Transformacin mediada por Agrobacterium de embriones maduros de Triticum
aestivum y Triticum durum
Transformacin gentica de plantas de cultivo de Agrobacterium mediada por co-cultivo es una eficiente y rentable mtodo para la entrega del gene. Monocotiledneas las plantas, incluidos los cereales importantes se pensaba antes de ser recalcitrantes a genes mediada por Agrobacterium transfer1, 2, pero el escenario ha cambiado en los ltimos aos. Coherente los esfuerzos de los investigadores en los cultivos de cereales han dado como resultado en el desarrollo de protocolos para la prestacin eficiente del gene a travs de Agrobacterium en rice3, 4, maize5, barley6 y el trigo Uno de los puntos clave de estos protocolos ha sido el uso de divisin activa clulas o los tejidos como los embriones inmaduros e inmaduros callos derivadas de embriones que se co ms cultivadas con Agrobacterium en presencia de inductores potentes de la virulencia genes8. Mooney y coworkers9 fueron los primeros en demostrar la herida independiente en el apego in vitro de Agrobacterium a los embriones de trigo. Posteriormente, Chen y Dale10 reportado una mayor frecuencia de la infeccin mediante la incubacin de exposicin meristemas apicales de semillas secas de trigo con Agrobacterium. El trabajo previo de este laboratorio tambin inform de la expresin transitoria de gus gen en meristemticas bases de las hojas, los callos, las semillas maduras y mesocotilo plntulas perforado siguientes co-cultivo con diferentes cepas y vectores de Agrobacterium tumefaciens11. Estable mediada por Agrobacterium transformacin de trigo y la transmisin de los transgenes a posteriores generaciones se han reportado por muchos workers7 ,12-15. No obstante, la aplicacin a gran escala de esta metodologa en diversos genotipos sigue siendo restringido. El presente estudio se centra tanto en el uso de extirpados maduros embriones y madura callos derivadas de embriones como principal explantes para la transformacin mediada por Agrobacterium de trigo pan (Triticum aestivum) y tambin los macarrones trigo (Triticum durum). El protocolo optimizado fue posteriormente utilizado para la introduccin de inhibidor de proteasa de patata (Pin 2) de genes en T. aestivum y T. durum, el el uso exitoso de los cuales haba conferido resistencia a los insectos en japonica rice16. El uso de inhibidores de la proteasa para genticos ingeniera de resistencia a los insectos en el trigo tambin se ha reported17. Aqu mostramos la transformacin mediada por Agrobacterium de T. aestivum y T. durum uso de embriones maduros como explantes destinatario. MATERIALES Y MTODOS Planta de los materiales y las condiciones de cultivo. Las semillas de T. aestivum cvs HD2329, PBW343 CPAN1676, y T. durum cvs PDW215, PDW233 y WH896 se obtuvieron de IARI, Nueva Delhi, as como la Direccin de Investigacin de Trigo, Haryana parcial, la India. Las semillas fueron inicialmente se lava con un detergente lquido (Teepol, Reckitt & Coleman, de la India) durante 1 minuto con agua del grifo, y superficie esterilizados con etanol absoluto durante 30 s seguida un 4% (v / v) de hipoclorito de sodio durante 30 min. Las semillas se lavaron bien con agua estril antes de madurar embrin de la escisin en una campana de flujo laminar. Embriones maduros fueron extirpados mediante la eliminacin de la parte del endospermo de la superficie esterilizada cariopsis con una cuchilla estril. Medium18 MS suplementado con 200 mg / l hidrolizado de casena y 100 mg / l de inositol designado como MSE19, se utilizados en esta investigacin. El pH del medio de cultivo se ajust a 5,8 con 1,0 M NaOH / HCl. Despus del ajuste de pH, Phytagel (0,4%) fue aadido como la gelificacin agente (Sigma, EE.UU.) y en autoclave a 121 C y 1,08 kg/cm2 de presin durante 15 minutos. Madura a lo largo de embriones con el escutelo adjunto se colocaron en el medio MSE2 con el eje embrionario lado hacia abajo, como la germinacin precoz de embriones maduros fue drsticamente reduce cuando los embriones fueron colocados de forma. Los explantes se cultivaron en MSE2 durante tres semanas en un lugar oscuro a 26 1 C con subcultivo regular a intervalos semanales. Los diferentes medios de comunicacin utilizados se enumeran en la Tabla 1.
