Boas prticas de laboratrio de microbiologia: assepsia e tcnicas de inoculao
de microorganismos.
O trabalho realizado visa atender princpios, com vistas sade do laboratorista e biossegurana, atravs do uso de equipamentos pessoais de proteo, a desinfeco e limpeza das bancadas e dos seus instrumentos de trabalho. Antes de qualquer procedimento ser realizado sobre as bancadas, as mesmas devem passar por uma rotina de limpeza e desinfeco prvia. A bancada de trabalho deve estar a mais desimpedida possvel. Retirar adornos pessoais, das mos e dos antebraos. Usar corretamente luvas, mscaras, jaleco, cala e sapato fechado. Passar detergente sobre a bancada. Passar papel toalha sobre a bancada para retirar o detergente de modo que voc no o passe no mesmo lugar. Com a bancada ainda mida passar lcool 70%. Ligar o bico de Bunsen aps quase completa evaporao do lcool na superfcie da bancada. Dispor direita do bico de Bunsen o material que vai ser inoculado e esquerda, o material que j foi inoculado. Flambar alas, agulhas e pinas antes e aps o uso. Seguir as normas de uso dos aparelhos. Materiais contaminados com microrganismos, inculos, placas de Petri que contm culturas e gar, utenslios utilizados nos experimentos microbiolgicos, entre outros, devem ser descontaminados antes de serem descartados e/ou limpos.
Os microorganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu crescimento. O uso da chama essencial para evitar contaminaes externas, por isso o material deve ser trabalhado sempre prximo chama do bico de Bunsen. A ala de platina flambada antes e aps a inoculao, mas deve-se ter cuidado de resfria-la antes de entrar em contato com o meio. H inmeras tcnicas de semeadura como: Meio liquido: tcnica visa inocular as culturas bacterianas ou fngicas dispostas em caldo ou em meio slido, em um meio lquido, com auxlio da ala de platina. Este desenvolvimento caracterstico de agitao constante em equipamento denominado Estufa Bacteriolgica Rotacional ou Shaker. Meio Slido Inclinado: A tcnica visa inocular as culturas bacterianas ou fngicas dispostas em caldo ou em meio slido, em um meio slido inclinado, com auxlio da ala de platina, fazendo estrias na superfcie do gar, prximo da chama do bico de Bunsen. Geralmente feita em tubos de ensaio, providos de tampas. Meio Slido em Placa: A tcnica visa inocular as culturas bacterianas ou fngicas dispostas em meio slido, em um meio slido em placa, com auxlio da ala de platina, fazendo o estriamento sobre a placa em trs posies distintas. A ala de platina deve ser flambada ao rubro, esfriada prxima da chama do bico de Bunsen, por alguns instantes, e imergida em caldo que contenha as culturas ou raspada sobre cultura desenvolvida superficialmente sobre o gar. O material da cultura fixado na ala deve ser espalhado sobre a placa, em dois ou trs setores, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do material sobre a placa, sem recarreg-la na cultura inicial. O sucesso da semeadura est em: fazer um grande nmero de estrias; no perfurar o meio (gar); no voltar a ala sobre a estria; pegar pequena quantidade de material para semear. Placa Pour-plate: Contagens de clulas viveis, que estima o nmero de clulas viveis em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais so ento inoculadas em meio slido. Aps a incubao dos meios, geralmente por 24 horas, o nmero de colnias contado. Espalhamento em placa: o inculo adicionado superfcie do meio contendo gar j solidificado. O inculo , ento, espalhado uniformemente na superfcie do meio atravs da utilizao de um basto de vidro com uma dobradura especial. Este mtodo mais empregado para bactrias que so muito sensveis ao calor, sendo destrudas durante a solidificao do gar no formando colnias, se fosse feito por Pour-plate. As bactrias no entram em contato com o gar fundido e crescem somente na superfcie do meio. 2. Estruturas externas parede celular bacteriana: morfologia e funo.
