Universidad Autnoma de Chihuahua

Facultad de Ciencias Qumicas

Maestra en biotecnologa

Materia: Tcnicas analticas en biotecnologa.

Determinacin de DNA plasmdico del cultivo PBI 121 por mtodo miniprep.




Catedrtico: Dr. Quintn Rascn Cruz.
Alumno: Manuel S. Domnguez Licerio.
Matricula No.88758



RESUMEN

La purificacin de DNA es un paso clave en la experimentacin en Biologa
Molecular. Los mtodos de purificacin de DNA se clasifican en dos grandes
categoras, segn pretendan purificar DNA cromosmico o DNA plasmdico. La
purificacin de DNA plasmdico es la base de cualquier experimento de clonacin
molecular. El problema principal que hay que resolver es la separacin del DNA
plasmdico y DNA cromosmico. En esta prctica hemos elegido el mtodo de
lisis alcalina, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. La purificacin de
RNA es otro paso clave en la experimentacin en Biologa Molecular. Cuando se
trabaja con clulas de mamfero existen dos posibilidades: purificar RNA total o
mRNA (en base a la cola de poliA). La purificacin de RNA es la base de la
cuantificacin de transcritos en estudios de expresin gnica. En esta prctica
Los cidos nucleicos se separarn por tamao mediante electroforesis en geles de
agarosa y se visualizarn por irradiacin con luz UV en presencia de bromuro de
etidio.

INTRODUCCIN Y OBJETIVOS


El genoma bacteriano se organiza en un nico cromosoma circular con un slo
origen de replicacin. Las bacterias pueden contener informacin gentica
adicional en forma de plsmidos. Los plsmidos son molculas circulares de DNA
extracromosmico que se replican de forma autnoma, a partir de su propio origen
de replicacin. La informacin gentica que portan los plsmidos no es
generalmente vital para la supervivencia celular. No obstante, dicha informacin
puede resultar imprescindible en determinadas circunstancias ambientales, e.g.
plsmidos portadores de genes de resistencia a antibiticos. Las bacterias pueden
llegar a tener un gran nmero de copias de un mismo plsmido (plsmidos
multicopia), facilitando enormemente su purificacin.
todos incluyen los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio
selectivo de aquellas que llevan el plsmido. (ii) Lisis de las bacterias para la
liberacin del plsmido. (iii) Purificacin del DNA plasmdico.
El problema principal que hay que resolver es la separacin del DNA plasmdico y
DNA cromosmico. En esta prctica hemos elegido el mtodo de lisis alcalina, por
su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad.
Lisis alcalina: Este mtodo explota las diferencias en las propiedades de
desnaturalizacin y renaturalizacin entre el DNA plasmdico (pequeos crculos de
DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosmico (fragmentado). La
alcalinizacin con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico (SDS),
provoca la lisis celular, la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas,
y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven menos afectados por su
pequeo tamao y estructura superenrollada. La neutralizacin del medio en
presencia de una concentracin alta de sal (acetato potsico), provoca la precipitacin
de las protenas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal
potsica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosmico (por reasociaciones aleatorias
intracatenarias). Los agregados insolubles de protenas y DNA cromosmico se
separan por centrifugacin del DNA plasmdico que queda en el sobrenadante y
conserva mayoritariamente su estructura nativa.
Electroforesis en gel de agarosa
La calidad de las purificaciones de cidos nucleicos se comprueba rutinariamente
mediante electroforesis en geles de agarosa.
Cuando se aplica un campo elctrico a una solucin de molculas, stas se
separan de acuerdo con su tamao y carga neta. Los cidos nucleicos son
polianiones que se mueven hacia el polo positivo. Las molculas y fragmentos de
molculas de cidos nucleicos se separan de acuerdo con su tamao y
conformacin, mediante electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un
polmero de residuos alternos de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por
enlaces glicosdicos, que Lisis alcalina forma geles con poros de gran tamao.



Los cidos nucleicos que emigran a mayor velocidad en los geles de agarosa son
los que encuentran menos resistencia en su avance (los de menor tamao y de
conformacin ms compacta).
Al gel de agarosa se le aade bromuro de etidio, un compuesto que se une a los
cidos nucleicos y que fluoresce cuando se ilumina con luz UV
Objetivos
Familiarizarse con protocolos de purificacin de distintos tipos de cidos nucleicos:
DNA plasmdico a partir de bacterias portadoras y RNA a partir de clulas
humanas cultivadas en el laboratorio. Separacin por tamao mediante
electroforesis en geles de agarosa y visualizacin por irradiacin con luz UV en
presencia de bromuro de etidio.