Cepa bacteriana y los vectores del plsmido A. tumefaciens strain 20 LBA4404 y los vectores binarios (P35SGUSINT, pBI101:: Ley y pCAMBIA3301:: pin 2) fueron empleados para las transformaciones mediada por Agrobacterium. Para la evaluacin de los parmetros involucrados en Agrobacterium transformaciones mediadas, las construcciones pCAMBIA1301, pCAMBIA2301 y pCAMBIA3301 tambin utilizados. Para la construccin del vector binario pBI101:: A1, el arroz ACT1-5 regin se ha escindido del plasmid21 pDM302 como un fragmento HindIII de 1,5 kb y se clon en el vector pBI101 (Clontech). Para la construccin de pCAMBIA3301 :: Pin2, el cassette de expresin de la papa inhibidor de la proteasa (pin2) del gen fue suprimido en un 3,0 kb PstI fragmento del pTWa vector de 16 y clonado en pCAMBIA3301 (ref. 22). El binario vector23 p35SGUSINT fue aislado de la cepa GV2260 Agrobacterium y movilizado por triparental mating24, 25 en A. tumefaciens cepa LBA4404. Transformacin Los cultivos bacterianos fueron iniciadas por la inoculacin de 50 l de accin del glicerol en 30 ml de medio LB + (medio LB suplementado con 0,5% de glucosa) con 100 g / ml de rifampicina, 100 g / ml de sulfato de kanamicina y 200 M acetosiringona. Los cultivos se incubaron a 28 rpm C/200 . Por la transformacin de plantas, cultivos bacterianos con A600 (absorbancia a 600 nm) de un valor de 0,5 a 1,00 fueron elegidos. La extirpados embriones maduros o tres semanas de edad madura embrin callos obtenidos fueron inoculados por inmersin en suspensin bacteriana e incubando durante 1 hora despus de lo cual los explantes se transfirieron a medio MSE2As. Co-cultivo se realiz mediante la incubacin de las placas de Petri a los 28 C en oscuridad durante 2-3 das.
Seleccin y regeneracin de los transformantes. Despus de 2-3 das de co-cultivo, los explantes fueron lavados en MSE2Cef250 lquido para eliminar Agrobacterium y despus de varios lavados, puestos en las hojas estriles secante para eliminar el exceso de humedad y se transfiere a MSE2Cef250 medio suplementado con 100 mg / l paromomicina (por LBA4404 (PBI101: ACT1) y LBA4404 (p35SGUSINT)) o 5 mg / l fosfinotricina para LBA4404 (pCAMBIA3301:: pin2). La explantes maduras de embriones se cultivaron en MSE2Pm100Cef250 o MSE2P5Cef250 durante dos semanas. Explantes mostrando callosidades en el medio de seleccin fueron trasladados a un nuevo MSE2Pm100Cef250 o medio MSE2P5Cef250 y se mantendr durante diez das. Los callos maduras derivadas de embriones tambin cultivadas en MSE2Pm100Cef250 o MSE2P5Cef250 por tres semanas con una subcultura en el medio. Para la regeneracin, los explantes se transfirieron a MSER medio suplementado con 2,5 mg / l fosfinotricina 50 mg / l paromomicina. Despus de 10 das en MSERP2.5 o MSERPm50, los explantes se transfirieron a selectionfree medio de regeneracin y despus de otros 10 das, el plntulas regeneradas fueron trasladados a MS1 / 2 suplementado con 2,5 mg / l fosfinotricina o 50 mg / l paromomicina de elongacin de ramas. Las plntulas regeneradas fueron transferido a la transferencia de los enchufes (Sigma) y se mantuvo durante cerca de diez das hasta que el sistema de races firmemente establecido. plntulas enraizadas fueron transferidas a macetas que contenan una mezcla de soilrite (Kel perlita, Bangalore, India) y el jardn del suelo (1, 1) y ha crecido a la madurez en cmaras de crecimiento (Conviron, entornos de control limitada, Winnipeg, Canad) que funcionan en 21 a 18 C a las 16 h luz / 8 / ciclo de oscuridad. Las plantas se suministran con un lquido medium26 recomienda para el crecimiento de plntulas de trigo.
