aproximado de 150 kDa, pertenecientes al grupo de las inmunoglobulinas (Ig). Son molculas capaces de reconocer otras molculas, los antgenos. La capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en las secuencias ariables de sus cadenas proteicas, generadas por recombinaci!n de una serie de "gene cassettes# en el proceso de producci!n de los lin$ocitos % durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de estas secuencias puede producir m&s de un bill!n de secuencias di$erentes. 'sta in$ormaci!n es almacenada en el "pool" de lin$ocitos % presentes en nuestro te(ido lin$&tico.
La estructura b&sica de un anticuerpo se es)uemati*a en la $igura+ $ormado por dos cadenas proteicas pesadas , dos ligeras, unidas por puentes disul$uro. Se diiden en arias clases )ue se identi$ican seg-n el tipo de cadena pesada en+ Ig., Ig/, Ig0, IgD e Ig'. La acci!n de en*imas proteol1ticas sobre los anticuerpos permite obtener $ragmentos )ue presentan actiidades biol!gicas di$erenciales. Los $ragmentos obtenidos son+ Fc. 2orresponde al extremo 23terminal de las dos cadenas pesadas. 'ste $ragmento est& constituido por la regi!n constante de la cadena pesada , es caracter1stica de cada clase de inmunoglobulinas. 's en esta regi!n donde radican las $unciones e$ectoras de la molcula como son la $i(aci!n del complemento, la interacci!n con los receptores celulares de monocitos , macr!$agos, la interacci!n con la prote1na 0 de S. aureus , . de Streptococcus sp. etc... La regi!n 4c es caracter1stica de especie. F(ab')2. 2orresponde al extremo 53terminal de las dos cadenas pesadas , a las dos cadenas ligeras. Se obtiene por digesti!n con pepsina. 6iene reconocimiento dialente del ep1tope. F(ab). 2orresponde al extremo 53terminal de una cadena pesada , a una cadena ligera, unidas por puentes disul$uro. Se obtiene por digesti!n con papaina. 6iene reconocimiento monoalente del ep1tope. De las distintas clases de inmunoglobulinas las )ue se encuentran predominantemente en el suero de animales inmuni*ados son las Ig/ , las Ig.. Las Ig/ se sinteti*an durante la respuesta primaria , se asocian en una estructura pentamrica. Su capacidad de reconocimiento de ep1topes es por ello de 10. Las Ig. se sinteti*an tanto durante la respuesta primaria como secundaria, siendo en esta -ltima donde se consiguen los ma,ores nieles de producci!n. Su acci!n bialente les permite interactuar con m&s de una molcula de ant1geno. Antgenos, Antigenicidad e inmunogenicidad. 7irtualmente toda molcula a(ena a un determinado organismo se comporta $rente a ste como un ant1geno, Se pueden di$erenciar dos caracter1sticas primordiales en un ant1geno. 8or una parte la inmunogenicidad o capacidad )ue presenta una molcula para generar una respuesta inmune en un organismo dado , la antigenicidad o particularidad del ant1geno )ue 9ace )ue ste sea reconocido por un determinado anticuerpo. 0mbas propiedades pueden o no estar presentes en un determinado ant1geno. /olculas de pe)ue:o tama:o (9aptenos o pptidos) son poco inmunognicas , por ello se asocian a prote1nas transportadoras de alto peso molecular o "carriers" para inducir una respuesta inmune adecuada. /acromolculas ub1cuas (alb-minas, citocromos, etc...) o de especies $ilogenticamente relacionadas, son poco inmunognicas. 'n estos casos, para obtener una respuesta adecuada es aconse(able utili*ar como animal 9usped una especie $ilogenticamente ale(ada a la del ant1geno a inocular. ;abitualmente se emplean como ant1genos puros o preiamente enri)uecidos mediante tcnicas de concentraci!n o de separaci!n electro$ortica. <no de los criterios de ma,or importancia en la obtenci!n de un suero monoespec1$ico es la inmuni*aci!n con ant1genos puros. 0 la regi!n del ant1geno reconocida por un anticuerpo se le denomina eptope o determinante antignico. <n ant1geno puede presentar un n-mero ariable de ep1topes de estructura -nica o repetitia. La comple(idad estructural de las prote1nas $aorece )ue stas presenten por lo general un n-mero eleado de ep1topes distintos, mientras )ue los &cidos nucleicos , los polisac&ridos, dada su repetitiidad estructural, poseen un n-mero escaso de ep1topes di$erentes. Inmunizacin y preparacin del antgeno 'l proceso de inmuni*aci!n es a)uel en el )ue se in,ecta al animal el ant1geno en condiciones adecuadas de cantidad, sustancias acompa:antes, , n-mero de eces, )ue sean necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. 