Introduccin

Los compuestos nitrogenados presentes en mosto y vino desempean una funcin importante en la fermentacin de las
levaduras y por eso su control es imprescindible.
La cantidad de estos compuestos oscila entre 60-2400 mg N/L y lo forman una gran variedad de molculas: aminocidos,
amonio, protenas, pptidos y polipptidos y en menor medida aminas, amidas, urea, pirimidinas, purinas, nitratos y nitritos
(figura 1, Zoecklein et al., 2001, Dukes and Butzke, 1998).
Sin embargo, las levaduras solo pueden asimilar parte de estos compuestos y adoptarlos en su masa celular. A este con-
junto de compuestos se les llama comnmente nitrgeno fcilmente asimilable (NFA), en ingls yeast assimilable nitrogen
(YAN). Los compuestos que forman el NFA son el in amonio (NH
4
+
) y el nitrgeno amnico primario (PAN) aportado por los
aminocidos.
Estudios recientes indican que el cido -aminobutrico (Bach et al., 2009) tambin forma parte del proceso fermentativo y
que la arginina puede aportar los cuatro nitrgenos que contiene su frmula molecular. Por el contrario, la prolina, uno de
los aminocidos ms abundantes en el vino junto con la arginina, es el nico que no es metabolizable, debido a que las
dos enzimas implicadas en su captacin y utilizacin (prolina permeasa y prolina oxidasa) estn reprimidas por la presen-
cia del in amonio y porqu la prolina oxidasa necesita oxgeno para su actividad (Zoecklein et al., 2001).
En general, se acepta que la concentracin mnima de NFA para una correcta fermentacin est entre 120 y 140 mg N/L.
Para vinos con niveles inferiores de nitrgeno la fermentacin se para o es muy lenta provocando la aparicin de H
2
S (Fili-
pe-Ribeiro et al., 2007) y se recomienda aadir fuentes de nitrgeno, como por ejemplo, de fosfato diamnico (en ingls,
diammonium phosphate, DAP). Para concentraciones muy altas (superiores a 600 mg N/L), se obtienen fermentaciones muy
vigorosas, con el consiguiente aumento de temperatura y acidez, y la aparicin de aminas bigenas y carbamato de etilo
(Austin et al., 2000).
Mtodos de anlisis
La OIV recoge en el compendio internacional de mtodos analticos de vinos y mostos (edicin 2010) tres mtodos para
determinar compuestos nitrogenados, dos para medir nitrgeno total (OIV-MA-AS323-02A: R2009 y OIV-MA-AS323-02B:
R2009) y uno para medir amonio (OIV-MA-AS322-01: R2009). El primer mtodo para determinar nitrgeno total, comn-
mente llamado mtodo Dumas, se basa en la combustin de la muestra, reduccin con cobre de los gases producidos y
posterior anlisis del nitrgeno con un detector universal. El segundo mtodo para medir nitrgeno total se basa en una
digestin en presencia de un cido fuerte y un catalizador para descomponer todas las molculas que contienen nitrgeno
Nitrgeno fcilmente asimilable. Sorensen vs. PAN/Amonio
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Texto / Sergio Muoz y Andreu Tobea. Departamento de Investigacin y Desarrollo. Divisin Reactivos. BioSystems S.A.
DIVULGACIN EMPRESARIAL / BIOSYSTEMS
Figura 1. Compuestos nitrogenados en mosto y vino y nitrgeno fcilmente asimilable (NFA).
en amonio, que se atrapa y se mide por titulacin. El mtodo para medir amonio se basa en la separacin del amonio en
una columna cromatogrfica de intercambio catinico y valoracin con cido clorhdrico. Los tres mtodos son manuales
y requieren un esfuerzo significativo de tiempo y recursos humanos. Adems, la OIV no presenta ningn mtodo oficial
para la determinacin de NFA.
La literatura describe varios mtodos para medir el NFA. Probablemente, el ms conocido y utilizado en las bodegas es la
titulacin con formaldehdo, tambin llamado mtodo Sorensen (Shively and Henick-Kling, 2001 y Gump et al., 2002). Este
mtodo se basa en aadir una solucin de formaldehdo a la muestra en unas condiciones de pH adecuadas. La reaccin
del formaldehdo con el amonio y las aminas primarias produce protones en el medio que hacen disminuir el pH. La valo-
racin con hidrxido de sodio hasta reestablecer el pH inicial permite hacer un clculo aproximado del nitrgeno fcilmente
asimilable que existe en el medio a partir del volumen de base utilizado. Otro mtodo cada vez ms extendido entre los
laboratorios es la utilizacin de reactivos enzimticos y/o qumicos. El amonio se puede medir utilizando la enzima gluta-
mato deshidrogenasa (GLDH) (figura 2).
En presencia de 2-oxoglutarato en el medio la enzima convierte el amonio en glutamato consumiendo NADH
+
que se
puede medir espectrofotomtricamente a 340 nm y que es proporcional a la cantidad de amonio presente en el medio (Tur-
bow SB, 2002) (figura 2). El nitrgeno amnico primario se puede medir utilizando el colorante o-ftaldialdehdo (OPA). En
este caso, las molculas con un nitrgeno amnico primario y en presencia de un reductor en el medio, forman un com-
puesto con el OPA que se puede medir espectrofotomtricamente a 340 nm y que es proporcional a la concentracin del
analito en el medio (Dukes and Butzke, 1998) (figura 3).
