ELISA

ELISA
Dra Morella Bouchard
Instituto de Inmunologa Clnica
Universidad de Los Andes
ELISA
ELISA
Enzyme
Enzyme
Linked
Linked
Immuno
Immuno
Sorbent
Sorbent
Assay
Assay
Dra Morella Bouchard
Instituto de Inmunologa Clnica
Universidad de Los Andes
Interacci
Interacci

n Ant
n Ant

geno Anticuerpo
geno Anticuerpo
Fuerzas que
Fuerzas que
participan
participan
en la
en la
Interacci
Interacci

n
n
Ant
Ant

geno
geno
Anticuerpo
Anticuerpo
Puentes de
Hidrgeno
Enlaces
Inicos
Interacciones
hidrofbicas
Fuerzas de van
der Waals
Enlaces Inicos
ANTGENO
ANTICUERPO
ENLACES NO COVALENTES
Caracter
Caracter

sticas del
sticas del
Ac
Ac
relacionadas con
relacionadas con
con el reconocimiento del
con el reconocimiento del
Ag
Ag
Espec i f i c i dad
Di ver si dad
Af i ni dad y Avi dez
RESPUESTA HUMORAL
RESPUESTA HUMORAL
ELISA
ELISA
Descrita por Engvall y Perlman en 1971
Uno de los inmunorreactivos se absorbe a una
fase slida y el otro se marca
con una enzima.
La enzima reacciona con
un sustrato formando un
producto coloreado
Ventajas del ELISA
Ventajas del ELISA
Muy sensible
Gran nmero de muestras procesadas
simultneamente.
Resultados rpidos
Utilizacin de reactivos menos txicos
Menor costo
Cuantificacin de sustancias diversas:
hormonas metabolitos toxinas
frmacos mediadores de inflamacin protenas
citoquinas agentes infecciosos, etc.
Fundamento del ELISA
Fundamento del ELISA
Ag o Ac
fijado a
una fase
slida
Ag o Ac
en la
muestra
Conjugado:
Ac unido a
ENZIMA
SUSTRATO
CAMBIO
DE
COLOR
+ + +
Componentes del ELISA
Componentes del ELISA
FASE SLIDA
Antgeno
Anticuerpo
Conjugado: ENZIMA
SUSTRATO
SOPORTE S
SOPORTE S

LIDO
LIDO
Material del Soporte Material del Soporte Formas disponibles Formas disponibles Uni Uni n n
Nitrocelulosa Membranas,
Lminas
No covalente
Polivinilo Placas, Lminas Covalente
Poliestireno Placas, Lminas,
Perlas
Covalente
Ltex, nylon, celulosa
y sefarosa
Membranas,
Lminas, Perlas
Covalente
ANT
ANT

GENO
GENO
Completo
Extracto total
Fraccin Purificada
Pptido sinttico
Protena recombinante

Anticuerpos
Anticuerpos
Policlonales
Policlonales
Heterogneos
Reconocen eptopes diferentes del Ag
Producidos por numerosos clones de Linfocitos B

Anticuerpos Monoclonales
Anticuerpos Monoclonales
Homogneos
Especificidad nica
Producidos por un nico clon de Linfocitos B
Disponibles en cantidades ilimitadas
MUESTRA
MUESTRA
Orina
LCR
Heces
Otros
Suero
Saliva
ENZIMAS
ENZIMAS
Peroxidasa
Fosfatasa alcalina
-galactosidasa
Penicilinasa
Ureasa
Glucosa oxidasa
SUSTRATOS
SUSTRATOS
Requerimientos del sustrato

Solubles en agua
Solubles en agua

F
F

cil de manipular
cil de manipular

No t
No t

xicos, no mutag
xicos, no mutag

nicos
nicos

Bajo costo
Bajo costo
Fosfatasa
Alcalina
Peroxidasa
-Nitrofenil Fosfato (NPP)
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /
nitro azul de tetrazolium (BCIP / NBT)
Naftol AS-TR posfato /fast red RC
2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6-
cido sulfnico)
-fenilendiamino (OPD)
3,35,5-tetrametilbencidina base o
Dihidrocloruro (TMB)
3,3-Diaminobencidina (DAB)
3-amino-9-Etilcarbazole (AEC)
4-cloro-1-Naftol (4C1N)
Prpura
Amarillo
Verde
Naranja
Azul
Marrn
Rojo
Azul
Formaci
Formaci