Ensayo de enzima. Ensayo GUS: La actividad del gen gus fue bien localizados histoqumicamente en los explantes o cuantitativamente determinada por el mtodo de espectrofluoromtrico de acuerdo con la protocolo descrito por Jefferson et al.27. Histoqumico localizacin de GUS se llev a cabo mediante la incubacin del tejido muestras de la noche a 37 C en tampn de histoqumica (0,1 M de tampn fosfato de sodio, pH 7,0, 50 mM EDTA; 0,5 mM K3Fe (CN) 6, 0,5 mM K4Fe (CN) 6, 0,1% Triton X- 100, 1 mg / ml de X-gluc (Amresco Inc., Ohio, EE.UU.)). Los explantes se lavaron a fondo con etanol al 70% antes de las observaciones mediante un estereomicroscopio (Nikon, SMZU). Para la estimacin cuantitativa de la actividad de gus, las muestras fueron incubaron con 300 l de tampn de ensayo GUS (1,0 mM MUG en tampn de extraccin GUS) a 37 C durante 15 horas y 900 l de dejar de tampn (0,2 M de Na2CO3), agreg. fluorescencia relativa de las muestras se midi en cubetas de cuarzo de slice, empleando unspectrofluorophotometer RF540 (Shimadzu, Japn) en una longitud de onda de excitacin de 365 nm y de emisin longitud de onda de 455 nm. Las unidades se convirtieron fluoromtricos en cantidad de 4-MU utilizando una curva de calibracin. Especficos actividad se expresa en trminos de pmol o nmol de 4-MU mg de protena / h. Cualquier actividad GUS observada en los controles se deducirse para obtener los valores finales. NptII punto blot: El nptII punto blot se realiz segn el protocolo de Roy y Sahasrabuddhe29. La mancha fue envuelto en film transparente y expuesto a una pelcula de rayos X (Kodak, la India) en Hypercassettes (Amersham, Reino Unido) a -20 C durante 2-3 das, dependiendo del que cuenta. La pelcula X-ray fue desarrollado para detectar nptII actividad en la forma de la intensidad de los puntos.
NptII funcional del ensayo: El ensayo funcional de nptII gen se performed21 en plntulas de trigo en las tres hojas etapa por pulverizacin con una solucin de 2% (w / v) paromomicina y el 0,1% de Tween-20. Por otra parte, las secciones 1.2 cm de las puntas de las hojas fueron pintadas con una solucin de paromomicina con un bastoncillo de algodn. La respuesta se observ despus de siete das de aplicacin paromomicina. Las plantas con un funcional gen nptII mostraron poco o ningn dao. Sin embargo, las plantas carecen de un gen nptII funcionales fueron identificados por el presencia de manchas blanqueada en toda la hoja, que posteriormente afectada su supervivencia. Fosfinotricina hoja pintura ensayo: La progenie de plantas transgnicas con el gen bar como el marcador de seleccin se analiz mediante el ensayo de la hoja de pintura. Hoja de pintura realizarn segn lo descrito por Lonsdale et al.30 una solucin de fosfinotricina (150 mg / l) y 0.1% Tween-20 se aplic a las secciones de la hoja, tres veces por semana a intervalos de dos das.Ausencia de dao necrtico en comparacin con los controles se tomado como evidencia para la expresin de transgenes bar. Aislamiento del ADN y el anlisis del Sur ADN genmico total fue aislado de hojas de trigo de acuerdo a Dellaporta et al. La sonda fue marcada radiactivamente utilizando Megaprime ADN kit de etiquetado (Amersham International Inc. Reino Unido) y (a-32P) ATP (Brit, Hyderabad, La India), de acuerdo a las especificaciones del fabricante. La hibridacin se llev a cabo durante 16-24 horas a 37 C con agitacin a 40 rpm. La mancha fue lavada en secuencia, con las siguientes soluciones durante 10 minutos cada uno: (i) 50% formamida, 5X SSC, SDS 0,1%, (ii) 2X SSC, SDS 0,1%; (Iii) 1X SSC, SDS 0,1% y (iv) O.5 SDS X SSC, 0.1%.
Anlisis de PCR El anlisis por PCR del ADN genmico se llev a cabo utilizando 200 a 300 ng de ADN genmico de trigo que emplean reactivos de MBI Fermentas (EE.UU.) en un volumen de reaccin de 25 l de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Amplificacin por PCR se realiz por desnaturalizacin inicial a 94 C (5 min espera), seguido por 25 ciclos a 94 C (30 s), recocido (30 s) y 72 C (30 s) y, finalmente, la celebracin de 72 C (7 min) de extensin, empleando un Perkin-Elmer Gene Amp PCR sistema de 2400. Las cartillas de avance y retroceso empleados para la amplificacin del gen nptII fueron 5 -TCG TCG ATG ACTO GGG CAC AAC AGA-3 (NPTF) y 5 -AAG AAG GCG ATA GAA GAT GGC GCG-3 (nptr), respectivamente. Cebadores utilizados para la deteccin del gen bar de 5 -ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC G-3 (bar5) y 5 -TCT AGC TGA AAC AAC GTG C-3 (Bar3). Recocido temperaturas para la amplificacin de los genes nptII y el bar 57 y 50 C, respectivamente. Los productos de PCR se corrieron en un 1,6% gel de agarosa en TAE 1X junto con marcadores de tamao (GeneRulerTM 1 kb escalera y escalera GeneRulerTM 100 pb, MBI Fermentas).
