de
mantenimiento (N
2
), y al final del perodo de enfriamiento (N
3
).
5. De cada una de las muestras tomadas, se hace una dilucin y se siembran por
duplicado en cajas de Petri utilizando la tcnica de vaciado en placas. Se
incuban a 30 C, hacer cuenta de colonias cada 24 h, durante tres das.


71

MUESTRA DILUCIN
N
O
10
-1
10
-5

N
1
10
-1
10
-5

N
2
10
-1
10
-3

N
3
10
-1
10
-2

INFORME

1. Presentar en un cuadro los valores de temperatura y tiempo para el ciclo de
esterilizacin. Graficar los perfiles para las etapas de calentamiento,
mantenimiento y enfriamiento.

2. Determinar los valores de (a) y (b) de las ecuaciones de temperatura en funcin
del tiempo para las etapas de calentamiento y enfriamiento.

3. Calcular el coeficiente global de transferencia de calor (U
iD
) para las etapas de
calentamiento y enfriamiento.

4. Con los valores de No, N
1
, N
2
y N
3
determinar el grado de destruccin para el
calentamiento, mantenimiento, enfriamiento y el
ciclo de esterilizacin
.

5. En el perodo de mantenimiento determinar el valor de la energa de activacin
conociendo el valor de la constante de Arrhenius: A = 7.49 X 10
38
min
-1
.

6. Elaborar un cuadro de valores de (k) en funcin del tiempo y trazar la grfica
correspondiente. Obtendr el grado de destruccin para calentamiento,


72
mantenimiento, enfriamiento y total por integracin grfica en la curva anterior y
por algn mtodo numrico.

7. En el caso de que la esterilizacin haya sido deficiente, recalcular el tiempo de
mantenimiento, suponiendo los criterios de diseo de calentamiento y
enfriamiento constantes y una poblacin final de microorganismos viables de 10
-3

( probabilidad de que en mil lotes de esterilizacin, uno resulte contaminado).

8. Realizar el escalamiento de las etapas de calentamiento, mantenimiento y
enfriamiento para un volumen de 10,000 litros de medio de cultivo. Graficar los
perfiles de temperatura vs. Tiempo para ambas escalas. El escalamiento se
efectuar con base al criterio de (P/V).

9. Discutir los perfiles obtenidos en ambas escalas con base en las siguientes
variables: volumen de trabajo, rea de transferencia de calor, coeficiente global
de transferencia de calor, flujo de vapor y flujo de agua de enfriamiento.

10. Calcular los tiempos del ciclo de esterilizacin para ambas escalas cuando se
usa una temperatura de mantenimiento de 121 C, No =10
6
UFC/mL y N =10
-3
. Discutir estos resultados.

11. Exponer sus conclusiones.



73
NOMENCLATURA

a - rea de transferencia de calor: calcularla experimentalmente
A - Constante de Arrhenius, min
-1
.
C - Calor especfico del medio de cultivo, kcal/ kg C
C - Calor especfico del elemento enfriador, kcal / kg C
E - Energa de activacin, cal / g mol, kcal / kg mol
h - Entalpa relativa al medio. kcal / kg (entalpa del vapor a la temperatura del medio
de cultivo).
k - Constante especfica de velocidad de muerte, min.
-1
k
R
- Constante especfica de inactivacin de esporas resistentes.
k
s
- Constante especfica de intermediarios sensibles.
M - Masa inicial del medio, kg.
N - Concentracin de microorganismos en el tiempo t
No - Concentracin de microorganismos t
o

N
1
- Concentracin de microorganismos t
1

N
2
- Concentracin de microorganismos t
2
N
3
-

Concentracin de microorganismos t
3

N
D
-Concentracin de esporas inactivas.
N
R
-Concentracin de esporas resistentes.
N
S
- Concentracin de esporas sensibles
q - Velocidad de transferencia de calor, kcal / s
R - Constante Universal de los gases, 1.98 cal / g Mol K
s - Gasto masa de vapor, kg / s, kg / h, kg / min.
t - Tiempo, min, h.
T - Temperatura absoluta K
T
0
- Temperatura inicial del medio K
T
H
- Temperatura de la fuente de calentamiento K
T
- Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 K

U - Coeficiente global de transferencia de calor, kcal / m
2
h C
W - Gasto masa del elemento enfriador: calcularla experimentalmente


74
BIBLIOGRAFA

1. Abbot, F.J ., Clamen, A., 1973. Biotechnol. Bioeng. 15:117-127.
2. Bailey, J .E., Ollis, D.F. 1977. Biochemical engineering fundamentals. McGraw-Hill,
Inc.
3. Deindoerfer, F.H. y Humphrey, A.E., 1959. Appl. Microbiol. 7: 256-264.
4. Richards, J .W., 1961. Progress in Ind. Microbiol. 5: 143-173.
5. Wang, I.C.D., y col. 1979. Fermentation and Enzyme Technology. J ohn Wiley, N. Y.