'n general se diide en dos $ases+ inmuni*aci!n primaria, en la cual se administra una determinada cantidad de ant1geno en presencia de ad,uante, e inmuni*aci!n de recuerdo ("booster"), en la )ue el ant1geno es administrado en $orma soluble o bien con ad,uante. 'xisten numerosos protocolos de inmuni*aci!n, con una duraci!n ariable. 2uando se inmuni*a un animal con un ant1geno , se prooca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig espec1$icas del ant1geno empleado. 'sto es la consecuencia de la selecci!n clonal de los lim$ocitos % )ue producen anticuerpos contra el ant1geno. 2omo 9emos isto un ant1geno puede presentar di$erentes ep1topes, , cada uno de ellos ser reconocido por un clon de lin$ocitos % )ue producir& molculas Ig con una secuencia caracter1stica. 8or ello en el suero de un animal inmuni*ado se acumulan un n-mero desconocido, posiblemente eleado, de di$erentes molculas de Ig espec1$icas en ma,or o menor medida de nuestro ant1geno. Se trata de un suero producido por la acci!n de s1ntesis de numerosos clones de lin$ocitos % , por ello se 9a denominado policlonal. Interaccin primaria antgenoanticuerpo. A!inidad y a"idez La interacci!n entre ant1geno , anticuerpo se estabili*a mediante enlaces dbiles, como puentes de 9idr!geno, $uer*as de 7an der =aals e interacciones electrost&ticas e 9idro$!bicas. La suma de todos estos enlaces genera una interacci!n estable entre el lugar de uni!n del anticuerpo (paratope) , el lugar de uni!n del ant1geno (eptope). 'stas $uer*as son inersamente proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo )ue implica )ue ep1tope , paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener una energ1a de uni!n su$iciente como para resistir la disrupci!n termodin&mica. La suma de estas $uer*as de atracci!n , de repulsi!n se conoce como a!inidad del anticuerpo. Los anticuerpos son molculas multialentes en su interacci!n con el ant1geno. Las molculas de inmunoglobulina presentan un m&ximo de 10 (Ig/) , un m1nimo de > bra*os de uni!n con el ant1geno. 'n el caso de )ue este -ltimo tambin sea multialente, presentar& un m1nimo de dos puntos de ancla(e para el anticuerpo correspondiente. 'sta interacci!n multialente entre ant1geno , anticuerpo permite introducir el concepto de a"idez o a!inidad !uncional. #speci!icidad y reaccin cruzada La complementariedad existente entre ep1tope , paratope condiciona la relaci!n espec1$ica entre ant1geno , anticuerpo. Dic9a complementariedad a$ecta tanto a una relaci!n espacial entre los grupos )u1micos reaccionantes, a la relaci!n complementaria de cargas netas como a la relaci!n estrica entre las estructuras reaccionantes. 'n general los anticuerpos son altamente espec1$icos, siendo capaces de discernir entre pe)ue:as ariaciones del ant1geno, tanto a niel de estructura primaria como de con$ormaci!n estrica o con$iguraci!n !ptica del mismo. Interaccin secundaria antgenoanticuerpo. 'n la interacci!n in itro de un ant1geno con su correspondiente anticuerpo se distinguen dos etapas, la reacci!n primaria no isuali*able , la reacci!n secundaria, )ue sigue a la anterior , se caracteri*a por la aparici!n de un $en!meno isible como la aglutinaci!n, la precipitaci!n, etc. Los comple(os iniciales )ue se $orman r&pidamente, sobre los )ue dentro de ciertos limites las ariaciones de temperatura , concentraci!n salina tienen poca in$luencia, se agregan luego para dar di$erentes $en!menos isibles cu,as caracter1sticas dependen en gran parte del estado $1sico del ant1geno. 'sta etapa se acelera con la temperatura, la agitaci!n , es electrolitodependiente. 's importante separar las etapas de la reacci!n ant1geno3anticuerpo. 8uede ocurrir )ue se demuestre la presencia de anticuerpo por interacci!n primaria, pero )ue este no sea detectable por interacci!n secundaria o terciaria. 'sto puede ser consecuencia de ariaciones cuantitatias, ,a )ue para conseguir $en!menos isibles son indispensables determinadas concentraciones de anticuerpo, , cualitatias in9erentes a las propiedades de la clase de inmunoglobulina comprometida en la respuesta inmune, as1 como de las caracter1sticas del ligando. Si bien es posible detectar un anticuerpo mediante estudios de interacci!n primaria, ello no signi$ica )ue siempre deban ocurrir reacciones secundarias o terciarias. $recipitacin 2uando una anticuerpo, excepci!n 9ec9a de los blo)ueantes , no precipitantes, es puesto en contacto con una soluci!n de macromolculas )ue lo origino, se $orman comple(os 0c?0g )ue se insolubili*an luego en su ma,or parte dando una reacci!n de precipitaci!n, )ue puede ser total o *onal. 