Resultados estudios de regeneracin en el trigo se han confinado principalmente a los bases de las hojas, los embriones inmaduros, escutelo y inmaduros inflorescencia tissue32, de 33 aos. A pesar de embriones maduros han sido los explantes de eleccin para la regeneracin y la transformacin experiments34-37, su uso no es frecuente. En el presente investigacin, los embriones maduros (ME) se han utilizados para evaluar la regeneracin y la transformacin respuesta en tres cultivares de cada uno de T. aestivum y T. durum, empleando diversos medios de comunicacin (Cuadro 2). En general, todos los cultivares de T. aestivum y T. durum experimentado con que aparecen respuesta razonable a la regeneracin MSER, y este ha sido el medio elegido para la regeneracin del presente estudio. Sin embargo, algunas diferencias en callosidades y la regeneracin de diferentes cultivares fueron evidentes, por ejemplo T. aestivum cv. HD2329 que aparecen la mayor callosidades pero bajo la regeneracin. En cambio, en T. duro cv WH896 aparecen callosidades pobre pero relativamente un la regeneracin de un mayor porcentaje. Mayor regeneracin de acerca de 67 a 68% se observ en el cv T. aestivum. CPAN1676 y T. cv duro. PDW233 (Tabla 2).
Factores que influyen en la entrega del gene La presente investigacin explora la conveniencia de extirpar embriones maduros, as como el embrin madura derivados callos a la infeccin agrobacterial. Extirpados maduros embriones fueron seleccionados para la transformacin mediada por Agrobacterium, como la respuesta de la regeneracin de este explante se encontr que era comparable a la de los embriones inmaduros en la cultura. embriones maduros fueron extirpados de forma asptica superficie esterilizada semillas y co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens LBA4404 albergar los vectores binarios (PBI101:: ACT1 y pCAMBIA3301:: pin2). En general, dos observaciones importantes se registraron. En primer lugar, el co-cultivo duracin de 2-3 das fue ms eficaz que otros, como lo demuestra la determinacin cuantitativa de actividad GUS- especficos (Tabla 3). En segundo lugar, el T. aestivum cultivar CPAN1676 era ms receptivo a Agrobacterium la transferencia de genes mediada en comparacin con T. durum PDW215 cultivar, especialmente en presencia de los inductores del vir como acetosiringona (Figura 1). La actividad GUS de un explante individuales (embrin maduro) de T. aestivum Se observ siempre a ser ms duro que el de T. siguientes co-cultivo con Agrobacterium (Figura 2). Acetosiringona se complet tambin en las bacterias medio de cultivo, la resuspensin de mediano y cultivo co-medio como un inductor. Esto es coherente con las anteriores observaciones en el caso del arroz y wheat8, la transformacin 10. En presencia de acetosiringona, plsmido diferentes construcciones muestran diferentes preferencias para diferentes genotipos (Tabla 3). Tales preferencias genotpicas estn bien documentados en la literatura. La idoneidad de madurez embryoderived callos en explantes de mediada por Agrobacterium transformacin fue evaluada despus de 2-3 das de cocultivo con Agrobacterium. Los experimentos preliminares detecta la actividad del gen gus hasta 45 das despus de co-cultivo de callos derivadas de embriones maduros de T. aestivum cv. HD2329 con LBA4404 (p35SGUSINT). Por lo tanto, esta combinacin de vectores genotipo fue empleado para generacin de plantas transgnicas. La transformacin gentica metodologas y las condiciones fueron similares a los optimizados para los embriones maduros, excepto que la precaucin ms se observ para minimizar los daos en el lavado de cefotaxima paso. As, tres das de co-cultivo se encontr que era ideal para la transferencia de genes con xito como lo demuestra histoqumicas localizacin de expresin de GUS y tambin fue confirmado por el ensayo GUS fluoromtricos de madurez embryoderived callos de tres cultivares de cada uno de T. aestivum y T. durum utilizando cuatro diferentes construcciones (Tabla 3).