75
PRCTICA 8

Prctica 8. Produccin de biomasa en cultivo por lote

Produccin de biomasa en
Cultivo por lote

INTRODUCCIN

Los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: cerrados, abiertos y sistemas
semicerrados. Al primer grupo pertenece el cultivo por lote empleado tradicionalmente
desde el siglo antepasado en el cual una vez iniciada la fermentacin ya no existe
entrada ni salida de materiales.

Hasta la fecha la gran mayora de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo
en cultivo por lote. Este consiste en agregar al fermentador un medio de cultivo que
contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo y/o para la
produccin de un metabolito. El medio despus de ser esterilizado y enfriado a la
temperatura de fermentacin, se inocular con el microorganismo para permitir su
desarrollo y produccin del metabolito, hasta un tiempo en el cual ocurre el agotamiento
de uno o ms nutrientes del medio de cultivo. Terminada la fermentacin, se cosecha la
totalidad del volumen de mosto o medio agotado para recuperar el producto.


76
Ya vaco el fermentador se limpia y lava perfectamente para permitir la siguiente
fermentacin. La determinacin de los parmetros cinticos de un cultivo por lote tiene
la finalidad de conocer, predecir y controlar la fermentacin misma. El cultivo por lote
tiene la particularidad de que todos los parmetros cinticos varan con el tiempo de
fermentacin. Los valores obtenidos de estos parmetros son lo suficientemente
confiables si las determinaciones se realizan adecuadamente durante el proceso de
fermentacin.

OBJETIVO

El alumno determinar los parmetros cinticos de la levadura Candida utilis creciendo
en condiciones ptimas en un cultivo por lote.

MATERIALES Y MTODOS

Equipo
1. Autoclave (15 L de capacidad).
2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 litros).
4. Electrodo de pH esterilizable.
5. Medidor controlador de pH.
6. Bombas peristltica (0 a 2 L/h).
7. Placas de calentamiento y agitacin.
8. Espectrofotmetro (rango: visible y UV).
9. Centrfuga clnica (0 a 5000 rpm).
10. Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad.).
11. Estufa.
12. Equipo de filtracin con vaco.



77

Microorganismo
Candida utilis

La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) a una temperatura de 4
0
C.

Medios de Cultivo
Cuadro 1. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO POR LOTE
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.73 1.365
NaH
2
PO
4
1.2637 1.2637
Extracto de levadura 0.990 0.990
* FeSO
4
7H
2
O
* CuSO
4
5H
2
O
* ZnSO
4
H
2
O
* Na
2
MoO
4
2H
2
O
* MnSO
4
H
2
O
Emplear agua de la llave

(*) Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL)
a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
V
sales
(mL) =0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inculo).


78
Mtodos analticos

Determinacin de la concentracin celular (x)

Procedimiento: A las membranas puestas previamente a peso constante y colocadas
sobre el dispositivo de filtracin se les adiciona 5mL de suspensin celular y se filtra al
vaco. Se separa el filtrado, y el paquete celular se lava con 5mL de agua destilada y se
filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse con el primero). El paquete
celular lavado se coloca en una estufa a 60
0
C durante 24 horas. La concentracin
celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza
analtica).

Determinacin de azcares reductores por DNS

Reactivos:

1g de cido 3,5- dinitrosaliclico se disuelve en 20ml de NaOH 2N, se agregan despus
50ml de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se lleva a un volumen
de 100ml.

Procedimiento:

A 1mL del filtrado se le adiciona 1mL del reactivo DNS, se coloca en bao mara a
ebullicin durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua
destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el
espectofotmetro.

Curva tipo de glucosa.
Elaborar una curva tipo de glucosa con volmenes de 0.1 a 1mL de solucin patrn de
1.0 g/Lde glucosa.


79


Preparacin del inculo
Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500ml) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a 15
lb/in
2
durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5mL del mismo medio sobre la cepa en
tubo inclinado, en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una agitadora (110
golpes/minuto) a una temperatura de 35
0
C durante 18 horas.

Cultivo por lote

A) Se preparan 1620 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a
4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se esteriliza en el
autoclave a 15 lb/in
2
, 15 min. Tambin se esterilizan, conjuntamente, los recipientes que
contienen el antiespumante y el lcali.