's una propiedad de la ma,or parte de los anticuerpos , no una caracter1stica particular de un determinado tipo al )ue originalmente se lo llamo anticuerpo precipitante. $recipitacin en medios l%uidos 'sta reacci!n se produce en dos etapas. 'n la inicial, )ue se desarrolla r&pidamente , es in$luida mu, poco por la temperatura , los electrolitos, se $orman los comple(os 0c?0g primarios. 0 medida )ue el tiempo transcurre, esos comple(os iniciales se agregan, originando micelas de di$erentes tama:os, las )ue $inalmente precipitan. 0lgunos comple(os no alcan*an a 9acerlo , )uedan en soluci!n. La temperatura acelera esta segunda etapa, siendo adem&s electrolitodependiente. 's muc9o m&s lenta )ue la inicial, puede durar minutos, e incluso 9oras, para )ue se complete. La $ormaci!n de agregados es una consecuencia de la bialencia de los anticuerpos , la multialencia de los ant1genos. 2on 9aptenos monoalentes o ant1genos )ue poseen un solo determinante antignico por molcula, la precipitaci!n no se produce. <n 9ec9o mu, particular lo constitu,en los anticuerpos monoclonales, )ue en su ma,or parte no muestran actiidad precipitante. 'llo se debe a )ue en muc9os casos, especialmente cuando est&n dirigidos contra macromolculas en soluci!n, reconocen a un -nico epitope no repetido, lo )ue les impide $ormar agregados. La $ormaci!n de estos di$erentes comple(os 9a sido explicada mediante la llamada teor1a del enre(ado, )ue considera )ue la composici!n del precipitado $ormado es una consecuencia del modo en )ue anticuerpo , antigeno se 9an unido. Dada la bialencia del anticuerpo , multialencia del antigeno, las posibilidades de combinaci!n ar1an seg-n )ue en la me*cla exista exceso de antigeno, exceso de anticuerpos o e)uialencia de ambos. 'n la *ona de exceso de antigeno, los comple(os son solubles. Si bien la precipitaci!n en medios l1)uidos es mu, -til para la identi$icaci!n de ant1genos , anticuerpos, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto en lo relatio a la $ormaci!n de los precipitados, la misma puede usarse con $ines cuantitatios , constitu,e un buen mtodo para la medida de la concentraci!n de los anticuerpos presentes en un suero. 8uede usarse tambin para medir nieles de ant1geno. $recipitacin en medios geli!icados Las macromolculas pueden di$undir libremente a tras de geles@ dic9a di$usi!n esta limitada por la concentraci!n del gel. 'mpleando soportes adecuados, en especial a)uellos )ue como base tienen agar disuelto en electrolitos, es posible 9acer migrar ant1genos , anticuerpos de modo )ue al encontrarse interaccionen. 8ueden utili*arse tambin geles con base de pectina, alginatos, pliacrilamida , aun tiras de acetato de celulosa gelatini*ado. Los precipitados )ue se originan se isuali*an como n1tidas bandas de precipitaci!n, )ue permanecer&n estables mientras un ma,or a$lu(o de molculas de los reactios no proo)uen su redisoluci!n. Se 9an descripto numerosas tcnicas cualitatias , cuantitatias basadas en este principio, entre las )ue pueden citarse la di$usi!n simple monodimensional, di$usi!n doble monodimensional, di$usi!n doble bidimensional, di$usi!n radial, etc.. &i!usin simple monodimensional Se coloca en un tubo de ensa,o pe)ue:o agar $undido, soluci!n al 1A en cloruro de sodio 0,15 /, me*clado con un olumen igual del antisuero para anali*ar. 8roducida la solidi$icaci!n, se a:ade la soluci!n de antigeno. 8or di$usi!n a tras del gel el antigeno a penetrando, creando un gradiente de concentraci!n. 'n la inter$ase gel3li)uido no se $orman precipitados, dada la alta concentraci!n antignica, , aparecen con la $orma de bandas cuando la concentraci!n del antigeno )ue 9a di$undido es la optima. Si en el suero 9ab1a mas de un anticuerpo , en la soluci!n a:adida mas de un antigeno )ue se correspondan, se $ormara tantas bandas de precipitaci!n como sistemas 9a,an interaccionado. 'sto no es exacto, pues si se tiene en cuenta )ue dic9as separaciones dependen de las elocidades de di$usi!n de las di$erentes molculas antignicas, solo ser& cierto si a)uellas son distintas. 'l numero de bandas de precipitaci!n nos indica la cantidad m1nima de sistemas reaccionantes presentes. 'sto tambin es relatio, ,a )ue es indispensable )ue los reactios no estn en concentraciones in$eriores a las necesarias para )ue la reacci!n ocurra. &i!usin doble monodimensional 'n este caso la reacci!n se e$ect-a colocando en la parte in$erior del tubo un olumen de agar al 1 A $undido, me*clado con partes iguales del antisuero. 