Seleccin y regeneracin de los transformantes Embriones maduros de T. aestivum cv. CPAN1676 y T. duro cv. PDW215 fueron extirpados aspticamente de las semillas y co-cultivadas con A. tumefaciens LBA4404 (pBI101:: ACT1). Despus de tres das de co- cultivo seguido por cuidadoso lavado, los embriones maduros de T. aestivum var CPAN1676 fueron trasladados a MSE2Pm100Cef250 de callos la induccin de aproximadamente 2-3 semanas. Formacin de callo se observ en MSE2Pm100Cef250 en 35 y el 16% de cocultivated explantes y explantes no transformados, respectivamente. Aproximadamente el 80% de los embriones maduros (de control) formaron callos en MSE2. En cv T. durum. PDW215, callos formacin en MSE2Pm100Cef250 se observ en 32 y el 12% de co-cultivadas y transformadas embriones maduros respectivamente (Figura 2 d, e), y la induccin de callos fue alrededor del 78% en los explantes de control en MSE2. El crecimiento de explantes no transformados se redujo cuando los callos Posteriormente fueron trasladados a MSE2Pm100 para seguir multiplicacin. callos no transformada no mostr crecimiento en MSE2Pm50, sin embargo, los callos derivados de co-cultivo embriones maduros mostraron un crecimiento en MSE2Pm100. Despus de cuatro semanas de co-cultivo, tanto en la proliferacin y no proliferativos callos fueron transferidos a MSERPm50 para regeneracin. Despus de 2-3 semanas, la regeneracin plntulas se transfirieron ms de MS1 / 2 de elongacin de ramas (Figura 2 f) y, posteriormente, se traslad a la transferencia de los enchufes para el refuerzo del sistema radical (Figura 2 g). Maduro callos derivadas de embriones se encuentran entre los preferidos explantes con una respuesta de la regeneracin (~ 60%) son comparables a la observada a partir de callos derivados de los inmaduros embriones. Sin embargo, esto exige una mayor atencin de explante durante la manipulacin y dao fsico a los callos se refleja en la respuesta de la regeneracin reducida y la transformacin eficiencia, as. Maduro callos derivadas de embriones son particularmente propensos a daos durante el antibitico de lavado paso, que es necesario para la eliminacin de Agrobacterium. Mientras se lava como resultado la prdida de las clulas competentes, insuficiente el lavado con cefotaxima generalmente como resultado de la necrosis y en la no recuperacin de la regeneracin de callos de co-cultivo de explantes. As, en varios experimentos a pesar de la proliferacin de los callos en el medio de seleccin, no hay regeneracin se obtuvo de la madurez embryoderived callos. La regeneracin de plntulas se obtuvo de los embriones maduros de co-cultivo en varios independientes experimentos, sin embargo, los datos presentados son de dos experiencias exitosas que indican una transformacin la eficiencia del 5,57% (16 transformantes supuesto un total de 287 co-cultivo de explantes) con el cv T. aestivum. HD2329, calculado sobre la base de la hoja de paromomicina pulverizacin de transformantes T0.
Anlisis de PCR amplificacin por PCR se llev a cabo para detectar la presencia del gen bar en el transformantes transformadas con LBA4404 (pCAMBIA3301:: pin2). Las muestras de hojas se recogida de transformantes putativos inmediatamente despus de la regeneracin, pero antes de la transferencia de las plntulas a halfstrength medio MS suplementado con 2,5 mg / l fosfinotricina. Plantas anot como positiva (Figura 3a) en la base de un anlisis de PCR (presencia de un producto amplificado de ~) 296 pb tambin sobrevivi en MS1/2P2.5, mientras que las plantas calific como algo negativo por anlisis de PCR no fueron capaces de sobrevivir (25%), lo que confirma la autenticidad prctica de la PCR y la fosfinotricina seleccin (Figura 3a, donde tres cuartas partes de las plantas son la PCR-positivo). Sobre la base de la resultado de ensayo de pintura fosfinotricina hoja y PCR anlisis, la transformacin de la eficiencia por el co-cultivo de embriones maduros de T. aestivum cv. HD2329 con Agrobacterium LBA4404 cepa (pCAMBIA3301:: pin 2) se casi el 1,77%. amplificacin por PCR se llev a cabo ms de detectar la presencia, as como la segregacin del gen nptII en la progenie T1 de T. aestivum transformantes CPAN1676 transformadas con LBA4404 (pBI101:: ACT1; Figura 3 b). El ADN genmico de transformantes putativos de T. aestivum HD2329 (LBA4404 (p35SGUSINT)) por co-cultivo de callos maduras derivadas de embriones fue deteccin por PCR especfica para el empleo nptII. Amplificacin por PCR del gen nptII en el ADN genmico muestras de transformantes T0 indica una transformacin