PROTOCOLO A REALIZAR

1. Crecer colonias transformantes en medio selectivo, en tubos con 5 ml de
caldo LB con ampicilina (100gramos/microlitro) e incubar a 37 grados celsius
a 2500 rpm durante tada la noche.

2. Al da siguiente centrifugar a temperatura ambiente 1.5 ml por 5 segundos en
una microcentrfuga y posteriormente tirar el sobre nadante en vaso de
precipitado con cloro.

3. resuspender las celulas en 200microlitros de STE (solucion 1: 15 sacarosa,
50 mM Tris pH 7.9, 50 mM EDTA pH 7.9) con micropipeta.

4. Agregar 200 microlitros de solucin de lisis (Solucin 2: 0.2M NaOH, 1%
SDS). Invertir el tubo 3 veces para mezclar.

5. Agregar 100 microlitros de Acetato de potacio 3.0 M pH6.0 (solucin 3).
Agitar suavemente.

6. centrifugar 10 minutos a temperatura ambiente.

7. Extraer el sobre nadante a otro tubo limpio.

8. Agregar al sobre nadante un volumen aproximado de 400 microlitros de una
mezcla de Fenol-cloroformo-isoamlico (50:48:2)

9. Agitar suavemente 5 minutos a mano. Tomara un aspecto lechoso.

10. Centrifugar a temperatura ambientepor 3 minutos en microcentrfuga. Se
formara una fase acuosa arriba, luego una capa blanca y luego estara el
fenol.

11. Retir el sobre nadante (aproximadamente 400 microlitros, la fase acuosa
solamente, a otro microtubo.

12. Agregar dos volmenes (Aproximadamente 600 microlitros) de etanol absoluto,
se da una suave ajutacion y se guarda a -20 grados celsius toda la nochepara
preciputar o 10 minutos a -70 grados celsius.

13. Decantar el alcohol, lavar con 500 microlitros de TE (10mM tris pH 7.9, 1mM
EDTA pH 7.9).

14. Se leen cada una de las muestras en por espectrofotometro a 260 para
acidos nucleicos y 280 para proteinas.

15. En funcion a los datos se ace el calculo para agregar la cantidad adecuada
para le electroforesis con gel de agarosa .


Electroforesis en gel de agarosa

1. En un microtubo, se dispensan los microlitros que se calculan para cada una
de las muestras de la muestra de DNA plasmdico y 2 l del tampn de
carga (glicerol y naranja G) se completa con H2O hasta un volumen de 10
micrlolitos.

2. Se cargan las muestra de DNA en geles de agarosa al 1% preparados con
anterioridad.

3. Se cargar tambin una muestra de referencia.

4. Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente
de alimentacin (rojo para el polo positivo).

5. Se programa la fuente a 70 voltios y se deja funcionar la electroforesis
durante ~ 15 min.


6. Acabada la electroforesis, se pone el gel en un transiluminador y se irradia
con luz UV. Los alumnos harn un esquema de la imagen resultante,
indicando el grosor aproximado de las bandas que aparezcan con mayor
nitidez y su posicin en el gel.


RESULTADOS

Del electrofotometro:
Muestras A260 A280 Conc.
1 0.146 0.075 730
microgrs/microlt.
2 .083 .035 415
microgrs/microlt.
3 0.127 0.053 635
microgrs/microlt.

Dados los resultados arriba mencionados se adicionan las siguientes cantidades
para la electroforesis (volumenes en microlitros).
Muestra Vol de muestra Buffer Vol. agua
1 2.739 2 5.27
2 4.819 2 3.19
3 3.149 2 4.86

Donde se obtienen la siguiente fotografia del gel de electroforesis.
















































Donde se observa en los carriles 1 el marcador de peso molecular Hind III y en
los carriles 6, 7 y 8 los correspondientes a la muestras 1, 2 y 3 de nuestro
plasmido.

CONCLUSIONES

Nuestras muestras no se corrieron, se quedaron fijas y es a que en el
precedimineto no se llevo a cabo con la pulcritud adecuada al agitar demaciado
suavemente y al hacer las extracciones del sobrenanate no se realizo con la
debida destreza.







BIBLIOGRAFA COMENTADA

Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7: 1513-1523. Artculo original
que describe el mtodo de lisis alcalina.