B) El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitacin, venteo,
agua de enfriamiento, etc. y despus se inocula con los dos matraces del inculo, en
condiciones aspticas: El cultivo por lote operar bajo las siguientes condiciones:
velocidad de agitacin : 500 rpm
aireacin : 1 vvm
temperatura : 35

C
pH (con NH
4
OH 2N) : 3.8
antiespumante (PPG-10%): de acuerdo a la formacin de espuma

C) Se tomarn muestras cada hora para la determinacin de la concentracin celular
por peso seco y turbidimetra, y azcares residuales por el mtodo del DNS. Las
determinaciones se harn por duplicado. El cultivo por lote durar aprox. 10 horas
durante las cuales el pH ser controlado con NH
4
OH 2N.


80

D) Procesamiento de muestras.
Las muestras se tratarn bajo el esquema de la figura 1.

(10mL)

(5mL) (5mL)

Figura 1. Procesamiento de las muestras.

MUESTRA
Determinacin de conc.
celular por turbidez
Filtracin al vaco
Filtrado
Paquete celular
Adicionar 5 mL de
agua destilada y filtrar
de nuevo
Determinacin de
glucosa residual
Determinacin de la
conc. celular por peso
seco


81
INFORME

1. Presentar los resultados en el cuadro 2.
2. Presentar las curvas tipo de concentracin celular y de glucosa.
3. Elaborar los siguientes grficos:
a) Concentracin celular (x) vs. Tiempo (identificar las fases del crecimiento).
b) Concentracin residual de glucosa (s) vs. Tiempo
c) Logaritmo natural de la concentracin celular vs. Tiempo (solo para la fase
exponencial)
4. Determinar los siguientes conceptos:
a) Velocidad especfica de crecimiento () a cada tiempo de cultivo.
b) Velocidad especfica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo de cultivo.
c) Velocidad especfica de crecimiento mxima (max).
d) Rendimiento celular con base al consumo de sustrato (Yxs) a cada tiempo de
cultivo.
e) Rendimiento celular global con base al consumo de sustrato (Yxs(global)).
f) Constante de afinidad por le sustrato (Ks).
g) Productividad celular global (Rx global).

DISCUSIN DE RESULTADOS

El alumno discutir los resultados obtenidos en la prctica.

RESUMEN

El alumno elaborar un resumen de la prctica.



82
BIBLIOGRAFA

1. Dunn, I.J ., Mor, J .R. 1975. Variable-volumen continuous cultivation. Biotechnol.
Bioeng. 17: 1805-1822.
2. Pirt, S.J . 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Black Well Scientific
Publications, London.
3. Whitaker, A. 1980. Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15.
4. Yaman, T., Hirano, S. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant feed
of substrate: A mathematical simulation. J . Ferment Technol. 55:156-165.



83
Cuadro 2. Resultados del cultivo por lote.

TIEMPO DE

Concentracin celular (por
turbidimetra)

Concentracin celular
(por peso seco)

Glucosa residual
HORA CULTIVO

(h)
No.
de
tubo
Dilucin. Lectura g/L No.
de
tubo
pms pmcs g/L tubo Lectura Dilucin g/L
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pms : peso membrana seca
pmcs: peso membrana ms clulas
secas

Reunir todas las muestras y aplicar la
tcnica de
Curva tipo de biomasa

pendiente (m) =
DNS, empleando 2 controles de 0.4 y
0.8 g/L de glucosa
ordenada (b) = 0.4 g/L _________
0.8 g/L _________

84

Cultivo por lote

Actividades

1. Membranas a peso constante (20 membranas).

2. Curva tipo de glucosa.

3. Curva tipo de concentracin celular

4. Preparacin del medio de cultivo para el inculo /esterilizacin /enfriamiento /
inoculacin de los matraces con la cepa en tubo inclinado/ incubacin durante 18
horas.

5. Preparacin del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparacin del
fermentador / esterilizacin del fermentador con medio de cultivo y esterilizacin
del lcali y el antiespumante / enfriamiento / inoculacin con los matraces a el
fermentador / arranque de la fermentacin.

6. Toma de muestra cada hora del cultivo por lote/procesamiento de las muestras.

7. Descarga y lavado del fermentador.


85
PRCTICA 9

Prctica 9. Produccin de biomasa en cultivo por lote alimentado

Cultivo por lote alimentado

INTRODUCCIN

Generalmente los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: Sistemas
cerrados, Sistemas abiertos y Sistemas semicerrados. Al primer grupo pertenece el
cultivo por lote empleado tradicionalmente desde el siglo XIX, en el cual una vez
iniciada la fermentacin ya no hay entrada ni salida de nutrientes.

Los cultivos continuos (simple etapa; con recirculacin; y mltiple etapa; principalmente)
pertenecen al segundo grupo, en donde existe entrada (nutrientes) y salida de
materiales (nutrientes no consumidos, biomasa y metabolitos).