La suma de los dos componentes expresados en mg N/L indican la concentracin de NFA.
Otros mtodos no tan habituales para medir el NFA son la determinacin de amonio con un electrodo selectivo de amonio
o la utilizacin de HPLC para medir aminocidos (Gump et al., 2002).
Comparacin de mtodos
Para evaluar las diferencias entre la titulacin con formaldehdo (mtodo Sorensen) y los mtodos espectrofotomtricos
de amonio y PAN se ha realizado una comparacin de mtodos con la prestigiosa bodega Freixenet utilizando el protoco-
lo interno de la bodega para el mtodo Sorensen y el sistema Enology de Biosystems para el mtodo espectrofotomtrico
(Reactivos: Primary Amino Nitrogen (Cd. 12807) y Ammonia (Cd. 12809); y el analizador automtico Y15

).
Se han analizado 61 muestras de vino base cava parando la fermentacin con NaF y tomando las medidas en paralelo.
Los resultados se pueden ver en la figura 4 y la tabla 1.
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Figura 2. Reaccin enzimtica para la determinacin de amonio.
Figura 3. Reaccin colorimtrica para la determinacin de PAN.
Figura 4. Comparacin de mtodos entre la valoracin con formaldehdo
(Sorensen) y los mtodos espectrofotomtricos. Izquierda: datos iniciales.
Derecha: datos corregidos con el factor.
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Los resultados indican la existencia de una diferencia proporcional del 7% (figura 4 y tabla 1, izquierda).
La literatura indica que el mtodo de valoracin con formaldehdo subestima parcialmente algunos aminocidos (Gump et
al., 2002), no ocurriendo lo mismo con el mtodo del nitrgeno amnico primario (Dukes and Butzke, 1998). Para corrobo-
rar esta afirmacin se realizan una serie de experimentos resumidos en la tabla 2.
Como se puede observar, el mtodo espectrofotomtrico responde correctamente a las concentraciones esperadas de amo-
nio y de nitrgeno amnico primario a varias concentraciones y empleando dos aminocidos diferentes (cido asprtico e
isoleucina), mientras que el mtodo Sorensen presenta resultados correctos para el amonio pero subestima el valor de nitr-
geno amnico primario, en funcin de la concentracin y del aminocido, un promedio del 20%. Si con estos datos, se cal-
cula un factor aproximado que represente las diferencias observadas, la comparacin de mtodos indica que los valores
obtenidos con los dos mtodos son equivalentes (figura 4 y tabla 1, derecha).
La literatura presenta tambin estas conclusiones con algunos matices (Filipe-Ribeiro et al., 2007, Shively and Henick-Kling,
2001 y Gump et al., 2002). En trminos generales los dos mtodos presentan resultados equivalentes, pero esta afirmacin
no se puede extender a todos los casos. La valoracin con formaldehdo mide parcialmente la prolina, aminocido que no
forma parte del NFA y subestima la determinacin de aminocidos, pero no de la misma manera para todos. Por el contra-
rio, el mtodo espectrofotomtrico no mide la prolina y responde de una manera ms homognea a todos los aminocidos.
En conclusin, en funcin de la bodega, el tipo de muestra y el estadio de la fermentacin en el que se mida el NFA se pue-
den observar diferencias entre mtodos por lo que se recomienda que cada bodega realice los ensayos oportunos.
Conclusiones
Los mtodos ms habituales para medir el NFA en vinos y mostos son la valoracin con formaldehdo (mtodo Sorensen)
y los mtodos espectrofotomtricos (Amonio y Nitrgeno amnico primario). La literatura y estudios propios corroboran la
equivalencia entre mtodos otorgando a los laboratorios dos herramientas diferentes para evaluar los nutrientes nitrogena-
dos presentes en la muestra y necesarios para la fermentacin.
Sin embargo existen diferencias importantes en la implementacin en el laboratorio. La valoracin con formaldehdo es un
mtodo manual, requiere personal experto, elevados tiempos de anlisis, su precisin depende del operario, utiliza reacti-
vos txicos y genera una elevada cantidad de residuos. En cambio, los mtodos espectrofotomtricos no necesitan perso-
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Tabla 2. Determinacin de aminocidos y amonio con los dos mtodos estudiados.
Tabla 1. Comparacin de mtodos. Izquierda: datos iniciales. Derecha: datos corregidos con el factor.
nal experto, estn completamente automatizados, lo que les da mayor velocidad de anlisis y precisin y generan menos
residuos.
Aunque el mtodo Sorensen ha sido durante aos el ms utilizado, la incorporacin de sistemas formados por analizado-
res automticos y reactivos dedicados ha facilitado el anlisis en las bodegas, sustituyendo protocolos manuales tediosos
y poco precisos, por mtodos mucho ms rpidos, limpios y eficaces.
Agradecimientos
Bodega Freixenet, por su desinteresada colaboracin en la elaboracin de este estudio.
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