exitosa evento (Figura 3 c), que se evidencia por el presencia de un producto de amplificacin del tamao esperado (~ 721 pb). NPTII ensayo Las plntulas transformado (8-10 cm de largo) que crecen en las plntulas bandejas fueron rociados con una solucin de 2% w / v paromomicina sulfato y el 0,1% de Tween-20. Despus de siete das, transformado las plantas que aparecen poco o ningn dao siguientes paromomicina pulverizacin. plantas no transformadas de control desarrollado puntos blanqueada y, posteriormente, aparecen importantes la inhibicin del crecimiento (Figura 2 l). La actividad de nptII gen se confirm por punto de ensayo-blot de los transformantes de T. aestivum var CPAN1676 y cv T. duro. PDW215 prueba (Figura 4 b), las cuales fueron seleccionadas en el base de paromomicina hoja de aspersin de los resultados. Transformacin frecuencias observadas en el caso de T. aestivum y T. durum fueron 1.6 y 1.28% respectivamente, con la construccin LBA4404 (pBI101:: ACT1). Cuando la construccin LBA4404 (PCAMBIA:: pin 2) se utiliz, la eficiencia de transformacin de 1,77 y un 1,54% se observ en T. aestivum y T. duro, respectivamente. Sin embargo, la respuesta de crecimiento de T0 transformantes fue pobre en comparacin con los no transformados plantas de control. establecimiento de semillas se observ en el 40 y el 33,33% de los transformantes de T. aestivum y T. durum, respectivamente, e incluso la calidad de las semillas no fue satisfactoria. Probablemente esto podra deberse a la falta de disponibilidad de las condiciones de crecimiento ptimo.
El sur de anlisis de transformantes T0 El ADN genmico de transformantes T0 de T. durum obtenidos despus de co-cultivo de embriones maduros con LBA4404 (PBI101:: ACT1) fue digerido con EcoRI y borrados en membrana de nylon y se hibrid con un gus- especfica sonda. La digestin de pBI101:: ACT1 edite un 3,3 kb ~ fragmento que tiene la regin de codificacin de Gus, una parte de arroz ACT1-5 regin y terminador NOS. Un fragmento especfico hibridacin de GUS se observ en las lneas transgnicas prueba. Esta observacin confirma la presencia de los gus gen en los transformantes seleccionados (Figura 4 a). ADN mancha de transformantes primarios de T. aestivum cv. HD2329 transformadas con LBA4404 (pCAMBIA3301:: pin 2) se prob con un fragmento de 1,5 kb BamHI del pCAMBIA3301:: pin 2 que contiene el cdigo PIN2 regin y tambin un pin2-3 terminador . El sur de anlisis de BamHI-digerido muestras revelaron la presencia de la hibridacin seales en el rango de 1,5 kb en el transformantes T0 prueba. EcoRI-digerido muestras de ADN genmico mostrar la presencia de bandas dehibridacin (Figura 5), lo que demuestra la presencia de genes en el pin2 regenerantes T0.
Anlisis de la progenie Como se mencion anteriormente, el T. aestivum transformantes T0 produce pocas semillas y la mayora de las semillas estaban mal desarrollados. De una planta T0 representante, tres de cada diez semillas germinaron con xito en un medio de resistencia MS. Despus de paromomicina pulverizacin de las plntulas de siete das de edad, una de las plantas T1 desarrollado extensas manchas amarillas en las hojas, mientras que las otras dos plantas sufrido poco o ningn dao (Figura 2 l). Presencia del gen nptII en dos de las plantas T1 tambin fue confirmada por la amplificacin por PCR de muestras de ADN genmico con primers nptII especfico (Figura 3 b). plantas T1 tambin se muestra un mayor crecimiento de las plantas T0 (Figura 2 j), en macetas que contenan una mezcla de tierra de jardn y soilrite. Discusin Los cereales, especialmente trigo, se consideraban recalcitrantes a la transformacin mediada por Agrobacterium. Sin embargo, desde el primer informe xito de trigo transgnico frtil plants7, ha habido un progreso considerable. Hay varios factores que que influyen en el xito gentica mediada por Agrobacterium transformacin de trigo han sido exploradas por varios los trabajadores en un intento de lograr una mayor eficiencia de transformacin- Figura 5. ciency9, 13,12,35. Las ventajas de utilizar el Agrobacterium enfoque mediada implican la capacidad de transferir grandes segmentos de ADN con un mnimo de reordenamiento, con menor nmero de copias en una mayor eficiencia efectuados con un mnimo de costo. De tal modo, como un enfoque da como resultado la segregacin simple patrn, ms frecuencia de la transformacin y la ausencia de secuencias de vector columna vertebral. Por otra parte, en ADN transformacin mediada por Agrobacterium general se inserta en transcripcionalmente activa regions38 