En los sistemas semicerrados slo ocurre entrada de nutrientes, pero no salida de
materiales, por lo que tambin se les conoce como sistemas de volumen variable.
Tambin a este tipo de sistemas se les denomina genricamente como cultivos
Fedbatch (trmino introducido por Yoshida en 1973) porque operativamente inician con

86
un cultivo por lote, y al finalizar ste, se inicia la alimentacin de nutrientes al
biorreactor. A su vez, por la forma de suministro de los nutrientes, pueden clasificarse
en cultivos con alimentacin a flujo variable flujo constante. A este ltimo pertenece el
cultivo objeto de esta prctica: cultivo por lote alimentado a flujo cte. ( Fedbatch
Lineal).

Hasta antes de la dcada de los setentas, el cultivo Fedbatch Lineal vena
emplendose empricamente, pero diseado, en principio, para ser ms productivo que
el cultivo por lote. Fue en 1975 cuando Pirt
(2)
report un tratamiento matemtico de este
sistema, el cual consiste en el conjunto de ecuaciones diferenciales del sistema que
describen a las velocidades volumtricas de acumulacin de materiales en el
biorreactor, es decir, la aplicacin de la ecuacin general de balance para biomasa,
sustrato y producto (Acumulacin =Entrada - Salida +Generacin).

Como toda resolucin de sistemas de ecuaciones, la resolucin del sistema de
ecuaciones diferenciales que describen este cultivo, nos dar las funciones (x, s, p) =
f(t), es decir, podremos conocer, a cualquier tiempo del cultivo, los valores de la
concentracin de biomasa, sustrato residual y del metabolito de inters. Dado que todas
las variables son dependientes del tiempo, no existe solucin analtica al sistema de
ecuaciones diferenciales, por lo que debe resolverse utilizando algn mtodo numrico
(el ms usual es el de Runge-Kutta de cuarto orden).

Sin embargo, pueden encontrarse dos soluciones particulares a este sistema bajo las
siguientes condiciones:

1. El suministro del sustrato limitante es mayor que lo demandado por el
microorganismo.

2. El suministro del sustrato limitante es menor que lo demandado por el
microorganismo.


87
En el primer caso puede existir acumulacin y desacumulacin de la concentracin del
sustrato residual, durante el tiempo necesario para alcanzar el volumen final del
biorreactor, y dependiendo de los valores del flujo de alimentacin y de la concentracin
del sustrato limitante, pueden calcularse las concentraciones celular y de producto a
cualquier tiempo. Debido a este exceso en el suministro del sustrato limitante el
microorganismo crecer a su mxima velocidad de crecimiento.

Para el segundo caso, como la demanda es mayor que el suministro, todo (o casi todo)
el sustrato limitante suministrado es completamente consumido por el microorganismo,
por lo que la concentracin del sustrato residual durante el cultivo es muy baja. Bajo
esta condicin el microorganismo ajusta su maquinaria metablica al bajo suministro del
sustrato, ocasionando limitacin en su crecimiento que se ve reflejado en una baja
velocidad de crecimiento.

Tambin, el clculo de la concentracin celular y de producto podrn determinarse
resolviendo el sistema de ecuaciones bajo las condiciones de este segundo caso, y
cuyos resultados dependern de los valores del flujo de alimentacin y concentracin
del sustrato limitante.

OBJETIVO

El alumno conocer y realizar un cultivo por lote con alimentacin constante
empleando Candida utilis, y comprobar que este sistema fermentativo es de mayor
productividad y rendimiento que el cultivo por lote.


88
MATERIALES Y MTODOS

Equipo
1. Autoclave (15 L de capacidad).
2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 6 litros).
5. Medidor controlador de pH.
6. Electrodo de oxgeno disuelto.
7. Medidor de oxgeno disuelto.
8. 2 Bombas peristltica (0 a 2 L/h).
9. 2 Placas de calentamiento y agitacin.
10. Espectrofotmetro (intervalo: visible y UV).
12. Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad).
13. Estufa con vaco.

Microorganismo utilizado: Candida utilis.

La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
0
C.


89
Medios de Cultivo

COMPONENTE MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO POR LOTE
(g/L)
MEDIO PARA LA
ALIMENTACION
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0 40.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.73 1.365 3.64
NaH
2
PO
4
1.2637 1.2637 3.37
Extracto de levadura 0.990 0.990 2.64
* FeSO
4
7H
2
O
* CuSO
4
5H
2
O
* ZnSO
4
H
2
O
* Na
2
MoO
4
2H
2
O
* MnSO
4
H
2
O

(*) Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL)
a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
V
sales
(mL) =0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)

Mtodos Analticos

Determinacin de la concentracin celular (x)

Procedimiento: A las membranas puestas previamente a peso constante y colocadas
sobre el dispositivo de filtracin se les adiciona 5mL de suspensin celular y se filtra al
vaco. Se separa el filtrado, y el paquete celular se lava con 5mL de agua destilada y se
filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse con el primero). El paquete
celular lavado se coloca en una estufa a 60
0
C durante 24 horas. La concentracin

90
celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza
analtica).