Glicoclice (cpsula): uma camada que fica ligada parede celular, como um revestimento externo, encobrindo a clula. De natureza polissacardica, pode ser composta por protenas ou glicoprotenas. Funes: Sustentao da clula em bactrias desprovidas de peptidioglicano verdadeiro; Reservatrio de gua e nutrientes; Resistncia fagocitose (capacidade invasiva de bactrias patognicas em hospedeiros); Aumentam a aderncia das bactrias em superfcies (biofilmes) e o poder infectante; Aumento da resistncia das bactrias a biocidas; Despejo de substncias de escria; Aumento do poder virulento, produzindo enfermidades.
Filamentos axiais: estrutura rgida, e com ela, mobilidade exclusiva. Emergem de ambos os extremos das clulas e as rodeiam em espiral por debaixo do envlucro. Funo: o movimento melhorado pelos filamentos axiais. Podem mover- se em ambas as direes.
Flagelos: formado de uma estrutura basal, um gancho e um longo filamento externo membrana. Seu comprimento geralmente maior que o da clula. So muito finos. Funo: confere movimento clula em velocidades muito elevadas.
Fimbrias (pelos, pilli): so apndices filamentosos proteicos. So menores, mais curtos e mais numerosos que os flagelos e no formam ondas regulares. No desempenham nenhum papel relativo mobilidade. Funes: A fmbria F, ou fmbria sexual, serve como condutor de material gentico durante a conjuno bacteriana; Stios de adsoro de vrus; So estruturas de aderncia s clulas de mamferos e outras superfcies e em tecidos nutrientes.
3. Estruturas internas parede celular bacteriana: morfologia e funo.
Plasmdios: pequenas molculas circulares de DNA, que se replicam de forma autnoma e independente. So de importncia para as clulas, pois podem agregar genes que determinam atividades como a resistncia a antibiticos, tolerncia a metais txicos, produo de toxinas e sntese de enzimas.
Componentes citoplasmticos: todos os componentes do interior do citoplasma da clula, envoltos pela membrana plasmtica (citoplasmtica). As principais estruturas que se encontram no citoplasma so DNA (nucleide), ribossomos, depsitos de reservas chamados incluses e vacolos gasosos.
Incluses: so estruturas de natureza qumica. Funo: reter substncia de reserva e subunidades de macro molculas para compor outras estruturas celulares.
Ribossomos: partculas citoplasmticas responsveis pela sntese proteica, compostas de RNA (60%) e protena (40%).
Vacolos gasosos: so vesculas gasosas individuais. As vesculas so cilindros ocos cobertos por protenas, organizadas de maneira a formar uma estrutura rgida somente permevel a gases e impermevel a gua ou solutos. Funo: manter a flotabilidade, de modo que as clulas possam permanecer na gua na profundidade adequada para receber suficiente quantidade de oxignio, luz e nutrientes.
Membrana plasmtica: uma estrutura que forma uma barreira responsvel pela separao do meio interno (citoplasma) e externo da clula. formada por fosfolipdios e protenas. As membranas plasmticas eucariticas contm esteroides (colesterol) e acares, ao passo que, as procariticas no contm esteroides, sendo menos rgidas. Funes: Barreira seletiva de nutrientes clula (permeabilidade a molculas e ons); Contm enzimas capazes de catalisar as reaes qumicas que rompem as substncias nutritivas (degradao de nutrientes) e produzem ATP (produo de energia), excreo de substncias inteis.
Material nuclear (nucleide): o nucleide ou DNA bacteriano, quando devidamente corado, pode ser visualizado com auxlio do microscpio ptico. A regio nuclear preenchida por fibrilas de DNA dupla hlice na forma de uma nica molcula de aproximadamente 1 mm de comprimento (desdobrada). O nucleide no apresenta cobertura nuclear (membrana) e podem assumir formas esfricas ou alargadas.