a travs de ilegtima recombinacin, lo que garantiza la transcripcin activa / expresin de los transgenes. la eficiencia de transformacin del trigo puede ser influenciada por muchos factores, tales como el genotipo, tipo de explante, optimizado condiciones de la inoculacin y el cultivo de cooperacin, optimizado callosidades y regeneracin de plantas, seleccin de medios, cepa de vectores y Agrobacterium, etc.13. La presente investigacin se inici para desarrollar una eficiente entrega de genes protocolo para el trigo pan y trigo duro. Se han estudios limitados sobre la transformacin gentica del trigo a travs de Agrobacterium co-cultivo y los pocos informes demostrar el xito de la produccin de transgnicos las plantas de trigo. La mayora de la investigacin mediada por Agrobacterium ha empleados embriones inmaduros, precultivado embriones inmaduros, y sus callos embriognicos para la co-cultivation7, 16,35,36. Para la introduccin eficiente de los genes del ADN-T en recalcitrantes explantes, varios grupos han empleado diferentes enfoques como la mejora de la expresin de los genes vir (por hiriendo a) o la promocin de la adhesin de Agrobacterium a los tejidos de la planta. Diversos enfoques incluyen mecnica abrasin de trigo seeds11, el uso de surfactants7, agrolistics39, uso de fibras de carburo de silicio por herir de inmaduros embryos40 trigo, y someter a los tejidos vegetales para informar perodos de la ecografa en la presencia de Agrobacterium (Transformacin mediada por Agrobacterium sonicacin-asistida) 41. La tcnica aqu presentada consiste en la extirpacin de embriones maduros: es simple y cumple con las heridas de base requisito y no requiere medios especiales. En la presente investigacin, nuestras eficiencias de transformacin (1,28-1,77%) son comparables con los reportados earlier7, 12,13,42,43, aunque no hemos sido capaces de caracterizar en detalle los patrones de segregacin debido a la escasez de transgnicos eventos. transformacin mediada por Agrobacterium ha ha informado de lograr un mximo de 4,4% transformacin la eficiencia mediante la construccin de aroA:: CP4 e inmaduros embriones como explants12. El factor clave de xito en la generacin de transgnicos plantas es la optimizacin de las condiciones para la regeneracin de las plntulas despus de varias rondas de seleccin con el herbicida / antibiticos, que es tambin necesario para la eliminacin de escapa. Nuestro trabajo tambin hace hincapi en las perspectivas de paromomicina y fosfinotricina como la seleccin efectiva agentes para la transformacin del trigo, y esto es consistente con las observaciones anteriores investigators2, 17. Estrategias a aumentar la frecuencia de la transformacin implica optimizacin de parmetros tales como el uso adecuado de los explantes junto con la optimizacin de los factores que promueven Agrobacterium infeccin. Puesto que hay dos pasos limitantes, agroinfection y la regeneracin de los callos transformados, enfoques tales como la transformacin de inmaduros / embriones maduros en lugar de inmaduros / madura embryoderived callos limitar la duracin del tiempo sin obstaculizar la capacidad de regeneracin de los explantes. En el presente investigacin, callosidades y la regeneracin se optimizaron para lograr transformaciones reproducibles, normalizado, segn prdida de potencial de regeneracin a travs del tiempo ha sido una de las principales limitacin en la mayora de experimentos de transformacin de trigo. Esta prdida de potencial de regeneracin, especialmente durante prolongados la cultura, ha sido superado por que se completa el medio de regeneracin con poliamina espermidina para mejorar recuperacin de regenerantes de transformarse calluses14. Sin embargo, en la transformacin actual enfoque directo de los embriones maduros se llev a cabo para minimizar la prdida del potencial de regeneracin debido a la cultura prolongada. En la presente investigacin, se utiliz LBA4404 como la cepa de Agrobacterium de eleccin. El xito de la produccin de las plantas transgnicas se logr mediante co-cultivo de embriones maduros y maduras callos derivadas de embriones. Nuestras investigaciones de apoyo las observaciones de otros investigadores, que recomiendan el uso de acetosiringona y la glucosa para su inclusin en la inoculacin y la cultura co- medium7. Acetosiringona fue empleado tanto en la inoculacin as como el medio de co-cultivo, resultando en aumento de 1,5 a 2 veces en la expresin transitoria de la actividad de gus, validando as la observacin de otros workers42, de 43 aos. transformacin