Determinacin de azcares reductores

Reactivos:

1g de cido 3,5- dinitrosaliclico se disuelve en 20mL de NaOH 2N, se agregan despus
50mL de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se lleva a un volumen
de 100mL.

Procedimiento:

A 1mL del filtrado se le adiciona1mL del reactivo DNS, se coloca en bao mara a
ebullicin durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua
destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el
espectrofotmetro.

Curva tipo de glucosa.
Elaborar una curva tipo de glucosa con volmenes de 0.1 a 1mL de solucin patrn de
1.0 g/L de glucosa.


91


reparten en dos matraces (de 500mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in
2
durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5ml del mismo medio sobre la cepa
en tubo inclinado, en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una agitadora (110
golpes/minuto) a una temperatura de 35
0
C durante 18 horas.

Cultivo por lote

A) Se preparan 810 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a
4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se esteriliza en el
autoclave a 15 lb/in
2
, 15 min. Tambin se esterilizan, conjuntamente, los recipientes que
contienen el antiespumante y el lcali.

B) El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitacin, venteo,
agua de enfriamiento, etc. y despus se inocula con un matraz del inculo, en
condiciones aspticas: El cultivo por lote operar bajo las siguientes condiciones:

velocidad de agitacin : 500 rpm
aireacin : 1 vvm
temperatura : 35

C
pH (con NH
4
OH 2N) : 3.8
antiespumante (PPG-10%): de acuerdo a la formacin de espuma


92
Se tomarn muestras slo al inicio y al final del cultivo por lote el cual durar 12 horas.
A las muestras se les determinar concentracin celular por peso seco (y turbiedad) y
glucosa residual por el mtodo del DNS.

Cultivo por lote alimentado constantemente (Feed-batch Lineal)

A) Se preparan 900 mL de medio de cultivo para el cultivo Fed Batch Lineal y se ajusta
el pH a 4.0. El medio se prepara en un matraz de 2 litros, y se esteriliza junto con la
manguera de adicin y el "medidor" de flujo (pipeta), a 15 lb/in
2
durante 15 min.

B) Se calibra la bomba peristltica, previamente al paso anterior, a un flujo de 180 mL/h,
que ser el flujo de adicin para el cultivo alimentado.

C) Una hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del matraz que
contiene el medio estril a la bomba peristltica y a la entrada del fermentador en
condiciones aspticas. Al finalizar el cultivo por lote se inicia la alimentacin del medio
de cultivo. Esta adicin terminar cuando se agoten los 900 mL de medio de cultivo.

Este cultivo operar bajos las mismas condiciones de operacin del cultivo por lote:
velocidad de agitacin, aireacin, T, pH, etc.

Se tomarn muestras cada hora, las cuales sern procesadas de acuerdo a la siguiente
figura.


93
(10mL)

(5mL) (5mL)

Fig. 1. Procesamiento de las muestras.

MUESTRA
Determinacin de conc.
celular por turbidez
Filtracin al vaco
Filtrado
Paquete celular
Adicionar 5 mL de
agua destilada y filtrar
de nuevo
Determinacin de
glucosa residual
Determinacin de la
conc. celular por peso
seco

94
INFORME

1. Determinar max, Yx
/s
(global) y R
x
(global) de Candida utilis en el cultivo por
lote.

2. Para el cultivo alimentado elaborar las siguientes grficas (tericas y
experimentales):

a) Concentracin celular (x) vs. tiempo
b) Volumen de medio de cultivo alimentado (V) vs. tiempo
c) Biomasa total (X) vs. tiempo ; donde X =xV
d) Glucosa residual (s) vs. tiempo
e) Velocidad especfica de crecimiento () vs. tiempo

3. Estimar los valores de la productividad celular global (Rx
global
) y el rendimiento
celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s
global
) en el cultivo por lote
alimentado constantemente.


El alumno discutir los resultados obtenidos en la prctica.

RESUMEN

El alumno elaborar un resumen de la prctica.


95

BIBLIOGRAFA

1. Dunn, I. J ., Mor, J .R. 1975. Variable-volumen continuous cultivation. Biotechnol.
Bioeng. 17: 1805-1822.
2. Pirt, S.J . 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Black Well Scientific
Publications, London.
3. Whitaker, A. 1980. Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15.
4. Yaman, T., Hirano, S. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant feed
of substrate: A mathematical simulation. J . Ferment Technol. 55:156-165.