n de colores por la acci

n de colores por la acci

n
n
enzim
enzim

tica
tica
sobre diferentes crom
sobre diferentes crom

genos
genos
Rojo
Revelaci
Revelaci

n de la actividad
n de la actividad
enzim
enzim

tica
tica
Incorporacin de cidos o bases
fuertes para detener la reaccin
La cantidad de producto enzimtico
formado se determina leyendo la
densidad ptica (DO) con un
espectrofotmetro
FASES DEL ELISA
FASES DEL ELISA
1. Titulacin de la cantidad de Ag o Ac a utilizar para
sensibilizar la placa.
2. Sensibilizacin
3. Lavado
4. Bloqueo
5. Lavado
6. Incubacin de las placas con las muestras y controles
positivos y negativos
7. Lavado
8. Incubacin del conjugado
9. Lavado
10.Incubacin del sustrato
11.Detenimiento de la reaccin enzimtica
12.Lectura de las placas
BLOQUEO
BLOQUEO
Buffer de Buffer de
bloqueo bloqueo
Composici Composici n n Desventajas Desventajas
Casena 5% p/v leche sin grasa
Deteriora rpidamente.
Enmascara algunos
antgenos
Casena/Tween20 5% p/v leche sin grasa, O,2 %de
Tween20
Deteriora rpidamente.
Enmascara algunos
antgenos
Tween 20 O,2 %de Tween Podra generar algunos
residuos
Gelatina Gelatina 0.2% (2mg/ml)
BSA 3% de BSA, Relativamente costoso
Lavados
Lavados
Utilizados para separar los componentes
unidos de los libres
Generalmente:
De 3 a 6 lavados por cada etapa
Duracin de 30 seg a 1 min c/u
Se utiliza Buffer fosfato 0.01 a pH 7,2
TIPOS DE ELISA
TIPOS DE ELISA
DIRECTO
INDIRECTO
COMPETITIVO
TIPO SANDWICH
MTODO AVIDINA-BIOTINA
E E E E E E
SSSSSS
E E E E E E
E
S
Ant
Ant

geno
geno
Buffer de bloqueo
Buffer de bloqueo
Muestra (Anticuerpo)
Muestra (Anticuerpo)
Sustrato
Sustrato
ELISA INDIRECTO
ELISA INDIRECTO
Conjugado Anticuerpo
Conjugado Anticuerpo
-
-
Enzima
Enzima
S
ELISA SANDWICH
ELISA SANDWICH
Anticuerpo
fijado al
pozo
S
ELISA SANDWICH
lavado
Anticuerpo
fijado al
pozo
Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido
S
ELISA SANDWICH
lavado lavado
Anticuerpo
fijado al
pozo
Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido
Adicin del
conjugado
enzima-
Anticuerpo
secundario
E E
E
S
E E
E
S
ELISA SANDWICH
lavado lavado lavado
Anticuerpo
fijado al
pozo
Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido
Adicin del
conjugado
enzima-
Anticuerpo
secundario
Adicin del
sustrato y
medicin
del color
E E
E
S
E E
E
S
ELISA SANDWICH
lavado lavado lavado
Anticuerpo
fijado al
pozo
Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido
Adicin del
conjugado
enzima-
Anticuerpo
secundario
Adicin del
sustrato y
medicin
del color
E E
E
INTERPRETACI
INTERPRETACI

N
N
DE RESULTADOS
DE RESULTADOS
INTERPRETACI
INTERPRETACI

N DE RESULTADOS
N DE RESULTADOS
Incluir controles:
Control del PBS (blanco)
Control Negativo
Control Positivo Bajo
Control Positivo Alto
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
1/64
A
B
1/256
B
C
1/1024
C
D
1/4096
D
E
1/64
E
F
1/256
F
G
1/1024
G
H
1/4096
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C
o
n
t
r
o
l

n
e
g
a
t
i
v
o
C
o
n
t
r
o
l

p
o
s
i
t
i
v
o
B


L


A


N


C


O


S
Paciente 1 2 3 4 5 8 7 6 9 10
19 20 11 12 13 14 15 16 17 18 Paciente
REPORTE DE RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS
REPORTE CUALITATIVO
Positivo
Negativo
REPORTE CUANTITATIVO
ng o g/ ml
Unidades internacionales de ELISA
(EIU)
REPORTE DE RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS
Pruebas cuantitativas:
Empleo de controles
negativos, positivos
bajos y positivos
altos para construir
curva de calibracin.
REPORTE DE RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS
Valor
mnimo
positivo
Promedio
de los
Controles
Negativos
2 3
Desviaciones
estndar
=
x
Semicuantitativa
Cut off
PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA
PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA
T
T

CNICA DE ELISA EN EL IDIC

CNICA DE ELISA EN EL IDIC
ANTICUERPOS CONTRA AGENTES INFECCIOSOS
Toxoplasma Cisticerco Amibas
CMV Hepatitis A-B-C Helycobacter pylori
Epstein Barr Rubeola HIV
ANTGENOS TUMORALES
ACE CA125 NSE
APS AFP CA19-9
AUTOANTICUERPOS
ANA FR ANCA
Anticuerpos antitiroideos Anticardiolipinas
PROTENAS PLASMTICAS
PCR
GRACIAS
GRACIAS