de trigo duro se ha logrado con xito utilizando el biolstica approach37 ,44-48, pero por Agrobacterium transformacin mediada an no se ha logrado. Los vectores utilizados con xito en este estudio son convencionales vectores binarios, mientras que los vectores supervirulent (Con copias adicionales de virB, Virc y virG del A281) que han sido ampliamente utilizados para la transformacin de arroz y maize4, 5 no parecen ser esenciales para la transformacin del trigo, que esta observacin tambin es compartida por otros coworkers7. En el vector binario pBI101: A1, el gen gus est bajo el control de un promotor monocotiledneas (arroz ACT1) para expresin especfica en los tejidos vegetales y contiene el gen gus un intrn en el pCAMBIA3301 vectores:: pin2 y p35SGUSINT, que bloquea de manera eficiente su expresin en bacterias, excluyendo as a los falsos positivos. El antibitico / la naturaleza resistente a los herbicidas de los tejidos transgnicos demuestra que los genes marcadores seleccionables estn activos en el trigo. Los resultados de los ensayos de resistencia a los antibiticos y herbicidas se observaron ser consistentes con los de anlisis molecular. La transformantes que un resultado positivo sobre la base de ensayos de resistencia a los antibiticos y herbicidas tambin se detectaron positivos por anlisis de Southern y PCR con la respectiva genes. Se observ una correlacin directa se observ (datos no presentados) entre la expresin del pin 2 en T. durum y la resistencia contra el nematodo del quiste de los cereales, Heterodera avenae49. En nuestro laboratorio, la idoneidad de los embriones maduros como explante de partida para la transformacin del trigo se ha demostrado demostrado tambin en experimentos de permeabilizacin celular que involucra mecnicamente aislada embriones con membrana permeabilizante agents35 y por bombardeo de partculas de basales de embriones derivados de calluses48. Por lo tanto, parece que embriones maduros son un excelente sistema de Agrobacterium transformacin mediada, ya que no slo son convenientes debido a su facilidad de disponibilidad, sino tambin que manejo de grandes cantidades en un plazo razonable, por lo tanto ayudar a la recuperacin de los transgnicos. En el presente estudio, la mayora de las plantas regeneradas alcanzado la madurez y las semillas de conjunto, y el anlisis ulterior de los transformantes se indica la ausencia de las secuencias de vector columna vertebral y se confirm la integracin de T- ADN en las copias de baja, lo que resulta en la segregacin simple patrones. tcnicas de transformacin gentica con frecuencia ha asociado con aberraciones en la morfologa y la fertilidad de las plantas. Los transformantes T0 obtenidos en el presente estudio crecimiento que aparecen pobres en comparacin con plntulas regeneradas a partir de callos sin transformar en un medio de seleccin libre. Sin embargo, la progenie T1 pareca ser fenotpicamente normal y similares en la morfologa de control de semillas derivadas de plantas.
Conclusin Un mtodo reproducible para la produccin eficiente de los transgnicos las plantas de trigo con A. tumefaciens con una frecuencia de cerca de 1,28 hasta 1,77% se ha logrado tanto en el pan trigo, as como el trigo duro. Aunque no significativo se observaron diferencias en la eficiencia de transformacin en condiciones similares, el nivel del gen gus transitoria expresin se observ siempre a ser mayor en T. aestivum variedades en comparacin con las variedades de T. durum. La razn para esto es difcil de determinar y probablemente reside en el mejor optimizado las capacidades de regeneracin de T. aestivum en comparacin con T. durum. transformacin mediada por Agrobacterium la eficiencia puede ser mejorada por los factores que activan los genes vir y aumentar la susceptibilidad de las clulas vegetales contra Agrobacterium como acetosiringona, monosacridos (Incluyendo phytohormonal, CaCl2 y osmtica tratamientos). El presente estudio se centra en la hasta ahora inexplorada el uso de embriones maduros como explantes propicio transformacin mediada por Agrobacterium. Los factores que repercutir en la entrega de T-ADN y la regeneracin son similares a las observadas cuando se emplean embriones inmaduros, tales como la duracin de la pre-cultura, y tambin la inoculacin y co-cultivo parameters13. Sin embargo, hemos desarrollado un mtodo para la produccin de trigo transgnico por A. tumefaciens aplicables tanto para el trigo pan y trigo duro trigo, lo que demuestra la independencia genotpica considerable.