96
Cuadro 2. Resultados del cultivo por lote alimentado constantemente.

TIEMPO
DE

(por turbidez)

(por peso seco)

Glucosa residual

Metabolito de
inters

HORA CULTIVO

(h)
No.
de
tubo
dilu-
cin.
lec
tu-
ra
g/L No.
de
tubo
pms pmcs g/L tubo lec-
tura
dilu-
cin
g/L

Cultivo por lote alimentado constantemente
Flujo =180 mL / hora

Condiciones de
Fermentacin:
Agitacin: 500 rpm
Aireacin: 1 vvm
Temperatura: 35 C
pH : 3.8

V
op
=__________

pmcs: peso membrana ms
clulas secas
Reunir todas las
muestras y aplicar la
tcnica de

Curva tipo de biomasa

pendiente (m) =
DNS, empleando 2
controles de 0.4 y 0.8 g/l
de glucosa

ordenada (b) = 0.4 g/L _________
0.8 g/L _________


97
Fed Batch Lineal

Actividades:

inoculacin de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
fermentador / esterilizacin del fermentador con medio de cultivo / enfriamiento /
inoculacin con los matraces a el fermentador / desarrollo del cultivo por lote /
muestreo: inicio y al final.
4. Preparacin del medio de cultivo para la alimentacin / esterilizacin en matraz
junto con las tuberas y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento / alimentacin
constante (a un flujo previamente determinado) del medio al fermentador.
5. Toma de muestras (cada hora) del cultivo alimentado / determinacin de
absorbancia / determinacin de peso seco / determinacin de glucosa residual.
6. Calibracin, previa, de la bomba peristltica para el flujo determinado
(preparacin de las mangueras, conexiones, pinzas, pipeta graduada, etc.)

98
PRCTICA 10

Prctica 10. Produccin de biomasa en cultivo continuo

Cultivo continuo

INTRODUCCIN

El cultivo continuo simple etapa pertenece al grupo denominado Sistemas
Fermentativos Abiertos. En este sistema hay una entrada y salida de materiales:
suministro continuo de nutrientes, y salida continua de biomasa, sustrato residual y
producto. Operativamente el flujo de entrada es igual al flujo de salida por lo que el
volumen de operacin del biorreactor permanece constante durante todo el cultivo.

Fue en la dcada de los sesentas cuando se iniciaron los primeros estudios
experimentales y tericos acerca del cultivo continuo. En estos estudios se propuso la
Teora del Quimiostato, la cual a grandes rasgos, establece que al trabajar un volumen
constante en cultivo continuo, y despus de un determinado tiempo (el necesario para
realizar dos o tres recambios del volumen de trabajo), ste alcanza un estado de
equilibrio dinmico donde las concentraciones de biomasa, sustrato residual y producto

99
permanecern constantes en el tiempo. Esta teora tambin predice que cuando se
cambien los flujos de alimentacin y remocin de caldo (los cuales a su vez deben ser
iguales entre s para mantener la condicin de volumen constante) el sistema se
alterar y finalmente alcanzar un nuevo equilibrio dinmico donde las concentraciones
de biomasa, sustrato residual y producto ya no variarn en el tiempo pero sus valores
sern ms o menos los mismos independientemente de los flujos. Sin embargo,
tambin predice que cuando los flujos de trabajo son ms elevados que el valor de la
velocidad especfica mxima de crecimiento, el sistema se quedar sin clulas,
condicin conocida como lavado del fermentador, debido a que se ha rebasado la
capacidad del microorganismo para metabolizar los nutrientes que le son suministrados
a altas velocidades.

En un quimiostato (biorreactor de laboratorio operando en continuo) una vez que se ha
alcanzado el estado de equilibrio, se crean ambientes constantes que permiten
mantener indefinidamente un determinado estado fisiolgico del microorganismo. Y en
este estado la velocidad especfica de crecimiento es constante y por ende lo son
tambin el resto de las velocidades especficas de consumo de sustrato, de produccin
del metabolito, de consumo de oxgeno, y de generacin de calor.

As, uno de los principales usos del quimiostato es el de la caracterizacin cintica de la
produccin de metabolitos empleando un determinado microorganismo, en un
determinado medio de cultivo y en determinadas condiciones de cultivo.

Con todo lo anterior, en un cultivo continuo puede controlarse y mantenerse aquella
velocidad especfica de crecimiento donde el microorganismo produzca la mayor
cantidad de aquel metabolito que se desea obtener, siendo sta la principal
caracterstica por la que fueron diseados los sistemas de fermentacin continuos.


100

OBJETIVO

El alumno determinar los parmetros cinticos de Candida utilis creciendo en
condiciones ptimas en un cultivo continuo.