8roducida la geli$icaci!n, se agrega agar al 0,5 A en soluci!n salina, en un olumen igual a la mitad del anterior. Despus de la solidi$icaci!n se cubre todo con un olumen de agar al 1 A $undido, me*clado con igual olumen de la soluci!n antignica. 0nt1genos , anticuerpos migrar&n 9acia la *ona media e interaccionar&n desencaden&ndose la precipitaci!n cuando las concentraciones sean las !ptimas. 'stando la di$usi!n en relaci!n directa con la concentraci!n de la sustancia )ue di$unde, la banda de precipitaci!n estar& m&s pr!xima a la *ona del ant1geno cuando 9a, exceso de anticuerpo, , ocurrir& lo inerso en caso contrario. 'ste es un buen mtodo cualitatio )ue permite demostrar arios sistemas reactios simult&neos, cosa )ue no ocurre en la precipitaci!n en medios l1)uidos. 8ueden detectarse 9asta 10 Bg?ml de anticuerpo. &i!usin doble bidimensional <n interesante mtodo de doble di$usi!n en placas $ue descripto por CDc9terlon,. 2onsiste en en$rentar en pe)ue:as per$oraciones e$ectuadas en el agar, , a distancias conenientes, las soluciones de ant1geno , de anticuerpo. 0l di$undir ambos , ponerse en contacto, producir&n una banda de precipitaci!n cuando estn en la relaci!n !ptima. 2on esta tcnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los ant1genos , anticuerpos reaccionantes. 6raba(ando con concentraciones !ptimas de 0g , de 0c, si la banda de pecipitaci!n $ormada es recta, indica )ue los pesos moleculares de ambos son mu, pr!ximos. Si la banda es c!ncaa con especto al reserorio del ant1geno, se:ala )ue el peso molecular de ste es superior al del anticuerpo, siendo menor en el caso en )ue la banda presente conexidad. 6odo esto es una consecuencia de las le,es generales de la di$usi!n, )ue establecen )ue la distancia a la )ue una sustancia di$unde est& en relaci!n directa con su concentraci!n , en relaci!n inersa con su peso molecular. /ediante esta metodolog1a, es posible identi$icar arios sistemas reaccionantes simult&neamente, pues cada uno de ellos dar& una banda de precipitaci!n espec1$ica ,, adem&s, inestigar reacciones cru*adas, pues en estos casos 9abr& $usi!n de bandas. Criginariamente CDc9terlon, describi!, de acuerdo a este 9ec9o, tres tipos de reacciones. 4ueron denominadas como reacciones de identidad, no identidad e identidad parcial. 'n el primer caso, los dos sistemas reactios se $unden en una -nica banda de precipitaci!n. Si los sistemas no son iguales (reacciones de no identidad), cada uno reacciona independientemente originando bandas de precipitaci!n )ue se cru*an. 2uando uno de los ant1genos anali*ados tiene alg-n componente capa* de dar una reacci!n cru*ada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad parcial), las bandas de precipitaci!n de ambos sistemas se unen , $unden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongaci!n o espol!n en la correspondiente al ant1geno )ue se emple! para la obtenci!n del antisuero. 'sto indica )ue en este ant1geno 9a, componentes antignicos no compartidos con el restante. &i!usin radial ('cnica de (ancini) 2uando un ant1geno es colocado en un ori$icio circular practicado en una placa de agar, al cual se adicion! anticuerpo monoespec1$ico, di$unde en $orma radial ,, de acuerdo con los principios b&sicos de la di$usi!n, el di&metro del 9alo de precipitaci!n est& en relaci!n directa con su concentraci!n. Si a esta operaci!n se la e$ect-a colocando en arios ori$icios de la placa cantidades ariables conocidas del ant1geno espec1$ico para el antisuero me*clado con el agar , se lo de(a a temperatura ambiente 9asta )ue el 9alo de precipitaci!n no se modi$i)ue, con los resultados obtenidos se puede con$eccionar una cura relacionando el di&metro de los 9alos de precipitaci!n con las correspondientes concentraciones antignicas. 'sta cura permite calcular la concentraci!n de ese mismo ant1geno en cual)uier muestra desconocida. La di$usi!n radial se utili*a en la cuanti$icaci!n de prote1nas )ue se encuentran presentes en me*clas comple(as como lo son los componentes del suero 9umano. 's indispensable disponer para ello de antisueros monoespec1$icos destinados a los ant1genos )ue se )uieren alorar.
%ibliogra$1a 9ttp+??EEE.ub.es?biocel?Ebc?tecnicas?anticuerpos.9tmFarriba Inmunolog1a e Inmuno)u1mica. /argni, G. 0., 5H edici!n 'ditorial /dica 8anamericana 1IIJ.