4. Parede celular bacteriana e a colorao de Gram:
Parede celular: estrutura constituda por aminocidos, acares, carboidratos e lipdios. Funo: Estrutura e proporciona a manuteno da forma bacteriana. Colorao de Gram usada para classificar microrganismos com base em suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular. A diferenciao encontrada em clulas Gram-negativas e Gram-positivas, justamente na composio qumica. O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptidioglicano e cido teicico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptidioglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdios, protenas e lipopolissacardeos.
Consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram- positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. Toda bactria absorve de maneira idntica o cristal violeta e o lugol, adquirindo a cor roxa devido ao complexo formado pelas duas substncias no citoplasma da clula. Entretanto, ao serem tratadas com o lcool, apresentam comportamentos diferentes: as Gram-positivas no se deixam descorar pelo lcool, enquanto as Gram-negativas o fazem sem qualquer dificuldade. As bactrias Gram-positivas mantm, ento, a cor roxa do complexo cristal violeta-lugol, e as Gram- negativas, que o perderam, tornam-se descoradas. Ao receber a fucsina, somente as ltimas bactrias se deixam corar, adquirindo a cor avermelhada do corante. Assim, quando se examina ao microscpico um esfregao bacteriano corado pelo mtodo de Gram, as bactrias Gram-positivas se apresentam na cor roxa e as Gram- negativas, de cor avermelhada.
5. Morfologia microscpica das clulas bacterianas:
As bactrias podem apresentar formas esfricas ou cocos; cilndricas ou bacilos; de espiral.
Bacilos: Cilndrica ou bastonete. Se dividem para formar poucos arranjos ou agrupamentos: os diplobacilos aparecem aos pares e os estreptobacilos ocorrem em cadeias. Alguns bacilos assemelham-se tanto aos cocos que, por isso, so chamados de cocobacilos.
Espiraladas: Espiralada ou helicoidal. Podem ter um ou mais espirais. Podem ser classificadas como vibries, quando tm corpo rgido, feito vrgulas; os espirilos, quando tm a forma de saca-rolhas e as espiroquetas, quando tm corpo flexvel e espiralado.
Cocos: Elipsoidal ou esfrica. Quando as bactrias em forma de cocos se dividem, as clulas podem permanecer unidas umas s outras, surgindo em decorrncia, cocos aos pares (diplococos), cadeias (estreptococos) e cachos (estafilococos).
6. Morfologia macroscpica de colnias bacterianas:
Tamanho e homogeneidade: o tamanho das colnias varia desde dimenses muito pequenas (puntiformes), com apenas uma frao de milmetros de dimetro, at colnias muito grandes, com 5 a 10 mm de dimetro.
Borda: a periferia das colnias pode formar muitos desenhos diferentes, dependendo da espcie. Pode ser inteira, ondulada, lobulada, denticulada, radiada ou franjada.
Elevao: as colnias podem ser achatadas, espraiadas, convexas (baixa e alta), umbilicada, centro saliente, mamilonada, papilfera.
Pigmentao da colnia (frente e verso): opaca, translcida ou com algum pigmento.
Pigmentao do miclio (frente e verso): se esteja presente opaco, translcido ou com algum pigmento (amarela, branca, preta, rsea, esverdeada, etc.).
Alterao de cor entre a borda e o centro: h alguma distino de colorao entre estas zonas na colnia?
Fluorescncia: fluorescente, no fluorescente ( luz UV 365 nm).
Forma: as colnias podem ser circulares, irregulares, radiadas, rizoides.
Textura: pode ser semelhante a consistncia da manteiga, facilmente removvel com a ala de platina: viscosa ou mucoide; fungos geralmente apresentam textura micelial ou filamentosa; seca ou quebradia.
Brilho (se viscosa): opaca, creo (com aspecto de cera de vela), vtreo, fosco.
Formao de setores: identificada como alteraes significativas na forma da colnia.
Presena de frisos ou nervuras: ausente, se presente: radiais, irregulares, onduladas, lobuladas, denticuladas ou franjadas.
Crescimento no gar: somente na superfcie, somente no fundo, distribudo.