MATERIALES Y MTODOS

Equipo

1. Autoclave (15 litros de capacidad).
2. Bao metablico de Temperatura controlada.
3. Fermentador con panel de control (2 6 litros).
5. Electrodo de oxgeno disuelto.
6. 3 Bombas peristlticas (0 a 2 L/h).
7. 2 Placas de calentamiento y agitacin.
8. Espectrofotmetro (intervalo: 200 a 700 nm).
10. Balanza analtica (0 a 200 g de capac.).
11. Estufa con vaco.

Microorganismo utilizado: Candida utilis.

La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
0
C.

101
Preparacin de medios de cultivo


COMPONENTE
MEDIO PARA
EL INOCULO

(g/L)
MEDIO PARA
EL CULTIVO
POR LOTE (g/L)
MEDIO PARA
EL CULTIVO
CONTINUO
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0 20.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.73 2.73 1.82
NaH
2
PO
4
1.2637 1.2637 1.685
Extracto de levadura 0.990 0.990 1.32
* FeSO
4
7H
2
O
* CuSO
4
5H
2
O
* ZnSO
4
H
2
O
* Na
2
MoO
4
2H
2
O
* MnSO
4
H
2
O

(*) Todas las sales estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL) a
emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
V
sales
(mL) =0.05 [ conc. de glucosa (g/L) ] [ volumen medio (L) ]

Mtodos Analticos

Determinacin de la concentracin celular
Procedimiento: el mismo de la prctica 8.

Determinacin de azcares reductores (DNS)
Reactivos: los mismos de la prctica 8.
Procedimiento: el mismo de la prctica 8.
Curva tipo de glucosa: la misma de la prctica 8.

102


reparten en dos matraces (de 500ml) con 100 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in
2
durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5mL del mismo medio sobre la cepa
en tubo de medio inclinado en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una
agitadora (110 golpes/minuto) a 35
0
C durante 18 horas.

Cultivo por lote
A) Se preparan 900mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a
4.0. El medio preparado se pasa al fermentador (previamente preparado este ltimo) y
se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in
2
, 15 min. Tambin se esterilizan los recipientes
que contienen el lcali y el antiespumante.

B) El fermentador cargado con el medio estril, se coloca en el sistema de agitacin,
venteo, agua de enfriamiento, etc. y despus se inocula con un matraz del inculo, en
condiciones aspticas: El cultivo por lote operar bajo las condiciones descritas en el
cuadro 2.

Cuadro 2. Condiciones de cultivo
PARAMETROS CONDICIONES
Velocidad de agitacin 500 rpm
Aireacin 1 vvm
Temperatura 35 C
pH (con NH
4
OH 2N) 3.8
Antiespumante Polipropilenglicol al 10%


103
Se tomarn muestras al inicio y al final del cultivo por lote y ste durar 12 horas. A las
muestras se les debe determinar concentracin celular por peso seco (por filtracin) y
sustrato residual por el mtodo del DNS.

Cultivo continuo

A) Se preparan 3.0 litros de medio de cultivo para el cultivo continuo y se ajusta el pH a
3.8. El medio se prepara en un recipiente que lo contenga totalmente, y se esteriliza
junto con mangueras y conexiones a 15 lb/in
2
durante 15 min. Esta misma cantidad de
medio de cultivo se prepara y esteriliza para cada velocidad de dilucin.

B) Previamente al paso anterior se calibra la bomba peristltica, que adicionar el
medio de cultivo, a un flujo de 0.1 L/h para la 1 velocidad de dilucin.
Para las restantes velocidades de dilucin (D) la bomba se calibrar a los siguientes
flujos:

D (h
-1
) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
F (L/h) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

C) Media hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del recipiente
que contiene el medio estril a la bomba y al puerto de suministro del fermentador, en
condiciones aspticas.

Al terminar el cultivo por lote se inicia el suministro continuo del medio de cultivo al
fermentador. El fluido de salida se recibe en otro recipiente el cual es marcado con la
hora a la cual se inici el suministro de medio (el fluido de salida sale a travs del tubo
capilar colocado previamente en el fermentador).


104
El cultivo continuo operar en todas las velocidades de dilucin bajo las mismas
condiciones de agitacin (500 rpm), aireacin (1 vvm), temperatura (35 C), pH (3.8) y
control de la espuma.

D) Se recomienda que cinco minutos antes de terminar la adicin de todo el medio de
cultivo para la 1 velocidad de dilucin, se tome muestra para la determinacin de
concentracin celular y glucosa residual.

Esto mismo se repite para cada una de las velocidades de dilucin restantes. Tambin
se deben tomar 2 mL del medio alimentado para determinar la concentracin de
glucosa.

E) Al finalizar la adicin de todo el medio del cultivo para la 1 velocidad de dilucin, se
inicia inmediatamente la adicin del siguiente medio de cultivo (preparado y esterilizado
previamente) para la segunda velocidad de dilucin y al segundo flujo de adicin. Esto
mismo se repite para las velocidades de dilucin restantes.

F) En cada velocidad de dilucin tomar una pequea muestra para observarla al
microscopio y detectar cualquier contaminacin. Si esto ocurre, detener la fermentacin
y repetir la velocidad de dilucin que se estaba trabajando.


105
INFORME

1. Determinar Y
x/s
(global) y R
x
(global) de Candida utilis en el cultivo por lote.

2. Para el cultivo continuo elaborar lo siguiente:
a) Tabular los valores de concentracin celular (x), glucosa residual (s),
rendimiento celular en base al consumo de sustrato (Y
x/s
), velocidad especfica
de consumo de sustrato (q
s
) y la productividad celular (R
x
) en funcin de la
velocidad de dilucin (D).
b) Grfica de la concentracin celular (x) v.s. velocidad de dilucin (D).
c) Grfica de la concentracin de glucosa residual (s) v.s. velocidad de dilucin
(D).
d) Grfica de la productividad celular (R
x
) v.s. velocidad de dilucin (D).
e) Grfica de la velocidad especfica de consumo de sustrato (qs ) v.s. velocidad
de dilucin (D).
e.1) Obtencin de los valores de (m) y (Y
g
).
f) Grfica de la velocidad especfica de consumo de oxgeno (qo2 ) v.s. velocidad
de dilucin (D).
f.1) Determinacin de (mo
s
) y (Yo
g
).
si H
glucosa
=3.74 k
cal
/g ; H
celulas
=5.61 k
cal
/g
g) Grfica de la velocidad especfica de genracin de calor (qk) v.s. velocidad de
dilucin (D).
g.1) Determinacin de (mk) y (Y
kg
).

El alumno discutir los resultados obtenidos en la presente prctica.

RESUMEN
El alumno elaborar un resumen de la presente prctica.


106
BIBLIOGRAFA

1. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
2. Tempert, D.W. 1970. The continuous cultivation of micro-organisms. I. Theory of the
Chemostat. Methods in Microbiology. Vol. 2. Academic. Press.
3. Herbert, A., Elsworth, F., Telling, H. 1956. The continuous culture of bacteria; a
theoretical and experimental study. J ournal of Microbiology 14, 601-622.


107

TIEMPO
DE

CONCENTRACION
CELULAR
(por turbidez)

CONCENTRACION
CELULAR
(por peso seco)

GLUCOSA
RESIDUAL

METABOLITO DE
INTERES

HORA CULTIVO

(h)
No.
de
tubo
dilu-
cin
lec
tu
ra
g/L No.
de
Mta
pms pmcs g/L No.
de
tubo
dilu-
cin
lectu
ra
g/L

Cultivo continuo de una etapa

HORA V
r
D F S
F
[x] [s]
t
o
t
f
(L) (h
-1
) (L/h) g/L Condiciones de
0.1 Fermentacin:
0.2 Agitacin: 500 rpm
0.3 Aireacin: 1 vvm
0.4 Temperatura: 35 C
0.5 pH : 3.8
M : membrana
pmcs: peso membrana mas
clulas secas.
Reunir todas las muestras
y aplicar la

tcnica de DNS,
empleando 2 testigos de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa

0.4 g/L _________
0.8 g/L _________


108

Cultivo continuo

Actividades:

inoculacin de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
fermentador / esterilizacin del fermentador con medio de cultivo /
enfriamiento / inoculacin con los matraces a el fermentador / desarrollo del
cultivo por lote / muestreo: inicio y al final.
4. Preparacin del medio de cultivo para cada VELOCIDAD DE DILUCIN /
esterilizacin en matraz junto con las tuberas y medidor (pipeta) de flujo /
enfriamiento / alimentacin (a un flujo previamente determinado) del medio al
fermentador.
5. Toma de muestras, 10 minutos antes de terminar la correspondiente
VELOCIDAD DE DILUCIN/ determinacin de absorbancia / determinacin de
peso seco / determinacin de glucosa residual.
6. Calibracin, previa, de la bomba peristltica para el flujo determinado para
cada VELOCIDAD DE DILUCIN (preparacin de las mangueras,
conexiones, pinzas, pipeta graduada, etc.).

Manual de Prácticas Del Laboratorio de Biorreactores2

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Manual de Prácticas Del Laboratorio de Biorreactores2

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

=una constante (0.00382 0.00393 para Platino)

=una constante (1.48 1.51 para Platino)

- Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 K

You might also like